CN115950994A - 用于孕早期诊断胎儿先天性心脏病的外周血代谢标志物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了代谢标志物的用途，其特征在于：上述代谢标志物包括I类标志物和II类标志物；上述I类标志物选自如下标志物A‑C中的至少一种；A.烟酰胺单核苷酸；B.维甲酸；C.胆碱；上述II类标志物选自如下标志物D和E中的至少一种：D.衣康酸；E.乳清酸；上述用途为：用于制备先天性心脏病的诊断工具。

Description

用于孕早期诊断胎儿先天性心脏病的外周血代谢标志物

技术领域

本发明涉及诊断工具，具体地，涉及一种能用于制备先天性心脏病诊断工具的代谢标志物。

背景技术

先天性心脏病又称先心病，是指在胎儿发育时期心血管发育异常或在出生后动脉导管未能自然闭合所导致的心血管结构或功能异常。先心病是最常见的一类出生缺陷，约影响1％的活产婴儿，并逐渐成为儿童死亡的主要原因。尽管病因学研究发现遗传，病毒感染，母体暴露等可能是先心病发生的潜在原因，但其具体发病机制仍不清楚。大多数类型的先心病可以通过手术恢复至正常心脏功能，但严重的心脏结构异常可能会影响患者的生存和生活质量。因此，胎儿先心病的早期产前诊断对于改善胎儿命运是非常重要的。

目前，临床诊断先心病的策略主要依赖于妊娠中期的胎儿超声心电图。然而，受限于设备质量、操作者技术、产妇肥胖等多方面因素，产前超声检查仅能检测到大约40％患先心病的胎儿，大多数的先心病在婴儿出生后才被发现。胎儿通过胎盘与母亲进行物质交换，若在孕早期母体血液中发现与先天性心脏病相关的可能的生物标志物，则会大大提高胎儿先心病筛查的准确性，这将对产前诊断做出巨大贡献。

发明内容

本发明旨在克服上述缺陷，利用代谢组学技术阐明孕早期母体血清中多种代谢物丰度变化可以作为预测胎儿先天性心脏病的分子靶标，为提高先心病的早期诊断效率提供新的可能。

本发明提供了代谢标志物的用途，其特征在于：

上述代谢标志物包括I类标志物和II类标志物；

上述I类标志物选自如下标志物A-C中的至少一种；

A.烟酰胺单核苷酸；

B.维甲酸；

C.胆碱；

上述II类标志物选自如下标志物D和E中的至少一种：

D.衣康酸；

E.乳清酸；

上述用途为：用于制备先天性心脏病的诊断工具。

进一步地，本发明提供的代谢标志物的用途，其特征还在于：

上述诊断工具，通过比较先天性心脏病患者和健康受试者的离体样本中的I类标志物的含量来区分两者；

其中，上述先天性心脏病患者的I类标志物水平显著高于健康受试者。

进一步地，本发明提供的代谢标志物的用途，其特征还在于：

上述诊断工具，通过比较先天性心脏病患者和健康受试者的离体样本中的II类标志物的含量来区分两者；

其中，上述先天性心脏病患者的II类标志物水平显著低于健康受试者。

进一步地，本发明提供的代谢标志物的用途，其特征还在于：

上述诊断工具，通过比较先天性心脏病患者和健康受试者的离体样本中的I类标志物和II类标志物的含量来区分两者；

上述先天性心脏病患者的I类标志物需满足较健康受试者上调，且II类标志物需满足较健康受试者下调。

进一步地，本发明提供的代谢标志物的用途，其特征还在于：

上述代谢标志物来源于离体血清。

进一步地，本发明提供的代谢标志物的用途，其特征还在于：

上述诊断工具包括仪器设备、系统平台、芯片、诊断试剂、试剂盒或试纸。

进一步地，本发明提供的代谢标志物的用途，其特征还在于：

上述试剂盒，包括能够与上述代谢标志物发生特异性结合的化合物；

以及

能够用于检测上述代谢标志物与上述化合物形成的复合物的试剂。

进一步地，本发明提供的代谢标志物的用途，其特征还在于：

上述仪器设备或系统平台包括：测量模块和分析模块；

其中，上述测量模块：测量待测离体样本中的目标代谢标志物的含量；

上述分析模块，逐一比较目标代谢标志物，在受试人离体样本与健康样本之间的含量差异，并根据结果预测该受试人是否符合先天性心脏病患者的标准。

进一步地，本发明提供的代谢标志物的用途，其特征还在于：

上述测量模块，基于LC-MS检测技术实现；

待测样本需经预处理；

上述预处理的方法为：

S1.提前将甲醇在不高于-50℃的温度下冷藏过夜；

S2.取孕早期离体血清样品，在不高于10℃，8000-12000rpm的条件下离心1-10分钟，吸取上清液转移至离心管中；

S3.向S2的上清液中加入预冷好的甲醇，将样品混合物置于不高于-50℃的温度下孵育10-30分钟；

S4.取出S3的样品，在不高于10℃，1000-8000rpm的条件下离心5-20min，将上清液转移至离心管中；

S5.向S4的沉淀中加入预冷的甲醇后涡旋1-5分钟，在不高于10℃，1000-8000rpm的条件下离心5-20min，取上清并与S4中所得上清混合；

S6.将S5的上清液等分三份，真空干燥样品后不高于-50℃存储；

S7.将S6的样品重悬于水/乙腈的混合溶剂中，取测试量进行检测。

进一步地，本发明提供的代谢标志物的用途，其特征还在于：

上述检测的检测参数为：

色谱法洗脱：

上述色谱法洗脱的过程中使用400μL/min的4.6mm内径×10cm美国沃特世AmideXBridge column及缓冲液A，缓冲液B；

洗脱梯度为：0-5分钟内从85％缓冲液B运行到42％缓冲液B；5-16分钟从42％缓冲液B到0％缓冲液B；0％缓冲液B保持16-24分钟；24-25分钟从0％缓冲液B至85％缓冲液B；85％缓冲液B保持7分钟；

质谱条件为：

所有离子均通过306个选择性反应监测转变以正和负模式切换方式获得；

在正或负模式下，ESI电压分别为+4900V和-4500V。

附图说明

图1.本实施例提供的代谢物检测过程中，五种发生显著变化的代谢物的结果图。

具体实施方式

1.检测方法

1.1参与者

孕早期母体血清样本取自67名怀有先心病胎儿的孕妇和37名怀有正常胎儿的孕妇。通过胎儿超声心动图和/或产后手术和/或尸检，胎儿被诊断为患有先心病(排除有其他先天缺陷)。

1.2试剂

所有用于质谱分析的化学品，包括HPLC级甲醇，水和乙腈，以及LC-MS级乙酸铵和氢氧化铵均从Fisher Chemical订购。

缓冲液A：20mM醋酸铵和20mM氢氧化铵的5％乙腈水溶液(PH9.2)

缓冲液B：乙腈

1.3实验过程

1)提前将80％甲醇在-80℃下冷藏过夜。

2)取孕早期血清样品4℃12000rpm离心5分钟，吸取50μL上清液转移至干净的15mL离心管中。

3)向50μL血清样品中加入4.0mL预冷好的80％甲醇，将样品混合物置于-80℃条件下孵育20分钟。

4)取出样品，4℃4000g离心10分钟。将上清液转移至另一干净的15mL离心管中。

5)向沉淀中加入预冷的500μL 80％甲醇后涡旋1分钟，然后4℃4000g离心10分钟。取上清并与4)中所得上清混合，最后大约得到4.5mL上清液。

6)将上清液等分三份，转移至三个1.5mL微量离心管中。使用SpeedVac真空干燥仪干燥样品后可储存于-80℃冰箱。

7)将样品重悬于50μL水：乙腈(v:v＝50:50)溶剂中，取5μL样品上机。质谱仪器使用6500QTRAP质谱仪(AB SCIEX)耦合HPLC系统(岛津)。代谢物通过亲水相互作用色谱法(HILIC)洗脱，过程中使用400μL/min的4.6mm内径×10cm美国沃特世Amide XBridgecolumn及缓冲液A，缓冲液B。洗脱梯度为：0-5分钟内从85％缓冲液B运行到42％缓冲液B；5-16分钟从42％缓冲液B到0％缓冲液B；0％缓冲液B保持16-24分钟；24-25分钟从0％缓冲液B至85％缓冲液B；85％缓冲液B保持7分钟。所有离子均通过306个选择性反应监测转变以正和负模式切换方式获得。在正或负模式下，ESI电压分别为+4900V和-4500V。所有代谢物数据均由MultiQuant软件(ABSCIEX)处理。

2.结果

本发明利用非靶向代谢组学分析67名怀有先心病胎儿的孕妇和37名怀有正常胎儿的孕妇的血清样本，如图1所述，发现有三种代谢物在怀有先心病胎儿的孕妇血清中显著上调(P<0.001)，分别是烟酰胺单核苷酸(nicotinamide ribotide)、维甲酸(retinoicacid)、胆碱(choline)；有两种代谢物在怀有先心病胎儿的孕妇血清中显著下调(P<0.001)，分别是衣康酸(itaconic acid)、乳清酸(orotate)。

3.结论

先天性心脏病是最常见的出生缺陷，常用的产前筛查手段不能有效地诊断出患先天性心脏病的胎儿，母体外周血中代谢物丰度的变化为先天性心脏病的诊断提供新的思路。

基于上述研究结果表明，孕早期母体血清中衣康酸、乳清酸浓度下调及烟酰胺单核苷酸、维甲酸、胆碱的浓度上调，可以作为胎儿先天性心脏病的潜在生物标志物，辅助胎儿超声心动图检查。

如：基于上述研究，在本实施例中提出了一种试剂盒，其包括能够与代谢标志物发生特异性结合的化合物；以及能够用于检测代谢标志物与化合物形成的复合物的试剂。

基于上述研究，在本实施例中还提出了一种仪器设备或系统平台，其包括测量模块和分析模块；

其中，该测量模块：基于上述LC-MS方法测量待测离体样本中的目标代谢标志物的含量；

该分析模块，逐一比较目标代谢标志物，在受试人离体样本与健康样本之间的含量差异，并根据结果预测该受试人是否符合先天性心脏病患者的标准。

即、烟酰胺单核苷酸(nicotinamide ribotide)、维甲酸(retinoic acid)、胆碱(choline)是否较标准值(即、健康人群的数值)上调；衣康酸(itaconic acid)、乳清酸(orotate)是否较标准值(即、健康人群的数值)下调。

这些新的生物标志物的应用可以提高妊娠早期的检出率，从而有可能提供最佳的围产期和围手术期管理。

Claims (10)

1.代谢标志物的用途，其特征在于：

所述代谢标志物包括I类标志物和II类标志物；

所述I类标志物选自如下标志物A-C中的至少一种；

A.烟酰胺单核苷酸；

B.维甲酸；

C.胆碱；

所述II类标志物选自如下标志物D和E中的至少一种：

D.衣康酸；

E.乳清酸；

所述用途为：用于制备先天性心脏病的诊断工具。

2.如权利要求1所述的代谢标志物的用途，其特征在于：

所述诊断工具，通过比较先天性心脏病患者和健康受试者的离体样本中的I类标志物的含量来区分两者；

其中，所述先天性心脏病患者的I类标志物水平显著高于健康受试者。

3.如权利要求1所述的代谢标志物的用途，其特征在于：

所述诊断工具，通过比较先天性心脏病患者和健康受试者的离体样本中的II类标志物的含量来区分两者；

其中，所述先天性心脏病患者的II类标志物水平显著低于健康受试者。

4.如权利要求1所述的代谢标志物的用途，其特征在于：

所述诊断工具，通过比较先天性心脏病患者和健康受试者的离体样本中的I类标志物和II类标志物的含量来区分两者；

所述先天性心脏病患者的I类标志物需满足较健康受试者上调，且II类标志物需满足较健康受试者下调。

5.如权利要求1所述的代谢标志物的用途，其特征在于：

所述代谢标志物来源于离体血清。

6.如权利要求1所述的代谢标志物的用途，其特征在于：

所述诊断工具包括仪器设备、系统平台、芯片、诊断试剂、试剂盒或试纸。

7.如权利要求1所述的代谢标志物的用途，其特征在于：

所述试剂盒，包括能够与所述代谢标志物发生特异性结合的化合物；

以及

能够用于检测所述代谢标志物与所述化合物形成的复合物的试剂。

8.如权利要求1所述的代谢标志物的用途，其特征在于：

所述仪器设备或系统平台包括：测量模块和分析模块；

其中，所述测量模块：测量待测离体样本中的目标代谢标志物的含量；

所述分析模块，逐一比较目标代谢标志物，在受试人离体样本与健康样本之间的含量差异，并根据结果预测该受试人是否符合先天性心脏病患者的标准。

9.如权利要求8所述的代谢标志物的用途，其特征在于：

所述测量模块，基于LC-MS检测技术实现；

待测样本需经预处理；

所述预处理的方法为：

S1.提前将甲醇在不高于-50℃的温度下冷藏过夜；

S2.取孕早期离体血清样品，在不高于10℃，8000-12000rpm的条件下离心1-10分钟，吸取上清液转移至离心管中；

S3.向S2的上清液中加入预冷好的甲醇，将样品混合物置于不高于-50℃的温度下孵育10-30分钟；

S4.取出S3的样品，在不高于10℃，1000-8000rpm的条件下离心5-20min，将上清液转移至离心管中；

S5.向S4的沉淀中加入预冷的甲醇后涡旋1-5分钟，在不高于10℃，1000-8000rpm的条件下离心5-20min，取上清并与S4中所得上清混合；

S6.将S5的上清液等分三份，真空干燥样品后不高于-50℃存储；

S7.将S6的样品重悬于水/乙腈的混合溶剂中，取测试量进行检测。

10.如权利要求8所述的代谢标志物的用途，其特征在于：

所述检测的检测参数为：

色谱法洗脱：

所述色谱法洗脱的过程中使用400μL/min的4.6mm内径×10cm美国沃特世AmideXBridge column及缓冲液A，缓冲液B；

缓冲液A：含醋酸铵和氢氧化铵的乙腈水溶液；

缓冲液B：乙腈；

洗脱梯度为：0-5分钟内从85％缓冲液B运行到42％缓冲液B；5-16分钟从42％缓冲液B到0％缓冲液B；0％缓冲液B保持16-24分钟；24-25分钟从0％缓冲液B至85％缓冲液B；85％缓冲液B保持7分钟；

质谱条件为：

所有离子均通过306个选择性反应监测转变以正和负模式切换方式获得；

在正或负模式下，ESI电压分别为+4900V和-4500V。

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