CN115960172A - 一种用于肉鸡免疫调节的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于肉鸡免疫调节的多肽及其应用，所提供的多肽具有抗菌和调节肉鸡免疫力的效果，而且不会对养殖肉鸡的肝脏造成损伤，可用做饲料添加剂来使用。所提供的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明提供的从肉鸡的肝脏组织中分离获得的多肽，该多肽具有广谱的抑菌效果。而且，高浓度使用时并不会使肉鸡产生明显的应激反应，可以用作肉鸡的饲料添加剂来使用。

Description

一种用于肉鸡免疫调节的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物制品制备应用技术领域，具体涉及一种用于肉鸡免疫调节的多肽及其应用。

背景技术

肉鸡是农业养殖生产中较为普遍的养殖项目，具有地域分布广、规模大、数量多等特点，是我国肉类供应的重要途径。在肉鸡养殖中，我国积累了丰富的实践经验，一定程度上保障了肉类制品的供应。但是，由于肉鸡养殖环境较为复杂、病害种类多、发生风险高，一定程度上影响了肉鸡养殖的经济效益和肉制品供应。我国肉鸡商用品种主要包括白羽肉鸡、黄羽肉鸡和小型白羽肉鸡等养殖品种，但上述商品肉鸡普遍存在抗病力差的缺点，导致养殖疾病经常影响肉鸡养殖的经济效益和肉制品供应。因此，为了有效预防和控制肉鸡疾病，除了需要认真研究肉鸡养殖各阶段的常见疾病类型和症状表现，掌握肉鸡各阶段疾病防控知识和技能外，还要在养殖饲料或添加剂上进行研究，提供能够有效提高肉鸡抗逆性，且不会对肉鸡造成严重应激反应的添加剂。

抗菌肽是从生物体内组织和细胞中分离的，具有免疫作用的多肽，其可以与病毒或细菌表面带电荷的成分相结合，进而破坏细胞膜结构或胞内大分子而扰乱细胞的正常功能并导致细菌死亡，从而达到抗菌效果。但外源的抗菌肽会使动物本身产生应激反应，不利于动物的生长，因此，筛选动物自身来源的抗菌肽更有利于健康养殖的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于肉鸡免疫调节的多肽及其应用，所提供的多肽具有抗菌和调节肉鸡免疫力的效果，而且不会对养殖肉鸡的肝脏造成损伤，可用做饲料添加剂来使用。

本发明一个方面提供一种用于肉鸡免疫调节的多肽Ggabp，其氨基酸序列为SEQID NO:1(SVISESVAVGDASVS)，

本发明再一个方面还提供多肽Ggabp的衍生多肽，是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽上取代、缺失、添加一个或几个氨基，且具有相同或近似活性的多肽；

本发明再一个方面还保护一种偶联多肽，是在上述的多肽Ggabp或其衍生多肽的5′端或3′端连接有用于增强其效果的分子，例如类泛素蛋白修饰分子SUMO(smallubiquitin-like modifier，SUMO)；

本发明再一个方面提供一种重组表达上述多肽Ggabp的方法，是将所述的多肽与SUMO进行偶联后，在芽孢杆菌或酵母菌中进行表达。

本发明还提供上述的多肽Ggabp的一种用途，是在作为肉鸡饲料添加剂的用途。

本发明再一个方面还提供一种肉鸡饲料，其中添加有上述的多肽，或用于重组表达上述多肽的菌株。

本发明提供一种从肉鸡的肝脏组织中分离获得的多肽，该多肽具有广谱的抑菌效果。而且，高浓度使用时并不会使肉鸡产生明显的应激反应，可以用作肉鸡的饲料添加剂来使用。

附图说明

图1：p3组多肽的色谱图；

图2：p3组多肽进一步纯化后的色谱图；

图3：对巴氏杆菌pmAUQ抑菌圈实验结果图，其中多肽浓度为2μg/ml，A：多肽Ggabp；B：抗菌肽LLv；C：阴性对照PBS。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：多肽的分离和纯化

1、肉鸡肝脏组织蛋白多肽的分离

对沙门氏杆菌感染后存活的7～9周龄鸡的肝脏组织用生理盐水进行匀浆，然后在4℃条件下12000g离心30min。将上清液分别用截留分子量为5kDa、2kDa和1k Da、500Da的滤膜进行超滤，分别获得截留液和过滤液。将分子量大于5kDa(p1)、5kDa-2kDa(p2)、2kDa-1kDa(p3)、1k Da-500 Da(p4)和小于500Da(p5)的蛋白溶液进行抗菌性检测，确定抗菌效果最佳的蛋白溶液组，具体步骤如下：

1)制备试验菌液

选用大肠杆菌作为试验菌株，将在固体LB培养基中划线培养的大肠杆菌进行培养，挑单菌落于含有30ml液体LB培养基的培养瓶中，在37℃培养8-12h。将培养后的菌液测OD600吸光度值，然后将菌液稀释成浓度为5×10⁶CFU/mL，分别取98μl加入到95孔板的各个培养孔中。

2)不同分子量的蛋白溶液的抗菌效果检测

将蛋白溶液进行定量(Bradford Protein Content Assay Kit，AKPR015，BOXBIO)后，用LB溶液分别稀释浓度为20μg/ml。分别取不同分子量的蛋白液各5μl加入到培养孔中，使每个孔的溶液体积为100μl。然后在37℃振荡培养24h后，用酶标仪在600nm处测量菌液浓度。结果表明分子量为1k Da-2k Da的p3组就有最高的抑菌效果。

2、p3组多肽溶液的纯化

将抗菌效果最好的分子量为1k Da-2k Da的p3组多肽加入到GEHitrap SP HP阳离子交换色谱柱中，用乙酸钠缓冲液平衡柱子，然后用Tris-HCl(pH值为7.2)以0.5mL/min的流速洗脱，收集洗脱组分并在214nm处监测。结果显示p3组多肽中存在六个主要的多肽峰(图1)。

对六个多肽峰再次进行抗菌效果检测，结果显示第二个峰的抗菌效果最好，命名为Ggabp多肽。

将Ggabp多肽的洗脱液在填充有Sephadex G-15的凝胶过滤色谱柱(25mm×500mm)上进一步纯化；用蒸馏水以1.0mL/min的流速进行洗脱纯化(图2)。

将收集的产物运用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步纯化后，纯化产物进行冻干；再使用LC/MSD Trap XCT系统(Agilent Technologies)对RP-HPLC纯化后多肽进行LC-MS/MS分析。光谱以正离子反射器模式记录，质量/电荷(m/z)范围200-1000。通过BioTools(version3.0，Bruker Daltonics lnc.，Karlsdorf-Neuthard，Germany)处理MS/MS光谱，确定2号峰的多肽的氨基酸序列为SVISESVAVGDASVS。利用固相合成法，按照氨基酸序列进行合成，得到了合成多肽Ggabp。

实施例2：Ggabp多肽的最小抑菌浓度及对肉鸡来源的巴氏杆菌pmAUQ株的抑菌效果

检测Ggabp多肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪副伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)，具体步骤如下：

分贝将三种菌在固体LB培养基中进行划线培养复苏，然后将过夜培养的细菌挑单菌落于含有30ml液体LB培养基的三角培养瓶中，置于摇床37℃培养10h。将培养后的菌液在OD600的条件下测其吸光度值，用LB液体培养基调节菌液浓度，使吸光值其处于0.6-0.8之间；然后将菌液稀释成浓度为1×10⁶CFU/mL，依次取90μl加入到培养孔中备用。

将合成的合成多肽Ggabp溶于生理盐水中制成母液，按照微量稀释测定的方法，使培养板的培养孔，从第1孔至第10孔的终浓度分别276μg/ml,138μg/ml,68μg/ml,34μg/ml,17μg/ml,8.5μg/ml,4.2μg/ml,2.1μg/ml,1.05μg/ml,0.52μg/ml；

将培养板在37℃振荡培养12h后，观察并用酶标仪在600nm处测量吸光值，以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度(MIC)。利用菌液和LB培养基分别用来做阳性和阴性对照，各自代表抑菌率为0和100％。同时使用氨基酸序列为LLGDFFKKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVWKTEK的抗菌肽LLv作为参照。

结果表明，多肽Ggabp对三种菌株都具有显著的抑制活性，其最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)在0.52μg/ml-2.1μg/ml之间，其中对于金黄色葡萄球菌的MIC为0.52μg/ml，对于大肠杆菌的MIC为0.52μg/ml，而对于猪副伤寒沙门氏菌的MIC为2.1μg/ml。

检测多肽Ggabp对本实验室筛选的病鸡来源的巴氏杆菌pmAUQ株进行牛津杯实验，结果表明Ggabp对巴氏杆菌pmAUQ株的抑制效果明显好于LLv抗菌肽。

实施例3：Ggabp多肽作为肉鸡饲料添加剂的安全性检测

1、溶血活性检测

考虑到血红细胞的溶血活性是检测分子对真核细胞毒性的一种常用的指标，本实施例验证Ggabp多肽是否具有细胞毒性，具体的方法包括如下的步骤：

1)用灭菌注射器吸取3.8％枸橼酸钠溶液(枸橼酸钠溶液的体积为抽血量的1/5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加入两倍体积的灭菌生理盐水，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球。如此将红细胞洗涤三次，用灭菌生理盐水配成5％鸡红细胞悬液。

2)将5％鸡红细胞悬液100μl加入96孔板中，再加入PBS系列稀释的抗菌肽100μl，使各孔中Ggabp多肽的浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL和0.78μg/mL。并设立0.2％ Triton X-100的阳性对照孔，PBS溶液的阴性对照孔。

将加入5％鸡红细胞悬液和各浓度Ggabp多肽的培养板在37℃孵育2h后，3000rpm离心10min，从各孔中吸取100μl上清，在550nm波长条件下测定OD吸光值。

其中溶血百分比＝[(实验孔OD值-阴性孔OD值)/(阳性孔OD值-阴性孔OD值)]×100。

结果表明在100μg/mL浓度下，Ggabp多肽对鸡红细胞也无溶血活性，表明对肉鸡是一种无毒性的多肽。

2、Ggabp多肽对肉鸡的应激水平检测

将Ggabp多肽作为饲料添加剂添加到正大公司的肉鸡饲料中，在申请人在烟台的养殖厂进行养殖。实验分三个组进行，其中阴性对照组为不添加饲料添加剂的肉鸡饲料，Ggabp多肽组是在饲料中添加浓度为100μg/kg饲料的Ggabp多肽，LLv多肽组是在饲料中添加浓度为100μg/kg饲料的LLv多肽。每组选用十只同一遗传背景，体重相似的15-17日龄的肉鸡进行养殖，从而尽可能减少个体差异造成的影响。

具体的养殖条件如下：

养殖期间温度为25±1℃,湿度控制在50-55％，饲养面积保为每平方米10只；光照时间为22小时，照明灯泡为15W。每日投喂的饲料粮为每只鸡150g；共养殖20天。

在养殖20天后，采用鸡翅静脉采血，分离血清后进行免疫因子IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量的检测，并进行谷胱甘肽过氧化物酶活力(GSH-PX)和糖皮质醇激素(GC)含量的检测。

采用酶联免疫法在酶标分析仪上测定血清中IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量，测定结果表明Ggabp多肽组和LLv多肽组的实验肉鸡的血液中免疫相关因子的含量，相比于对照组显著提高。而Ggabp多肽组和LLv多肽组的IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量并没有明显的区别，表明Ggabp多肽和LLv多肽都具有提高鸡免疫力的功效。

使用谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)检测试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司)和皮质醇检测试剂盒(深圳市豪地华拓生物科技有限公司)检测谷胱甘肽过氧化物酶活力(GSH-PX)和糖皮质醇激素(GC)含量。结果表明，与对照组相比，LLv多肽组中的谷胱甘肽过氧化物酶活力和糖皮质醇激素含量明显提高，而Ggabp多肽组相比于对照组，GSH-PX和GC含量虽然有提高，但显著低于LLv多肽组(表1)。表明作为自体来源的多肽，Ggabp再有效提高免疫力的情况下，并不会使养殖的鸡产生严重的应激反应。

表1：谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX和糖皮质醇激素GC含量表

正是由于Ggabp组多肽不会使养殖的鸡产生严重的应激反应，该实验组的肉鸡的终末体重与对照组接近，而LLv多肽组的终末体重明显偏低，表明该多肽虽然具有提高养殖鸡免疫力的效果，但也会抑制肉鸡的生长。

本发明所提供的Ggabp多肽可与SUMO进行偶联后，在饲料领域中常用的芽孢杆菌或酵母菌中进行表达，重组表达蛋白或重组菌株可直接作为添加剂添加到饲料中来使用。

Claims (10)

1.一种用于肉鸡免疫调节的多肽，其特征在于，所述的多肽包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽，

2)在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽上取代、缺失、添加一个或几个氨基，由1)所衍生的多肽。

2.一种偶联多肽，其特征在于，所述的偶联多肽是在权利要求1所述的多肽的5′端或3′端连接有用于增强其效果的分子。

3.如权利要求2所述的偶联多肽，其特征在于，所述的分子为类泛素蛋白修饰分子SUMO。

4.一种重组表达权利要求1所述的多肽的方法，其特征在于，所述的方法是将权利要求1所述的多肽与SUMO进行偶联后，在宿主菌中进行表达。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌为芽孢杆菌或酵母菌。

6.权利要求1所述的多肽在作为肉鸡饲料添加剂中的应用。

7.权利要求2所述的偶联多肽在作为肉鸡饲料添加剂中的应用。

8.一种肉鸡饲料，其特征在于，所述饲料中添加有权利要求1所述的多肽。

9.如权利要求8所述的肉鸡饲料，其特征在于，所述的饲料中添加有用于重组表达权利要求1所述的多肽的重组菌株。

10.如权利要求8或9所述的肉鸡饲料，其特征在于，所述的饲料中添加权利要求2所述的偶联多肽。

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