CN115927441A - 玉米基因afb1在调控玉米株高性状中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子遗传学领域。具体涉及玉米基因AFB1在调控玉米株高性状中的应用。本发明提供了一个调控玉米株高基因AFB1及其编码蛋白的序列，且公开了利用基因工程手段突变AFB1基因以降低玉米株高的方法。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学领域。具体涉及调控玉米基因AFB1在调控玉米株高性状中的应用。本发明提供了一个调控玉米株高基因AFB1及其编码蛋白的序列，且公开了利用基因工程手段突变AFB1基因以降低玉米株高的方法。
背景技术
F-box蛋白包含一个F-box基序,是SCF复合体的一个亚基,它决定了底物识别的特异性。在泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)中，F-box蛋白因特异识别底物蛋白而参与细胞周期调控、转录调控、细胞凋亡、细胞信号转导等生命活动。目前,从各种植物中已鉴定出大量的F-box蛋白质，它们参与了植物激素(乙烯,生长素,GA,JA)的信号传导以及自交不亲和、花器官发育等生物学过程，以及植物的胁迫反应(秘彩莉，刘旭，张学勇.F-box蛋白质在植物生长发育中的功能[J].遗传，2006，28(10)：1337-1342.)。
根据生物信息学预测的结果，玉米中的F-box蛋白多达有322个，但仅有极少数成员的功能得到了初步的研究，例如调控玉米分枝数性状的F-box基因Zm00001d053358(秦心儿.一个调控玉米雄穗分枝数的F-box基因的鉴定和功能解析[D].湖北：华中农业大学，2021)。绝大多数F-box基因和编码蛋白的功能有待进行深入的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于明确玉米F-box基因AFB1和编码蛋白的功能。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种蛋白在调控玉米株高性状中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种核酸在调控玉米株高性状中的应用，其特征在于：所述核酸编码权利要求1所述的蛋白。
在一些实施方案中，上述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种降低玉米株高的方法，其特征在于：抑制玉米中上述蛋白的表达和/或活性，选择玉米株高降低的植株。
在一些实施方案中，上述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中任一种。
在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。
在一些实施方案中，上述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供一种用于降低玉米株高的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)能够识别上述靶标序列的RNA分子；该RNA分子可以是包含gRNA、crRNAs和tracrRNA结构的sgRNA分子，也可以是gRNA、crRNAs和tracrRNA单独形成的复合体，或包括gRNA、crRNAs的复合体；在一些实施方案中，上述的RNA分子的序列如SEQ ID NO.5所示。
(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；
(3)表达(1)所述RNA的载体。
本发明还提供一种玉米突变基因，其特征在于：上述突变基因序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
本发明还提供上述的突变基因在降低玉米株高中的应用。这些突变基因或突变蛋白可以通过常规杂交授粉的方式转育到其他玉米材料或玉米品种中，从而用于降低玉米株高，培育新的矮秆玉米。
本发明的优点及有益效果如下：玉米中的F-box基因成员数量庞大，且参与的生物学过程复杂，难以推断其调控的性状。本发明通过筛选玉米中的部分F-box基因成员，并根据参考基因组序列设计编辑位点，并使用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制每个F-box基因的编辑突变材料，并对这些编辑材料的表型性状进行调查，以明确特定F-box基因的功能和调控的性状。本发明利用CRISPR/Cas9方法突变该基因，发现AFB1基因能够调控玉米株高性状，这是之前没有报道过的。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法和编辑后的突变基因，可以降低玉米株高，创制矮化玉米品种，从而提高玉米产量，降低倒伏率，提高种植效率，方便机械化收获。
附图说明
图1利用CRISPR/Cas9技术突变玉米AFB1基因蛋白后的株高表现。左图为玉米整株照片，右图为去除叶片的植株照片。每张图左边为未编辑植株，右边为编辑植株。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方案中，所分离的核酸可以包含在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸的少于约0.5kb的核苷酸序列。
在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。
本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。
在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。
在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
实施例1玉米F-box基因筛选
鉴于F-box基因成员数量庞大，且参与的生物学过程复杂，难以推断其调控的性状。本发明通过筛选部分玉米中的F-box基因成员，并根据参考基因组序列设计编辑位点，并使用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制每个F-box基因的编辑突变材料，并对这些编辑材料的表型性状进行调查，以明确特定F-box基因的功能和调控的性状。
F-box结构域长度大约为50个氨基酸，通常处于蛋白质的N端，与Leucine RichRepeats(LRRs；PF00560,PF07723)和WD repeat(PF00400)相关。在Pfam网站上下载F-boxdomain的hmm文件(PF00646)，并用HMMER软件在B73 v5版本注释氨基酸文件中搜索可以编码F-box domain的序列，共找到385条序列(对应205个基因)。从中继续挑选可以编码LRRs或WD repeat的22个基因进行突变体创制，这些基因的编号如下：Zm00001eb031170、Zm00001eb066980、Zm00001eb066990、Zm00001eb067010、Zm00001eb091260、Zm00001eb145730、Zm00001eb152580、Zm00001eb205780、Zm00001eb207690、Zm00001eb235810、Zm00001eb246170、Zm00001eb249570、Zm00001eb276590、Zm00001eb288390、Zm00001eb354200、Zm00001eb354560、Zm00001eb386390、Zm00001eb411850、Zm00001eb413420、Zm00001eb413520、Zm00001eb421340、Zm00001eb431140。
实施例2基因编辑敲除候选基因分析基因功能
本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对上述基因进行定点突变。实施方式包括基因编辑载体的构建、玉米的遗传转化以及编辑效果的功能验证。具体如下：
1.基因编辑载体的构建
本发明通过BsaI酶切，切去骨架载体pCXB053中的ccdB序列，把靶标序列(如SEQID NO.4所示)通过T4连接酶连接到U6和gRNA之间。具体的构建流程如下：
1)合成引物
Primer TF：ATTGGGGCTCAGAGTGAACCTCC；
Primer TR:AAACGGAGGTTCACTCTGAGCCC。
在上海生工合成，用超纯水溶解后混合均匀。
2)配Annealing Buffer TE
Tris-HCl PH8.0 10mM
EDTA 0.1mM
NaCl： 50mM
3)退火连接
连接体系：
Annealing Buffer 50μL
Mix Primer 5μL
连接程序：
95℃ 3min
0.1℃/s匀速下降
20℃ 1min
储存在-20℃
4)骨架载体用BsaI限制酶酶切
酶切体系：
37度酶切5h后，直接回收(使用quangen回收试剂盒)。
回收产物加水稀释到50ng/μL，加等量的T4 Buffer稀释，存放于-20℃。
5)T4酶连
酶连体系：
酶连程序：
25℃ 2h(PCR仪中)
6)转化大肠杆菌
酶连反应液10μL与100μL大肠杆菌5α感受态混合，严格静置冰浴30min，42℃热激35s，冰浴2min，加入500L无抗生素LB，37℃震荡复苏1h。3000g离心1分钟，吸走上清液，留下100μL液体吹打混匀细菌细胞后涂皿(含50mg/L卡那霉素的固体培养基)，37℃倒置培养12h。
挑取阳性克隆测序和抽提质粒。测序验证引物为PUV3-R：CTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAA。
2.玉米遗传转化
将载体通过电击法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米自交系KN5585(未米生物科技(江苏)有限公司选育的自交系)的幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0mL农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养2周，然后转到含8mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周。再将愈伤转移至分化培养基2中，光照培养2周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
3.基因编辑植株的性状评价
对T1代材料提取苗期DNA检测基因编辑情况，设计引物扩增靶标编辑区段，扩增体系为：DNA：3μL，双向引物各1μL，2×TaqMix：7.5μL，ddH2O：2.5μL，总体积10μL。PCR反应条件如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃40秒，(3)57℃30秒，(4)72℃60秒，(5)从(2)步－(4)步循环35次，(6)72℃7分钟，(7)4℃保存。PCR产物测序。将转化株测序结果与野生型KN5585的基因组比对，发生碱基替换、插入或缺失的材料即为阳性编辑材料，否则为阴性材料。经过对各基因编辑材料的表型鉴定，发明人意外发现，Zm00001eb421340基因的编辑植株的株高发生了变化(图1)。
进一步对Zm00001eb421340基因(命名为AFB1)编辑植株进行深入分析。该基因共获得2个独立转化事件。对靶标编辑区段的序列分析结果显示，有2个转化事件(KO1和KO2)的基因发生了编辑，它们分别多插入了一个A和一个C(见表1，编辑后的基因序列如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示)，而单碱基的插入均导致蛋白翻译的提前终止，蛋白质的结构被完全破坏。调查编辑植株授粉后期的株高，发现编辑植株的株高比未编辑植株显著降低(数据见表2)，表明突变该基因或抑制其编码的蛋白可以降低玉米株高，培育矮秆玉米。
表1 AFB1基因编辑玉米材料靶标序列信息
黑体表示插入的碱基，下划线标注PAM序列。
表2AFB1基因编辑玉米材料的株高性状数据
数据以“平均值±标准差”表示，“(+)”表示编辑材料；“(-)”表示分离出来的未编辑材料。
通过参考基因组数据库查询可知，AFB1基因组序列如SEQ ID NO.2所示。cDNA序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种蛋白在调控玉米株高性状中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.一种核酸在调控玉米株高性状中的应用，其特征在于：所述核酸编码权利要求1所述的蛋白；任选地，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
3.一种降低玉米株高的方法，其特征在于：抑制玉米中权利要求1所述蛋白的表达和/或活性，选择株高降低的玉米植株。
4.根据权利要求3所述降低玉米株高的方法，其特征在于：所述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中任一种。
5.根据权利要求4所述降低玉米株高的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。
6.根据权利要求5所述降低玉米株高的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
7.一种用于降低玉米株高的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)能够识别权利要求6中所述靶标序列的RNA分子；
(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；
(3)表达(1)所述RNA的载体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的RNA分子的序列如SEQ ID NO.5所示。
9.一种玉米突变基因，其特征在于：所述突变基因序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
10.权利要求9所述的突变基因在降低玉米株高中的应用。
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| CHUNWEN YANG 等: "Overexpression of ZmAFB2, the maize homologue of AFB2 gene, enhances salt tolerance in transgenic tobacco", 《PLANT CELL TISS ORGAN CULT》, 19 August 2012 (2012-08-19), pages 171 - 179, XP035165737, DOI: 10.1007/s11240-012-0219-5 * |
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