CN115927460A - 抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体和猪成纤维细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体和猪成纤维细胞系及其构建方法和应用。本发明将pCAG‑pH11和px330载体用NOTI和SnaBI双酶切，将两个双酶切后的片段进行连接，得到pCAG‑中间载体；将pCAG‑中间载体利用ASCI和SnaBI双酶切，将含有ASFV CP204L、pS273R、B646L和I215L 4个gRNA的基因合成载体与双酶切后的pCAG‑中间载体连接，得到载体pX330‑pH11‑gRNA‑anti‑AFSV，将其转染猪原代成纤维细胞中，得到成功构建的抗ASFV转基因猪成纤维细胞系，其对于ASFV的研究及药物研发具有重要意义。

Description

抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体和猪成纤维细胞系及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体和猪成纤维细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟是(ASF)一种由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪急性、出血性传染病。因其具有病程短、发病率高、死亡率高等特点，该疾病被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物疫病，我国也将非洲猪瘟列为I类动物疫病。为了降低ASF的发生，科研人员致力于对病毒进行基因改造及疫苗的研发，但效果甚微。这严重阻碍了猪养殖业和社会经济发展。

目前，研究人员通过件ASFV的8DR基因删除，但这并没有改变该病毒的毒力。NL(DP71L)和UK(DP96R)这两个基因被认为是ASFV E70毒株中的毒力相关基因，当其被删除后，与亲本病毒相比，也没有降低毒力；以腺病毒为载体的ASFV抗原混合物不能抵抗格鲁吉亚2007/1分离株的入侵。在猪中接种了两种含有ASFV抗原的腺病毒载体混合物，其免疫效果也不具有统计学意义，从而使嵌合重组疫苗研发未取得较大进展。因而亟待提出一种抗非洲猪瘟的新策略，为临床生产应用提供基础保障。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体和猪成纤维细胞系及其构建方法和应用，目的是为了解决目没有有效的手段来降低ASFV的毒力，以及没有有效的疫苗抵抗该病毒的技术问题。

本发明提供第一个方案为抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体，具体技术方案如下：

抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体，包括如下步骤：

S1，将pCAG-pH11载体和px330载体分别用NOTI和SnaBI双酶切后获得线性载体1和线性载体2，所述线性载体1和线性载体2进行连接，获得pCAG-中间载体；

S2，将步骤S1中的pCAG-中间载体经过利用ASCI和SnaBI双酶切，获得线性化pCAG-中间载体；

S3，将步骤S3中的线性化pCAG-中间载体与目的基因合成载体进行连接，获得抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体；所述目的基因合成载体为含有ASFV CP204L、ASFV pS273R、ASFV B646L和ASFV I215L4个gRNA的基因片段，所述ASFV CP204L、ASFV pS273R、ASFVB646L和ASFV I215L 4个gRNA的碱基序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

在某些实施方式中，步骤S1中，所述线性载体1和线性载体2通过同源重组处理方法进行连接；步骤S3中，线性化pCAG-中间载体与目的基因合成载体通过同源重组处理方法进行连接。

本发明还提供了第二个技术方案，即抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体，利用第一个方案所述的方法构建的重组载体，命名为pX330-pH11-gRNA-anti-AFSV。

本发明还提供了第三个技术方案，即抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体的应用，第二个技术方案所述的重组载体，抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体在制备治疗/预防/诊断非洲猪瘟病毒药物中的应用，以及在体外构建抗ASFV大动物模型的应用。

本发明还提供了第四个技术方案，即抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系的构建方法，将第二个技术方案所述的pX330-pH11-gRNA-anti-AFSV、px330辅助质粒混合后，共转染进入猪成纤维细胞，转染后加入培养液令细胞恢复生长，随后加入含有G418的培养基中培养，筛选分离出单克隆，获得抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系。

在某些实施方式中，所述转染方式为电转染，电转染的参数为：0.4cm电击杯，250volt，975μF，细胞数量为5*10⁵-5*10⁶，DNA质量为6μg。

在某些实施方式中，所述G418的浓度为500μg/mL。

本发明还提供了第五个技术方案，即抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系，利用第四个技术方案所述的方法构建的细胞系。

本发明还提供了第六个技术方案，即抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系的应用，基于第五个技术方案所述的细胞系，抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系在制备治疗/预防/诊断非洲猪瘟病毒药物中的应用，以及在体外构建抗ASFV大动物模型的应用。

本发明具有以下有益效果：ASFV CP204L基因编码病毒P30蛋白，该蛋白为病毒颗粒核心骨架蛋白，也是最具免疫原性的蛋白之一，通常在ASFV感染后约2h～4h即可表达，然后在整个感染周期中持续表达。p30的表达表明病毒已经进入细胞并脱壳，病毒基因的早期表达已经开始。阻断该蛋白表达能够抑制病毒颗粒形成。ASFV pS273R基因编码蛋白酶，病毒自身编码众多前体蛋白，均需要pS273R编码的蛋白酶对其进行剪切，使其形成具有不同功能作用的多个成熟蛋白。阻断该蛋白酶表达能够抑制病毒复制成熟。ASFV B646L基因编码病毒p72蛋白，是ASFV的主要结构蛋白，产生于病毒感染后半阶段，约占病毒粒子蛋白的32％，同时也是病毒粒子二十面体线轴的重要部分。阻断该蛋白表达能够抑制病毒颗粒形成。ASFV I215L基因是目前已知的唯一的病毒编码的E2泛素结合酶基因，参与调控宿主泛素蛋白酶体系统，具有抑制宿主蛋白表达的功能。阻断该蛋白表达能够降低病毒感染增殖对宿主细胞的杀伤作用。

本发明提供的pX330-pH11-gRNA-anti-AFSV，其在目的序列(ASFV CP204L、pS273R、B646L和I215L 4个gRNA序列)的上下游各有多个酶切位点，可以将外源基因整合在此处构建转基因表达载体；该载体的真核筛选标记neor，可以通过Cre-loxp系统去除；针对猪pH11位点的CRISPR/Cas9识别序列位于质粒启动子上游，可以通过定点整合的方法将质粒整合入猪转基因安全位点pH11。本发明所构建的抗病转基因猪成纤维细胞系由于对ASFVCP204L、ASFV pS273R、ASFV B646L和ASFV I215L四个基因进行蛋白表达阻断从多维度对ASFV病毒的毒力进行抑制，从而使其抵抗ASFV入侵效率较高，后期可用于构建抗ASFV大动物模型，对于临床生产应用具有极高意义。

附图说明

图1为本发明的设计原理；

图2为px330-pH11质粒的构建；

图3为转基因细胞系鉴定策略；

图4为转基因细胞系鉴定胶图；

图5为转基因细胞系Cas9鉴定胶图；

图6为转基因细胞系4X gRNA鉴定胶图；

图7为免疫荧光实验检测转基因细胞系病毒感染情况；

图8为转基因细胞系病毒病毒感染量统计结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

实施例

本实施例中，猪原代成纤维细胞由北京农业大学赠予，pCAG-pH11质粒、px330质粒均由浙江大学动物科学学院贺津副教授赠予。目的基因合成载体获取方法如下：将目的基因(ASFV CP204L、ASFV pS273R、ASFV B646L和ASFV I215L)序列输入gRNA设计网站，挑选出评分较高的gRNA序列交由擎科生物进行合成。

一、猪原代成纤维细胞培养

1、细胞复苏：将冻存于液氮中的猪原代成纤维细胞取出，快速置于37℃水浴锅中，待细胞冻存管中无结晶后取出，加入适量含20％胎牛血清(FBS；Gibco)的高葡萄糖Dulbecco's Medium Eagle培养基(Gibco,Gaithersburg,MD,USA)，放入37℃细胞培养箱中进行培养。

2、细胞培养：猪原代成纤维细胞需在含有20％胎牛血清的高糖DMEM培养基中生长，培养环境与普通细胞相同。

3、细胞消化：猪原代成纤维细胞生长至80-90％密度时进行细胞消化。具体操作为弃去培养基后用PBS清洗细胞培养皿，弃去PBS后加入适量胰酶进行消化(如太难消化则将细胞培养皿放入细胞培养箱中进行消化)，当细胞在显微镜下开始变圆、变亮即可加入适量培养基终止消化。

4、细胞计数：消化后的细胞吸取1μL进行稀释(稀释比例以细胞数量进行评估，一般而言为10倍或100倍)，稀释后的细胞利用细胞计数板进行计数，随后按照细胞数量进行稀释，使细胞终浓度为1×10⁶/mL。

二、px330-pH11载体的构建

(1)首先将pCAG-pH11质粒载体利用NOTI和SnaBI双酶切，得到一个5.3kb和一个1.3kb的片段，回收5.3kb目的片段；

(2)将px330载体利用NOTI和SnaBI双酶切，得到一个5.3kb和一个3.3kb的片段，回收5.3kb目的片段；

(3)利用同源重组技术将两个5.3kb的片段进行连接，得到pCAG-中间载体；

(4)随后将pCAG-中间载体利用ASCI和SnaBI双酶切，得到一个9.8kb和一个300bp的片段，回收9.8kb目的片段；

(5)然后将含有4个gRNA的基因合成载体(包括4个gRNA和CBH部分启动子，共1.7kb)，其碱基序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，与上述9.8kb目的片段通过同源重组技术进行连接，得到最终载体pX330-pH11-gRNA-anti-AFSV。

三、猪成纤维细胞转染

1、消化下来的猪成纤维细胞进行细胞计数，终浓度为1×10⁶/mL，离心后尽量吸干离心管中的液体；将3μgpX330-pH11-gRNA-anti-AFSV与3μg px330辅助质粒混合在一个新的1.5mL EP管中，分别加入82uL P3 Primary Cell Nucleofector Solution溶液与18uLpmaxGFPTM Vector溶液于混合质粒管中，吸打混匀后加入细胞沉淀中，轻轻混匀，避免产生气泡。将液体转移至电转杯中进行电转，使用仪器为Lonza4D-Nucleaofector，转染参数为DO-113。

2、转染后的细胞按照100-200cells/孔铺于96空板中，24h后进行药筛。

四、基因敲入阳性细胞筛选

由于定点整合载体中携带neo(G418)抗性，若成功插入可以整合到猪的基因组中，因此用含有G418的培养基对阳性细胞进行筛选。依据细胞密度对G418浓度进行调整，一般而言G418浓度可为500μg/mL。连续药筛7天，其中更换含药筛的培养基一次，挑选生长成簇的细胞用于下一步操作。

五、基因敲入阳性细胞鉴定

将生长成簇且状态良好的细胞转入24孔板中继续培养，直至出现单克隆细胞簇后消化转入6孔板中，剩余少量细胞于24孔板中生长鉴定。6孔板中的细胞长满后可冻存待用。24孔板中的细胞长满后利用试剂盒提取基因组DNA用于后续鉴定。

六、阳性细胞的抗ASFV感染验证

将1×10⁴生长状态良好的细胞在24孔板上铺板培养12h。弃去细胞上清，加入100ul ASFV病毒液，37℃CO2培养箱中静止培养，2h后弃去病毒液，用400ul DMEM培养基清洗细胞3次，最后加入400ul含有2％FBS的DMEM培养基继续培养。

72h后用抗ASFV的猪血清为一抗，488标记羊抗猪抗体为二抗进行间接免疫荧光检测，细胞核用DAPI染色。最后通过细胞荧光数验证细胞系的抗病毒感染效果。

测试例1:

基于图1的设计原理，对图2所示的pX330-pH11-gRNA-anti-AFSV质粒进行鉴定，其中，关键结构：4个U6 promoter(启动4个gRNA，依次为gRNA-C，gRNA-D，gRNA-A，gRNA-B)；抗性：Neo(G418)，Kan，Amp；Cas9酶切位点：猪H11基因gRNA识别位点。具体鉴定策略如图3所示，鉴定步骤图下：

如图3所示，对于收集得到的细胞，首先对pH11位点进行鉴定。即进行pH11位点正反向插入情况检测，引物序列如表1所示：

表1

	sequence
		pH11-up-F	tgcctctactcttactcaacc
pH11-down-F	tctcccaaacaaatacccac
		pH11-up-R	cattgcgggcacgcgtatatc
pH11-down-R	aggctttacactttatgcttc

鉴定时若pH11-up-F/R和pH11-down-F/R同时出现阳性条带，认为正向插入；若pH11-up/down-F和pH11-up/down-R同时出现阳性条带，认为反向互补插入。鉴定结果如图4所示，对于收集得到的37个细胞基因组进行鉴定，一共得到了4个正向插入和10个反向插入的细胞。

对确定插入的阳性个体进行后续检测。即对Cas9部分进行检测，引物序列如表2所示：

表2

	sequence
		Cas9-1-F	gtcccagcagccgacaagaa
Cas9-1-R	gatgggcttgatgaacttgtag
		Cas9-2-F	ggacctgaccctgctgaaag
Cas9-2-R	acgatgttctcgggcttgtg
		Cas9-3-F	cgacgacagcctgaccttta
Cas9-3-R	cttatcgctgttcctcttgg
		Cas9-4-F	ttttcaagaccgagattaccc
Cas9-4-R	ggatccactagttctagagcg

对于鉴定成功的细胞进行后续正反向插入情况鉴定，对于正向/反向PCR结果正确的个体再进行后续Cas9和4gRNA检测。其中，由于Cas9片段较大，分别设计4对引物进行扩增鉴定。鉴定结果如图5所示，对于上述14个细胞进行PCR鉴定，其中有7个细胞簇PCR鉴定结果完全正确。

对Cas9阳性个体进行后续检测。即对4个gRNA部分进行检测，引物序列图表3所示。

表3

	sequence
		gRNA2-R	taacgacggtgaacttgattc
gRNA1-F	gatatacgcgtgcccgcaatg
		gRNA3-R	tgcatatatacgagcagattc
gRNA2-F	gaatcaagttcaccgtcgtta
		gRNA4-R	ctaggattaccgacgaagac
gRNA3-F	gaatctgctcgtatatatgca

如图6所示，对于上述7个细胞簇进行PCR鉴定，其中4个细胞簇PCR鉴定结果完全正确。

结果分析：经过筛选与鉴定，我们从37个细胞簇中筛选得到4个鉴定结果完全正确(不含任何突变/缺失)的阳性细胞，成功携带Cas9及4gRNA，可用于后续测试。

测试例2

为了检测筛选得到的阳性细胞株对ASFV的抵抗效率，进行如下测试：

将上述获得的4个完全正确的阳性细胞克隆(FB5、BA6、FA5和HA6)和阴性对照细胞(CA6和GC4)铺板后用ASFV病毒进行感染，72h后间接免疫荧光实验检测病毒感染情况。如图7所示，以抗ASFV猪血清为一抗，Alexa Fluor 488荧光标记羊抗猪为二抗的间接免疫荧光实验显示，阴性对照CA6和GC4中可见绿色荧光细胞，而阳性细胞克隆(FB5、BA6、FA5和HA6)基本无可见绿色荧光信号，图8为对24孔板中所有荧光的统计结果，阴性对照组病毒感染量显著高于阳性细胞克隆组。

以上实验结果表明筛选获得的阳性细胞株能够抵抗ASFV病毒感染。

综上所述，本发明成功构建了一种基于px330-pH11载体的抗ASFV转基因猪成纤维细胞系，该细胞系成功携带4个U6启动子(用于启动4个gRNA)、4个靶向ASFV病毒的gRNA和Cas9序列。

上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，将pCAG-pH11载体和px330载体分别用NOTI和SnaBI双酶切后获得线性载体1和线性载体2，所述线性载体1和线性载体2进行连接，获得pCAG-中间载体；

S2，将步骤S1中的pCAG-中间载体经过利用ASCI和SnaBI双酶切，获得线性化pCAG-中间载体；

S3，将步骤S3中的线性化pCAG-中间载体与目的基因合成载体进行连接，获得抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体；所述目的基因合成载体为含有ASFV CP204L、ASFV pS273R、ASFVB646L和ASFVI215L4个gRNA的基因片段，所述ASFV CP204L、ASFV pS273R、ASFV B646L和ASFV I215L 4个gRNA的碱基序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。

2.根据权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述线性载体1和线性载体2通过同源重组处理方法进行连接；步骤S3中，线性化pCAG-中间载体与目的基因合成载体通过同源重组处理方法进行连接。

3.抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体，其特征在于，利用权利要求1或2所述的方法构建的重组载体，命名为pX330-pH11-gRNA-anti-AFSV。

4.抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体的应用，基于权利要求4所述的重组载体，其特征在于，抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体在制备治疗/预防/诊断非洲猪瘟病毒药物中的应用，以及在体外构建抗ASFV大动物模型的应用。

5.抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，将权利要求3所述的pX330-pH11-gRNA-anti-AFSV、px330辅助质粒混合后，共转染进入猪成纤维细胞，转染后加入培养液令细胞恢复生长，随后加入含有G418的培养基中培养，筛选分离出单克隆，获得抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系。

6.根据权利要求4所述的抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，所述转染方式为电转染，电转染的参数为：0.4cm电击杯，250volt，975μF，细胞数量为5*10⁵-5*10⁶，DNA质量为6μg。

7.根据权利要求4所述的抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，所述G418的浓度为500μg/mL。

8.抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系，其特征在于，利用权利要求4-6任一项所述的方法构建的细胞系。

9.抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系的应用，基于权利要求7所述的细胞系，其特征在于，抗非洲猪瘟病毒转基因猪成纤维细胞系在制备治疗/预防/诊断非洲猪瘟病毒药物中的应用，以及在体外构建抗ASFV大动物模型的应用。

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