CN114874934A

CN114874934A - 一种植物乳杆菌及其在制备对虾养殖用益生菌制剂中的应用

Info

Publication number: CN114874934A
Application number: CN202210437494.4A
Authority: CN
Inventors: 杜杨; 陈炯; 苗亮
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2022-04-25
Filing date: 2022-04-25
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2042-04-25
Also published as: CN114874934B

Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌及其在制备对虾养殖用益生菌制剂中的应用，特点是该菌株为Ep‑M17菌株，分类命名为植物乳杆菌，于2022年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24559，植物乳杆菌具有在制备对虾养殖用益生菌制剂、副溶血弧菌抑制剂、溶藻弧菌抑制剂、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、杀香鱼假单胞菌抑制剂、类志贺邻单胞菌抑制剂、嗜水气单胞菌抑制剂和维氏气单胞菌抑制剂中的应用，优点是对迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、杀香鱼假单胞菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌病原均具有抑制作用。

Description

一种植物乳杆菌及其在制备对虾养殖用益生菌制剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种植物乳杆菌菌株，尤其是涉及一种植物乳杆菌及其在制备对虾养殖用益生菌制剂中的应用。

背景技术

水产养殖在我国渔业中占有重要地位。集约化、高密度养殖已成为水产养殖业的发展趋势，但同时导致水产动物疾病频发，极大地制约了我国水产养殖产业的发展。由于水产动物疾病爆发迅速、传染力强、影响因素多等原因，水产疾病还是以预防为主，对急性疾病的治疗通常只能采用抗生素和化学药物进行控制。而长期、大量使用抗生素不仅造成水产动物耐药性增加，也给环境造成严重污染，使得病原菌产生变异，耐药菌株增多，给水产动物病害的防治带来巨大隐患。近年来，绿色、环保的生物防治方法得到大力提倡，微生态制剂也叫活菌制剂(Bigone)或生菌剂，是一类能促进正常微生物群生长繁殖的及抑制致病菌生长繁殖的活细菌，其在水产动物疾病防治方面表现出了很好的效果，不仅可以调节动物肠道菌群，增强动物肠道免疫力，而且可以改善水环境，是未来解决水产动物病害以及安全性问题的有效途径。

乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌，在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，是重要的微生态制剂。乳酸菌通过粘附于动物肠壁，竞争排斥有害菌的生存空间，从而调节胃肠道正常菌群；通过生长繁殖，产生有机酸、特殊酶系和表面成分等物质，降低肠道的pH及Eh值，抑制有害菌的生长，从而维持微生态平衡，改善胃肠道功能，提高宿主食物消化率和生物效价，补充必要的营养物质，促进组织发育和动物生长；通过控制细菌内毒素含量，抑制肠道内腐败菌生长，改善内部微环境，增强机体免疫机能等。因此，乳酸菌作为饲料添加剂被广泛应用到水产养殖中。但市场上乳酸菌制剂种类和来源繁杂，有效成分难以证实，其在水产动物肠道作为优势菌的调节作用并不理想。而乳酸菌本身是大多数水产动物肠道内的有益菌，只是在不同动物间乳酸菌种类存在一定的差异，而从水产动物肠道分离的乳酸菌可以更好的适应肠道环境并形成优势菌群。近年来，肠道疾病给对虾养殖业造成严重经济损失，因此利用其它水产动物肠道的乳酸菌防治对虾肠道疾病的具有重大意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、杀香鱼假单胞菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌病原均具有抑制作用的植物乳杆菌及其在制备对虾养殖用益生菌制剂中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种植物乳杆菌，该菌株为Ep-M17菌株，分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），于2022年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24559。

上述植物乳杆菌在制备对虾养殖用益生菌制剂中的应用。

上述植物乳杆菌在制备副溶血弧菌抑制剂中的应用。

上述植物乳杆菌在制备溶藻弧菌抑制剂中的应用。

上述植物乳杆菌在制备迟缓爱德华氏菌抑制剂中的应用。

上述植物乳杆菌在制备金黄色葡萄球菌抑制剂中的应用。

上述植物乳杆菌在制备杀香鱼假单胞菌抑制剂中的应用。

上述植物乳杆菌在制备类志贺邻单胞菌抑制剂中的应用。

上述植物乳杆菌在制备嗜水气单胞菌抑制剂中的应用。

上述植物乳杆菌在制备维氏气单胞菌抑制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种植物乳杆菌及其在制备对虾养殖用益生菌制剂中的应用，该菌株从珍珠龙胆肠道中分离得到，此菌生长旺盛，培养10 h时其OD₆₀₀值达到1.2左右；该菌株还具有广谱抑菌活性，对迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、杀香鱼假单胞菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌等均有较强的抑制作用；使用该菌株作为对虾养殖的益生菌添加剂，可以提高对虾的生长和成活率，并能提高对虾对副溶血弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌等多种典型病原菌的抗病能力；因此植物乳杆菌Ep-M17在水产动物养殖，尤其是对虾新型绿色饲料添加剂开发和抗生素代替品等研究上具有重大的经济价值。

上述植物乳杆菌为Ep-M17菌株，分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），于2022年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 24559，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为植物乳杆菌Ep-M17对迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、杀香鱼假单胞菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的抑制作用；

图2为植物乳杆菌Ep-M17随培养时间的pH值变化和OD600值变化；

图3为根据植物乳杆菌Ep-M17菌株16s DNA基因序列构建的聚类树；

图4为添加植物乳杆菌Ep-M17菌株的对虾的增重率、饲料转化率和成活率的影响；

图5为投喂植物乳杆菌Ep-M17的对虾在用副溶血性弧菌、溶藻弧菌和迟缓爱德华氏菌攻毒后的相对保护率。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

1、目标菌株的分离纯化

在无菌超净台上，用灭菌牙签挑取活珍珠龙胆肠道装入灭菌的2 ml EP管中，加入高压灭菌的1.5 ml PBS缓冲液（pH=7.0），剧烈震荡30 s后置于28℃、180 rpm摇床震荡培养30 min；取适量培养后的培养液进行梯度稀释（10^-2、10^-3、10^-4、10^-5），均匀涂布于MRS固体培养基上，37℃倒置培养2-3天；用无菌接种环挑取单菌落，继续在MRS平板上纯化培养2次，而后加入菌液体积的20%无菌甘油保种于-80℃。

2、本发明菌株的抑菌作用

将分离的得到的菌株活化后，用MRS培养基于28℃培养过夜，然后测定OD₆₀₀并将其OD值调节到0.6-0.8待用。指示菌迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda Et1）、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus E1) 、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus VL3)、杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、类志贺邻单胞菌 (Plesiomons shigelloides)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)分别用LB或MB培养基于28℃培养过夜，与含1.0wt% 琼脂（Agar）的LB或MB培养基混合，使其OD₆₀₀值为0.1，混合均匀后倒入一次性培养皿制作含病原菌的培养基平板，在超净台上风干30 min后，取5 μL待测菌液滴入平板上，待菌液风干后，于30℃培养24 h后测定抑菌圈大小。由图1可知，菌株植物乳杆菌Ep-M17对8种病原菌均具有较好的抑制作用。

3、目标菌株形态分析

该菌株为革兰氏阳性菌，在MRS琼脂培养基上37℃培养24 h，菌落为乳白色，菌体卵圆形。如图2所示，该菌株在MRS肉汤培养基中培养6 h时，OD₆₀₀值显著增加，9 h时达到稳定，且此时培养基pH值显著下降，说明该菌株可以生产酸性物质。

4、目标菌株鉴定

16S rDNA 基因的PCR扩增：将筛选出的菌株Ep-M17用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用引物为：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系为(20μl)：模板2 μl， 2×Taq PCR MasterMix (Cat. No. G497，abm，Canada)10 μl，引物27F0.5 μl，引物1492R 0.5 μl，ddH₂O 7 μl。

PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR在1.5wt%琼脂糖凝胶上进行电泳，其条带为1500 bp 左右，然后割胶回收纯化后送杭州有康生物技术公司测序，测得16S rDNA序列为1469 bp，基因序列如SEQID No.3所示。将该序列提交到EZBioCloud比对后发现，该菌株与模式菌株Lactobacillus plantarum Heal19菌株的相似度高达100%，因此将该NBU1菌株命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Ep-M17，于2022年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 24559，该菌株的16S rDNA聚类树见附图3。

上述MRS培养基配方为：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.8～7.0；MRS固体培养基为在MRS肉汤培养基中加入MRS培养基质量18%的琼脂。所用的LB培养基配方为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.0；所用的MB培养基配方为商用的2216E培养基（Difco ™Marine Broth2216）：称取37.4 g溶于1000 ml蒸馏水中，调节pH为7.6。

具体实施例二

本实验是在浙江省海洋水产养殖研究所清江养殖基地进行，共设置10个400L（直径1m，高度0.8m）凡纳滨对虾养殖生态实验桶，其中5个桶用作对照，5个用作植物乳杆菌Ep-M17添加组。统一投放虾苗，每个实验桶放苗200尾（平均体长为6.05 ± 0.45 cm，平均体重为4.02 ± 0.54 g），养殖密度为500尾/m³，放苗7天后正式开始实验。菌剂活化与添加：取保藏编号为CGMCC No. 24559的保存菌株在MRS固体培养基上划板活化，待单菌落长出后，挑取单菌落于10 mL无菌MRS肉汤培养基中培养过夜，然后以2%（V/V）的比例转接于新鲜的MRS肉汤培养基中培养24 h，此时菌液浓度达1×10⁹ - 5×10⁹ CFU/mL，且pH稳定在4.0-4.1之间，得到植物乳杆菌Ep-M17菌液。从500 mL新鲜的培养液离心收集菌体后，用无菌海水洗涤菌体3次，然后用无菌海水重悬菌体，喷洒到基础商品饲料，使得最终饲料中的菌体浓度为5×10⁸CFU/g，在室温放置5h，将晾干的饲料保存在4℃。

对照组投喂基础饲料。每天投喂量占对虾体重的4 %，每天投喂3次，分别是早上7:00、中午12:00和下午6:00。持续投喂45天。饲养实验结束后测定对虾的产量、饲料转化率和成活率，如图4所示，使用植物乳杆菌Ep-M17组的单位产量比对照组增加18.5%，饲料转化率比对照组降低9.3%，成活率比对照组增加了17.8%，说明添加Ep-M17可以促进对虾生长，提高成活率。

饲养实验结束后进一步用致病菌副溶血性弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌进行攻毒实验。从每个养殖池随机挑选30尾对虾饲养到100L的水桶中，分别将培养的新鲜副溶血性弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌加入其中，根据不同病原菌的半致死量不同，使得3种细菌终浓度分别达到1×10⁷CFU、2×10⁷CFU、0.5×10⁷CFU，连续攻毒7天，每天记录水槽中对虾的死亡情况，攻毒结束后，通过公式（RPS= （对照组死亡率-试验组死亡率）/对照组死亡率*100%）计算其最终相对保护率。如图5所示，投喂Ep-M17的对虾在用副溶血性弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌攻毒后获得相对保护率分别为76.9%、83.3%和80%，说明添加Ep-M17可以提高对虾的抗病能力。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 一种植物乳杆菌及其在制备对虾养殖用益生菌制剂中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 27F（5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' ）

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 1492R（5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）

<400> 2

<210> 3

<211> 1496

<212> DNA

<213>菌株Ep-M17 16S rDNA基因序列（GTCCACCTTAGGCGGCTGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCAGAATCAAAAATCTTT）

<400> 3

Claims

1.一种植物乳杆菌，其特征在于该菌株为Ep-M17菌株，分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），于2022年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24559。

2.一种权利要求1所述的植物乳杆菌在制备对虾养殖用益生菌制剂中的应用。

3.一种权利要求1所述的植物乳杆菌在制备副溶血弧菌抑制剂中的应用。

4.一种权利要求1所述的植物乳杆菌在制备溶藻弧菌抑制剂中的应用。

5.一种权利要求1所述的植物乳杆菌在制备迟缓爱德华氏菌抑制剂中的应用。

6.一种权利要求1所述的植物乳杆菌在制备金黄色葡萄球菌抑制剂中的应用。

7.一种权利要求1所述的植物乳杆菌在制备杀香鱼假单胞菌抑制剂中的应用。

8.一种权利要求1所述的植物乳杆菌在制备类志贺邻单胞菌抑制剂中的应用。

9.一种权利要求1所述的植物乳杆菌在制备嗜水气单胞菌抑制剂中的应用。

10.一种权利要求1所述的植物乳杆菌在制备维氏气单胞菌抑制剂中的应用。