CN115974981A - DNA结合结构域、融合型phi29 DNA聚合酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了DNA结合结构域、融合型phi29DNA聚合酶及其制备方法和应用。本发明的融合型phi29DNA聚合酶包括phi29DNA聚合酶，上述DNA结合结构域，连接前两者的连接肽。本发明还提出编码融合型phi29DNA聚合酶的核酸分子；包括上述核酸分子的载体；包括上述核酸分子或载体的宿主细胞；包括上述融合型phi29DNA聚合酶的试剂盒；上述融合型phi29DNA聚合酶的制备方法；一种DNA复制、扩增或测序方法。本发明提出的融合型phi29DNA聚合酶的耐盐性好，DNA结合能力强。

Description

DNA结合结构域、融合型phi29 DNA聚合酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及DNA结合结构域、融合型phi29 DNA聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术

体外核酸扩增被广泛应用于研究、医学、食品科学等领域，其中最为广泛被研究和使用的是聚合酶链式反应(PCR)。然而PCR反应依赖于提高和降低反应混合物的温度循环，需要配备专用的热循环仪器才能进行，并且扩增时间长，一般需要几个小时，难以在基层尤其是一些偏远地区或条件较差的实验室推广使用。

针对常规PCR反应的不足，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术得到了迅猛的发展。等温扩增过程中需要使用链置换DNA聚合酶，为了提高等温扩增反应的特异性，有必要将引物在高温条件下序列特异性地退火至模板DNA，这一过程即需要性能优异的DNA聚合酶的参与。phi29 DNA聚合酶是枯草芽孢杆菌噬菌体phi29的执行基因组复制功能的DNA聚合酶，具有持续合成和超强的链置换性质，且具有高保真性，是等温扩增的理想DNA聚合酶。然而，野生型phi29 DNA聚合酶在扩增过程中对DNA的结合能力相对较弱，且耐盐性差，因此其合成新链的效率低、持续性低，也无法在高盐的条件下使用。

基于此，提高phi29 DNA聚合酶对DNA的结合能力和耐盐性具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种DNA结合结构域。

本发明还提出一种融合型phi29 DNA聚合酶，具有耐盐性好，DNA结合能力强的优点。

本发明还提出编码所述融合型phi29 DNA聚合酶的核酸分子。

本发明还提出一种载体。

本发明还提出一种宿主细胞。

本发明还提出一种试剂盒。

本发明还提出所述融合型phi29 DNA聚合酶的制备方法。

本发明还提出一种DNA复制、扩增或测序方法。

根据本发明的一个方面，提出了一种DNA结合结构域，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

所述DNA结合结构域能够非特异性地与模板DNA结合。

根据本发明的第二个方面，提出了一种融合型phi29 DNA聚合酶，包括：

phi29 DNA聚合酶；所述DNA结合结构域；连接肽，用于连接所述phi29 DNA聚合酶和所述DNA结合结构域。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：

本发明提出的融合型phi29 DNA聚合酶中包括DNA结合结构域(DNA bindingdomain，DBD)，DNA结合结构域能够非特异性地结合模板DNA。DNA结合结构域与phi29 DNA聚合酶融合后，二者协同作用显著提高了融合型phi29 DNA聚合酶对DNA的结合能力和耐盐性，适用于模板含量较低时，或者样本成分复杂时，对样品的扩增和检测。使用该融合型phi29 DNA聚合酶进行PCR扩增时，在高盐、抑制剂等存在情况下，使用微量模板，即可实现高效率扩增，扩增产物量高。

在本发明的一些实施方式中，所述融合型phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

在本发明的一些实施方式中，所述连接肽与所述phi29 DNA聚合酶的羧基端相连。

具体地，所述phi29 DNA聚合酶的羧基端与所述连接肽的氨基端相连，所述连接肽的羧基端与所述DNA结合结构域的氨基端相连。

在本发明的一些实施方式中，所述连接肽能够把所述phi29 DNA聚合酶和所述DNA结合结构域适当隔开，进而在反应过程中避免两个结构域的互相干扰，以实现所述融合型phi29 DNA聚合酶的成功表达。

在本发明的一些实施方式中，所述连接肽为柔性连接肽、刚性连接肽或采用生物信息学技术设计的连接肽。

在本发明的一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3：GTGSGA或SEQ ID NO:4：AYVDGA所示。

根据本发明的第三个方面，提出了编码所述融合型phi29 DNA聚合酶的核酸分子。

在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

根据本发明的第四个方面，提出了一种载体，所述载体包括所述核酸分子。

在本发明的一些实施方式中，所述载体为表达载体。

具体地，包括所述载体可用于克隆或用于生产表达载体，所述载体可以是质粒、病毒、噬菌体或任何其他遗传工程中通常使用的载体。

更具体地，所述载体是质粒，如pET-28a。

具体地，所述载体除包括所述核酸分子外，还可包括用于控制表达的真核或原核元件，如用于启动和终止转录和/或翻译的调节序列、增强子、启动子、信号序列等。

在本发明的一些实施方式中，所述载体为细菌、真菌、昆虫、病毒或哺乳动物载体。

根据本发明的第五个方面，提出了一种宿主细胞，包括所述核酸分子或所述载体。

在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

具体地，所述核酸分子和所述载体可被引入合适的宿主细胞。所述核酸分子可被引入所述宿主细胞的基因组；所述载体可在胞质中以染色体外的形式存在或被并入所述宿主细胞的染色体中。

在本发明的一些实施方式中，所述原核细胞为细菌细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述真核细胞包括酵母细胞、丝状真菌细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞。

根据本发明的第六个方面，一种试剂盒，包括所述融合型phi29 DNA聚合酶。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括引物、dNTP、缓冲液。

根据本发明的第七个方面，提出了所述融合型phi29 DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：

S1：提供编码所述融合型phi29 DNA聚合酶的cDNA序列，将所述cDNA序列连接到载体上，转入宿主细胞中，得重组细胞；

S2：诱导所述重组细胞表达所述融合型phi29 DNA聚合酶，对所述融合型phi29DNA聚合酶进行纯化。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1根据所述融合型phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列推导出所述cDNA序列。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2中诱导所述重组细胞表达后，收集菌体，对所述菌体进行超声破碎，收集上清液，然后用Ni-亲和柱纯化所述上清液，即可得到所述融合型phi29 DNA聚合酶。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2在纯化所述融合型phi29 DNA聚合酶后，得到纯化蛋白液，还可对所述纯化蛋白液进行浓缩，以达到所需融合型phi29 DNA聚合酶的浓度。

根据本发明的第八个方面，提出了一种DNA复制、扩增或测序方法，包括将所述DNA与所述试剂盒中的所述phi29 DNA聚合酶接触的步骤。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明试验例中融合型phi29 DNA聚合酶和野生型phi29 DNA聚合酶的SDS-PAGE蛋白电泳结果图；其中，M-蛋白Marker；

图2为本发明试验例中的TBE凝胶电泳检测图；其中，M-DNA marker；野生-野生型phi29 DNA聚合酶；融合-融合型phi29 DNA聚合酶。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的描述中，除非另有明确的限定，纯化、表达等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。

实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

本实施例制备了融合型phi29 DNA聚合酶，具体过程为：

(1)提供野生型phi29 DNA聚合酶、连接肽(SEQ ID NO:3：GTGSGA)和DN A结合结构域(SEQ ID NO:1：MRYIELAQLYQKLEKTTMKLIKTRLVADFLKKVPED HLEFIPYLILGDVFPEWDERELGVGEKLLIKAVSMATGIDSKEIENSVKDTGDLGESIALAVKKRKQKSFFSQPLTIKRVYQTLVKVAETTGEGSQDKKMKYLANLFMDAEPIEAKYIARTVLGTMRTGVAEGLLRDAISLAFNVKVELVERAYMLTSDFGFVAKIAKTEGNDGLAKVTIQIGKPIK)的氨基酸序列，将三者依次连接起来，得到融合型phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:2：MPRKMYSCDFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHS EYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISRMGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRYAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLFKDFIDKWTYIKTTSEGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPKKLGYWAHESTFKRAKYLRQKTYIQDIYMKEVDGKLVEGSPDDYTDIKFSVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIKGTGSGAMRYIELAQLYQKLEKTTMKLIKTRLVADFLKKVPEDHLEFIPYLILGDVFPEWDERELGVGEKLLIKAVSMATGIDSKEIENSVKDTGDLGESIALAVKKRKQKSFFSQPLTIKRVYQTLVKVAETTGEGSQDKKMKYLANLFMDAEPIEAKYIARTVLGTMRTGVAEGLLRDAISLAFNVKVELVERAYMLTSDFGFVAKIAKTEGNDGLAKVTIQIGKPIK)。

(2)根据融合型phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列，推导出对应的cDNA序列(SE Q IDNO:5：ATGCCGAGAAAGATGTATAGTTGTGACTTTGAGACAACTACTAAAGT GGAAGACTGTAGGGTATGGGCGTATGGTTATATGAATATAGAAGATCACAGTGAGTACAAAATAGGTAATAGCCTGGATGAGTTTATGGCGTGGGTGTTGAAGGTACAAGCTGATCTATATTTCCATAACCTCAAATTTGACGGAGCTTTTATCATTAACTGGTTGGAACGTAATGGTTTTAAGTGGTCGGCTGACGGATTGCCAAACACATATAATACGATCATATCTCGCATGGGACAATGGTACATGATTGATATATGTTTAGGCTACAAAGGGAAACGTAAGATACATACAGTGATATATGACAGCTTAAAGAAACTACCGTTTCCTGTTAAGAAGATAGCTAAAGACTTTAAACTAACTGTTCTTAAAGGTGATATTGATTACCACAAAGAAAGACCAGTCGGCTATAAGATAACACCCGAAGAATACGCCTATATTAAAAACGATATTCAGATTATTGCGGAAGCTCTGTTAATTCAGTTTAAGCAAGGTTTAGACCGGATGACAGCAGGCAGTGACAGTCTAAAAGGTTTCAAGGATATTATAACCACTAAGAAATTCAAAAAGGTGTTTCCTACATTGAGTCTTGGACTCGATAAGGAAGTGAGATACGCCTATAGAGGTGGTTTTACATGGTTAAATGATAGGTTCAAAGAAAAAGAAATCGGAGAAGGCATGGTCTTCGATGTTAATAGTCTATATCCTGCACAGATGTATAGCCGTCTCCTTCCATATGGTGAACCTATAGTATTCGAGGGTAAATACGTTTGGGACGAAGATTACCCACTACACATACAGCATATCAGATGTGAGTTCGAATTGAAAGAGGGCTATATACCCACTATACAGATAAAAAGAAGTAGGTTTTATAAAGGTAATGAGTACCTAAAAAGTAGCGGCGGGGAGATAGCCGACCTCTGGTTGTCAAATGTAGACCTAGAATTAATGAAAGAAC

ACTACGATTTATATAACGTTGAATATATCAGCGGCTTAAAATTTAAAGCAACTACAG

GTTTGTTTAAAGATTTTATAGATAAATGGACGTACATCAAGACGACATCAGAAGGA

GCGATCAAGCAACTAGCAAAACTGATGTTAAACAGTCTATACGGTAAATTCGCTAG

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CATCACTGCATGGGCTAGATACACGACAATTACAGCGGCACAGGCTTGTTATGATC

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CCTATTGAAGCTAAGTACATAGCGAGAACGGTGCTCGGAACGATGAGAACTGGAG

TAGCCGAGGGACTGCTCAGGGATGCGATATCCCTAGCATTTAACGTCAAAGTTGAG

CTCGTTGAGAGGGCTTACATGCTAACTAGCGACTTTGGATTCGTCGCAAAAATTGC

CAAAACTGAGGGTAATGATGGATTAGCTAAGGTGACAATTCAGATTGGTAAGCCAA

TAAAGTAA)。扩增上述cDNA序列，回收扩增产物。

(3)对步骤(2)的回收产物与pET28a载体进行双酶切后，连接酶切后的两种产物，得连接产物；

取连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(北京全式金生物技术有限公司，目录号CD901-02)中。抗性筛选后，取5μL菌种接于5mL的LB液体培养基中，37℃摇瓶培养过夜。然后转接于500mL的LB液体培养基中，37℃摇瓶培养6h后，加入IPTG至终浓度为0.6mM后继续于16℃摇瓶培养过夜，进行诱导表达。

纯化：培养结束后，收集菌体，超声破碎细胞；经离心去除细胞碎片，取上清。用Ni亲和层析柱进行纯化，得到融合型phi29 DNA聚合酶，并使用超滤柱AMICON ULTRA15ML 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)对融合型phi29 DNA聚合酶进行浓缩。

对比例1

本对比例制备了野生型phi29 DNA聚合酶，与实施例1的区别在于，对比例1的聚合酶中没有连接肽、DNA结合结构域与野生型phi29 DNA聚合酶连接。具体过程同实施例1，只是步骤(1)中直接提供野生型phi29 DNA聚合酶；(2)中为野生型phi29 DNA聚合酶对应的cDNA序列，并对其进行扩增。

试验例

本试验例测试了实施例和对比例制备的DNA聚合酶的性能。其中：

1.SDS-PAGE蛋白电泳验证融合型phi29 DNA聚合酶和野生型phi29 DNA聚合酶的蛋白大小和纯度：

将实施例1制备得到的融合型phi29 DNA聚合酶(91KD)和对比例1制备得到的野生型phi29 DNA聚合酶(67KD)进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，以鉴定融合型phi29DNA聚合酶蛋白的大小和纯度。结果如图1所示，野生型phi29 DNA聚合酶的大小约67KD，融合型phi29DNA聚合酶由于融合了DNA结合结构域，其分子量变大，与蛋白Marker对比发现，其分子量约91KD，大小正确；且即使浓度升高到300ng，也没有杂带产生，表明本发明制备的融合型phi29 DNA聚合酶的纯度较高。同时，图1结果也表明DNA结合结构域的融合并不会影响融合型phi29 DNA聚合酶的表达量和纯度。

2.测试实施例1和对比例1制备的DNA聚合酶的DNA模板结合能力及耐盐性：

(1)DNA模板制备：提供DNA模板序列(如SEQ ID NO:6：TAGCGAAGGAT GTGAACCTAATCCCTGCTCCCGCGGCCGATCTGCCGGCCGCGGGA*G*C*A所示，其中*代表点硫代修饰)；将0.5μL的DNA模板(2μg/μL)和149μL的1×binding buffer(20mM HEPES，pH7.5；50mM KCl，2％Trehalose)混合，然后于95℃加热5min，在室温下冷却3min，制成DNA模板。

(2)DNA模板与DNA聚合酶结合：取17.95μL(1)中的DNA模板，与2.05μL的800ng/μL的融合型phi29 DNA聚合酶或野生型phi29 DNA聚合酶，在25℃条件下反应10min。

(3)电泳验证：取8μL(2)中的样品与2μL的Hi-Density TBE Sample Buffer(5×)(Invitrogen^TM公司，目录号：LC6678)混合。将上述混合样品进行4～20％ Novex^TM TBE凝胶(Invitrogen^TM公司，目录号：EC6225BOX)电泳检测。

结果如图2所示，泳道1为DNA marker；泳道2为野生型phi29 DNA聚合酶在0mM KCl条件下与DNA模板结合的条带；泳道3为融合型phi29 DNA聚合酶在0mM KCl条件下与DNA模板结合的条带；泳道4为野生型phi29 DNA聚合酶在300mM KCl条件下与DNA模板结合的条带；泳道5为融合型phi29 DNA聚合酶在300mM KCl条件下与DNA模板结合的条带；泳道6为DNA模板条带。从图2中条带位置可初步判断，在0mM KCl条件下，泳道2中有游离DNA存在，而泳道3中没有游离DNA存在，表明该条件下融合型phi29 DNA聚合酶比野生型phi29 DNA聚合酶与DNA模板的结合能力强；在300mM KCl(高盐)条件下，泳道4、5均有游离DNA存在，表明在高盐条件下两种DNA聚合酶与DNA模板的结合能力均有所减弱；但是泳道5的游离DNA较少，且能看到融合型phi29 DNA聚合酶/DNA模板复合条带，而泳道4看不到复合条带，表明在高盐条件下，融合型phi29 DNA聚合酶依旧比野生型phi29 DNA聚合酶与DNA模板的结合能力强，融合型phi29 DNA聚合酶的耐盐性也有提高。

以上结果表明，本发明将DNA结合结构域与野生型phi29 DNA聚合酶融合后，显著提高了融合型phi29 DNA聚合酶与DNA模板的结合能力和耐盐性。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种DNA结合结构域，其特征在于，所述DNA结合结构域具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.一种融合型phi29 DNA聚合酶，其特征在于，包括：

phi29 DNA聚合酶；权利要求1所述DNA结合结构域；连接肽，用于连接所述phi29DNA聚合酶和所述DNA结合结构域。

3.根据权利要求2所述的融合型phi29 DNA聚合酶，其特征在于，所述融合型phi29DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求2所述的融合型phi29 DNA聚合酶，其特征在于，所述连接肽与所述phi29 DNA聚合酶的羧基端相连；优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所示。

5.编码权利要求2～4任一项所述融合型phi29 DNA聚合酶的核酸分子。

6.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求5所述核酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求5所述核酸分子或权利要求6所述载体。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2～4任一项所述融合型phi29DNA聚合酶。

9.权利要求2～4任一项所述融合型phi29 DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：提供编码所述融合型phi29 DNA聚合酶的cDNA序列，将所述cDNA序列连接到载体上，转入宿主细胞中，得重组细胞；

S2：诱导所述重组细胞表达所述融合型phi29 DNA聚合酶，对所述融合型phi29DNA聚合酶进行纯化。

10.一种DNA复制、扩增或测序方法，其特征在于，包括将所述DNA与权利要求8所述试剂盒中的所述融合型phi29 DNA聚合酶接触的步骤。

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