CN115947770A - 新的百蕊草苷化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供新的百蕊草苷化合物及其应用。该百蕊草苷化合物，具有如下结构式：
其中，R为：
百蕊草苷A；或者
Description
技术领域
本发明涉及中草药活性成分提取与应用技术领域，具体涉及新的百蕊草苷化合物及其应用。
背景技术
中药百蕊草(Thesium chinense Turcz)为檀香科(Santalaceae)百蕊草属(Thesium)百蕊草的干燥全草。百蕊草始记载于《本草图经》：味辛，微苦；性寒；归脾，肾经；有清热，利湿，解毒之功；主治风热感冒，中暑，肺痈，乳蛾，淋巴结结核，乳痛，疖肿，淋证，黄疽，腰痛，遗精。化学研究表明，百蕊草中含有多种类型的化学成分，包括黄酮、生物碱、萜类、芳香类、脂肪酸等等，其中，隶属于黄酮类化合物的百蕊草素I和百蕊草素I I已经有报道，但还有很多化学成分目前尚未可知。现代药理研究表明，百蕊草具有很好的抑菌作用，临床上多用作治疗急性乳腺炎、肺炎、上呼吸道感染等病症，其中的百蕊草素II对金黄色葡萄球菌、卡他球菌、伤寒杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌均有抑制作用；而百蕊草素I则对金黄色葡萄球菌、卡他球菌、痢疾杆菌有抑制作用。鉴于目前对于百蕊草化学成分的提取以及药理活性研究并不全面，因而有必要进行深入探究，以扩大其在临床上的应用。
发明内容
有鉴于此，为了进一步研究百蕊草中的活性成分，本发明从百蕊草中提取出新的百蕊草苷化合物，并探究其可能的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种新的百蕊草苷化合物，具有如下结构式：
其中，R为：
(百蕊草苷A)或者
(百蕊草苷B)。
上述百蕊草苷A和百蕊草苷B是从百蕊草中提取获得。
进一步地，所述百蕊草苷A和百蕊草苷B的提取方法包括如下步骤：
步骤1，将百蕊草依次采用不同浓度梯度的乙醇-水溶液浸提，合并所有浸提液；
步骤2，将浸提液浓缩至原体积一半，依次采用非极性溶剂和极性溶剂各萃取多次，合并极性溶剂萃取的有机相；
步骤3，将有机相采用多重色谱分离，即得。
进一步地，所述步骤1中，将百蕊草依次采用体积浓度95％乙醇-水溶液浸提1次、85％乙醇-水溶液浸提1次、70％乙醇-水溶液浸提2次。
进一步地，所述步骤2中，依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取水相多次，最后合并并保留正丁醇萃取有机相。
进一步地，所述步骤3中，先采用200～300目的硅胶色谱柱，以二氯甲烷、甲醇、水按照体积比为12.25∶3∶0.1混合液为洗脱液对有机相进行等度洗脱，获得4个流分(Fr.1～4)；Fr.2和Fr.3的流分再分别采用MCI色谱柱，依次以体积浓度10％、40％、70％、100％的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，分别获得10个流分(Fr.2-1～Fr.2-10)和7个流分(Fr.3-1～Fr.3-7)；Fr.2-7和Fr.3-7的流分进一步分别采用Sephadex LH-20凝胶色谱柱，依次以体积浓度10％、40％、70％、100％的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，分别获得3个流分(Fr.2-7-1～Fr.2-7-3)和5个流分(Fr.3-7-1～Fr.3-7-5)；Fr.2-7-1的流分最后采用硅胶色谱柱纯化，以二氯甲烷和甲醇按照体积比7∶1混合液为洗脱液进行等度洗脱，获得化合物1；以及Fr.3-7-4的流分采用ODS色谱柱纯化，依次以体积浓度为5％、25％、50％、75％、100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，获得化合物2。
第二方面，本发明提供上述百蕊草苷A或者含有上述百蕊草苷A的组合物在制备抗金黄色葡萄球菌药物上的应用。
第三方面，本发明提供上述百蕊草苷B或者含有上述百蕊草苷B的组合物在制备抗金黄色葡萄球菌药物上的应用。
第四方面，本发明提供包含上述百蕊草苷A和上述百蕊草苷B的组合物在制备抗金黄色葡萄球菌药物上的应用。
第五方面，本发明提供一种抗金黄色葡萄球菌药物，所述药物至少含有上述百蕊草苷A和/或上述百蕊草双糖苷B。
进一步地，所述百蕊草苷A在抗金黄色葡萄球菌药物中的最小抑菌浓度为250μM/mL，最小杀菌浓度为500μM/mL。
进一步地，所述百蕊草苷B在抗金黄色葡萄球菌药物中的最小抑菌浓度为1000μM/mL，最小杀菌浓度为2000μM/mL。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明提取出2种新的百蕊草苷A和百蕊草苷B化合物，这两个新化合物均可以改变金黄色葡萄球菌的细胞膜通透性，引起生物大分子泄露以及菌液电导率的增加，从而对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌抑菌效果，有望单独或者组合开发成抗金黄色葡萄球菌药物用于临床。
附图说明
图1为本发明实施例2中化合物1对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。
图2为本发明实施例2中化合物2对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。
图3为本发明实施例2中化合物1对金黄色葡萄球菌电导率的影响。
图4为本发明实施例2中化合物2对金黄色葡萄球菌电导率的影响。
图5为本发明实施例2中化合物1对金黄色葡萄球菌胞外核酸相对含量的影响。
图6为本发明实施例2中化合物2对金黄色葡萄球菌胞外核酸相对含量的影响。
图7为本发明实施例2中化合物1对金黄色葡萄球菌胞外可溶性蛋白的影响。
图8为本发明实施例2中化合物2对金黄色葡萄球菌胞外可溶性蛋白的影响。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种百蕊草苷A(化合物1)和百蕊草苷B(化合物2)的提取纯化方法，该百蕊草苷A和百蕊草苷B具有如下结构式：
化合物1和化合物2的提取纯化方法具体如下：
步骤1，将百蕊草干燥全草(500g)，依次用料液比1∶4的95％、85％、70％、70％乙醇-水溶液各提取一次，合并提取液，减压浓缩至原体积一半。
步骤2，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取水相四次(油水体积比为2∶1)，得石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相。
步骤3，将正丁醇萃取相经硅胶色谱柱(200～300目)，以二氯甲烷、甲醇、水按照体积比为12.25∶3∶0.1混合液为洗脱液对油相进行等度洗脱，得4个流分(Fr.1～4)；
步骤4，对Fr.2和Fr.23进行MCI色谱柱，依次以体积浓度10％、40％、70％、100％的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，分别得10个流分(Fr.2-1～Fr.2-10)和7个流分(Fr.3-1～Fr.3-7)；
步骤5，分别对Fr.2-7和Fr.3-7进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，依次以体积浓度10％、40％、70％、100％的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，分别得3个流分(Fr.2-7-1～Fr.2-7-3)和5个流分(Fr.3-7-1～Fr.3-7-5)；
步骤6，对Fr.2-7-1经硅胶色谱柱纯化，以二氯甲烷和甲醇按照体积比7∶1混合液为洗脱液进行等度洗脱，得化合物1(98.0mg)(纯度大于99％，得率为每克全草分离0.196毫克化合物1)，对Fr.3-7-4经ODS色谱柱纯化，依次以体积浓度为5％、25％、50％、75％、100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，得化合物2(66mg)(纯度大于99％，得率为每克全草分离0.132毫克化合物2。
对化合物1和化合物2进行相关结构鉴定，具体结果如下：
化合物1：
1)白色无定形粉末；
2)红外IR(KBr)Vmaxcm-1：3371，3008，2963，2964，2881，1409，1371，1231，1161，1077,895；紫外UV(DMSO)λmaxnm：252.5(0.05)，279.5(0.10)；
3)1H NMR(DMSO，600MHz)和13C NMR(DMSO，150Hz)数据见表1；
4)质谱ESIMS(-)m/z：423[M-H]-，高分辨质谱HR-ESIMS(-)m/z：423.1872(M-H)-，C18H32O11)。
化合物2：
1)白色无定形粉末；
2)红外IR(KBr)Vmaxcm-1：3456，3390，2927，2882，1608，1512，1436，1382,1374,1274,1233，1134,1077,885,825,804,565；
3)紫外UV(MeOH)λmaxnm：202.5(0.60)，217.5(0.28)，279.0(0.10)；
4)1H NMR(CD3OD，600MHz)和13C NMR(CD3OD，150MHz)数据见表2；
5)质谱ESIMS(-)m/z：477[M-H]-，高分辨质谱HR-ESIMS(-)m/z：477.1614[M-H]-，C20H30O13)。
表1化合物1的1H(600MHz)和13C(150MHz)NMR数据(δppm)in DMSO
表2化合物2的1H(600MHz)和13C(150MHz)NMR数据(δppm)in CD3OD
实施例2
本实施例验证了实施例1获得的2种百蕊草苷A和B的抗菌功效，具体实验如下：
1.实验方法
1.1溶液配制
菌悬液的制备：将金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、化脓性链球菌在平板培养基上进行划线培养，放置在37℃恒温培养箱中培养24h，恢复菌种活力。将复苏后的细菌挑取单菌落于液体培养基中，200r/min，37℃培养18h，即制得菌悬液。将菌悬液调成0.5麦氏后，稀释至106CFU/mL备用。
抗菌溶液的制备：取化合物1和2，分别溶于DMSO中，使药液母液浓度为50mM/mL，记作药物1和药物2。
1.2最小抑菌浓度(MIC)实验
将准备好的浓度为106CFU/mL的菌悬液，分别与不同浓度梯度的药物1、药物2混合均匀，使药物终浓度为4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.25μM/mL，并在37℃条件下培养24h，以液体澄清透明、无菌体生长所对应的药物浓度为MIC。取前一步实验中各孔澄清上清液100μL，于平板培养基上涂布均匀，并置于37℃条件下培养24h，以平板上菌落计数低于5的药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)。分别以MHB液体培养基和4μg/mL氨苄西林(AMP)为阴性和阳性对照。
1.3抑菌生长曲线
将准备好的浓度为106CFU/mL的菌悬液，分别加入不同浓度的药物1和2，使其最终浓度分别为0.5MIC和MIC，以等体积MHB液体培养基作为空白对照组。置37℃、200r/min恒温摇床中培养，分别于0、2、4、8、12和24h取样，测定OD600nm值。通过培养时间和OD600nm值绘制生长曲线，检测药物1和2对金黄色葡萄球菌生长曲线的变化。结果如图1和2所示。
1.4菌液电导率的测定
将药物1和2加入制备好的细菌悬液，使之成0.5MIC和1MIC浓度，MHB液体培养基作空白对照，37℃、200r/min恒温摇床中培养，在0、2、4、6、8和10小时取样，5000r/min离心10min后取上清液测定菌液的电导率。结果如图3和4所示。
1.5细胞内生物大分子的测定
用无菌PBS制备浓度为106CFU/mL的菌悬液，将细菌悬浮液与不同质量浓度药物1和2溶液混合，使其最终浓度为1MIC，以相同体积的无菌PBS缓冲液作空白对照，并在37℃恒温培养箱孵育。分别于0、2、4、6、8和12h取样，并在4℃、5000r/min条件下离心10min，取上清液，用超微紫外分光光度计测定上清液OD260nm和OD280nm，其中OD260nm是为了表征化合物1及化合物2对胞外核酸相对含量的影响，OD280nm是为了表征化合物1及化合物2对胞外可溶性蛋白的影响。结果如图5～8所示。
1.6统计分析
所有试验均进行3次生物学重复，采用GraphPadPrism6.0软件对数据进行统计分析。
2.实验结果及分析：
2.1抗菌活性测定
通过二倍比稀释法分别测定了两种新化合物对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、化脓性链球菌的抗菌活性，所测各组中，阴性对照均显示细菌长势良好，排除溶剂对实验的干扰，空白对照无细菌生长。
实验结果为：药物1和药物2对金黄色葡萄球菌有较好抑制效果，对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、化脓性链球菌无明显抑菌作用。
两药物对各菌株的MIC及MBC如表1所示，药物1和药物2处于较高浓度时均可抑制金黄色葡萄球菌的生长(4000、2000、1000μM/mL)，处于较低浓度时药物无明显抑菌效果，药物1的MIC为250μM/mL，MBC为500μM/mL，药物2的MIC为1000μM/mL，MBC为2000μM/mL。
表1
注：NA＝不适用。
2.2抗菌机制研究
2.2.1细菌生长曲线测定
从图1及图2可以看出，药物1和药物2作用后的金葡菌与对照组相比生长显著减缓，处于MIC和0.5MIC浓度时均可抑制金黄色葡萄球菌的生长。金黄色葡萄球菌在2h进入对数生长期，看图可知，随着质量浓度的升高，药物对金黄色葡萄球菌的抑制效果更为明显。当溶液中药物浓度为MIC时，对细菌的生长具有明显的抑制效果。
2.2.2菌液电导率的测定
从图3和图4可以看出，在金黄色葡萄球菌菌液中加入药物后，菌液的导电率显著增加，各试验组的导电率均显著高于空白对照组。菌液导电率在12h内均呈现增长，提示有可能是药物改变了金黄色葡萄球菌的细胞膜通透性，使胞内电解质外渗。
2.2.3细胞内生物大分子的测定
图5与图6显示，在金黄色葡萄球菌菌液中分别加入药物1和药物2后，细菌胞外核酸相对量明显高于对照组。提示可能是正常状态下不能透过细胞膜的DNA、RNA等大分子物质在药物作用后，穿过了细胞膜泄漏到培养液中，导致培养液在260nm处的吸光度值增大。
图7和图8显示，菌液中的蛋白质含量显著增加，各试验组的蛋白浓度均显著高于空白对照组。当菌液中药物的浓度为MIC时，胞外蛋白质含量在0～6h内呈快速增长趋势，在6h后总体呈平稳状态。说明药物可以改变细胞膜的通透性，可使胞内的蛋白质通过细胞膜泄漏到细胞外。这一结果于上述药物1和药物2对金黄色葡萄球菌胞外核酸的影响结果相似，进一步说明了这两种药物可以影响细菌的细胞膜通透性，造成细胞内的蛋白质、DNA穿过细胞膜泄漏到胞外。
总结：实验显示，这两个新化合物均对金黄色葡萄球菌具有一定的抗菌活性，对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、化脓性链球菌无明显抑菌效果。药物1对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为250μM/mL，药物2的MIC为1000μM/mL，实验结果显示，两种药物对细菌生长具有抑制作用，此外两种药物均可以改变细菌的细胞膜通透性，引起生物大分子泄露以及菌液电导率的增加，从而起到良好的抗菌效果。因此，这两种化合物有望单独或者组合开发成抗金黄色葡萄球菌药物用于临床。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.百蕊草苷化合物，其特征在于：具有如下结构式：
其中，R为：
百蕊草苷A；或者
百蕊草苷B。
2.根据权利要求1所述的百蕊草苷化合物，其特征在于：所述百蕊草苷A和所述百蕊草苷B的提取方法包括如下步骤：
步骤1，将百蕊草依次采用不同浓度梯度的乙醇-水溶液浸提，合并所有浸提液；
步骤2，将浸提液浓缩至原体积一半，依次采用非极性溶剂和极性溶剂各萃取多次，合并极性溶剂萃取的有机相；
步骤3，将有机相采用多重色谱分离，即得。
3.根据权利要求2所述的百蕊草苷化合物，其特征在于：所述步骤1中，将百蕊草依次采用体积浓度95％乙醇-水溶液浸提1次、85％乙醇-水溶液浸提1次、70％乙醇-水溶液浸提2次。
4.根据权利要求2所述的百蕊草苷化合物，其特征在于：所述步骤2中，依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取水相多次，最后合并并保留正丁醇萃取有机相。
5.根据权利要求2所述的百蕊草苷化合物，其特征在于：所述步骤3中，先采用200～300目的硅胶色谱柱，以二氯甲烷、甲醇、水按照体积比为12.25∶3∶0.1混合液为洗脱液对有机相进行等度洗脱，获得4个流分：Fr.1～4；Fr.2和Fr.3的流分再分别采用MCI色谱柱，依次以体积浓度10％、40％、70％、100％的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，分别获得10个流分：Fr.2-1～Fr.2-10，和7个流分：Fr.3-1～Fr.3-7；Fr.2-7和Fr.3-7的流分进一步分别采用SephadexLH-20凝胶色谱柱，依次以体积浓度10％、40％、70％、100％的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，分别获得3个流分：Fr.2-7-1～Fr.2-7-3，和5个流分：Fr.3-7-1～Fr.3-7-5；Fr.2-7-1的流分最后采用硅胶色谱柱纯化，以二氯甲烷和甲醇按照体积比7∶1混合液为洗脱液进行等度洗脱，获得百蕊草苷A；以及Fr.3-7-4的流分采用ODS色谱柱纯化，依次以体积浓度为5％、25％、50％、75％、100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，获得百蕊草苷B。
6.权利要求1～5任意一项所述的百蕊草苷化合物中的百蕊草苷A或者含有所述百蕊草苷A的组合物在制备抗金黄色葡萄球菌药物上的应用。
7.权利要求1～5任意一项所述的百蕊草苷化合物中的百蕊草苷B或者含有所述百蕊草苷B的组合物在制备抗金黄色葡萄球菌药物上的应用。
8.权利要求1～5任意一项所述的百蕊草苷化合物中的百蕊草苷A和百蕊草苷B的组合物在制备抗金黄色葡萄球菌药物上的应用。
9.一种抗金黄色葡萄球菌药物，其特征在于：所述药物至少含有权利要求1～5任意一项所述的百蕊草苷化合物中的百蕊草苷A和/或权利要求1～5任意一项所述的百蕊草苷化合物中的百蕊草双糖苷B。
10.根据权利要求9所述的一种抗金黄色葡萄球菌药物，其特征在于：所述药物还包括药学上可接受的辅料。
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