CN115948277A - 一株兼具低温耐受与生防拮抗特性的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株兼具低温耐受与生防拮抗特性的植物乳杆菌及其应用，属于生物技术领域。本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2022858，保藏日期为2022年6月10日。该植物乳杆菌分离于大连地区海参人工养殖水体环境，在15‑25℃环境下兼具良好低温耐受与生防拮抗特性，发酵24‑48h有效活菌数≥1010cfu/mL。本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022及发酵产物可高效拮抗多种水产养殖致病菌，水产应用价值及优势明显。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株兼具低温耐受与生防拮抗特性的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
植物乳杆菌是一种广泛存在于发酵食品及动物肠道中的兼性厌氧细菌，适宜生长温度在30～35℃，最适pH6.5左右。植物乳杆菌作为一种乳酸菌，可以合成多种有益物质，如细菌素、胞外多糖等，具有调节免疫、维持菌群平衡、提高免疫力等功能，是一种极具有研究价值的益生菌。不仅被广泛应用在食品生产领域，而且它在饲料生产和医学领域均起着不可替代的作用。细菌素是其自身的次级代谢产物，具有无毒副作用、可被蛋白水解酶分解、维持肠道稳定的特性，在养殖领域具备作为抗生素替代物的使用价值。
目前植物乳杆菌在养殖业中主要添加在饲料原料中生产发酵饲料，适用温度在30-35℃，而海参养殖环境温度为15-25℃，且植物乳杆菌发酵菌液中，具有抑菌拮抗作用的细菌素主要来源于发酵中后期，因而兼顾生防抑菌作用与低温下菌株活性两方面特性筛选优良植物乳杆菌菌株尤为重要。例如，中国专利CN114107120A中公开了一种秸秆发酵垫料用微生物菌剂及其在生猪健康养殖中的应用，乳酸菌发酵体系包含植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌，在温度33-37℃、pH4.0-5.5、转速150-200rpm、发酵36-48h，乳酸菌活菌数CFU为6.0×1010。中国专利CN113403227A中公开了一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Kmust-Li01，按体积比2％-5％的接种量将植物乳杆菌种子液接种到MRS液体培养基中，在35-38℃、pH6.2-6.4、搅拌、溶氧量小于1％条件下高密度发酵24-48h，有效活菌数达到1011。
现普遍使用的植物乳杆菌在水产养殖低温环境下，由于温度降低，导致植物乳杆菌活性下降，发酵速率减慢，次级代谢产物含量降低，抑制病原菌效果减弱。因此植物乳杆菌具有良好的低温耐受特性，更有利于提高水产养殖产能、饲料利用与致病菌生防拮抗效果。
发明内容
为解决现有植物乳杆菌菌种在海参等低温水产养殖环境中(15-25℃)，由于低温耐受性不足，造成细胞生长速率缓慢、有效活菌数低，进而影响生长与生防效果的实际问题，本发明提供了一株兼具低温耐受与生防拮抗特性的植物乳杆菌，并提供了该菌株在低温环境中的水产致病菌拮抗应用。
本发明一方面提供了一株植物乳杆菌，分离于大连地区海参人工养殖水体环境，该菌株分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022，该菌株已于2022年6月10日在中国典型培养物保藏中心保藏(地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编430072)，保藏编号为：CCTCC M 2022858。
进一步地，所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022在低温环境下的水产致病菌拮抗应用。
上述应用中，所述的水产养殖致病菌，包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌或哈维氏弧菌等。
进一步地，所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022生防应用方法，即添加使用1％-10％发酵菌剂，所述发酵菌剂的有效成分为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022及其发酵产物，或植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CTB2022发酵菌液。
进一步地，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022发酵温度为15-25℃，24-48h内发酵菌液有效活菌数≥1010cfu/mL
进一步地，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022发酵菌液制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌条件下将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022保藏液稀释涂布于MRS固体平板培养基上，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
(2)在无菌条件下将上述步骤(1)中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，150-200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
(3)在无菌条件下，将上述步骤(2)中液体种子液按体积比5％～10％接入液体发酵培养基中，15-25℃，150-200rpm，通入氮气发酵培养24-48h，得到发酵菌液，所得发酵菌液中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022有效活菌数≥1010cfu/mL。
进一步地，所述种子培养基或发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温80 1mL/L，1000mL蒸馏水，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20min。
本发明所提供的兼具低温耐受与生防拮抗特性的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CTB2022，在15-25℃培养温度下具有良好的低温耐受性，生长快速且有效活菌数高，液体发酵24-48h即可实现有效活菌≥1010cfu/mL，较对照组植物乳杆菌发酵有效活菌数提高了4-16.7倍。此外，本发明植物乳杆菌CTB2022及其发酵产物、或植物乳杆菌CTB2022发酵菌液对低温水产养殖致病菌如溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌和哈维氏弧菌等具有高效的生防拮抗作用。本发明中植物乳杆菌CTB2022具有的潜在应用优势在于，能够显著提高低温环境下益生菌活力及其生物效价、提升低温水产养殖产能。本发明提供的兼具低温耐受与生防拮抗特性的植物乳杆菌及其发酵菌剂，一方面丰富了优势菌种资源与种类，拓宽了水产养殖制剂产品的功能化发展，另一方面很好地兼顾了菌株低温耐受及生防拮抗特性，为绿色水产养殖发展提供了新思路。
附图说明
图1植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022菌落形态。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明内容，但不应该理解为对本发明的限制。若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022的分离
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022，分离于大连地区海参人工养殖水体环境，对采集样品进行梯度稀释涂布后分离获得的。具体操作步骤为：
a.采集海参养殖区不同深度水体及底部污泥，采样环境温度为15-25℃，采样量为1mL或1g，加至含有99mL无菌水的三角瓶中，于15-25℃，200rpm条件下振荡培养120min。
b.用移液枪进行梯度稀释(10-3、10-4、10-5)，取100μL稀释液涂布于MRS固体平板培养基上，每个稀释浓度涂布15个培养皿，5个一组分别于15℃、20℃、25℃培养箱中培养24-48h天。每天观察形成的乳酸菌菌落生长情况，挑取培养时间内最早形成的乳酸菌单菌落分别进行稀释划线分离培养，转接到MRS固体培养基上划线纯化与保藏。
所述MRS固体培养基组成为：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温80 1mL/L、琼脂15g/L，1000mL蒸馏水，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20min。
其中，在按不同稀释浓度所涂布的15个培养皿上，培养24-48h即出现生长最快的乳酸菌单菌落，纯化保藏后将该菌株命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022。
实施例2：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022的鉴定
菌株形态特征如下：在培养温度30℃条件下，在MRS固体培养基上培养24-48h后，形成菌落呈乳白色，表面光滑，凸起明显，边缘整齐，不透明，有光泽。根据《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》判断菌株CTB2022具有典型乳酸菌属形态特征。
提取上述分离并纯化得到的菌株基因组DNA，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行16s rDNA测序分析(测序结果详见序列表)，通过NCBI数据库中BLAST同源比对，选取同源性较高的植物乳杆菌及其菌株序列，用ClustalX1.81软件进行多序列比对分析，同时结合菌落形态特征，初步鉴定分离纯化菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，已于2022年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CTB2022，以下叙述或简称植物乳杆菌CTB2022或CTB2022，保藏编号为CCTCC M2022858，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
实施例3：25℃条件下植物乳杆菌发酵菌液的制备及其有效活菌数的测定
1.实验组植物乳杆菌CTB2022发酵菌液的制备
利用实施例2中获得的植物乳杆菌CTB2022，作为实验组，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.在无菌条件下将植物乳杆菌CTB2022保藏液稀释涂布于MRS固体平板培养基上，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，25℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养24-48h，即得到植物乳杆菌CTB2022发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温80 1mL/L，1000mL蒸馏水，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20min。
2.对照组植物乳杆菌ACCC11016发酵液制备(对照例1)
对照组植物乳杆菌ACCC11016(以下叙述或简称ACCC11016)，购买于辽宁省微生物菌种保藏中心，其最适培养温度为30-37℃，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养对照实验，具体操作步骤如下：
a.在无菌条件下将植物乳杆菌ACCC11016稀释涂布于MRS固体平板培养基上，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，25℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养24-48h，即得到植物乳杆菌ACCC11016发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温80 1mL/L，1000mL蒸馏水，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20min。
3.植物乳杆菌有效活菌数的测定
在无菌条件下，分别取上述步骤c中24h与48h培养后的植物乳杆菌CTB2022发酵菌液和植物乳杆菌ACCC11016发酵菌液，用移液枪进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3…10-8、10-9、10-10)，取100μL稀释液涂布于MRS琼脂培养基平板上，每个稀释浓度涂布5个培养皿，25℃培养箱中培养2-3天后进行平板菌落计数，结果取平均值，如表1所示。
表1植物乳杆菌发酵菌液(25℃)有效活菌数
结果表明，实验组植物乳杆菌CTB2022在25℃条件下，具有更高的发酵有效活菌数水平，发酵24h-48h即可实现有效活菌数≥1010cfu/mL。如在25℃条件下，发酵至24h，对照组植物乳杆菌ACCC11016发酵有效活菌数为1×1010cfu/mL，实验组植物乳杆菌CTB2022发酵有效活菌数为4×1010cfu/mL，较对照组提高了4倍；如在25℃条件下，发酵至48h，对照组植物乳杆菌ACCC11016发酵有效活菌数为5×1010cfu/mL，实验组植物乳杆菌CTB2022发酵有效活菌数为3×1011cfu/mL，较对照组提高了6倍。可见，本发明的植物乳杆菌CTB2022，在25℃低温环境下，可保持良好的生理代谢活性，具有更强的低温耐受特性。
实施例4：20℃条件下植物乳杆菌发酵菌液的制备及其有效活菌数的测定
1.实验组植物乳杆菌CTB2022发酵菌液的制备
利用实施例2中获得的植物乳杆菌CTB2022，作为实验组，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.在无菌条件下将植物乳杆菌CTB2022保藏液稀释涂布于MRS固体平板培养基上，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，20℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养24-48h，即得到植物乳杆菌CTB2022发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温80 1mL/L，1000mL蒸馏水，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20min。
2.对照组植物乳杆菌ACCC11016发酵液制备(对照例2)
利照组植物乳杆菌ACCC11016(以下叙述或简称ACCC11016)，购买于辽宁省微生物菌种保藏中心，其最适培养温度为30-37℃，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养对照实验，具体操作步骤如下：
a.在无菌条件下将植物乳杆菌ACCC11016稀释涂布于MRS固体平板培养基上，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，20℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养24-48h，即得到植物乳杆菌ACCC11016发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温80 1mL/L，1000mL蒸馏水，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20min。
3.植物乳杆菌有效活菌数的测定
在无菌条件下，分别取上述步骤c中24h与48h培养后的植物乳杆菌CTB2022发酵菌液和植物乳杆菌ACCC11016发酵菌液，用移液枪进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3…10-8、10-9、10-10)，取100μL稀释液涂布于MRS琼脂培养基平板上，每个稀释浓度涂布5个培养皿，20℃培养箱中培养2-3天后进行平板菌落计数，结果取平均值，如表2所示。
表2植物乳杆菌发酵菌液(20℃)有效活菌数
结果表明，实验组植物乳杆菌CTB2022在20℃条件下，具有更高的发酵有效活菌数水平，发酵24h-48h即可实现有效活菌数≥1010cfu/mL。如在25℃条件下，发酵至24h，对照组植物乳杆菌ACCC11016发酵有效活菌数为3.5×109cfu/mL，实验组植物乳杆菌CTB2022发酵有效活菌数为2×1010cfu/mL，较对照组提高了5.7倍；如在20℃条件下，发酵至48h，对照组植物乳杆菌ACCC11016发酵有效活菌数为1×1010cfu/mL，实验组植物乳杆菌CTB2022发酵有效活菌数为1×1011cfu/mL，较对照组提高了10倍。可见，本发明的植物乳杆菌CTB2022，在20℃低温环境下，可保持良好的生理代谢活性，具有更强的低温耐受特性。
实施例5：15℃条件下植物乳杆菌发酵菌液的制备及其有效活菌数的测定
1.植物乳杆菌CTB2022发酵菌液的制备
利用实施例2中获得的植物乳杆菌CTB2022，作为实验组，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.在无菌条件下将植物乳杆菌CTB2022保藏液稀释涂布于MRS固体平板培养基上，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，15℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养24-48h，即得到植物乳杆菌CTB2022发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温80 1mL/L，1000mL蒸馏水，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20min。
2.对照组植物乳杆菌ACCC11016发酵液制备(对照例3)
利照组植物乳杆菌ACCC11016(以下叙述或简称ACCC11016)，购买于辽宁省微生物菌种保藏中心，其最适培养温度为30-37℃，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养对照实验，具体操作步骤如下：
a.在无菌条件下将植物乳杆菌ACCC11016稀释涂布于MRS固体平板培养基上，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，15℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养24-48h，即得到植物乳杆菌ACCC11016发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温80 1mL/L，1000mL蒸馏水，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20min。
3.植物乳杆菌有效活菌数的测定
在无菌条件下，分别取上述步骤c中24h与48h培养后的植物乳杆菌CTB2022发酵菌液和植物乳杆菌ACCC11016发酵菌液，用移液枪进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3…10-8、10-9、10-10)，取100μL稀释液涂布于MRS琼脂培养基平板上，每个稀释浓度涂布5个培养皿，15℃培养箱中培养2-3天后进行平板菌落计数，结果取平均值，如表3所示。
表3植物乳杆菌发酵菌液(15℃)有效活菌数
结果表明，实验组植物乳杆菌CTB2022在15℃条件下，具有更高的发酵有效活菌数水平，发酵24h-48h即可实现有效活菌数≥1010cfu/mL。如在25℃条件下，发酵至24h，对照组植物乳杆菌ACCC11016发酵有效活菌数为8×108cfu/mL，实验组植物乳杆菌CTB2022发酵有效活菌数为1×1010cfu/mL，较对照组提高了12.5倍；如在15℃条件下，发酵至48h，对照组植物乳杆菌ACCC11016发酵有效活菌数为1.5×109cfu/mL，实验组植物乳杆菌CTB2022发酵有效活菌数为2.5×1010cfu/mL，较对照组提高了16.7倍。可见，本发明的植物乳杆菌CTB2022，在15℃低温环境下，可保持良好的生理代谢活性，具有更强的低温耐受特性。
实施例6：植物乳杆菌发酵产物(10％作用浓度)拮抗海参致病菌
利用高速离心机将实施例3中获得的植物乳杆菌CTB2022发酵菌液与植物乳杆菌ACCC11016发酵菌液分别在25℃，8000rpm条件下离心10min，获得离心后的上清液，无菌条件下将上清液透过0.22μm滤膜，置于4℃环境冷藏备用。在100mL2216E液体培养基摇瓶中按10％比例分别添加植物乳杆菌CTB2022上清液和植物乳杆菌ACCC11016上清液，随后分别接入1mL新鲜的溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌以及哈维氏弧菌保藏液，于28℃，200rpm条件下发酵培养12～24h，设置一组空白对照组，记录菌株OD600的变化。抑菌率计算公式：
每个处理设置三组平行实验，结果取平均值。植物乳杆菌CTB2022为实验组，植物乳杆菌ACCC11016为对照组，相关拮抗作用效果即抑菌率，如下表4所示。
表4植物乳杆菌CTB2022与ACCC11016的25℃发酵产物对海参致病菌拮抗作用
结果表明，利用实验组植物乳杆菌CTB2022的发酵产物，在10％作用浓度下，即在2216E培养基中按照10％(v/v)添加CTB2022的发酵产物，培养12h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌效果显著，抑菌率分别达到98.6％、98.9％、98.6％、99.1％、98.5％，而利用对照组植物乳杆菌ACCC11016的发酵产物，在10％(v/v)相同作用浓度下，培养12h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌率仅分别为80.4％、76.7％、88.3％、84.5％、79.7％。继续培养至24h，实验组植物乳杆菌CTB2022的发酵产物(10％)抑菌率仍保持在97.5％、96.3％、96.7％、98.3％、97.5％，相反，对照组植物乳杆菌ACCC11016的发酵产物(10％)抑菌率大幅降至60.0％、52.3％、63.4％、61.2％、60.4％。可见，本发明的植物乳杆菌CTB2022，在25℃低温环境下，使用其10％发酵产物对海参致病菌具有很好的生防拮抗作用。
实施例7：植物乳杆菌发酵产物(1％作用浓度)拮抗海参致病菌
利用高速离心机将实施例5中获得的植物乳杆菌CTB2022发酵菌液与植物乳杆菌ACCC11016发酵菌液分别在15℃，8000rpm条件下离心10min，获得离心后的上清液，无菌条件下将上清液透过0.22μm滤膜，置于4℃环境冷藏备用。在100mL2216E液体培养基摇瓶中按1％比例分别添加植物乳杆菌CTB2022上清液和植物乳杆菌ACCC11016上清液，随后分别接入1mL新鲜的溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌以及哈维氏弧菌保藏液，于28℃，200rpm条件下发酵培养12～24h，设置一组空白对照组，记录菌株OD600的变化。抑菌率计算公式：
每个处理设置三组平行实验，结果取平均值。植物乳杆菌CTB2022为实验组，植物乳杆菌ACCC11016为对照组，相关拮抗作用效果即抑菌率，如下表5所示。
表5植物乳杆菌CTB2022与ACCC11016的15℃发酵产物对海参致病菌拮抗作用
结果表明，利用实验组植物乳杆菌CTB2022的发酵产物，在1％作用浓度下，即在2216E培养基中按照1％(v/v)添加CTB2022的发酵产物，培养12h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌效果显著，抑菌率分别达到75.7％、72.3％、80.2％、79.9％、77.5％，继续培养至24h，实验组植物乳杆菌CTB2022的发酵产物(1％)抑菌率大幅度降低至53.7％、48.6％、57.8％、55.3％、50.9％。然而，利用对照组植物乳杆菌ACCC11016的发酵产物，在1％(v/v)相同作用浓度下，培养12h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌率均＜5％，没有抑制海参致病菌作用。可见，本发明的植物乳杆菌CTB2022，在15℃低温环境下，使用其1％发酵产物对海参致病菌同样具有很好的生防拮抗作用。
所述的序列表如下：
CAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAA
Claims (7)
1.一株兼具低温耐受与生防拮抗特性的植物乳杆菌，分离于大连地区海参人工养殖水体环境，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022，保藏编号为：CCTCC M2022858。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌，在低温环境下的水产致病菌拮抗应用。
3.根据权利要求2所述的水产致病菌拮抗应用，其特征在于：所述的致病菌，包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌或哈维氏弧菌。
4.根据权利要求2或3所述的水产致病菌拮抗应用，其特征在于：添加使用1％-10％发酵菌剂，所述发酵菌剂的有效成分为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022及其发酵产物，或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022发酵菌液。
5.根据权利要求4所述的水产致病菌拮抗应用，其特征在于，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022发酵温度为15-25℃，24-48h内发酵菌液有效活菌数≥1010cfu/mL。
6.根据权利要求4或5所述的水产致病菌拮抗应用,其特征在于：所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022的发酵菌液制备，包括以下步骤：
(1)无菌条件下将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022保藏液稀释涂布于MRS固体平板培养基上，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
(2)在无菌条件下将上述步骤(1)中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，150-200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
(3)在无菌条件下，将上述步骤(2)中液体种子液按体积比5％～10％接入液体发酵培养基中，15-25℃，150-200rpm，通入氮气发酵培养24-48h，得到发酵菌液，所得发酵菌液中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CTB2022有效活菌数≥1010cfu/mL。
7.根据权利要求6所述的水产致病菌拮抗应用，其特征在于，所述种子培养基或发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温80 1mL/L，1000mL蒸馏水，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20min。
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| CN202211115321.7A CN115948277A (zh) | 2022-09-14 | 2022-09-14 | 一株兼具低温耐受与生防拮抗特性的植物乳杆菌及其应用 |
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| CN114874934A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-08-09 | 宁波大学 | 一种植物乳杆菌及其在制备对虾养殖用益生菌制剂中的应用 |
-
2022
- 2022-09-14 CN CN202211115321.7A patent/CN115948277A/zh active Pending
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MARGOLIS DE AROCHA, MARLENE ADELA: "Inhibition of pathogenic Vibrio spp. in shellfish harvested in Venezuela", 《 THE UNIVERSITY OF NEBRASKA - LINCOLN》, pages 303 - 172 * |
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