CN115970654A - 一种磁性微球的高效合成工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种磁性微球的高效合成工艺及其应用。本发明首次是以氧化石墨烯掺杂Fe3O4为基础制备磁性内核,以壳聚糖作为外壳制备成功地制备具备高效分离纯化性能的磁性微球。经证明,本发明制备的磁性微球对核酸的回收率可达到96%以上,对蛋白质的回收率可达到92%以上,取得了与市售的磁珠相媲美的技术效果,相比于单纯的未经任何修饰的Fe3O4纳米磁性微球和壳聚糖微球而言,本发明制备的磁性微球更加适合核酸、蛋白质的纯化分离,具有非常大的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及核酸、蛋白质分离纯化的技术领域,特别涉及一种磁性微球的高效合成工艺及其应用。
背景技术
从生物样品中提取核酸、蛋白质等活性物质是分子生物学和临床医学等生命科学研究领域中的一项基本技术。核酸提取的传统方法如酚-氯仿抽提法,存在着有机溶剂毒性大、重复性劳动多、难以实现微型化、自动化操作等缺点。蛋白质分离纯化是当代生物产业当中的核心技术,其存在技术难度、成本均高等问题,目前常用的蛋白质分离纯化技术包括:沉淀、电泳、透析、层析等手段,但是上述技术都面临着分离纯化效率低下的问题。
磁性微粒作为一种新型的核酸、蛋白质分离的固相萃取剂,借助于适当的磁分离装置,可以进一步简化和加速核酸和蛋白质的分离与纯化过程,实现核酸、蛋白质纯化处理的微型化、自动化和平行化。最近,报道了新型磁性二氧化硅微球具有球形规整、粒度分布窄、磁响应性高的特点,尤其适合于在高粘度样品溶液中核酸的提取。但是目前现有的磁性微球制备技术都无法同时实现快速、高效地进行生物分离,且对检测的纯化效率也面临着高质量的要求。
发明内容
针对上述现状,本发明提供了一种磁性微球的高效合成工艺及其应用。经证明,本发明首次是以氧化石墨烯掺杂Fe3O4为基础制备磁性内核,以壳聚糖作为外壳制备成功地制备具备高效分离纯化性能的磁性微球。经证明,本发明制备的磁性微球对核酸的回收率可达到96%以上,对蛋白质的回收率可达到92%以上,取得了与市售的磁珠相媲美的技术效果。相比于单纯的未经任何修饰的Fe3O4纳米磁性微球和壳聚糖微球而言,本发明制备的磁性微球更加适合核酸、蛋白质的纯化分离,具有非常大的市场应用前景。
具体而言,本发明提供了本发明提供了一种磁性微球的高效合成方法,其包括如下步骤:
1)磁性内核制备:将氧化石墨烯、氯化铁经水热合成法制备得到磁性内核;
2)壳聚糖外壳修饰:在步骤1)合成的磁性内核的基础上在其表面修饰壳聚糖外壳,即可制备得到磁性微球。
优选地,步骤1)的合成方法包括如下步骤:首先是将氧化石墨烯溶解于乙二醇和二甘醇的溶液中,再接着加入醋酸钠和氯化铁,混合均匀。然后,将上述混合液转移至不锈钢的反应釜中,200℃条件下加热。反应结束后,用乙醇进行清洗,去除未反应的杂质。并将上述混合液转移至透析袋中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于去离子水中。
进一步优选地,所述步骤1)的合成方法包括如下步骤:首先是将10-30mg氧化石墨烯溶解于0.5-1.5mL乙二醇和9.5-28.5mL二甘醇的溶液中,再接着加入0.2830-0.8490g醋酸钠和270-810mg氯化铁,混合均匀。然后,将上述混合液转移至不锈钢的反应釜中,200℃条件下加热10-30小时。反应结束后,用乙醇进行清洗,去除未反应的杂质。并将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于去离子水中。
优选地,步骤2)的合成方法包括如下步骤:首先是将壳聚糖溶解于乙酸溶液中,通过超声分散,使其充分溶解。然后取出步骤1)中合成的产物,并同时加入EDC和NHS,混合均匀。在氮气的保护下,进行反应,以便使得石墨烯上的羧基活化。紧接着,加入上述配制的壳聚糖溶液,在室温条件下,使其反应两天。反应结束后,同样将上述混合液转移至透析袋中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于去离子水中,即可得到本发明所述的磁性微球。
进一步优选地,步骤2)的合成方法包括如下步骤:首先是将0.1-0.3g壳聚糖溶解于14-42mL0.04M的乙酸溶液中,通过超声分散,使其充分溶解。然后取出7-21mL步骤1)中合成的产物,并同时加入1-3mL0.5M的EDC和1-3mL0.96M的NHS,混合均匀。在氮气的保护下,进行反应4-8个小时,以便使得石墨烯上的羧基活化。紧接着,加入上述配制的壳聚糖溶液,在室温条件下,使其反应两天。反应结束后,同样将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于50-150mL去离子水中,即可得到本发明所述的磁性微球。
另一方方面,本发明提供了本发明提供了一种磁性微球的高效合成方法,其包括如下步骤:
1)磁性内核制备:首先是将10-30mg氧化石墨烯溶解于0.5-1.5mL乙二醇和9.5-28.5mL二甘醇的溶液中,再接着加入0.2830-0.8490g醋酸钠和270-810mg氯化铁,混合均匀。然后,将上述混合液转移至不锈钢的反应釜中,200℃条件下加热10-30小时。反应结束后,用乙醇进行清洗,去除未反应的杂质。并将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于去离子水中。
2)壳聚糖外壳修饰:首先是将0.1-0.3g壳聚糖溶解于14-42mL0.04M的乙酸溶液中,通过超声分散,使其充分溶解。然后取出7-21mL步骤1中合成的产物,并同时加入1-3mL0.5M的EDC和1-3mL0.96M的NHS,混合均匀。在氮气的保护下,进行反应4-8个小时,以便使得石墨烯上的羧基活化。紧接着,加入上述配制的壳聚糖溶液,在室温条件下,使其反应两天。反应结束后,同样将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于50-150mL去离子水中,即可得到本发明所述的磁性微球。
另一方方面,本发明提供了本发明提供了一种磁性微球在核酸分离纯化中的应用。
进一步优选地,所述应用是将本发明制备的磁性微球与待分离核酸样本接触,经磁分离,即可实现核酸分离纯化。
优先地,所述待分离核酸样本为大肠杆菌的基因组DNA。
另一方方面,本发明提供了本发明提供了一种磁性微球在蛋白质分离纯化中的应用。
进一步优选地,所述应用是将本发明制备的磁性微球与待分离蛋白质样本接触,经磁分离,即可实现蛋白质分离纯化。
优先地,所述待分离蛋白质样本为BSA。
本发明的优点如下:
1)本发明首次是以氧化石墨烯掺杂Fe3O4为基础制备磁性内核,相比于单独以Fe3O4为基础构建的磁性内核而言,由于氧化石墨烯具有和石墨烯相似的单分子层二维网络结构,又具有羧基、羟基、环氧基等含氧官能团,这种结构使GO在拥有石墨烯优异屏蔽性能、高长径比、超高强度、超高导热性能、高表面活性等优点的同时,还拥有优异的物理、化学、光学、电学性质,GO中含有大量含氧活性基团,这些基团一方面提高了其在极性溶剂中的溶解性,另一方面也有利于对石墨烯进行共价键功能化,使其为后续的壳聚糖外壳制备奠定了基础。
2)经试验证明,本发明制备的磁性微球对核酸的回收率可达到96%以上,取得了与市售的AMpureXP磁珠相媲美的技术效果,同时,该磁性微球对蛋白质的回收率可达到92%以上。相比于单纯的未经任何修饰的Fe3O4纳米磁性微球和壳聚糖微球而言,本发明制备的磁性微球更加适合核酸、蛋白质的纯化分离,具有非常大的市场应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明,以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例,仅用于说明本发明,并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下,所获得的其他所有实施例,都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中,若无特殊说明,所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品;在本发明实施例中,若未具体指明,所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本发明提供了一种磁性微球的高效合成方法,其包括如下步骤:
1)磁性内核制备:首先是将10mg氧化石墨烯溶解于0.5mL乙二醇和9.5mL二甘醇的溶液中,再接着加入0.2830g醋酸钠和270mg氯化铁,混合均匀。然后,将上述混合液转移至不锈钢的反应釜中,200℃条件下加热10小时。反应结束后,用乙醇进行清洗,去除未反应的杂质。并将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于去离子水中。
2)壳聚糖外壳修饰:首先是将0.1g壳聚糖溶解于14mL0.04M的乙酸溶液中,通过超声分散,使其充分溶解。然后取出7mL步骤1中合成的产物,并同时加入1mL0.5M的EDC和1mL0.96M的NHS,混合均匀。在氮气的保护下,进行反应4个小时,以便使得石墨烯上的羧基活化。紧接着,加入上述配制的壳聚糖溶液,在室温条件下,使其反应两天。反应结束后,同样将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于50mL去离子水中,即可得到本发明所述的磁性微球。
实施例2
本发明提供了一种磁性微球的高效合成方法,其包括如下步骤:
1)磁性内核制备:首先是将20mg氧化石墨烯溶解于1mL乙二醇和19mL二甘醇的溶液中,再接着加入0.566g醋酸钠和540mg氯化铁,混合均匀。然后,将上述混合液转移至不锈钢的反应釜中,200℃条件下加热20小时。反应结束后,用乙醇进行清洗,去除未反应的杂质。并将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于去离子水中。
2)壳聚糖外壳修饰:首先是将0.2g壳聚糖溶解于28mL0.04M的乙酸溶液中,通过超声分散,使其充分溶解。然后取出14mL步骤1中合成的产物,并同时加入2mL0.5M的EDC和2mL0.96M的NHS,混合均匀。在氮气的保护下,进行反应6个小时,以便使得石墨烯上的羧基活化。紧接着,加入上述配制的壳聚糖溶液,在室温条件下,使其反应两天。反应结束后,同样将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于100mL去离子水中,即可得到本发明所述的磁性微球。
实施例3
本发明提供了一种磁性微球的高效合成方法,其包括如下步骤:
1)磁性内核制备:首先是将30mg氧化石墨烯溶解于1.5mL乙二醇和28.5mL二甘醇的溶液中,再接着加入0.8490g醋酸钠和810mg氯化铁,混合均匀。然后,将上述混合液转移至不锈钢的反应釜中,200℃条件下加热30小时。反应结束后,用乙醇进行清洗,去除未反应的杂质。并将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于去离子水中。
2)壳聚糖外壳修饰:首先是将0.3g壳聚糖溶解于42mL0.04M的乙酸溶液中,通过超声分散,使其充分溶解。然后取出21mL步骤1中合成的产物,并同时加入3mL0.5M的EDC和3mL0.96M的NHS,混合均匀。在氮气的保护下,进行反应8个小时,以便使得石墨烯上的羧基活化。紧接着,加入上述配制的壳聚糖溶液,在室温条件下,使其反应两天。反应结束后,同样将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天。最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于150mL去离子水中,即可得到本发明所述的磁性微球。
实施例4
磁性微球纯化回收核酸的效果验证:分别采用实施例1-3按照下述方法进行核酸回收性能测试,分别以采用水热合成法Fe3O4纳米磁性微球作为对比例1,以采用离子交联法制备的壳聚糖微球作为对比例2,以商业化的AMpureXP磁珠作为对照。
以大肠杆菌的基因组DNA作为核酸回收模板,并根据Nano-500超微量分光光度计制备总浓度为100.0ng/μL基因组DNA模板,利用本发明的纯化磁珠,进行纯化,测定样本回收率。取50μL基因组DNA模板,置于1.5ml离心管中,取磁珠150μL至待纯化样本,吹打混匀不低于10次;室温静置10min;将上一步的磁珠-样本混合物置于磁力架上静置5min,至磁珠全部吸附在磁力架上;吸弃上一步的上清液,然后加入300μL80%乙醇,静置5min;吸弃上一步的上清液,然后加入300μL准备的80%乙醇,静置5min;采用小量程移液器再次吸弃上一步残留酒精,确保无明显液滴酒精存在;将上一步结合了基因组DNA的磁珠进行室温晾干,至无明显水痕残留;采用纯水200μL进行DNA洗脱;将洗脱液与步磁珠进行吹打混匀,室温静置5min;将上一步的磁珠洗脱液进行瞬时离心,置于磁力架上静置5min,至磁珠全部被磁力架吸附,洗脱液呈澄清透明状态;吸取上层澄清液体50μL,采用Nano-500超微量分光光度计进行基因组DNA浓度定量检测。每个处理组重复3次实验,取结果平均值,各处理组组内3个数据差异不显著。测定回收率数据见表1。
表1核酸回收率测试数据
由检测数据比较可知,实施例1-3对核酸的平均回收效率分别为96.83%、96.53%和96.73%,该回收效果可以和市售的AMpureXP磁珠相媲美。相比于未经任何修饰的Fe3O4纳米磁性微球而言,本发明经氧化石墨烯和壳聚糖的修饰后会引起核酸回收效果的显著性提升,由10%提升至96%;相比于壳聚糖微球而言,本发明制备的磁性微球的回收率也从30%提升至96%,取得了显著性的改善效果。
实施例5
磁性微球纯化回收蛋白质的效果验证:分别采用实施例1-3按照下述方法进行核酸回收性能测试,分别以采用水热合成法Fe3O4纳米磁性微球作为对比例1,以采用离子交联法制备的壳聚糖微球作为对比例2,以商业化的蛋白纯化磁珠(购自于南京东纳生物科技有限公司,编号MB1201)作为对照。
以BSA作为蛋白质回收模板,并根据人牛血清白蛋白(BSA)ELISA试剂盒(购自于上海康朗生物科技有限公司,规格48T/96T,货号KL-BSA-Hu),制备总浓度为50.0ng/mL基因组DNA模板,利用本发明的纯化磁珠,进行纯化,测定样本回收率。取50μL总BSA蛋白模板,置于1.5ml离心管中,取磁珠150μL至待纯化样本,吹打混匀不低于10次;室温静置10min;将上一步的磁珠-样本混合物置于磁力架上静置5min,至磁珠全部吸附在磁力架上;吸弃上一步的上清液,然后加入300μL1×PBS缓冲液,静置5min;吸弃上一步的上清液,然后加入300μL1×PBS缓冲液,静置5min;采用小量程移液器再次吸弃上一步残留缓冲液,确保无明显液滴存在;将上一步结合了BSA的磁珠进行室温晾干,至无明显水痕残留;然后加入300μL纯水进行洗脱;将洗脱液与步磁珠进行吹打混匀,室温静置10min;将上一步的磁珠洗脱液进行瞬时离心,置于磁力架上静置10min,至磁珠全部被磁力架吸附,洗脱液呈澄清透明状态;吸取上层澄清液体50μL,采用人牛血清白蛋白(BSA)ELISA试剂盒进行总蛋白浓度定量检测。每个处理组重复3次实验,取结果平均值,各处理组组内3个数据差异不显著。测定回收率数据见表2。
表2蛋白质回收率测试数据
由检测数据比较可知,实施例1-3对BSA蛋白的平均回收效率分别为92.46%、92.36%和92.56%,该回收效果可以和市售的蛋白纯化磁珠相媲美。相比于未经任何修饰的Fe3O4纳米磁性微球而言,本发明经氧化石墨烯和壳聚糖的修饰后会引起蛋白回收效果的显著性提升,由8%提升至92%;相比于壳聚糖微球而言,本发明制备的磁性微球的回收率也从20%提升至92%,取得了显著性的改善效果。
因此有必要指出的是,以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明,并不是对本发明的技术方案的进一步的限制,本发明的方法仅为较佳的实施方案,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于核酸和/或蛋白质分离纯化的磁性微球的高效合成方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
1)磁性内核制备:将氧化石墨烯、氯化铁经水热合成法制备得到磁性内核;
2)壳聚糖外壳修饰:在步骤1)合成的磁性内核的基础上在其表面修饰壳聚糖外壳,即可制备得到磁性微球。
2.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于,步骤1)的合成方法包括如下步骤:首先是将氧化石墨烯溶解于乙二醇和二甘醇的溶液中,再接着加入醋酸钠和氯化铁,混合均匀;然后,将上述混合液转移至不锈钢的反应釜中,200℃条件下加热;反应结束后,用乙醇进行清洗,去除未反应的杂质;并将上述混合液转移至透析袋中,缓慢透析两天;最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于去离子水中。
3.如权利要求2所述的合成方法,其特征在于,所述步骤1)的合成方法包括如下步骤:首先是将10-30mg氧化石墨烯溶解于0.5-1.5mL乙二醇和9.5-28.5mL二甘醇的溶液中,再接着加入0.2830-0.8490g醋酸钠和270-810mg氯化铁,混合均匀;然后,将上述混合液转移至不锈钢的反应釜中,200℃条件下加热10-30小时;反应结束后,用乙醇进行清洗,去除未反应的杂质;并将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天;最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于去离子水中。
4.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于,步骤2)的合成方法包括如下步骤:首先是将壳聚糖溶解于乙酸溶液中,通过超声分散,使其充分溶解;然后取出步骤1)中合成的产物,并同时加入EDC和NHS,混合均匀;在氮气的保护下,进行反应,以便使得石墨烯上的羧基活化;紧接着,加入上述配制的壳聚糖溶液,在室温条件下,使其反应两天;反应结束后,同样将上述混合液转移至透析袋中,缓慢透析两天;最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于去离子水中,即可得到本发明所述的磁性微球。
5.如权利要求4所述的合成方法,其特征在于,步骤2)的合成方法包括如下步骤:首先是将0.1-0.3g壳聚糖溶解于14-42mL0.04M的乙酸溶液中,通过超声分散,使其充分溶解;然后取出7-21mL步骤1)中合成的产物,并同时加入1-3mL0.5M的EDC和1-3mL0.96M的NHS,混合均匀;在氮气的保护下,进行反应4-8个小时,以便使得石墨烯上的羧基活化;紧接着,加入上述配制的壳聚糖溶液,在室温条件下,使其反应两天;反应结束后,同样将上述混合液转移至透析袋(MWCO8000-14000)中,缓慢透析两天;最后,通过磁分离收集产物,并将其重悬于50-150mL去离子水中,即可得到本发明所述的磁性微球。
6.权利要求1-5任一项所述方法制备得到的磁性微球在核酸和/或蛋白质分离纯化中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述应用是将所述磁性微球与待分离核酸样本接触,经磁分离,即可实现核酸分离纯化。
8.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述应用是将所述磁性微球与待分离蛋白质样本接触,经磁分离,即可实现蛋白质分离纯化。
9.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述待分离核酸样本为大肠杆菌的基因组DNA。
10.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述待分离蛋白质样本为BSA。
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