CN111304253A

CN111304253A - 非洲猪瘟病毒疫苗、其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111304253A
Application number: CN202010405691.9A
Authority: CN
Inventors: 曹文龙; 孔迪; 孙祥明; 滕小锘; 张大鹤; 易小萍
Original assignee: Suzhou Shinuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Womei Biology Co ltd
Priority date: 2020-05-14
Filing date: 2020-05-14
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2040-05-14
Also published as: CN111304253B

Abstract

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒疫苗、其制备方法及应用。所述非洲猪瘟病毒疫苗的制备方法包括：提供包含重组猪干扰素编码基因的AAV载体；提供包含重组非洲猪瘟病毒中和抗体编码基因的AAV载体；提供包含重组非洲猪瘟病毒多种抗原蛋白的编码基因的AAV载体；提供包含能够针对非洲猪瘟病毒的关键基因转录出shRNA的基因的AAV载体；以前述的AAV载体分别转染宿主细胞，经培养和后处理，获得多个重组AAV病毒。本发明提供的非洲猪瘟病毒疫苗可以提供防治ASFV病毒感染的多重屏障，因而能够实现对于非洲猪瘟病毒感染的综合预防和治疗，具有安全性高、免疫原性强，对动物没有致病性等优点。

Description

非洲猪瘟病毒疫苗、其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种疫苗，具体涉及一种非洲猪瘟病毒疫苗、其制备方法与应用，属于动物免疫药物技术领域。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，临床表现为高热、皮肤充血、水肿及脏器广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能的改变等。该病发病过程短，潜伏期5-15天，有很高的发病率和死亡率，死亡率甚至可高达100%。在被该病原感染的国家或地区，可造成巨大的经济损失，严重威胁食品安全并且影响养猪产业。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疫病，我国规定为动物一类疾病。

ASFV为二十面体对称结构，直径175-215nm。病毒核酸为双链DNA，长度为170kb~190kb，含有151个开放性阅读框，可以编码150~200种蛋白质，其中构成病毒粒子的主要结构蛋白有P72、P54、P220、P62、CD2V等。P54蛋白作为非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白，是血清抗体的主要结合位点，有良好的免疫原性，可以作为非洲猪瘟早期检测的标志物。

非洲猪瘟病毒在组织和环境中的抵抗能力强，现在没有有效治疗措施，全球最有效的方法就是杀死疫区及附近地区的所有猪只，这给养猪企业和猪农带来灾难性的后果。

而且，目前也还没有针对非洲猪瘟病毒特别有效的疫苗。传统方法制备的疫苗，比如纯化以及灭活的病毒，甲醛灭活的感染了病毒的猪肺泡巨噬细胞或者感染了猪的外周血白细胞上清都不能诱导保护性免疫。亦即，总的来说，细胞免疫和体液免疫对于防治非洲猪瘟的感染和病毒的清除都有限。

早期的研究结果倾向于认为非洲猪瘟病毒不能诱导产生中和抗体，因为使用噬斑减少的方法检测中和抗体比较困难。更具体地，是因为一些分离的ASFV，特别是传代代次比较低的ASFV，形成肉眼可看的噬斑非常困难。但是，随着研究方法的提升，通过在病毒中引入标记基因，使得病毒的检测非常方便，后续越来越多的研究表明一些分离的ASFV能够被病毒感染而恢复的猪的血清或者单克隆抗体中和。免疫了减毒活疫苗的猪的血清至少有两种机制去中和病毒对Vero或者猪肺泡巨噬细胞的感染。一种机制是阻止病毒对细胞的结合，另一种机制是阻止病毒的内吞作用。

对感染病毒正在恢复健康的猪的血清的研究表明，P72、P30和P54蛋白是ASFV中免疫原型最强的三个外膜蛋白。抗P72和抗P54蛋白的抗体只能在病毒吸附易感细胞之前中和病毒，而抗P30抗体能够在病毒吸附易感细胞之前或者之后中和病毒。所以，可以认为抗P72和抗P54蛋白的抗体抑制病毒复制周期的第一步即病毒吸附过程。而抗P30蛋白的抗体抑制病毒的内吞作用。

通过去污剂处理ASFV病毒释放P30和P54蛋白，这两个蛋白能够吸附到对ASFV敏感的猪肺泡巨噬细胞表面，并且这种吸附能够被相应的抗体抑制。另外使用昆虫细胞表达ASFV血凝素蛋白CD2V（一种与CD2蛋白同源的蛋白），免疫猪能够产生临时的血凝抑制抗体。

猪免疫弱毒株OUR/T88/3后，能够抵御同源强毒株OUR/T88/1的攻毒，但是当耗尽体内的CD8+淋巴细胞时，就不能完全抵御强毒株攻击，说明CD8+淋巴细胞的细胞免疫在免疫保护中起到一个关键的作用，而单独的中和抗体不能充分的抵御病毒的攻击。

另一方面，将一个至弱的已经适应CV1细胞中培养的弱毒株注射猪，从恢复的猪的血清中分离的抗体免疫另外的健康猪，该健康猪能够抵御强毒株的攻击。从恢复的猪血清中分离的抗体能够中和包括E75、E70、Lisbon60等野毒株，使其感染Vero细胞或者巨噬细胞的能力降低86-97%。

一些研究表明，85%接种了抗ASFV抗体的猪能够抵御强毒株E75毒株的攻击，其余的只接种阴性血清或者PBS注射的猪100%死亡。接种抗体的猪除了延迟的以及一过性的发热反应，其他的临床表现都和正常的猪一样，而对照组在攻毒后4天就显现出了明显的ASFV临床症状。另外，接种抗体组的猪血液中病毒的含量降低了10000倍以上，这说明抗ASFV抗体单独能够保护ASFV强毒株的攻击。也有数据表明，抗体介导的保护早起能够延迟疾病的发展。另一些研究表明，当乳猪通过初乳获得了抗ASFV的抗体后，乳猪也能获得一定的保护。

研究开发一种可有效预防和治疗非洲猪瘟的药物是对全球医药科学界最严重的挑战，也是一项最为紧迫的任务。

目前也有一些关于非洲猪瘟病毒疫苗的研究见诸报道。例如，CN110093324A、CN106459931A提出了敲除不同基因的非洲猪瘟病毒弱毒株作为非洲猪瘟减毒活疫苗，虽然在实验室条件下，疫苗的保护效果很好，但是减毒活疫苗使用有非常大的副反应，并且因为对非洲猪瘟病毒的研究不够透彻，对病毒毒力相关基因以及机制不是很了解，并且这些减毒活疫苗还没有进行严谨而全面的安全评估，所以作为疫苗的生物风险极大。CN109836478A、CN104311660A提供了一种非洲猪瘟病毒多克隆抗体的制备方法，但多克隆抗体容易产生大量非特异性抗体，同时多克隆抗体的多表位识别可能会产生交叉反应。CN109734810A的专利申请了一种制备抗非洲猪瘟病毒和CD双靶标猪源化抗体的方法，但是可能存在抗体双靶点难以平衡，抗体结合免疫细胞激活免疫系统引起细胞因子风暴的问题；同时双靶标抗体可能会降低免疫原性和抗体结构的稳定性。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种非洲猪瘟病毒疫苗、其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种重组腺相关病毒载体的组合的制备方法，其包括：

提供包含重组猪α、β、γ干扰素中一种或多种的编码基因的第一AAV载体；

提供包含重组非洲猪瘟病毒中和抗体的编码基因的第二AAV载体；

提供包含重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白P72、P30、PP62、PP220中一种或多种的编码基因的第三AAV载体；

提供包含能够针对非洲猪瘟病毒A104R、I215L基因中的至少一者转录出shRNA的DNA序列的第四AAV载体；

以所述第一AAV载体、第二AAV载体、第三AAV载体、第四AAV载体分别转染宿主细胞，经培养和后处理，获得重组腺相关病毒载体（亦即重组AAV病毒）的组合，所述的组合为第一重组腺相关病毒载体、第二重组腺相关病毒载体、第三重组腺相关病毒载体与第四重组腺相关病毒载体的混合物，所述第一重组腺相关病毒载体、第二重组腺相关病毒载体、第三重组腺相关病毒载体、第四重组腺相关病毒载体分别对应于第一AAV载体、第二AAV载体、第三AAV载体、第四AAV载体。

本发明实施例还提供了一类表达载体的组合，包括：

第一AAV载体，包括如下重组表达载体中的至少一种：

将重组猪α、β干扰素的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体，其中所述重组猪α、β干扰素的编码基因通过连接肽连接，

将重组猪γ干扰素的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体；

将重组非洲猪瘟病毒中和抗体的重链编码基因和轻链编码基因通过连接肽连接再克隆到pAAV载体上而得的第二AAV载体；

第三AAV载体，包括如下重组表达载体中的至少一种：

将重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白P72的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体，

将重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白PP62的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体，

将重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白P30的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体，

将重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白PP220的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体；以及

第四AAV载体，包括如下重组表达载体中的至少一种：

将能够针对非洲猪瘟病毒A104R基因转录出shRNA的DNA克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体，

将能够针对非洲猪瘟病毒I215L基因转录出shRNA的DNA克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体。

本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其包括：前述的任一种病毒载体，以及，药物学上可接受的佐剂。

在本发明的前述实施例中，所述重组猪α干扰素的编码基因为Seq ID No：16所示序列或其保守性变异序列。

在本发明的前述实施例中，所述重组猪β干扰素的编码基因为Seq ID No：17所示序列或其保守性变异序列。

在本发明的前述实施例中，所述重组猪γ干扰素的编码基因为Seq ID No：20所示序列或其保守性变异序列。

在本发明的前述实施例中，所述重组非洲猪瘟病毒中和抗体的编码基因所含重链编码基因为SEQ ID NO:7所示序列或其保守性变异序列，所含轻链编码基因为SEQ ID NO:8所示序列或其保守性变异序列。

在本发明的前述实施例中，所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白P72的编码基因为SeqID No：12所示序列或其保守性变异序列。

在本发明的前述实施例中，所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白P30的编码基因为SeqID No：13所示序列或其保守性变异序列。

在本发明的前述实施例中，所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白PP62的编码基因为Seq ID No：14所示序列或其保守性变异序列。

在本发明的前述实施例中，所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白PP220的编码基因为Seq ID No：15所示序列或其保守性变异序列。

在本发明的前述实施例中，所述能够针对非洲猪瘟病毒A104R基因转录出shRNA的DNA序列为Seq ID No：10所示序列或其保守性变异序列。

在本发明的前述实施例中，所述能够针对非洲猪瘟病毒I215L基因转录出shRNA的DNA序列为Seq ID No：11所示序列或其保守性变异序列。

本发明实施例还提供了所述表达载体的组合、所述重组腺相关病毒载体的组合或所述免疫组合物在制备非洲猪瘟病毒的检测试剂、用于在受试动物中诱导针对非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂或者用于预防动物受非洲猪瘟病毒感染的药剂中的用途。

较之现有技术，本发明实施例提供的前述技术方案具有以下突出的优点和效果：通过使用AAV作为载体表达猪干扰素、ASFV中和抗体、ASFV shRNA以及ASFV主要结构蛋白，分别提供猪干扰素、中和抗体、shRNA以及针对ASFV的细胞免疫，四种手段联合，可以有效实现ASFV的防治。更具体的，本发明提供的疫苗在使用时，利用含有猪中和抗体的AAV注射猪后，使猪能够迅速而持续长久的分泌该单克隆抗体，提供防治病毒感染的第一道屏障；再利用含有猪干扰素基因的AAV注射后，产生猪干扰素，有效的减轻ASFV对INF诱导的抑制，产生的干扰素抑制ASFV的分裂增值，此为第二道屏障；以及，利用含有猪P30、P72、PP62以及PP220的AAV注射到猪体内，在猪细胞中表达这四个ASFV主要结构蛋白，产生针对这四个蛋白的T细胞免疫，有效防治病毒感染，此为第三道屏障；利用将含有非洲猪瘟病毒A104R和I215L基因shRNA的重组AAV注射猪后，能够显著抑制非洲猪瘟病毒的复制，并且能够专一特异地进入猪巨噬细胞抑制靶标基因的表达，此为第四道屏障；使得本发明的疫苗能够有效地、综合预防和治疗非洲猪瘟病毒感染，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1~4分别为实施例3中pAAV-CAG-P72、pAAV-CAG-P30、pAAV-CAG-PP62、pAAV-CAG-PP220载体的示意图；

图5为实施例4中pAAV-CAG-α-2A-β载体的示意图；

图6为实施例4中pAAV-CAG-γ载体的示意图。

图7为实施例8中检测血清中的ASFV中和抗体结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明实施例的一个方面提供的一种重组腺相关病毒载体的组合的制备方法包括：

在一些实施方式中，所述第一AAV载体包括如下重组表达载体中的至少一种：

将所述重组猪α、β干扰素的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体，其中所述重组猪α、β干扰素的编码基因通过连接肽连接，

将所述重组猪γ干扰素的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体。

在一些实施方式中，所述第二AAV载体是通过将所述重组非洲猪瘟病毒中和抗体的重链编码基因和轻链编码基因通过连接肽连接，再克隆到pAAV载体上而得。

在一些实施方式中，所述第三AAV载体包括如下重组表达载体中的至少一种：

将所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白P72的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体，

将所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白PP62的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体，

将所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白P30的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体，

将所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白PP220的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体。

在一些实施方式中，所述第四AAV载体包括如下重组表达载体中的至少一种：

将所述能够针对非洲猪瘟病毒A104R基因转录出shRNA的DNA克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体，

将所述能够针对非洲猪瘟病毒I215L基因转录出shRNA的DNA克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体。

在一些实施方式中，所述pAAV载体，特别是应用于形成所述第一AAV载体、第二AAV载体、第三AAV载体的pAAV载体的启动子包括CAG启动子或者CMV启动子，且不限于此。

在本说明书中，所述pAAV-CAG载体的制备方法为本领域常规制备方法，或者通过市售可得。其中所述pAAV-CAG载体的多克隆位点的酶切位点为本领域常规的酶切位点，只要能将所述的各编码基因克隆到pAAV-CAG载体即可，所述酶切位点优选地为限制性内切酶Kpn1、EcoR的酶切位点。

在一些实施方式中，所述pAAV载体，特别是应用于形成所述第四AAV载体的pAAV载体的启动子包括U6启动子，且不限于此。

在本说明书中，所述pAAV-U6载体的制备方法为本领域常规制备方法，或者通过市售可得。其中所述pAAV-U6载体的多克隆位点的酶切位点为本领域常规的酶切位点，只要能将所述的各编码基因克隆到pAAV-U6载体即可，所述酶切位点优选地为Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点。

在一些实施方式中，所述的制备方法还包括：将所述重组猪α、β干扰素的编码基因通过连接肽连接，再克隆到pAAV载体上，且使之位于启动子后方，获得重组表达载体。

在一些实施方式中，所述的制备方法还包括：将所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白P72、P30、PP62、PP220的编码基因分别克隆到pAAV载体上，且使之位于启动子后方，获得重组表达载体。

进一步的，所述连接肽包括FMDV 2A肽，但不限于此。

在一些实施方式中，所述的制备方法还可以包括：将所述重组猪α、β干扰素的编码基因通过IRES序列连接，再克隆到pAAV载体上，且使之位于启动子后方，获得重组表达载体。通过使用IRES序列连接两个目的基因，可以以双顺反子的形式使用一个启动子表达两个蛋白。

在一些实施方式中，所述的制备方法还包括：以AAV载体（所述第一AAV载体、第二AAV载体、第三AAV载体中的任意一种或多种）与pHelper载体、pAAV-RC载体转染宿主细胞，并进行培养和后处理。即，利用三质粒转染方法实现重组AAV病毒的制取。

在一些实施方式中，所述的制备方法还可以包括：以所述第四AAV载体与pHelper载体、pAAV-RCM载体转染宿主细胞，并进行培养和后处理。进一步的，所述pAAV-RCM载体可以通过将优化的猪巨噬细胞C反应蛋白基因（SEQ ID NO: 23）连接到pAAV-RC质粒的BfuA I酶切位点处而获得。

例如，在前述实施方式中，可以培养宿主细胞，待细胞生长至70％融合，加入转染试剂，加入前述的一种AAV表达载体、pAAV2-RC载体与pHelper载体共转染宿主细胞，室温培养5小时后换新鲜培养基，之后继续培养并收集细胞，再将收集的细胞反复冻融裂解，其后经后处理而提取获得病毒颗粒。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，较佳地为真核细胞，更佳地为HEK293细胞。

在一些实施方式中，所述转染试剂为本领域常规的转染试剂，只要能满足将外源质粒转染到宿主细胞中即可，较佳地为聚乙烯亚胺试剂(PEI试剂)。所述聚乙烯亚胺试剂的制备方法为本领域常规制备方法，或者市售可得。

在一些实施方式中，所述AAV载体、pAAV2-RC载体、pHelper载体的加入量较佳地为等物质量比例加入。

在一些实施方式中，所述三种质粒的加入量为8-16μg，较佳地为12.5μg。当所述三种质粒的加入量不在上述范围值之内时，会产生AAV病毒包装效率低下，甚至无法包装出AAV病毒的现象发生。

在本说明书中，所述pAAV2-RC载体、pHelper载体为本领域常规的pAAV2-RC载体、pHelper载体，所述载体的制备方法为本领域常规制备方法，或者通过市售可得。

在一些实施方式中，所述非洲猪瘟病毒疫苗的制备方法还可以包括浓缩步骤，所述浓缩的方法为本领域常规的浓缩方法，例如可以用浓缩柱浓缩处理收集的包含病毒的洗脱液。其中所述浓缩柱为本领域常规的浓缩柱，只要能够浓缩所得AAV病毒颗粒即可。所述浓缩柱的制备方法为本领域常规的制备方法，或者通过市售可得。

例如，在一些实施方式中，所述的后处理可以具体包括：收获并浓缩所述重组AAV病毒，将其滴度调整到10¹³-10¹⁵GC（Genome Copies）/ml，然后将多个重组AAV病毒按照一定比例混合制备成疫苗。

进一步的，所述重组AAV病毒的血清型包括但不限于血清1、2、3、4、5、6、7、8、9型。

本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的重组腺相关病毒载体的组合。

本发明实施例的另一个方面还提供了一类表达载体的组合，包括：

第一AAV载体，包括如下重组表达载体中的至少一种：

第三AAV载体，包括如下重组表达载体中的至少一种：

第四AAV载体，包括如下重组表达载体中的至少一种：

本发明实施例的另一个方面提供了含有所述第一AAV载体、第二AAV载体、第三AAV载体、第四AAV载体的转化体。在本说明书中，所述转化体为将本发明的表达载体转化至相应的宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足AAV载体可稳定地自行复制即可，其中所述宿主细胞较佳地为真核细胞，更佳地为HEK293细胞。所述HEK293细胞株的制备方法为本领域常规制备方法，或者通过市售可得。进一步的，在一些实施方式中，所述转化体是将所述表达载体（前述的AAV表达载体）与pHelper载体、pAAV-RC载体共转染宿主细胞而得。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种免疫组合物，其包括：

前述重组腺相关病毒载体的组合，以及

药物学上可接受的佐剂。

所述佐剂可以包括保护剂、填充剂、稀释剂或赋形剂等，且不限于此。相应的，所述疫苗可以是多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、注射液、或粉针剂等。例如，在一些实施方式中，可以将所获的重组AAV病毒加入合适的保护剂，再冻干成冻干粉。

在本说明书中，前述的保守型变异序列是指由原始核苷酸序列和/或原始氨基酸序列中的一个或多个位点处的核苷酸或氨基酸被替换、插入或缺失变异形成的核苷酸和/或氨基酸序列。优选的，所述保守型变异序列中至少95%与原始序列相同。

在本说明书中，前述的各编码基因的序列较佳地是SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No:17、SEQ ID No:20等的同系物，这些同系物可以使启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。前述的同系物还包括一类具有在标准条件下能够与SEQ ID No:12、SEQ IDNo:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No:17、SEQ ID No:20等所示序列的多聚核酸进行杂交的碱基序列的多聚核酸，所述标准条件下进行的杂交可根据《分子克隆》(Cold Spring Harbor Laboratory Press)记载的分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)所述的方式进行。SEQ ID No:1的同系物较佳地为在SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQID No:17、SEQ ID No:20等所示序列之前添加信号肽分子，所述信号肽分子的作用在于控制SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No:17、SEQ ID No:20等所示序列在细胞中的转移和定位等功能，其中所述信号肽分子为本领域常规的信号肽分子，信号肽分子的序列可以通过人工合成多肽序列或者分子克隆技术获得，可根据《分子克隆》(Cold Spring Harbor Laboratory Press)记载的分子生物学中的通用方案所述的方式进行。

在本发明的前述实施方案中，所述中和抗体是一种嵌合单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，所述重链包含重链可变区和重链恒定区；所述轻链可变区具有Seq ID No：3所示序列或其保守型变异序列，所述重链可变区具有SeqID No：5所示序列或其保守型变异序列；所述轻链恒定区、重链恒定区均来源于猪源抗体。

在一些实施方式中，所述轻链的编码基因具有Seq ID No：8所示序列或其保守型变异序列，所述重链的编码基因具有Seq ID No：7所示序列或其保守型变异序列。

在一些实施方式中，对应于所述中和抗体的AAV载体中是在CAG启动子后面插入编码重链的基因和编码轻链的基因，且编码重链的基因和编码轻链的基因之间通过连接肽连接。优选的，所述连接肽包括FMDV 2A肽，但不限于此。

本发明实施例的另一个方面提供了所述表达载体的组合、所述重组腺相关病毒载体的组合或所述免疫组合物在制备非洲猪瘟病毒的检测试剂、用于在受试动物中诱导针对非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂或者用于预防动物受非洲猪瘟病毒感染的药剂中的用途。

例如，本发明的一些实施例提供了所述表达载体的组合或者所述重组腺相关病毒载体的组合在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的用途。

本发明的一些实施例提供了所述免疫组合物在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的用途。所述免疫组合物包括如上所述AAV病毒为活性成分和至少一种药用载体。本发明所述药用载体为本领域常规药用载体，较佳地为填充剂、稀释剂或赋形剂等，且不限于此。进一步的，所述免疫组合物可以被制备为多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、注射液、或粉针剂；较佳地，所述的剂型为注射剂，如静脉注射剂、腹腔注射剂等。

应当理解，除非特别说明，本说明书述及的一些术语的释义均是本领域技术人员已知的。例如：

抗体，其由两个相同的轻链（light chain，L）和两个相同的重链（heavy chain,H）组成。每条重链的一端为可变区（variable region,V），其后是多个恒定区（constantregion，C）。每条轻链的一端为可变区（variable region,V），其后是多个恒定区（constantregion，C）。

抗体可变区，其所指的是抗体之间某些部分再序列上有很大的不同，并且这些部分再每个特定抗体对其特定靶的结合和特异性中有作用。可变性并不是均匀的分布在抗体可变区中。它集中在轻链和重链可变区被称作互补决定区（complementary determiningregion，CDR），也称作高变区（hypervariable region，HVR）的三个节段中。可变区中更高度共有的部分称为框架（frame region, FR）。天然重链和轻链的可变区各包含四个FR区，它们大多数采取β折叠构型，由三个CDR连接，改三个CDR连接形成环连接且再某些情况下形成β折叠的一部分。每条链中的多个CRD通过FR区连接再相邻近的位置，并且和另一条链的CDR一起形成抗体的靶结合部位。

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)，其属于微小病毒科依赖病毒属，是一类DNA复制缺陷型病毒，AAV病毒的复制与增殖需要依赖其他辅助病毒如腺病毒的参与。AAV病毒的基因组为单链DNA，长度约 4.7 Kb，其中由三个重要的元件组成，即：一对末端反向重复序列（Inverted terminal repeats，ITRs）、一个Rep区和一个Cap区。ITRs可以形成T型二级结构，是 AAV 病毒复制、包装、整合与拯救等活动需要的唯一顺式作用元件(Molecular structure of adeno-associated virus variant DNA. The Journal ofbiological chemistry 1980，255:3194-3203)。现阶段已经开发出不需要辅助病毒来完成重组腺相关病毒包装的系统（Highly purified recombinant adeno-associated virusvectors are biologically active and free of detectable helper and wild-typeviruses. Hum Gene Ther. 1999, 10:1031-1039）。该包装系统包括三种质粒和一种细胞系，三种质粒分别是，携带ITRs元件、真核启动子与外源基因插入位点的pAAV-MCS；提供AAV病毒包装所必须的Rep区和Cap区的pAAV-RC；提供来源于辅助病毒中的辅助蛋白E2A、E4和VA RNA的p Helper。将这三种质粒共转染到 HEK-293细胞系中，即可包装形成具有感染性的重组腺相关病毒颗粒。重组的腺相关病毒可以在细胞内部稳定表达外源基因，并且AAV相对于其他的病毒引起机体的免疫反应相对温和。AAV作为一个病毒载体，在基因治疗，预防以及治疗性疫苗以及基础研究领域得到了普遍的应用。

本发明提供的疫苗可以综合实现对于非洲猪瘟病毒感染的预防和治疗，其机理在于：含有猪中和抗体的AAV病毒注射猪后有效的在猪体内产生ASFV中和抗体，使猪能够迅速而持续长久的分泌该单克隆抗体，提供防治病毒感染的第一道屏障；含有猪干扰素基因的AAV病毒注射后，产生猪干扰素，有效的减轻ASFV对INF诱导的抑制，产生的干扰素抑制ASFV的分裂增值，此为第二道屏障；含有猪P30、P72、PP62以及PP220的AAV病毒注射到猪体内，在猪细胞中表达这些ASFV主要结构蛋白，产生针对这些蛋白的T细胞免疫，有效防治病毒感染，此为第三道屏障；含有非洲猪瘟病毒A104R和I215L基因shRNA的重组AAV注射猪后，能够显著抑制非洲猪瘟病毒的复制，并且能够专一特异地进入猪巨噬细胞抑制靶标基因的表达，此为第四道屏障。本发明提供的疫苗具有安全性高、免疫原性强，对动物没有致病性等诸多优点。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Thirdedition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Thirdedition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 表达嵌合ASFV P54中和抗体重组AAV的制备

将中国分离的一株ASFV（Gene Bank登录号：MK128995）的P54蛋白氨基酸序列进行密码子优化（SEQ ID No：1），并在南京金斯瑞公司合成并克隆到pCI表达载体，在蛋白的C端加上His标签，插入pCI载体的限制性内切酶MluI和XhoI的酶切位点之间，获得pCI-P54His质粒，利用大肠杆菌扩增pCI-P54His质粒，并抽提质粒转染293细胞，获得P54His蛋白（SEQ IDNo：2）。进行SDS-PAGE检测确认正确表达后，使用制备的P54 His蛋白免疫小鼠制备非洲猪瘟病毒P54单克隆抗体以及杂交瘤细胞株。

筛选出杂交瘤细胞株后进行抗体可变区基因序列的扩增，将轻链可变区（相应基因、多肽序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4）以及重链可变区（相应基因、多肽序列分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6）序列与已经公布的猪IgG抗体的恒定区序列拼接，从而获得嵌合的猪源化的ASFV中和抗体序列。将优化后的序列克隆到载体pAAV-CAG载体上（Kpn1、EcoR酶切位点处），载体使用CAG启动子，启动子后面插入重链基因序列（SEQ ID NO:7）和轻链基因序列（SEQ ID NO:8），两个基因序列之间用FMDV 2A肽序列（相应基因、多肽序列分别为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19）连接，构建获得pAAV-CAG-P54载体（SEQ ID NO:9）。

将pHelper、pAAV-RC和pAAV-CAG-P54三种质粒载体按照摩尔比1:1:1混合DNA样品，转染传代后的HEK293细胞中。

质粒转染HEK293细胞48~72小时后收集细胞，弃原培养基，加适量DMEM，用细胞刮将细胞刮下后转移到15 mL离心管中，5000rmp离心20min，-20℃冷冻，室温融化，彻底冻融3次，冰浴下破碎细胞4次，10000rmp离心20min后收集上清，并进行病毒颗粒纯化。即获得表达中和抗体的重组AAV病毒，即AAV-P54。

实施例2 针对非洲猪瘟A104R和I215L基因shRNA的重组腺相关病毒的制备

分别针对非洲猪瘟病毒A104R基因和I215L基因设计出能够转录出shRNA的DNA序列，其DNA序列如下：

A104R正义链（SEQ ID NO.24）:

cgcaagagctttactccttagtagcggcagttcaagagactgccgctactaaggagtaaagctcttgctttttta

A104R反义链（SEQ ID NO.25）:

agcttaaaaaagcaagagctttactccttagtagcggcagtctcttgaactgccgctactaaggagtaaagctcttgcggtac

上述正义链及反义链模板包含粘性末端及shRNA序列，所述shRNA的序列为：5’- gcaagagcuuuacuccuuaguagcggcaguucaagagacugccgcuacuaaggaguaaagcucuugcuuuuuu-3’（SEQID NO.10），其中uucaagaga为loop结构，酶切位点为Kpn1（ggtacc）。

I215L正义链（SEQ ID NO.26）：

cgacacctgatagagaatccctctgagaatttcaagagaattctcagagggattctctatcaggtgtctttttta

I215L反义链（SEQ ID NO.27）：

agcttaaaaaagacacctgatagagaatccctctgagaattctcttgaaattctcagagggattctctatcaggtgtcggtac

上述正义链及反义链模板包含粘性末端及shRNA序列，所述shRNA的序列为：5’- gacaccugauagagaaucccucugagaauuucaagagaauucucagagggauucucuaucaggugucuuuuuu-3’（SEQID NO.11），其中uucaagaga为loop结构，酶切位点为Kpn1（ggtacc）。

构建pAAV-U6-A104R-shRNA质粒和pAAV-U6-I215L-shRNA质粒。以及，将猪巨噬细胞C反应蛋白基因优化后连接到pAAV-RC质粒的BfuA I酶切位点处，构建新的质粒pAAV-RCM。

具体过程为：

南京金斯瑞公司合成了U6启动子基因（SEQ ID NO.22）并构建了pAAV-U6载体，具体操作如下：

将pAAV-CAG载体（购自Addgene）进行改造，使用Nde 1和Kpn 1双酶切pAAV-CAG载体，去除CAG启动子，然后将合成的U6启动子连接到双酶切的pAAV-CAG载体上，把CAG启动子替换成人细胞U6启动子，得到pAAV-U6。

将载体pAAV-U6使用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切回收目的载体。

1. 将pAAV-U6质粒分别用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表1。

表1 pAAV-U6质粒酶切反应体系

2. 连接

将双酶切纯化后的pAAV-U6质粒和退火的对应于A104R-shRNA基因的两条引物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表2：

表2 A104R-shRNA基因和pAAV-U6质粒连接体系

采用同样的方法完成A104R-I215L基因与pAAV-U6质粒的连接。

3．转化

将10μl连接产物加入100μl的DH10B感受态细胞，混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

将长出来的菌落送测序，确定正确的克隆。然后抽提正确的pAAV-U6-A104R-shRNA质粒。

以同样的方法抽提pAAV-U6-I215L-shRNA质粒。

pAAV-RCM的构建过程如下：将金斯瑞公司合成优化后的猪巨噬细胞C反应蛋白基因（SEQ ID NO: 23）连接到pAAV-RC质粒的BfuA I酶切位点处，构建pAAV-RCM质粒。

对数生长期的HEK293细胞，消化后重新悬浮于DMEM培养基+10%FBS中，计数细胞浓度，调整细胞密度到5×10⁵ cells/mL；接种于3块6孔板，共18个孔，2mL/孔；取10 mL DMEM培养基置于摇瓶中，将摇瓶放于冰箱中，备用。12小时候后在1.5mL 无菌EP管中，加入200 μL的预热DMEM；分别按三个质粒（pAAV-U6-A104R-shRNA质粒或pAAV-U6-I215L-shRNA质粒和pAAV-RCM质粒，pHelper质粒）的摩尔比是1:1:1，加入质粒3μg，立即旋涡震荡混合；超净台内放置2分钟；然后加入PEI 7.5μg，立即旋涡震荡混合；超净台内放置10分钟；将DNA-PEI加入到对应培养板的孔中，充分混合后将孔板放入培养箱中培养；6小时后，所有的孔都更换培养基为DMEM+10%FBS，继续培养；转染96小时后，用细胞刮把细胞刮下来，使用PBS重悬，反复冻融4次离心取上清，分别收获重组腺相关病毒AAV2M-A104R-shRNA、AAV2M-I215L-shRNA。

实施例3 表达P30、P72、PP62、PP220蛋白重组AAV载体构建

将中国分离的一株ASFV（Gene Bank登录号：MK128995）的P72蛋白氨基酸序列进行密码子优化（SEQ ID NO: 12），上海桑尼生物科技有限公司合成该基因克隆到pAAV-CAG目标载体的Kpn 1、EcoR 1酶切位点处，获得pAAV-CAG-P72载体（参阅图1）。

用同样的方法得到表达优化后的非洲猪瘟P30、PP62、PP220基因（SEQ ID NO:13、14、15）的重组AAV质粒载体（参阅图2-图4），分别命名为pAAV-CAG-P30、pAAV-CAG-PP62、pAAV-CAG-PP220载体。

实施例4 表达猪干扰素蛋白重组AAV载体构建

1．将猪α和β干扰素基因氨基酸序列（SEQ ID NO:16、17）进行密码子优化，并在上海桑尼生物科技有限公司合成并克隆到表达载体pAAV-CAG载体上（Kpn 1、EcoR 1酶切位点处），两个基因之间用FMDV 2A肽连接（相应基因、多肽序列分别为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19）,最终的α-2A-β序列是（SEQ ID NO:21），得到pAAV-CAG-α-2A-β（参阅图5）。

2．将猪γ干扰素基因氨基酸序列（SEQ ID NO:20）进行密码子优化，并在上海桑尼生物科技有限公司合成并克隆到表达载体pAAV-CAG载体上（Kpn 1、EcoR 1酶切位点处），得到pAAV-CAG-γ（参阅图6）。

实施例5 表达P30、P72、PP62、PP220蛋白重组AAV病毒和表达猪干扰素蛋白重组AAV病毒的制备

1．将T 25方瓶中的HEK293细胞1∶3传代，细胞汇合度至70%左右时进行转染。将细胞培养基更换为DMEM，并使用三质粒转染的方法制备表达目的蛋白的AAV进行转染，三个质粒共转染12.5μg，并且按pHelper、pAAV-RC和pAAV-CAG-P30的摩尔比为1:1:1混合DNA样品，将混合的DNA样品转移到500 μL的DMEM中，短暂旋涡震荡后，室温放置两分钟，向样品中加入31.25 μL的PEI，短暂旋涡震荡后，室温孵育10分钟后，将转染复合物加入HEK293细胞中，5小时后换完全培养基。

2．病毒收集转染72小时后收集细胞，弃原培养基，加适量DMEM，用细胞刮将细胞刮下后转移到15 mL离心管中，反复冻融3次离心后收获上清，获得重组腺相关病毒AAV-P30。

3. 按照上述方法分别使pAAV-CAG-P72、pAAV-CAG-PP62、pAAV-CAG-PP220、pAAV-CAG-α-2A-β、pAAV-CAG-γ与pHelper和pAAV-RC共转染，分别获得五种重组腺相关病毒AAV-P72、AAV-PP62、AAV-PP220、AAV-α-2A-β、AAV-γ。

实施例6 病毒滴度测定

按照以下操作步骤分别纯化前述AAV-P54、AAV2M-A104R-shRNA、AAV2M-I215L-shRNA、AAV-P30、AAV-P72、AAV-PP62、AAV-PP220、AAV-α-2A-β、AAV-γ。

1. 纯化AAV病毒颗粒 AAV滴度的测定根据AAVpro® Titration Kit (for RealTime PCR) Ver.2（TaKaRa，Cat.#6233），加入0.5M的 EDTA（加入体积为培养基的1/80），1750 g，4℃离心10分钟完全移除上清。旋涡震荡样品并加入250μL AAV 提取液A，旋涡震荡15s重悬细胞，室温放置5分钟后，再旋涡震荡15秒，2000 g – 14000 g、4 ℃离心10分钟。收集上清到新的离心管中，加入25μL的AAV提取缓冲液B，用移液器洗吹混匀。

2. 提取AAV病毒基因组用15μL的dH₂O溶解2μL AAV病毒样品，并加入2μL l0 xDNase I Buﬀer和1μL DNase I，37 ℃孵育15分钟后95 ℃孵育10分钟，加入20 μL的裂解缓冲液，70 ℃孵育10分钟，用EASY稀释溶液将样品稀释50倍。

3. PCR检测梯度稀释标准品，从2 x 10⁷copies/μl稀释到2 x 10²copies/μl，准备50 X 引物混合物，5 μL AAV Forward Titer 引物、5 μL AAV Reverse Titer 引物并加入15 μL dH₂O。取12.5μL的TB GreenPremix Ex Taq II (2X conc.)、0.5 μL引物混合物、7 μL的dH₂O和5 μL模板进行RT-PCR反应，95℃预变性2分钟；94 ℃变性5秒，60 ℃反应30秒，35个循环。根据标准样品的绘制的标准曲线，计算样品的滴度，结果参见表3。

表3 病毒滴度结论

实施例7 重组AAV病毒对ASFV病毒体外抑制试验

取对数生长期的猪肺泡巨噬细胞，消化后使用MEM+10%FBS培养基重悬到4×10⁶cells/ml，接种到六孔板中，细胞汇合度达到50%。首先细胞中分别按照以下组合（表4）接种重组AAV病毒，并设空载体对照组。5天后接种ASFV病毒，每孔接种10⁶HAD₅₀病毒。然后分别于48h，72h和96h和120 h收集细胞培养上清，检测ASFV病毒滴度。

表4

实施例8 中和抗体测定

将实施例6中收获的重组AAV病毒分别稀释到1×10¹³ gc/mL滴度，然后按照表5中的组合进行等比例混合，作为免疫抗原。

表5

取40头健康未感染ASFV病毒的乳猪，其中35头随机分为7组，每组5头，分别接种2 ml的上述分组中的混合重组AAV病毒，另外5头作为对照组，接种2ml空的AAV病毒，接种后分别于第4周、第6周、第8周、第16周、第20周采血，检测血清中ASFV中和抗体。结果参阅图7。

实施例9

取健康仔猪1头，以浓度梯度离心法分离淋巴细胞，调节细胞浓度为10⁹/ml，培养于6孔板，每孔2.5 ml，在 37℃、5% CO₂孵箱中培养贴壁5 h，吸取悬浮细胞备用，于每孔贴壁单个核细胞中加2.5 ml含GM-CSF的AIM-V培养基，将细胞分为本专利重组AAV病毒感染组和对照组，感染组每孔加入重组AAV病毒液0.5ml感染5h后换液为每孔3ml含GM-CSF和IL-4的AIM-V培养基，对照组不感染，培养4天，隔天半量换液，第5天时加入TNF-α，第7天收集细胞。按1：20的比例混合6孔板内的DC细胞和T细胞，并加入GM-CSF和IL-2以AIM-V培养基培养7天，诱导CTL克隆形态。

分别取转染组和对照组CTL 10⁶，PBS洗涤2遍之后，分别加入下列FITC标记的猪源性单抗：anti-IFN-g、anti-CD4、anti-CD56以及PE标记的anti-IL-10、anti-CD8，流式细胞仪检测其IFN-γ、IL-4、CD4、CD8、CD56表达情况。以同样方法对CD4⁺T细胞检测CD25表达情况，对CD8⁺T细胞检测CD69表达情况。结果显示，感染组DC诱导的CTL表面标志CD8、CD4、CD56阳性表达率分别为61.2%、8.6%、0.9%，而对照组DC诱导的CTL的CD8、CD4、CD56阳性表达率分别为54.9%、19.6%、6.1%。感染组T细胞中CD4⁺CD25⁺（Treg）率为14.8%，明显低于对照组的49.8%，转染组T细胞CD8⁺CD69⁺率为90.1%，明显高于对照组的79.3%。

分别以感染组CTL和对照组CTL为效应细胞，以HEK293细胞株为靶细胞，利用⁵¹Cr释放法检测CTL对ASFV抗原阳性细胞株的杀伤效率，结果显示，感染组CTL对HEK293细胞的杀伤活性为53.5％，明显高于对照组CTL杀伤活性的22.6％。

应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 非洲猪瘟病毒疫苗、其制备方法与应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gccgccacca tggaaacaga tacactcctc ctctgggtgc tgctcctctg ggtgccagga 60

tctacaggat cctcccggaa gaagaaggcc gccgccatcg aggaggagga catccagttc 120

atcaacccct accaagatca gcagtgggtg gaggtgaccc ctcagcccgg aacctccaag 180

cccgctggcg ctaccacagc ctccgtgggc aaacccgtga ctggtcgtcc cgctaccaat 240

cgtcccgcta ccaacaagcc cgtgaccgac aaccccgtga ccgataggct ggtgatggcc 300

accggaggac ccgctgctgc tcccgctgcc gctagcgctc ccgctcatcc cgctgagccc 360

tacaccaccg tgactaccca gaacaccgct tcccagacca tgtccgccat cgagaatctg 420

cggcagcgga acacctacac ccacaaggat ttagaaaact ctttacatca ccatcaccat 480

cactgatga 489

<210> 2

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu

20 25 30

Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu

35 40 45

Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala

50 55 60

Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala

65 70 75 80

Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met

85 90 95

Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala

100 105 110

His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser

115 120 125

Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr

130 135 140

His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu His His His His His His

145 150 155

<210> 3

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atggcctgga tttcacttat actctctctc ctggctctca gctcaggggc catttcccag 60

gctgttgtga ctcaggaatc tgcactcacc acatcacctg gtggaacagt catactcact 120

tgtcgctcaa gtactggggc tgttacaact agtaactatg ccaactggat acaagaaaaa 180

ccagatcatt tattcatagg actaataggt ggtaccagca accgaggacc aggtgttcct 240

gccagattct caggctccct gattggagac aaggctgccc tcaccatcat aggggcacag 300

actgaggatg aggcaatata tttctgtgct ctatggttca gaacacactt tgtattcggc 360

agtggaacca aggtcactgt cctaggt 387

<210> 4

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Met Ala Trp Ile Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ser Gly

1 5 10 15

Ala Ile Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser

20 25 30

Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val

35 40 45

Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Ile Gln Glu Lys Pro Asp His Leu

50 55 60

Phe Ile Gly Leu Ile Gly Gly Thr Ser Asn Arg Gly Pro Gly Val Pro

65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile

85 90 95

Ile Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp

100 105 110

Phe Arg Thr His Phe Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

115 120 125

Gly

<210> 5

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atgggatgga cctggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgac 60

gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg ataaagcctg gcgcttcagt gaagatatcc 120

tgcaaggctt ctggtttctc attcaccggc cacggagtaa gctggatagt gcagaggaat 180

ggaaagagcc ttgagtggat tggaaatatt gatcctggaa gcggtgtaac taacttcaac 240

caaaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagtac attgtacatg 300

cacctcacga gcctgcaatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aagacggcca 360

tgggactacg tatttgacta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc t 411

<210> 6

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 6

Met Gly Trp Thr Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe

35 40 45

Thr Gly His Gly Val Ser Trp Ile Val Gln Arg Asn Gly Lys Ser Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Gly Ser Gly Val Thr Asn Phe Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Leu Tyr Met His Leu Thr Ser Leu Gln Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Pro Trp Asp Tyr Val Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

130 135

<210> 7

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atgggatgga cctggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgac 60

gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg ataaagcctg gcgcttcagt gaagatatcc 120

tgcaaggctt ctggtttctc attcaccggc cacggagtaa gctggatagt gcagaggaat 180

ggaaagagcc ttgagtggat tggaaatatt gatcctggaa gcggtgtaac taacttcaac 240

caaaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagtac attgtacatg 300

cacctcacga gcctgcaatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aagacggcca 360

tgggactacg tatttgacta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ttcagccccc 420

aagacggccc catcggtcta ccctctggcc ccctgcggca gggacacgtc tggccctaac 480

gtggccttgg gctgcctggc ctcaagctac ttccccgagc cagtgaccat gacctggaac 540

tcgggcgccc tgaccagtgg cgtgcatacc ttcccatccg tcctgcagcc gtcagggctc 600

tactccctca gcagcatggt gaccgtgccg gccagcagcc tgtccagcaa gagctacacc 660

tgcaatgtca accacccggc caccaccacc aaggtggaca agcgtgttgg aacaaagacc 720

aaaccaccat gtcccatatg cccaggctgt gaagtggccg ggccctcggt cttcatcttc 780

cctccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccagaccc ccgaggtcac gtgcgtggtg 840

gtggacgtca gcaaggagca cgccgaggtc cagttctcct ggtacgtgga cggcgtagag 900

gtgcacacgg ccgagacgag accaaaggag gagcagttca acagcaccta ccgtgtggtc 960

agcgtcctgc ccatccagca ccaggactgg ctgaagggga aggagttcaa gtgcaaggtc 1020

aacaacgtag acctcccagc ccccatcacg aggaccatct ccaaggctat agggcagagc 1080

cgggagccgc aggtgtacac cctgccccca cccgccgagg agctgtccag gagcaaagtc 1140

accgtaacct gcctggtcat tggcttctac ccacctgaca tccatgttga gtggaagagc 1200

aacggacagc cggagccaga gggcaattac cgcaccaccc cgccccagca ggacgtggac 1260

gggaccttct tcctgtacag caagctcgcg gtggacaagg caagatggga ccatggagaa 1320

acatttgagt gtgcggtgat gcacgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagtccatc 1380

tccaagactc agggtaaatg a 1401

<210> 8

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

atggcctgga tttcacttat actctctctc ctggctctca gctcaggggc catttcccag 60

gctgttgtga ctcaggaatc tgcactcacc acatcacctg gtggaacagt catactcact 120

tgtcgctcaa gtactggggc tgttacaact agtaactatg ccaactggat acaagaaaaa 180

ccagatcatt tattcatagg actaataggt ggtaccagca accgaggacc aggtgttcct 240

gccagattct caggctccct gattggagac aaggctgccc tcaccatcat aggggcacag 300

actgaggatg aggcaatata tttctgtgct ctatggttca gaacacactt tgtattcggc 360

agtggaacca aggtcactgt cctaggtcag cccaaggccg ctcccacggt caacctcttc 420

ccgccctcct ctgaggagct cggcaccaac aaggccaccc tggtgtgtct aataagtgac 480

ttctacccgg gcgccgtgac ggtgacctgg aaggcaggcg gcaccaccgt cacccagggc 540

gtggagacca ccaagccctc gaaacagagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 600

gccctgtccg ccagtgactg gaaatcttcc agcggcttca cctgccaggt cacccacgag 660

gggaccattg tggagaagac agtgacgccc tccgagtgcg cctag 705

<210> 9

<211> 2169

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gccgccacca tggcctggat cagcctgatc ctgagcctgc tggccctgag cagcggcgcc 60

atcagccagg ccgtggtgac ccaggagagc gccctgacca ccagccccgg cggcaccgtg 120

atcctgacct gccgcagcag caccggcgcc gtgaccacca gcaactacgc caactggatc 180

caggagaagc ccgaccacct gttcatcggc ctgatcggcg gcaccagcaa ccgcggcccc 240

ggcgtgcccg cccgcttcag cggcagcctg atcggcgaca aggccgccct gaccatcatc 300

ggcgcccaga ccgaggacga ggccatctac ttctgcgccc tgtggttccg cacccacttc 360

gtgttcggca gcggcaccaa ggtgaccgtg ctgggccagc ccaaggccgc ccccaccgtg 420

aacctgttcc cccccagcag cgaggagctg ggcaccaaca aggccaccct ggtgtgcctg 480

atcagcgact tctaccccgg cgccgtgacc gtgacctgga aggccggcgg caccaccgtg 540

acccagggcg tggagaccac caagcccagc aagcagagca acaacaagta cgccgccagc 600

agctacctgg ccctgagcgc cagcgactgg aagagcagca gcggcttcac ctgccaggtg 660

acccacgagg gcaccatcgt ggagaagacc gtgaccccca gcgagtgcgc cagcctgaac 720

ttcgacctgc tgaagctggc cggcgacgtg gagagcaacc ccggcatggg ctggacctgg 780

atcttcatcc tgatcctgag cgtgaccacc ggcgtgcaca gcgacgtgca gctgcagcag 840

agcggccccg agctgatcaa gcccggcgcc agcgtgaaga tcagctgcaa ggccagcggc 900

ttcagcttca ccggccacgg cgtgagctgg atcgtgcagc gcaacggcaa gagcctggag 960

tggatcggca acatcgaccc cggcagcggc gtgaccaact tcaaccagaa gttcaagggc 1020

aaggccaccc tgaccgtgga caagagcagc agcaccctgt acatgcacct gaccagcctg 1080

cagagcgagg acagcgccgt gtactactgc gcccgccgcc gcccctggga ctacgtgttc 1140

gactactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagcg cccccaagac cgcccccagc 1200

gtgtaccccc tggccccctg cggccgcgac accagcggcc ccaacgtggc cctgggctgc 1260

ctggccagca gctacttccc cgagcccgtg accatgacct ggaacagcgg cgccctgacc 1320

agcggcgtgc acaccttccc cagcgtgctg cagcccagcg gcctgtacag cctgagcagc 1380

atggtgaccg tgcccgccag cagcctgagc agcaagagct acacctgcaa cgtgaaccac 1440

cccgccacca ccaccaaggt ggacaagcgc gtgggcacca agaccaagcc cccctgcccc 1500

atctgccccg gctgcgaggt ggccggcccc agcgtgttca tcttcccccc caagcccaag 1560

gacaccctga tgatcagcca gacccccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagcaag 1620

gagcacgccg aggtgcagtt cagctggtac gtggacggcg tggaggtgca caccgccgag 1680

acccgcccca aggaggagca gttcaacagc acctaccgcg tggtgagcgt gctgcccatc 1740

cagcaccagg actggctgaa gggcaaggag ttcaagtgca aggtgaacaa cgtggacctg 1800

cccgccccca tcacccgcac catcagcaag gccatcggcc agagccgcga gccccaggtg 1860

tacaccctgc ccccccccgc cgaggagctg agccgcagca aggtgaccgt gacctgcctg 1920

gtgatcggct tctacccccc cgacatccac gtggagtgga agagcaacgg ccagcccgag 1980

cccgagggca actaccgcac cacccccccc cagcaggacg tggacggcac cttcttcctg 2040

tacagcaagc tggccgtgga caaggcccgc tgggaccacg gcgagacctt cgagtgcgcc 2100

gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaga gcatcagcaa gacccagggc 2160

aagtgatga 2169

<210> 10

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gcaagagctt tactccttag tagcggcagt tcaagagact gccgctacta aggagtaaag 60

ctcttgcttt ttt 73

<210> 11

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

gacacctgat agagaatccc tctgagaatt tcaagagaat tctcagaggg attctctatc 60

aggtgtcttt ttt 73

<210> 12

<211> 1941

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

atggcatcag gaggagcttt ttgtcttatt gctaacgatg ggaaggccga caagattata 60

ttggcccaag acttgctgaa tagcaggatc tctaacatta aaaatgtgaa caaaagttat 120

gggaaacccg atcccgaacc cactttgagt caaatcgaag aaacacattt ggtgcatttt 180

aatgcgcatt ttaagcctta tgttccagta gggtttgaat acaataaagt acgcccgcat 240

acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 300

ttccatgata tggtgggcca tcatatattg ggtgcatgtc attcatcctg gcaggatgct 360

ccgattcagg gcacgtccca gatgggggcc catgggcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 420

ggatatgact gggacaacca aacaccctta gagggcgccg tttacacgct tgtagatcct 480

tttggaagac ccattgtacc cggcacaaag aatgcgtacc gaaacttggt ttactactgc 540

gaataccccg gagaacgact ttatgaaaac gtaagattcg atgtaaatgg aaattcccta 600

gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt gtgcgcaaat tttgcatccc aggggataaa 660

atgactggat ataagcactt ggttggccag gaggtatcgg tggagggaac cagtggccct 720

ctcctatgca acattcatga tttgcacaag ccgcaccaaa gcaaacctat tcttaccgat 780

gaaaatgata cgcagcgaac gtgtagccat accaacccga aatttctttc acagcatttt 840

cccgagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tatcacggac 900

gcaacgtatc tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct 960

aaatactatc agccccctct tgcgctctgg attaagttgc gcttttggtt taatgagaac 1020

gtgaaccttg ctattccctc agtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag 1080

cttgcatcgc aaaaggattt ggtgaatgaa tttcctggac tttttgtacg ccagtcacgt 1140

tttatagctg gacgccccag tagacgcaat atacgcttta aaccatggtt tatcccagga 1200

gtcattaatg aaatctcgct cacgaataat gaactttaca tcaataacct gtttgtaacc 1260

cctgaaatac acaacctttt tgtaaaacgc gttcgctttt cgctgatacg tgtccataaa 1320

acgcaggtga cccacaccaa caataaccac cacgatgaaa aactaatgtc tgctcttaaa 1380

tggcccattg aatatatgtt tataggatta aaacctacct ggaacatctc cgatcaaaat 1440

cctcatcaac accgagattg gcacaagttc ggacatgttg ttaacgccat tatgcagccc 1500

actcaccacg cagagataag ctttcaggat agagatacag ctcttccaga cgcatgttca 1560

tctatatctg atattagccc cgttacgtat ccgatcacat tacctattat taaaaacatt 1620

tccgtaactg ctcatggtat caatcttatc gataaatttc catcaaagtt ctgcagctct 1680

tacataccct tccactacgg aggcaatgcg attaaaaccc ccgatgatcc gggtgcgatg 1740

atgattacct ttgctttgaa gccacgggag gaataccaac ccagtggtca tattaacgta 1800

tccagagcaa gagaatttta tattagttgg gacacggatt acgtggggtc tatcactacg 1860

gctgatcttg tggtatcggc atctgctatt aactttcttc ttcttcagaa cggttcagct 1920

gtgctgcgtt acagtaccta a 1941

<210> 13

<211> 606

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

atggatttta ttttaaatat atccatgaaa atggaggtca tcttcaaaac ggatttaaga 60

tcatcttcac aagttgtgtt tcatgcgggt agcctgtata attggttttc tgttgagatt 120

atcaatagcg gtagaattgt tacgaccgct ataaaaacat tgcttagtac tgttaagtat 180

gatattgtga aatctgctcg tatatatgca gggcaagggt atactgaaca tcaggctcaa 240

gaagaatgga atatgattct gcatgtgctg tttgaagagg agacggaatc ctcagcatct 300

tcggagaaca ttcatgaaaa aaatgataat gaaaccaatg aatgcacatc ctcctttgaa 360

acgttgtttg agcaagagcc ctcatcggag gtacctaaag actccaagct gtatatgctt 420

gcacaaaaga ctgtgcaaca tattgaacaa tatggaaagg cacctgattt taacaaggtt 480

attagagcac ataattttat tcaaaccatt tatggaaccc ctctaaagga agaagaaaaa 540

gaggtggtaa gactcatggt tattaaactt ttaaaaaaaa taagctttta tctcacctac 600

atttaa 606

<210> 14

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

atgccctcta atatgaaaca gttttgcaag atttctgtat ggctacagca gcacgatcca 60

gatttattag aaattatcaa caacttatgt atgcttggca atttatccgc ggcaaagtac 120

aaacacggag ttaccttcat ttaccccaaa caggcaaaga tccgcgatga aataaaaaaa 180

catgcctact ccaatgaccc ttcacaagcc ataaagacct tagaatcact catccttcca 240

ttttacattc ccactccagc ggagttcacc ggggaaatcg gctcctacac cggagtgaaa 300

ttagaggttg aaaaaacgga ggcgaataaa gttattttaa aaaatggaga agcggtccta 360

gtaccggcgg ccgattttaa gccctttcct gatcgccgac tagcggtctg gatcatggag 420

tcaggctcta tgcccctgga gggtcccccc tataagcgga aaaaggaggg tggggggaat 480

gacccgccgg ttcctaagca tatctcgccg tatactccgc gcacgcgtat tgccattgag 540

gtggaaaagg cctttgatga ctgtatgcgt caaaactggt gtagtgtcaa taatccctat 600

cttgccaagt cggtctcctt gctgtctttc ttgtcgctca accatcccac cgagtttatt 660

aaggtactgc cgcttataga ctttgacccc ttggtgacct tttatctact tcttgagccc 720

tataaaacgc atggggatga ctttttaatt ccggaaacca ttttattcgg ccctaccgga 780

tggaatggta cagatctgta tcaaagtgcc atgctggagt ttaaaaagtt ttttacccag 840

attactcgcc aaacctttat ggacatagcc gattcggcta ctaaggaggt agatgttccc 900

atatgttact cggatcccga aaccgtacat tcctatgcca atcacgtgcg tactgaaatt 960

ttgcatcaca atgccgtcaa taaggttaca acacctaacc tcgtcgtgca ggcctataat 1020

gagctcgagc aaaccaatac catacgacat tacggcccta ttttcccgga aagtaccatc 1080

aacgcactgc gtttttggaa aaagctgtgg caggatgaac agcgatttgt tatccacggc 1140

ctgcaccgca cgttgatgga tcaacccacc tatgaaacct ctgagtttgc agagatcgtt 1200

agaaatttac ggttttcgcg tcccggcaat aactatataa acgagcttaa tattacaagt 1260

cccgctatgt acggcgacaa gcataccacc ggagatattg cgcccaatga tagatttgcc 1320

atgttggtgg cctttatcaa cagtactgac tttttataca ccgcgattcc cgaggaaaag 1380

gtagggggga atgaaaccca aaccagtagc cttacagacc tagttccaac acggctacac 1440

tcttttttaa atcataatct aagcaaactt aaaatcttaa accgcgcgca gcaaacggtt 1500

agaaatattc tttcaaatga ttgtcttaat caactgaaac attatgttaa acacacggga 1560

aaaaatgaaa tactaaagtt acttcaagaa taa 1593

<210> 15

<211> 7431

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

atgggtaacc gtggatcttc aacctctagt agaccactgc cttcatcaga agcaaatata 60

tatgcgaagt tacaggatca tatacaaaga caaactcgtc ctttttcagg gggaggatat 120

tttaatggcg ggggggacaa aaatcctgta caacacatta aagattatca catagactcc 180

gtatcgagta aagcaaagct gcggattata gaaggaatta tcagggcgat tgccaaaata 240

gggttcaaag tagacacaaa gcagcccatc gaagatattc ttaaagatat caaaaaacaa 300

ctgcccgatc ctcgagccgg ttccaccttt gtaaaaaatg cggaaaaaca ggagaccgtc 360

tgtaaaatga ttgcagacgc cattaaccag gaatttattg atttaggtca ggataagctt 420

atagatacca ccgaaggggc cgccagtata tgtcgacaaa tagttctgta cattaactcc 480

ctaactcatg gactgcgcgc agagtatctt gatgtacacg gcagtataga aaatacactt 540

gaaaatatca agctgttaaa cgacgccatt aagcaacttc acgagcgcat ggtgacggag 600

gtaaccaaag cagcccccaa tgaggaagtc attaatgcag tcaccatgat tgaagcagta 660

tatcgtcgac ttttaaatga acaaaacctg caaatcaaca ttttaacgaa ttttattgac 720

aatattttaa ctcccaccca aaaggaactt gataaactgc agacggatga ggtggatatt 780

attaaacttt taaatgatac aaatagtgtc ttgggaacca aaaattttgg aaaagtactt 840

tcgtacacac tttgtaatct aggtattgct gcgtctgttg cgaataaaat taataaggct 900

ctccagaaag taggactcaa ggttgaacag taccttcaaa gcaaaaactg ggcggagttt 960

gacaaggagc ttgacctcaa aaggtttagt ggtcttgtct ccgcagaaaa cattgctgag 1020

tttgaaaaag ccgtgaacct gttgcgacag acctttaatg aacgccacaa aatccttgag 1080

aacagttgtg ccaaaaaggg gggcgatgag gagaaaacgc cactagatag gaggattgaa 1140

gcgcaaagac tggatagaaa gcacatcctc atggaatttt tgaataaaag cacacaagcc 1200

tataacgact ttttggaaaa tgtgaaaaaa ataggcatca aacttgttaa agaaattgcc 1260

ttgacgccga acataacgag gcttcgagat gctctttcgc gcattaatga tatgggcacc 1320

atcgcacttg atctaagtct tatcggcttt tacaccaatg cggccgcacg agaagaacgc 1380

gaaaccttct taacacagct tacgcttgtt aaaaatgttt tggaggagat atctaaaacc 1440

gaccctaatt ttaaaaatct ttatgactcc tgctctcgct tgctacagat tattgatttt 1500

tataccgata ttgtgcaaaa aaagtatgga ggcgaggagg actgcgagtg tacaagggta 1560

ggcggtgctg ccctaacagt tgaagagctt gggctcagca aggccgcgcg atcgcaggtt 1620

gacctcaacc aggcaattaa cacctttatg tattactatt atgtggccca gatttactcc 1680

aatttaacgc ataacaaaca ggagtttcaa tcctacgagg aaaactatgc cactattctc 1740

ggagatgcta ttgcgggacg cctcatgcag ttggatacgg aaaaaaatgc gcgcattaat 1800

tctccggctg tagatcttgc cagaggacac gtgggcccaa atcctggagg tgcccaggaa 1860

gtagactgga aggcaaccgt aagcgccatc gagctggagt atgatgtaaa acgccgattc 1920

tatcgagctc tggaagggct agatctttat cttaaaaaca ttaccaaaac gtttgtaaac 1980

aacatagatt ctattcaaac agtccaacag atgctggatg gcgtgcgcat tataggacga 2040

tggttcaccg agacaacagg ggacacgctt gcacaagtct ttgaaagttt tcccacctcc 2100

acaggcaacg actccaacgt ctttacggat aatgctcctg cgggccacta ctacgaaaaa 2160

gttgcggctg aaatccaaca aggccgaagc gttggtaccc tccgtcccgt cagagcaagc 2220

caggctaaaa acattcgcga ccttatcggg cgctctcttt ctaactttca ggcgcttaaa 2280

aatatcatca atgcctttgc ccggattggg gacatgcttg ggggagagga gctgcggcaa 2340

atggtgccca tgtcgcccct gcaaatctat aaaaccttgc ttgaatatct tcaacattct 2400

gcgctttccg tgggacttaa aaatctaaat caatcagaaa ttggaggaca aaggatggcg 2460

cttgcacaga ctgccgagga agcggctcag cgggtctacc tctctactgt gagagttaac 2520

gacgccctat caacccgctg ggaaaccgag gacgtcttct tcaccttcat gctgaaaagt 2580

atggccgcca agatttttat tgtattaggg atttacgaca tgtttgaacg gcctgagccc 2640

gtgtacaaac ttatacccac gcgtatgata ttggggggtg ccgatgagct agagcccgag 2700

gtaattcccg aggcagcaga gctttacttc cgccttcccc gcctcgccga attttatcaa 2760

aagttgtttt cctttagaga tgaaaatgta cagatctcga tgcttcctga gctggaagga 2820

atcttctcag gacttattcg cattatcttt atgcgtccta ttgagcttat taacattggt 2880

gactactcag aaaccgaaat tcgtcagctt atcaaagaaa taaacgtcat ttaccaacac 2940

tttaacttag agtatggtga acaagaagca accaaaaaag cgcttatcca ttttgtaaat 3000

gaaataaacc gcagattcgg tgtcattaca cgcaccgaat gggaaaaatt tcaacgcatt 3060

gttcaggaag cgcgaactat gaatgatttt ggaatgatga atcaaaccaa ctactccatt 3120

cttcctgatg aggatggcta tacacaatcc tcacaattac ttccctccga taggtttatt 3180

agtccttcaa cccagcctac ccccaagtgg cgcccggcac tatacaatat agactctgtg 3240

gatgtccaaa caggaatgct gcagcccaac tcccagtggg atttggtaca aaaatttagg 3300

aaacagctta gtgagatgtt tgaagatccc agtctgcaac aagaattggg caaaatttcc 3360

taccaagaac tcattcgcca ggctatcaat gaactcaaaa aggagcatac cgataaaatt 3420

caaatcgttt caaaacttat tcaaggctct gagtcactgg cagatacaga tgttaacaaa 3480

atatttctgt ttcatgaaac cgttattaca ggtcttaact tattgagtgc tatttacgta 3540

cttcttaata actttcgtaa taacattaaa ggtttagacc tagatacgat tcaaaaaagc 3600

attatcgaat ggttacgaga gacacaagct gccaacgtga accgcgccaa tcttattgac 3660

tggctcggaa gaaaacacgg ggccatctct gagattagaa atccaggatt agtcattaaa 3720

gaaatcaata tgcggctttc tatggtgtac cctgatccca ctaccgaagc ggctgcagca 3780

gcccaagacc gaaatttaac cacagaaact ctttttgctt ggattgtacc atatgtgggt 3840

attcctgctg gtggaggagt tcgtccggag caagagttgg ccgcaaggta tttagtagat 3900

aatcagcgaa tcatgcagct cctgttgacc aatatcttcg aaatgacctc cagttttaac 3960

aaaatggttc aagttcgctt ccctgaaacc agcaccgctc aagtgcattt agattttaca 4020

ggtcttattt ccttaattga ttctttgatg gccgacacga agtattttct tgatcttcta 4080

cgcccgcata ttgataaaaa cattattcaa tactatgaaa atagatctaa tcctggctca 4140

ttttactggt tggaagaaca tttaattgac aaacttatta aaccacctac cgatgccgga 4200

ggaaggccgc ttcctggcgg tgaattgggc ctggaggggg ttaaccaaat cattaataaa 4260

acctacacct tgcttacaaa gccttataat gtactgcaac ttcgaggtgg ggcgcaaaga 4320

agggacgcgg ctaatattca aataaataac aatccccaat cctctgaacg ctttgaacaa 4380

tacggaagag tattcagtag actcgtattt tacgatgctt tggagaataa ctctggactt 4440

cgtgtagagc aggtggcact aggagacttt agactctcca atcttattcg taccaacaac 4500

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gtcaatgatg ccgcaaacaa ccttcgacgt tatcgcctat acggatcaga ctatggtatt 4620

caaaataatc gtagtatgat gatggtgttt aaccagctca tagcttcata tattacccga 4680

ttttatgatg ctcccagcgg aaaaatatat ctaaatctta ttaatgcatt cgctaatggg 4740

aactttagcc aagcagtgat ggagatggga tatgctcacc ctgacttagc acgcaataac 4800

aacgtctttg gtcatagagg cgaccccaca gagcagtcgg tgcttcttct gtctttggga 4860

cttatacttc agcggcttat taaggatacc aatcgccagg gcctgagtca gcatcttatt 4920

tctactttaa cagaaattcc catttacctt aaagaaaatt atagagccaa tcttccacta 4980

tttaacaaaa tgtttaatat tcttattagc cagggagagc ttctaaaaca atttatacaa 5040

tacacaaatg tccaactagc tcgccctaat ctgacggcac tcttgggagc caataatgat 5100

tccgttattt attataataa taacaatgtt cctgcgacag gactatccgt cggtcaggcg 5160

gccctgcggg gaattggcgg cgtatttcgt cccaatgtta cgcttatgcc cctaggagac 5220

gcacaaaata atacgagcga tgttgtgcga aagcgactgg tcgcagtgat cgacgggatc 5280

attagaggct ctcacactct ggcagattct gccatggagg tcctgcacga gcttaccgat 5340

catcccatct atcttgaaac agaagaacac ttcattcaaa actatatgtc ccggtacaat 5400

aaggagcctc ttatgccatt ttcactttcg ctctattatt tacatgacct aagaatagaa 5460

aataatgagg tatatgatcc tcttctttac ccgaaccttg aaagcggctc ccccgagttt 5520

aaactactat acggcacaag aaaattactg ggaaatgatc cggtacagct ctcagatatg 5580

cccggagtac agcttatcat gaaaaactat aatgaaacgg tagttgctcg cgaacaaatt 5640

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cttattagcg agaacagaga cgataaaccc attataacag cgggaatagg gatgaatgca 5820

gtgtattcgc ttcgtaaaac attgcaagac gtaatttcct tcgtggaaag ctcttaccaa 5880

gaggagcaaa tcaatcatat tcacaaaata gtgtcgccga aaggtcaaac acgcactctt 5940

ggctctaata gagagcgcga gcgcatattt aacttgtttg atatgaatat tatacctatc 6000

aatgtaaatg cgctgatgcg atctatacca cttgccaata tttacaacta tgactatagt 6060

tttgaagaaa ttgcttgtct tatgtacggc atttcggctg aaaaagtacg atctctggac 6120

accacggctc ctcaaccaga tgttgcagag gtattaaaca ttccgaatcg tccccccata 6180

aatactcgag aatttatgct aaaacttctt ataaacccct atgtctcggt ctctattact 6240

caatatggga atgagttact atccaaaggc aacgccggat acatgtcacg catctttaga 6300

ggggacaacg cgctaaatat gggccgccct aaatttcttt ctgaccaaat tttcaataaa 6360

gtgctatttg gaagccttta tcctacacaa tttgattatg acgaggcagg tcctagtttg 6420

gccgcaggta ttcaacgtgg acgtgagcgg tggggccatc ccatgtcaat atacataaac 6480

caggccttac atgaaattgt gcgtactata cgattggctg aaacagttcg aggtttaaga 6540

aatgttattg atagaaacca aattataggc gagttaaatg catttaggac tcagcttgaa 6600

gatacacgaa gagaagtgaa taatctaata caaacacctg aaattcaaaa caatccaacc 6660

cctgagatca tcgctgccat tcaaaactgg gtacaacaat atcgaggtca aataaccaat 6720

ttaatcgatc ttataggaaa tgccgggcaa gccaattcga tgataaattt aatacaaaat 6780

attacgcccc aaacagccgg tgcacaatta accgctttat tcaacatacg tggattacct 6840

gccccgcctc cccgtcaagc attacaaaat gatattgaag caatgcaatg gtttatgaca 6900

atggttataa accatccacc tgttttaata gcacccttca tgctactcgt aaataacctt 6960

aaggaatttt taaatacgct agaacgatat gtttataaaa ctccacgatg gttgggtccc 7020

ggtacagccc gaattgcaca accgccagtt ggaatggcac caggtattaa tatgcgacat 7080

catacctcat atacagaaaa tagtgtgctg acctatatca cggaacaaaa tcgggaagaa 7140

ggaccctggt ccatcgttaa acaagtggga gttggaatac aaaagcccac cttagtacaa 7200

attggaaagg atcgctttga cactcgcctc atacgcaatc taatatttat tacaaatata 7260

cagcgactat tacgactgcg tctaaaccta gaactctcgc agttcagaaa tgtgcttgtc 7320

agtcctgacc acattataaa ccccagcatt acagagtatg ggttctccat cacaggaccc 7380

agtgagacct tctcagataa acagtatgat agtgatattc ggattttata a 7431

<210> 16

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

atggccccaa cctcagcctt cctcacggcc ctggtgctac tcagctgcaa tgccatctgc 60

tctctgggct gtgacctgcc tcagacccac agcctggctc acaccagggc cctgaggctc 120

ctggcacaaa tgaggagaat ctctcccttc tcctgcctgg accacagaag ggactttgga 180

tcccctcatg aggcttttgg gggcaaccag gtccagaagg ctcaagccat ggctctggtg 240

catgagatgc tccagcagac cttccagctc ttcagcacag agggctcggc tgctgcctgg 300

aatgagagcc tgctgcacca gttctacact ggactggatc agcagctcag ggacctggaa 360

gcctgtgtca tgcaggaggc ggggctggaa gggacccccc tgctggagga ggactccatc 420

cgggctgtga ggaaatactt ccacagactc accctctatc tgcaagagaa gagctacagc 480

ccctgtgcct gggagatcgt cagggcagaa gtcatgagat ccttctcttc ctccagaaac 540

ctgcaagaca gactcaggaa gaaggagtga 570

<210> 17

<211> 561

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

atggctaaca agtgcatcct ccaaatcgct ctcctgatgt gtttctccac cacagctctt 60

tccatgagct atgatgtgct tcgataccaa caaaggagca gcaatttggc atgtcagaag 120

ctcctgggac agttgcctgg gactcctcaa tattgcctcg aagataggat gaactttgag 180

gtccctgagg agattatgca accaccacaa ttccagaagg aagatgcagt attgattatc 240

cacgagatgc tccagcagat cttcggcatt ctcagaagaa atttctctag cactggctgg 300

aatgaaaccg tcattaagac tatccttgtg gaacttgatg ggcagatgga tgacctggag 360

acaatcctgg aggaaatcat ggaggaggaa aatttcccca ggggagacat gaccattctt 420

cacctgaaga aatattactt gagcattctg cagtacctga agtccaagga gtacagaagc 480

tgtgcctgga cagtcgtcca agtggaaatc ctcaggaact tttctttcct taacagactt 540

acagattacc tccggaactg a 561

<210> 18

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

tccttgaact ttgatctgct caagttggca ggggacgtgg agtccaaccc tggg 54

<210> 19

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 19

Ser Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn

1 5 10 15

Pro Gly

<210> 20

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

atgagttata caacttattt cttagctttt cagctttgcg tgactttgtg tttttctggc 60

tcttactgcc aggcgccctt ttttaaagaa ataacgatcc taaaggacta ttttaatgca 120

agtacctcag atgtacctaa tggtggacct cttttcttag aaattttgaa gaattggaaa 180

gaggagagtg acaaaaaaat aattcagagc caaattgtct ccttctactt caaattcttt 240

gaaatcttca aagataacca ggccattcaa aggagcatgg atgtgatcaa gcaagacatg 300

tttcagaggt tcctaaatgg tagctctggg aaactgaatg acttcgaaaa gctgattaaa 360

attccggtag ataatctgca gatccagcgc aaagccatca gtgaactcat caaagtgatg 420

aatgatctgt caccaagatc taacctaaga aagcggaaga gaagtcagac tatgttccaa 480

ggccagagag catcaaaata a 501

<210> 21

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

atggccccaa cctcagcctt cctcacggcc ctggtgctac tcagctgcaa tgccatctgc 60

tctctgggct gtgacctgcc tcagacccac agcctggctc acaccagggc cctgaggctc 120

ctggcacaaa tgaggagaat ctctcccttc tcctgcctgg accacagaag ggactttgga 180

tcccctcatg aggcttttgg gggcaaccag gtccagaagg ctcaagccat ggctctggtg 240

catgagatgc tccagcagac cttccagctc ttcagcacag agggctcggc tgctgcctgg 300

aatgagagcc tgctgcacca gttctacact ggactggatc agcagctcag ggacctggaa 360

gcctgtgtca tgcaggaggc ggggctggaa gggacccccc tgctggagga ggactccatc 420

cgggctgtga ggaaatactt ccacagactc accctctatc tgcaagagaa gagctacagc 480

ccctgtgcct gggagatcgt cagggcagaa gtcatgagat ccttctcttc ctccagaaac 540

ctgcaagaca gactcaggaa gaaggagtga tccttgaact ttgatctgct caagttggca 600

ggggacgtgg agtccaaccc tgggatggct aacaagtgca tcctccaaat cgctctcctg 660

atgtgtttct ccaccacagc tctttccatg agctatgatg tgcttcgata ccaacaaagg 720

agcagcaatt tggcatgtca gaagctcctg ggacagttgc ctgggactcc tcaatattgc 780

ctcgaagata ggatgaactt tgaggtccct gaggagatta tgcaaccacc acaattccag 840

aaggaagatg cagtattgat tatccacgag atgctccagc agatcttcgg cattctcaga 900

agaaatttct ctagcactgg ctggaatgaa accgtcatta agactatcct tgtggaactt 960

gatgggcaga tggatgacct ggagacaatc ctggaggaaa tcatggagga ggaaaatttc 1020

cccaggggag acatgaccat tcttcacctg aagaaatatt acttgagcat tctgcagtac 1080

ctgaagtcca aggagtacag aagctgtgcc tggacagtcg tccaagtgga aatcctcagg 1140

aacttttctt tccttaacag acttacagat tacctccgga actga 1185

<210> 22

<211> 241

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

c 241

<210> 23

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

aggggaaaga ctgctgtgta cagtatatcc gtgggtggtg ccgatgtcgt tttcaagcct 60

catcagagtt ctgaacccat gcacttctgt atgacgtggg agtccacctc agggattaca 120

gagctctggg tggacgggaa gcccatggtg aggagaagtc tgaagagggg ctactctctg 180

gggacacagg caagcatcat cctggggcag gagcaagatg catttgctgg gggctttgag 240

aagaaccagt gtttggtggg agacattgga gatgtgaaca tgtgggacta tgtgttgtca 300

ccggaggaga ttaacactgt ctatgctggt gggaccttca gtcctaatgt ccttaactgg 360

aggtaa 366

<210> 24

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

cgcaagagct ttactcctta gtagcggcag ttcaagagac tgccgctact aaggagtaaa 60

gctcttgctt tttta 75

<210> 25

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

agcttaaaaa agcaagagct ttactcctta gtagcggcag tctcttgaac tgccgctact 60

aaggagtaaa gctcttgcgg tac 83

<210> 26

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

cgacacctga tagagaatcc ctctgagaat ttcaagagaa ttctcagagg gattctctat 60

caggtgtctt tttta 75

<210> 27

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

agcttaaaaa agacacctga tagagaatcc ctctgagaat tctcttgaaa ttctcagagg 60

gattctctat caggtgtcgg tac 83

Claims

1.一种重组腺相关病毒载体的组合的制备方法，其特征在于包括：

以所述第一AAV载体、第二AAV载体、第三AAV载体、第四AAV载体分别转染宿主细胞，经培养和后处理，获得重组腺相关病毒载体的组合，所述的组合为第一重组腺相关病毒载体、第二重组腺相关病毒载体、第三重组腺相关病毒载体与第四重组腺相关病毒载体的混合物，所述第一重组腺相关病毒载体、第二重组腺相关病毒载体、第三重组腺相关病毒载体、第四重组腺相关病毒载体分别对应于第一AAV载体、第二AAV载体、第三AAV载体、第四AAV载体；

所述重组猪α干扰素的编码基因为Seq ID No：16所示序列，

所述重组猪β干扰素的编码基因为Seq ID No：17所示序列，

所述重组猪γ干扰素的编码基因为Seq ID No：20所示序列，

所述重组非洲猪瘟病毒中和抗体的编码基因所含重链编码基因为SEQ ID NO:7所示序列，所含轻链编码基因为SEQ ID NO:8所示序列，

所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白P72的编码基因为Seq ID No：12所示序列，

所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白P30的编码基因为Seq ID No：13所示序列，

所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白PP62的编码基因为Seq ID No：14所示序列，

所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白PP220的编码基因为Seq ID No：15所示序列，

所述能够针对非洲猪瘟病毒A104R基因转录出shRNA的DNA序列为Seq ID No：10所示序列，

所述能够针对非洲猪瘟病毒I215L基因转录出shRNA的DNA序列为Seq ID No：11所示序列。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述第一AAV载体包括如下重组表达载体中的至少一种：

将所述重组猪γ干扰素的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体；

和/或，所述第二AAV载体是通过将所述重组非洲猪瘟病毒中和抗体的重链编码基因和轻链编码基因通过连接肽连接，再克隆到pAAV载体上而得；

和/或，所述第三AAV载体包括如下重组表达载体中的至少一种：

将所述重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白PP220的编码基因克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体；

和/或，所述第四AAV载体包括如下重组表达载体中的至少一种：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：用于形成所述第一AAV载体、第二AAV载体、第三AAV载体的pAAV载体的启动子包括CAG启动子或者CMV启动子，和/或，用于形成所述第四AAV载体的pAAV载体的启动子包括U6启动子，和/或，所述第一AAV载体、第二AAV载体中所采用的连接肽包括FMDV 2A肽。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：

以所述第一AAV载体、第二AAV载体、第三AAV载体中的任意一种或多种与pHelper载体、pAAV-RC载体转染宿主细胞，并进行培养和后处理；

和/或，以所述第四AAV载体与pHelper载体、pAAV-RCM载体转染宿主细胞，并进行培养和后处理，其中所述pAAV-RCM载体是通过将优化的猪巨噬细胞C反应蛋白基因连接到pAAV-RC质粒的BfuA I酶切位点处而获得，所述优化的猪巨噬细胞C反应蛋白基因为Seq ID No：23所示序列。

5.由权利要求1-4中任一项所述方法制备的重组腺相关病毒载体的组合。

6.表达载体的组合，包括：

第一AAV载体，包括如下重组表达载体中的至少一种：

第三AAV载体，包括如下重组表达载体中的至少一种：

第四AAV载体，包括如下重组表达载体中的至少一种：

将能够针对非洲猪瘟病毒I215L基因转录出shRNA的DNA克隆到pAAV载体上而得的重组表达载体；

所述重组猪α干扰素的编码基因为Seq ID No：16所示序列，

所述重组猪β干扰素的编码基因为Seq ID No：17所示序列，

所述重组猪γ干扰素的编码基因为Seq ID No：20所示序列，

7.根据权利要求6所述表达载体的组合，其特征在于：用于形成所述第一AAV载体、第二AAV载体、第三AAV载体的pAAV载体的启动子包括CAG启动子或者CMV启动子；和/或，用于形成所述第四AAV载体的pAAV载体的启动子包括U6启动子；和/或，所述第一AAV载体、第二AAV载体中所采用的连接肽包括FMDV 2A肽。

8.免疫组合物，其特征在于包括：权利要求5所述重组腺相关病毒载体的组合，以及，药物学上可接受的佐剂。

9.权利要求5所述重组腺相关病毒载体的组合、权利要求6或7所述表达载体的组合或者权利要求8所述免疫组合物在制备非洲猪瘟病毒的检测试剂、用于在受试动物中诱导针对非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂或者用于预防动物受非洲猪瘟病毒感染的药剂中的用途。

10.权利要求5所述重组腺相关病毒载体的组合、权利要求6或7所述表达载体的组合或者权利要求8所述免疫组合物在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的用途。