CN115927220A - 单加氧酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种单加氧酶突变体及应用。其中，该单加氧酶突变体，包括(a)具有SEQID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)在(a)中的所述氨基酸序列的如下至少一个位点：W60，Y65，D71，Y77，D163，V166，S178，T179，T199，G200，S201，R222等，经过氨基酸突变且具有单加氧酶功能的蛋白质；(c)与(a)和(b)中任一项限定的所述氨基酸序列具有80％以上同源性且具有单加氧酶功能的蛋白质。能够解决现有技术中的单加氧酶活性低的问题，适用于酶催化领域。
Description
技术领域
本发明涉及酶催化领域，具体而言，涉及一种单加氧酶突变体及应用。
背景技术
手性亚砜是一类手性有机硫化合物，广泛用作不对称催化的手性助剂或配体，和医药工业中的生物活性分子。许多手性亚砜都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活性、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异，通常一种对映体是有效的，而另一种对映体则是低效或无效的。例如：作为手性亚砜类消化道药物的奥美拉唑和兰索拉唑，对映体纯度对该类药物的药效有很大影响。左旋的奥美拉唑即埃索美拉唑，药效优于右旋体；右旋的兰索拉唑药效优于左旋体。因此，如何高立体选择性地构建含手性中心的化合物在医药研发中有着重要意义。
手性亚砜可以采用化学方法和生物方法来合成，化学方法包括手性辅剂诱导、手性拆分和不对称催化等方法。然而，在合成过程中存在一些明显的缺点，如使用有害的氧化剂和有机金属试剂。此外，高光学纯度亚砜的效率不足以实现，异构体的下游去除又通常会比较棘手。与之相比，利用生物法实现手性亚砜的合成，由于相对温和的反应条件和无毒废物产生的“绿色”优势，以及更好的对映选择性和非对映选择性，越来越多的受到人们的青睐。但是，野生型的单加氧酶普遍存在的底物范围窄，活性低，稳定性差，选择性不够高，副产物砜生成等问题。我们可以通过定向进化的方法对单加氧酶进行改造，提高酶的各种性质，从而使其可以被用于工业化生产中。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种单加氧酶突变体及应用，以解决现有技术中的问题单加氧酶活性低、产品手性不足、杂质砜较多的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种单加氧酶突变体，包括(a)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)在(a)中的所述氨基酸序列的如下至少一个位点：W60，Y65，D71，Y77，D163，V166，S178，T179，T199，G200，S201，R222，T223，H337，P338，K342，R343，S344，R365，I393，F395，D396，A397，L448，D505，S506，Y508或R509，经过氨基酸突变且具有单加氧酶功能的蛋白质；(c)与(a)和(b)中任一项限定的所述氨基酸序列具有80％以上同源性且具有单加氧酶功能的蛋白质。
进一步地，(b)的氨基酸突变各自独立地选自如下：D163V或D163A或D163E；V166S或V166Y或V166M或V166C或V166D或V166H或V166I或V166N或V166K或V166M或V166L或V166A或V166T或V166P或V166G或V166F；H337Y或H337M或H337K或H337P或H337F或H337A或H337L或H337E或H337D或H337R；P338A或P338M或P338L或P338Y；K342A或K342E或K342L或K342Y；R343A或R343Y或R343H或R343V；S344F或S344Y或S344L或S344M或S344K或S344A或S344T或S344N或S344R或S344D或S344E；R365A或R365G或R365D或R365T或R365Y；I393A或I393K或I393P或I393W或I393R或I393C或I393M或I393T或I393V或I393Y或I393G或I393L；F395S或F395Q或F395V；D396A或D396R或D396S或D396F或D396H或D396Q或D396K；A397V或A397L或A397I或A397M或A397R或A397H或A397W；其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸；优选地，所述(c)中，与(a)或(b)中限定的所述氨基酸序列具有85％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选99％以上同源性且具有单加氧酶功能的蛋白质。
进一步地，单加氧酶突变体的突变包括如下任意一种氨基酸突变：D163V；D163A；D163E；A397V；A397L；A397I；V166S；V166Y；V166M；I393A；I393K；I393P；D396A；D396R；D163A+A397L；D163A+A397V；D163A+A397I；D163A+A397M；D163A+A397R；D163A+A397H；D163A+A397W；D163A+I393W；D163A+I393R；D163A+I393C；D163A+I393L；D163A+I393M；D163A+I393T；D163A+I393V；D163A+I393Y；D163A+I393G；D163A+V166C；D163A+V166D；D163A+V166H；D163A+V166I；D163A+V166N；D163A+V166K；D163A+V166M；D163A+V166L；D163A+H337Y；D163A+H337M；D163A+H337K；D163A+H337P；D163A+H337F；D163A+S344F；D163A+S344Y；D163A+S344L；D163A+S344M；D163A+S344K；D163A+S344A；D163A+S344T；D163A+A397L+I393R；D163A+A397L+I393C；D163A+A397L+I393L；D163A+A397L+I393M；D163A+A397L+I393T；D163A+A397L+I393V；D163A+A397L+V166I；D163A+A397L+V166C；D163A+A397L+V166H；D163A+A397L+V166A；D163A+A397L+V166Y；D163A+A397L+V166D；D163A+A397L+V166T；D163A+A397L+V166N；D163A+A397L+S344F；D163A+A397L+S344M；D163A+A397L+S344L；D163A+A397L+S344Y；D163A+A397L+S344K；D163A+A397L+S344N；D163A+A397L+S344R；D163A+A397L+I393L；D163A+A397L+I393L+V166C；D163A+A397L+I393L+V166H；D163A+A397L+I393L+V166D；D163A+A397L+I393L+V166I；D163A+A397L+I393L+V166N；D163A+A397L+I393L+V166P；D163A+A397L+I393L+V166G；D163A+A397L+I393L+V166F；D163A+A397L+I393L+V166L；D163A+A397L+I393L+H337Y；D163A+A397L+I393L+H337A；D163A+A397L+I393L+H337L；D163A+A397L+I393L+H337E；D163A+A397L+I393L+H337D；D163A+A397L+I393L+S344A；D163A+A397L+I393L+S344D；D163A+A397L+I393L+S344F；D163A+A397L+I393L+S344L；D163A+A397L+I393L+S344R；D163A+A397L+I393L+S344Y；D163A+A397L+I393L+V166I+H337Y；D163A+A397L+I393L+V166I+H337A；D163A+A397L+I393L+V166I+H337L；D163A+A397L+I393L+V166I+H337R；D163A+A397L+I393L+V166I+H337F；D163A+A397L+I393L+V166I+S344M；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344L；D163A+A397L+I393L+V166I+S344F；D163A+A397L+I393L+V166I+S344A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344E；D163A+A397L+I393L+V166I+S344T；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+P338A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+P338M；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+P338L；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+P338Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K342A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K342E；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K342L；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K342Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R343A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R343A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R343Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R343H；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R343V；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R365A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R365G；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R365D；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R365T；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R365Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396S；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396F；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396H；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F164A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F164L；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F164M；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D165A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D165M；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D165Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K162A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K162S；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K162G；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+G394A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+G394L；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+G394T；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F395S；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F395Q；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F395V；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396Q；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396S；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396F；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396H；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396K。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述的单加氧酶突变体。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种重组质粒，该重组质粒连接上述DNA分子。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞内转化有上述重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞；优选地，原核细胞包括大肠杆菌。
为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种手性亚砜化合物的制备方法，该制备
方法包括利用上述单加氧酶突变体与式I和/或式Ⅱ所示硫醚类底物进行加氧反应，得到手性亚砜化合物，
R1选自烷基、环烷基、芳基或杂芳基，所述烷基的C原子数选自1～8，所述环烷基、芳基或杂芳基的C原子数选自5～10；R2选自烷基、环烷基、芳基或杂芳基，所述烷基的C原子数选自1～8，所述环烷基、芳基或杂芳基的C原子数选自5～10；或，所述R1和R2与硫原子共同形成杂环基、碳环基或杂芳基，所述杂环基、碳环基或杂芳基的C原子数选自5～10；所述杂环基或杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种；所述芳基中的芳基、杂芳基中的杂芳基、碳环基中的碳环基或杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或取代基选自卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团。
进一步地，硫醚类底物选自
应用本发明的技术方案，以来源于Rhodococcus jostii RHA1的单加氧酶突变体(SEQ ID NO：1)为母本，进行了单点定点突变、饱和突变、组合突变等蛋白质工程改造，获得了可生产高纯度光学纯手性亚砜化合物、杂质砜较少、酶活性高的单加氧酶突变体。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，手性亚砜的化学合成由于存在多种不足，利用生物法合成手性亚砜不仅更加“绿色”且反应较温和，成为合成该物质的优选方法。但是，进行生物合成的野生型的单加氧酶主要存在活性低的问题。此外，还存在有底物范围窄，稳定性差，选择性不够高，副产物砜生成等问题。
因此，在本申请中发明人尝试通过定向进化的方法对单加氧酶进行改造，进而提高酶的各种性质，使其可以用于工业化生产手性亚砜的技术方案中，因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种单加氧酶突变体，包括(a)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)在(a)中的所述氨基酸序列的如下至少一个位点：W60，Y65，D71，Y77，D163，V166，S178，T179，T199，G200，S201，R222，T223，H337，P338，K342，R343，S344，R365，I393，F395，D396，A397，L448，D505，S506，Y508或R509，经过氨基酸突变且具有单加氧酶功能的蛋白质；(c)与(a)和(b)中任一项限定的所述氨基酸序列具有80％以上同源性且具有单加氧酶功能的蛋白质。
上述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，是来源于Rhodococcus jostii RHA1的氨基酸突变体。通过对该氨基酸序列进行同源模建的计算机模拟分析模型结构与硫醚底物的分子对接结果，发现了28个氨基酸残基包括：W60，Y65，D71，Y77，D163，V166，S178，T179，T199，G200，S201，R222，T223，H337，P338，K342，R343，S344，R365，I393，F395，D396，A397，L448，D505，S506，Y508，R509，这些氨基酸位点位于活性中心附近，存在影响蛋白催化性质的可能。通过对上述氨基酸位点进行突变，能够获得具有单加氧酶功能、乃至单加氧酶功能增强的蛋白质。对于上述获得的蛋白质，在非关键突变位点和活性位点处可以进行变化，能够获得与上述氨基酸序列有80％以上同源性、且具有单加氧酶功能的蛋白质。
SEQ ID NO：1的序列如下：
MTTSMKAANPMNFPSTSDTGIVDVLGVGAGFSGLYLSHRLTTAGWTFAGFEAGPSVGGTWFWNTYPGARCDVESIYYSYSFDEALQQEWTWSQRFAPQAEILSYINHVADRFDLRKHFTFNTRVVGATWNAAERLWEVQLDNGETRRGRYLISGAGGLSTPKDFDVPGLGNFTGLQVSTSRWNISLDDLAGKRVAVIGTGSSGVQAIPLIAEVAEHVTVFQRTPNYVMPARNAELPLERVDSIKDDYPAIREECRHSPGGIPDRPVTDKAFDVSAEERQRRYEAAYERSGFNGVGGEFADLLTDVEANRTASEFIHDKIREIVEDPATAELLVPRYHPLGAKRSVFGTDYYETYNRPNVSLVSLRDEPIETMTANAIVTSKGTYEADAVVLAIGFDAFTGPLYGLGLTGASGRKLQETWQDGIRTYLGMMTTDFPNFFMVAGPQSPALASNVVMTIEQAVDWIADLIEHARDSGATLVEATPEGQNDWVDITEETVAQTLYATTDSWYRGSNVEGKPNTFMGYVGGVGKYRRMCTEIAKRGYPGVRIDGETESPHLGPIHREIS。
在一种优选的实施例中，(b)的氨基酸突变各自独立地选自如下：D163V或D163A或D163E；V166S或V166Y或V166M或V166C或V166D或V166H或V166I或V166N或V166K或V166M或V166L或V166A或V166T或V166P或V166G或V166F或；H337Y或H337M或H337K或H337P或H337F或H337A或H337L或H337E或H337D或H337R；P338A或P338M或P338L或P338Y；K342A或K342E或K342L或K342Y；R343A或R343Y或R343H或R343V；S344F或S344Y或S344L或S344M或S344K或S344A或S344T或S344N或S344R或S344D或S344E；R365A或R365G或R365D或R365T或R365Y；I393A或I393K或I393P或I393W或I393R或I393C或I393M或I393T或I393V或I393Y或I393G或I393L；F395S或F395Q或F395V；D396A或D396R或D396S或D396F或D396H或D396Q或D396K；A397V或A397L或A397I或A397M或A397R或A397H或A397W；其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸；优选地，(c)中，与(a)或(b)中限定的氨基酸序列具有85％以上，优选90％以上，更优选95％、96％、97％或98％以上，进一步优选99％、99.9％以上同源性且具有单加氧酶功能的蛋白质。
在本申请中，申请人对上述活性位点继续进行探究，发现活性位点突变为不同氨基酸，相应的蛋白质活性也有差别，特定的突变能够增强单加氧酶活性。通过试验探究，发现对于活性位点进行上述特定的突变，能够获得活性增强的蛋白质。对于单加氧酶蛋白质的氨基酸突变位点，可以在上述的突变中进行灵活的选择和组合。
在一种优选的实施例中，单加氧酶突变体的突变包括如下任意一种氨基酸突变：
D163V；D163A；D163E；A397V；A397L；A397I；V166S；V166Y；V166M；I393A；I393K；I393P；D396A；D396R；D163A+A397L；D163A+A397V；D163A+A397I；D163A+A397M；D163A+A397R；D163A+A397H；D163A+A397W；D163A+I393W；D163A+I393R；D163A+I393C；D163A+I393L；D163A+I393M；D163A+I393T；D163A+I393V；D163A+I393Y；D163A+I393G；D163A+V166C；D163A+V166D；D163A+V166H；D163A+V166I；D163A+V166N；D163A+V166K；D163A+V166M；D163A+V166L；D163A+H337Y；D163A+H337M；D163A+H337K；D163A+H337P；D163A+H337F；D163A+S344F；D163A+S344Y；D163A+S344L；D163A+S344M；D163A+S344K；D163A+S344A；D163A+S344T；D163A+A397L+I393R；D163A+A397L+I393C；D163A+A397L+I393L；D163A+A397L+I393M；D163A+A397L+I393T；D163A+A397L+I393V；D163A+A397L+V166I；D163A+A397L+V166C；D163A+A397L+V166H；D163A+A397L+V166A；D163A+A397L+V166Y；D163A+A397L+V166D；D163A+A397L+V166T；D163A+A397L+V166N；D163A+A397L+S344F；D163A+A397L+S344M；D163A+A397L+S344L；D163A+A397L+S344Y；D163A+A397L+S344K；D163A+A397L+S344N；D163A+A397L+S344R；D163A+A397L+I393L；D163A+A397L+I393L+V166C；D163A+A397L+I393L+V166H；D163A+A397L+I393L+V166D；D163A+A397L+I393L+V166I；D163A+A397L+I393L+V166N；D163A+A397L+I393L+V166P；D163A+A397L+I393L+V166G；D163A+A397L+I393L+V166F；D163A+A397L+I393L+V166L；D163A+A397L+I393L+H337Y；D163A+A397L+I393L+H337A；D163A+A397L+I393L+H337L；D163A+A397L+I393L+H337E；D163A+A397L+I393L+H337D；D163A+A397L+I393L+S344A；D163A+A397L+I393L+S344D；D163A+A397L+I393L+S344F；D163A+A397L+I393L+S344L；D163A+A397L+I393L+S344R；D163A+A397L+I393L+S344Y；D163A+A397L+I393L+V166I+H337Y；D163A+A397L+I393L+V166I+H337A；D163A+A397L+I393L+V166I+H337L；D163A+A397L+I393L+V166I+H337R；D163A+A397L+I393L+V166I+H337F；D163A+A397L+I393L+V166I+S344M；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344L；D163A+A397L+I393L+V166I+S344F；D163A+A397L+I393L+V166I+S344A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344E；D163A+A397L+I393L+V166I+S344T；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+P338A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+P338M；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+P338L；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+P338Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K342A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K342E；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K342L；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K342Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R343A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R343A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R343Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R343H；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R343V；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R365A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R365G；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R365D；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R365T；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+R365Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396S；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396F；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396H；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F164A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F164L；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F164M；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D165A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D165M；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D165Y；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K162A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K162S；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+K162G；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+G394A；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+G394L；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+G394T；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F395S；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F395Q；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+F395V；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396Q；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396S；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396F；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396H；D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y+D396K。
上述氨基酸突变均在本申请实施例中进行试验探究，均具有单加氧酶活性，相较于具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的母本，能够获得具有高纯度光学纯手性亚砜、酶活性高、产生杂质砜少的单加氧酶突变体。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述单加氧酶突变体。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种重组质粒，该重组质粒连接有上述DNA分子。
上述DNA能够编码上述单加氧酶突变体，并能够连接在重组质粒上形成环状DNA。上述DNA和重组质粒均能在RNA聚合酶、核糖体、tRNA等的作用下，进行转录、翻译，获得上述单加氧酶突变体。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种原核宿主细胞，该原核宿主细胞内转化有上述重组质粒。
利用上述原核宿主细胞，能够在原核宿主细胞中进行重组质粒的复制，也能够将重组质粒上携带的DNA分子进行转录、翻译，获得大量单加氧酶突变体。利用现有技术，对原核宿主细胞进行破碎蛋白纯化、破碎后粗酶催化或其他方式，能够获得单加氧酶突变体，并进行后续对于亚砜化合物的催化。该宿主细胞为非植物来源的原核宿主细胞。
在本申请第五种典型的实施方式中，提供了一种手性亚砜化合物的制备方法，该制备方法包括利用上述单加氧酶突变体与式I和/或式Ⅱ所示硫醚类底物进行加氧反应，得到手性亚砜化合物；R1选自烷基、环烷基、芳基或杂芳基，所述烷基的C原子数选自1～8，所述环烷基、芳基或杂芳基的C原子数选自5～10；R2选自烷基、环烷基、芳基或杂芳基，所述烷基的C原子数选自1～8，所述环烷基、芳基或杂芳基的C原子数选自5～10；或所述R1和R2与硫原子共同形成杂环基、碳环基或杂芳基，所述杂环基、碳环基或杂芳基的C原子数选自5～10；所述杂环基或杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种；所述芳基中的芳基、杂芳基中的杂芳基、碳环基中的碳环基或杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或取代基选自卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团；
利用上述制备方法，利用上述单加氧酶突变体在提供的式I和/或式Ⅱ硫醚类底物的反应中，能够对式I和/或式Ⅱ所示的硫醚类底物进行加氧反应，获得手性亚砜化合物。上述单加氧酶突变体，能够对于上述的硫醚类底物，进行手性催化，合成所需的手性亚砜化合物。大幅度提高了单加氧酶的活性和选择性，降低了催化过程中杂质亚砜的生成，能够提高生产效率，降低工业生产成本，更适用于工业化生产。
在一种优选的实施例中，硫醚类底物选自
本申请中，发明人通过同源模建，根据模型结构对不同的硫醚底物进行分子对接，分析对接结果，选择了28个活性中心附近有可能影响蛋白催化性质的残基，这些残基包括：W60，Y65，D71，Y77，D163，V166，S178，T179，T199，G200，S201，R222，T223，H337，P338，K342，R343，S344，R365，I393，F395，D396，A397，L448，D505，S506，Y508，R509。对这些残基进行饱和突变和定点突变。
其中，饱和突变是通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体的一种方法。此方法不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。饱和突变往往能获得比单点突变更为理想的进化体。而对于定点突变方法不能解决的这些问题，恰恰是饱和突变方法所擅长的独特之处。饱和突变获得的突变体经测序鉴定，分别测试其对不同底物的活性和高温下的耐受性。
定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。利用全质粒PCR引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模版质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
开发如下的高通量筛选方法对突变体库进行筛选：
1、突变体培养：96孔板每孔加入300μL LB培养基，将琼脂平板上的单克隆接种到深孔96孔板中，37℃、200rpm过夜培养；利用Qpix转接过夜培养的菌液，至另一块每孔加入800μL LB培养基96孔板中，37℃、200rpm，培养5h后，待96孔板菌液OD600达到0.6-0.9，再次利用Qpix向96孔板中加入IPTG溶液，使孔板中IPTG终浓度为0.1mM，25℃、200rpm过夜诱导约16h；4000rpm，离心5min，弃上清，用全细胞进行反应。
2、96孔板高通量筛选体系：向第1步得到的96孔板中加入反应体系：0.6mg的NADP+，0.5wt的醇脱氢酶，用pH 8.0的PB(0.2M)补到总体积300μL混匀，3mg底物溶于20μL的异丙醇中，配制底物溶液，将配好的底物加到96孔板反应体系中，混匀，20℃恒温摇床200rpm反应16h，将过夜反应后的96孔板反应体系，加乙腈终止反应，离心，用排枪吸取上清至HPLC检测专用浅孔板中，用锡箔纸封口，进行高通量的HPLC分析，筛选出性质提高的突变体。
对突变体库中筛选出来的突变体进行测序，根据测序结果选择合适的突变体，进行放大反应的验活。在经过多轮进化之后，发明人获得了一系列单加氧酶突变体，这些突变体对多种硫醚类底物的活性和选择性都大幅提高，杂质砜明显减少，这些突变体可被用于进行工业生产，催化效率得到极大提升。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1
利用上述方法，在母本SEQ ID NO:1的基础上进行定点突变，具体突变位点见表1，并按照如下反应条件对突变体的催化活性进行检测：
反应体系包括100mg底物1或底物2，120μL异丙醇，20mg NADP+，5mg醇脱氢酶干粉，1mL单加氧酶粗酶液(由100mg湿菌泥制得)，0.2M PB 8.0补到总体积6mL，20℃恒温摇床200rpm反应16h。反应结束后，向体系中加入3倍体积的乙腈终止反应，离心，取样，送HPLC分析产品的转化率和ee值。结果见下表。
上述湿菌泥由相应突变体的大肠杆菌经发酵后离心所得，粗酶液由得到的湿菌泥加pH8.0100mM磷酸盐buffer，经超声破壁后得到。
检测结果见表1
表1：
注：上表中，+代表转化率<20％，++代表转化率大于等于20％且小于30％，+++代表转化率大于等于30％且小于等50％；-代表ee值小于等于90％，--代表ee值大于90％且小于等于95％，---代表ee值大于95％且小于等于98％，----代表ee值大于98％且小于等于99.5％；****代表杂质砜含量大于5％，***代表杂质砜含量小于等于5％且大于2％，**代表杂质砜含量小于等于2％且大于0.5％，*代表杂质砜含量小于等于0.5％.
实施例2
在实施例1的基础上进行饱和突变和组合突变，并按照与实施例1相同的反应条件对组合突变进行活性筛选，结果见表2。
表2：
注：上表中，+代表转化率<20％，++代表转化率大于等于20％且小于30％，+++代表转化率大于等于30％且小于等50％；-代表ee值小于等于90％，--代表ee值大于90％且小于等于95％，---代表ee值大于95％且小于等于98％，----代表ee值大于98％且小于等于99.5％；****代表杂质砜含量大于5％，***代表杂质砜含量小于等于5％且大于2％，**代表杂质砜含量小于等于2％且大于0.5％，*代表杂质砜含量小于等于0.5％.
实施例3
在实施例2的基础上进行饱和突变和组合突变，并按照如下反应条件对突变体的催化活性进行检测：
反应体系包括100mg底物1或底物2，120μL异丙醇，20mg NADP+，5mg醇脱氢酶干粉，0.5mL单加氧酶粗酶液(由50mg湿菌泥制得)，0.2M PB 8.0补到总体积6mL，20℃恒温摇床200rpm反应16h。反应结束后，向体系中加入3倍体积的乙腈终止反应，离心，取样，送HPLC分析产品的转化率和ee值。结果见表3。
表3：
注：上表中，+代表转化率<20％，++代表转化率大于等于20％且小于30％，+++代表转化率大于等于30％且小于等50％；-代表ee值小于等于90％，--代表ee值大于90％且小于等于95％，---代表ee值大于95％且小于等于98％，----代表ee值大于98％且小于等于99.5％；****代表杂质砜含量大于5％，***代表杂质砜含量小于等于5％且大于2％，**代表杂质砜含量小于等于2％且大于0.5％，*代表杂质砜含量小于等于0.5％。
实施例4
在实施例3的基础上进行饱和突变和组合突变，并按照与实施例3相同的反应条件对组合突变进行活性筛选，结果见表4。
表4：
注：上表中，+代表转化率<20％，++代表转化率大于等于20％且小于30％，+++代表转化率大于等于30％且小于等50％，++++代表转化率大于等于50％且小于等于70％；-代表ee值小于等于90％，--代表ee值大于90％且小于等于95％，---代表ee值大于95％且小于等于98％，----代表ee值大于98％且小于等于99.5％；****代表杂质砜含量大于5％，***代表杂质砜含量小于等于5％且大于2％，**代表杂质砜含量小于等于2％且大于0.5％，*代表杂质砜含量小于等于0.5％。
实施例5
在实施例4的基础上进行饱和突变和组合突变，并按照如下反应条件对突变体的催化活性进行检测：
反应体系包括100mg底物1或底物2，120μL异丙醇，20mg NADP+，5mg醇脱氢酶干粉，0.25mL单加氧酶粗酶液(由25mg湿菌泥制得)，0.2M PB 8.0补到总体积6mL，20℃恒温摇床200rpm反应16h。反应结束后，向体系中加入3倍体积的乙腈终止反应，离心，取样，送HPLC分析产品的转化率和ee值。结果见表5和表6。
表5：
表6：
注：上表中，+代表转化率<20％，++代表转化率大于等于20％且小于30％，+++代表转化率大于等于30％且小于等50％，++++代表转化率大于等于50％且小于等于70％,+++++代表转化率大于等于70％且小于等于95％；-代表ee值小于等于90％，--代表ee值大于90％且小于等于95％，---代表ee值大于95％且小于等于98％，----代表ee值大于98％且小于等于99.5％；****代表杂质砜含量大于5％，***代表杂质砜含量小于等于5％且大于2％，**代表杂质砜含量小于等于2％且大于0.5％，*代表杂质砜含量小于等于0.5％。
实施例6
室温向250mL四口瓶内加入56mL 200mmol/L磷酸盐缓冲液，1.2mL异丙醇，200mg的NADP+,50mg醇脱氢酶干粉,调pH＝8.0。加入1g
搅拌均匀，再加入SEQID NO：1基础上突变的单加氧酶突变体(D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y)的酶液2.5mL(0.1g湿菌泥/mL)调pH＝8.0。控温20℃搅拌反应过夜。反应完全后，将体系调酸至pH＝2-3，变性蛋白。过滤后滤液用60mL二氯甲烷萃取2次。合并有机相用无水硫酸镁干燥后于T＜35℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分。得到目标产物
经HPLC检测，纯度＞99％，ee值＞99％，收率82％
实施例7
室温向250mL四口瓶内加入56mL 200mmol/L磷酸盐缓冲液，1.2mL异丙醇，200mg的NADP+,50mg醇脱氢酶干粉,调pH＝8.0。加入1g
搅拌均匀，再加入SEQID NO：1基础上突变的的单加氧酶突变体(D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y)的酶液2.5mL(0.1g湿菌泥/mL)调pH＝8.0。控温20℃搅拌反应过夜。反应完全后，将体系调酸至pH＝2-3，变性蛋白。过滤后滤液用60mL二氯甲烷萃取2次。合并有机相用无水硫酸镁干燥后于T＜35℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分。得到目标产物
经HPLC检测，纯度＞98％，ee值＞99％，收率84％.
实施例8
室温向250mL四口瓶内加入56mL 200mmol/L磷酸盐缓冲液，1.2mL异丙醇，200mg的NADP+,50mg醇脱氢酶干粉,调pH＝8.0。加入1g
搅拌均匀，再加入SEQ ID NO：1基础上突变的的单加氧酶突变体(D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y)的酶液2.5mL(0.1g湿菌泥/mL)调pH＝8.0。控温20℃搅拌反应过夜。反应完全后，将体系调酸至pH＝2-3，变性蛋白。过滤后滤液用60mL二氯甲烷萃取2次。合并有机相用无水硫酸镁干燥后于T＜35℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分。
得到目标产物
经HPLC检测，纯度＞99％，ee值＞99％，收率87％.
实施例9
采用SEQ ID NO：1基础上突变的单加氧酶突变体(D163A+A397L+I393L+V166I+S344Y)的酶液，参照实施例6至实施例8的催化合成步骤，对底物4-11进行催化反应，结果如表7：
表7：
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请在获得的具有优良活性的单加氧酶母本的基础上，通过探究转单加氧酶的活性位点，发现了多个能够提高单加氧酶活性的位点，通过对于一个或多个位点的组合探究，获得多种具有优秀性能的单加氧酶突变体，上述单加氧酶突变体能够获得具有高纯度光学纯手性亚砜化合物、具有酶活性高、产生杂质砜少等优点，能够满足工艺生产的需求。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种单加氧酶突变体，其特征在于，包括
(a)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质；或
(b)在(a)中的所述氨基酸序列的如下至少一个位点：W60，Y65，D71，Y77，D163，V166，S178，T179，T199，G200，S201，R222，T223，H337，P338，K342，R343，S344，R365，I393，F395，D396，A397，L448，D505，S506，Y508或R509，经过氨基酸突变且具有单加氧酶功能的蛋白质；或
(c)与(a)和(b)中任一项限定的所述氨基酸序列具有80％以上同源性且具有单加氧酶功能的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的单加氧酶突变体，其特征在于，所述(b)的所述氨基酸突变各自独立地选自如下：
D163V或D163A或D163E；
V166S或V166Y或V166M或V166C或V166D或V166H或V166I或V166N或V166K或V166M或V166L或V166A或V166T或V166P或V166G或V166F或；
H337Y或H337M或H337K或H337P或H337F或H337A或H337L或H337E或H337D或H337R；
P338A或P338M或P338L或P338Y；
K342A或K342E或K342L或K342Y；
R343A或R343Y或R343H或R343V；
S344F或S344Y或S344L或S344M或S344K或S344A或S344T或S344N或S344R或S344D或S344E；
R365A或R365G或R365D或R365T或R365Y；
I393A或I393K或I393P或I393W或I393R或I393C或I393M或I393T或I393V或I393Y或I393G或I393L；
F395S或F395Q或F395V；
D396A或D396R或D396S或D396F或D396H或D396Q或D396K；
A397V或A397L或A397I或A397M或A397R或A397H或A397W；
其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸；
优选地，所述(c)中，与(a)或(b)中限定的所述氨基酸序列具有85％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选99％以上同源性且具有单加氧酶功能的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的单加氧酶突变体，其特征在于，所述单加氧酶突变体的突变包括如下任意一种氨基酸突变：
4.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1至3中任一项所述的单加氧酶突变体。
5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求4所述的DNA分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述原核宿主细胞内转化有权利要求5所述的重组质粒。
7.一种手性亚砜化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括利用权利要求1至3中任一项所述的单加氧酶突变体与式I和/或式Ⅱ所示硫醚类底物进行加氧反应，得到手性亚砜化合物，
R1选自烷基、环烷基、芳基或杂芳基，所述烷基的C原子数选自1～8，所述环烷基、芳基或杂芳基的C原子数选自5～10；
R2选自烷基、环烷基、芳基或杂芳基，所述烷基的C原子数选自1～8，所述环烷基、芳基或杂芳基的C原子数选自5～10；
或，所述R1和R2与硫原子共同形成杂环基、碳环基或杂芳基，所述杂环基、碳环基或杂芳基的C原子数选自5～10；
所述杂环基或所述杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种；
所述芳基、杂芳基、碳环基或杂环基各自独立地未被取代或被取代，当被取代时，取代基选自卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团。
8.根据权利要求7中所述的制备方法，其特征在于，所述硫醚类底物选自：
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|---|---|---|---|---|
| WO2015074162A1 (es) * | 2013-11-22 | 2015-05-28 | Pontificia Universidad Catolica De Chile | Variantes de enzima fenilacetona monooxigenasa (pamo) capaces de catalizar conversión de ciclohexanona a caprolactona. |
| CN110055230A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-07-26 | 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 | 单加氧酶突变体及其应用 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "NAD(P)/FAD-dependent oxidoreductase [Nocardia africana]", 《GENBANK》, 12 January 2018 (2018-01-12) * |
| MCLEOD, M.P.等: "monooxygenase [Rhodococcus jostii RHA1]", 《GENBANK》, 31 January 2014 (2014-01-31) * |
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