CN115927196A - 恩西地平在培养car-t细胞中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了恩西地平在培养CAR‑T细胞中的应用，涉及嵌合抗原受体T细胞的产品制备和免疫治疗领域。本发明提供了恩西地平在培养CAR‑T细胞中的应用，一种基于IDH2抑制剂的CAR‑T细胞和制备方法，以及IDH2抑制剂联合CAR‑T细胞作为药物组合物，本发明方法简单易行，通过在CAR‑T细胞培养过程中添加IDH2抑制剂或体内二者联合治疗肿瘤，能够明显的增加免疫细胞持续性及杀伤功能，很大程度上解决了细胞治疗过程中的难治复发问题，延长患者的生存期。

Description

恩西地平在培养CAR-T细胞中的应用
技术领域
本发明涉及嵌合抗原受体T细胞的产品制备和免疫治疗领域，尤其涉及恩西地平在培养CAR-T细胞中的应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)疗法是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，其通过体外基因编辑技术将CAR基因稳定整合至人的T淋巴细胞基因组，使T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，成为CAR-T细胞。CAR基因通常编码一个用于结合靶抗原的单链抗体可变区片段、跨膜结构域和细胞内信号结构域(如CD3ζ胞内结构域等)。当CAR-T细胞进入患者体内，则联合抗体作用和T淋巴细胞的效应功能，以非MHC限制性方式高特异性识别靶抗原，释放多种效应因子，从而高效地杀灭肿瘤细胞，达到治疗恶性肿瘤的目的。靶向CD19的CAR-T技术治疗B细胞恶性肿瘤的基础研究与临床试验已取得里程碑式突破，治疗急性B淋巴母细胞白血病有效率在70％以上，治疗B细胞型非霍奇金淋巴瘤在50％以上。CAR-T治疗其他肿瘤也显示了良好的应用前景。然而，仍有半数以上患者在CAR-T免疫治疗后未能完全缓解或复发。另外，现在研究认为患者体内CAR-T细胞的记忆表型维持和耗竭水平直接与CAR-T细胞持久性相关，影响患者疗效。因此，提高CAR-T细胞体内的持久性成为了亟需解决的技术问题。
T细胞介导的适应性免疫反应源于抗原特异性T细胞的克隆性扩增和不同功能亚群的分化，而T细胞扩增和分化对能量代谢和生物合成有极大的需求。T细胞活化后从脂肪酸氧化和丙酮酸氧化转为糖酵解和谷氨酰胺分解，并产生包括核苷酸、氨基酸和脂肪酸中间产物，为T细胞的增殖和功能所必需。越来越多的证据显示，代谢平衡是免疫细胞功能和持久性的最客观决定因素。另外，肿瘤微环境(TME)为缺氧并缺乏关键营养元素的限制性环境，会导致免疫细胞耗竭。细胞疗法领域需要致力于代谢调节以增加免疫细胞疗法的持久性、归巢性、有效性和安全性。
恩西地平(Enasidenib，分子式C19H17F6N7O，CAS号1446502-11-9)是一种异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)抑制剂，由Agios和Celgene联合开发，于2017年8月1日由美国食品药品管理局(FDA)批准上市，用于治疗携带IDH2基因突变的成人复发或难治性AML。三羧酸循环对于许多的生化信号通路至关重要，IDH2是三羧酸循环中的关键酶，该蛋白的某些突变形式(R140Q，R172S，R172K)导致特异性代谢产物2-羟基戊二酸(2-HG)升高，恩西地平可降低2-HG的含量从而诱导白血病细胞分化。
而恩西地平处理CAR-T细胞后，CAR-T细胞的耗竭情况是未知的，以及使用恩西地平联合恩西地平处理后的CAR-T细胞在体内的抗肿瘤作用在现有技术中也没有进行报道。
发明内容
本发明针对CAR-T细胞体外培养过程中和体内治疗存在的技术问题，提供了恩西地平在培养CAR-T细胞中的应用，准确提供IDH2抑制剂恩西地平优化CAR-T细胞产品的制备工艺，及二者联合治疗肿瘤的应用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了恩西地平在培养CAR-T细胞中的应用，所述恩西地平为恩西地平本身或药学上可接受的盐。
本发明提供了一种培养基，所述培养基中含有恩西地平；所述恩西地平为恩西地平本身或药学上可接受的盐。
优选的，所述恩西地平的浓度为5-10μM。更为优选的，所述恩西地平的浓度为5μM。
本发明还提供了所述培养基在CAR-T细胞培养中的应用。
本发明还提供了一种CAR-T细胞的培养方法，使用所述的培养基培养CAR-T细胞。
本发明还提供了一种药物组合物，包括恩西地平或药学上可接受的盐，以及CAR-T细胞。这里所述的CAR-T细胞指的是未经恩西地平共同培养处理过的CAR-T细胞。
优选的，所述药物组合物中恩西地平的剂型为液体注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、口服液、膏剂、颗粒剂或敷料；CAR-T细胞为液体注射剂。
优选的，当所述药物组合物中恩西地平的剂型为粉针剂时，恩西地平的剂量为15mg/kg；注射CAR-T细胞的剂量为2×106/mL。
优选的，在注射CAR-T细胞后的第二天再施用恩西地平。
按照2×106/mL向小鼠尾静脉注射CAR-T细胞，第二天在体内施用恩西地平，以15mg/kg的剂量联合CAR-T细胞能够显著增强肿瘤治疗效果，延长荷瘤小鼠的生存期。
本发明的有益效果：
本发明提供了恩西地平在培养CAR-T细胞中的应用，一种基于IDH2抑制剂的CAR-T细胞和制备方法，以及IDH2抑制剂联合CAR-T细胞作为药物组合物，本发明方法简单易行，通过在CAR-T细胞培养过程中添加IDH2抑制剂或体内二者联合治疗肿瘤，能够明显的增加免疫细胞持续性及杀伤功能，很大程度上解决了细胞治疗过程中的难治复发问题，延长患者的生存期。
附图说明
图1为CAR结构示意图。
图2为不同浓度IDH2抑制剂培养CAR-T细胞亚群分化比例和统计图；其中，*P＜0.05，**P＜0.01，NS表示没有统计学差异。
图3为不同浓度IDH2抑制剂CAR-T培养细胞，流式检测PD-1、LAG-3、TIM-3耗竭指标的表达变化和凋亡水平的检测图；其中，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001，NS表示没有统计学差异。
图4为IDH2抑制剂CAR-T培养细胞3天后输注体内的处理过程示意图。
图5为IDH2抑制剂CAR-T培养细胞3天后输注体内，肿瘤清除效果(A)、小鼠生存曲线(B)、肿瘤负荷(C)、CAR-T细胞在体内比例(D)及肿瘤细胞在骨髓中的绝对数量图(E)；其中，*P＜0.05，**P＜0.01。
图6为CAR-T细胞回输体内后口服IDH2抑制剂，不同组别的肿瘤清除效果(A)、肿瘤负荷(B)、CAR-T细胞在体内外周血中的绝对计数(C)、肿瘤细胞在体内外周血中的绝对计数(D)；其中，*P＜0.05，**P＜0.01，NS表示没有统计学差异。
具体实施方式
1、实验材料
HEK-293T细胞、ALL细胞株Nalm-6由中科院上海细胞所引进保存。感受态细胞DH5α购自南京诺维赞生物科技有限公司。慢病毒载体采用三质粒系统：psPAX2、pMD2.G和Lenti-EF1α。NSG小鼠：6-8周龄，购自百奥赛图基因生物技术有限公司，浙江大学药物安全评价研究中心SPF级环境常规饲养。
2、实验仪器
流式细胞仪Cytoflex(美国Beckman公司)；CytoFLEX LX流式细胞分析仪(美国Beckman公司)；流式细胞分选仪(美国Beckman公司)；小动物活体成像仪(美国Perkin-Elmer公司)。
3、主要试剂
RPMI 1640培养基(美国Corning公司)；DMEM(High Glucose)培养基(美国Corning公司)；胎牛血清(FBS)(美国GIBCO公司)；Ficoll淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；质粒抽提试剂盒(美国Life Biotechnology公司)；Genomic DNAPurification Kit(Lifetech，CAT#K0512)；PrimeScriptIMII 1st Strand cDNA SynthesisKit(日本Takara公司，CAT#6210A)；Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus)，ROXplus(日本Takara公司，CAT#RR42WR(LR×5))；IL-2(美国Peprotech公司)；anti-CD3/CD28磁珠：临床研究级别Cat#40203D(美国Thermo公司)；Bright-GloTM Luciferase Assaysystem(美国Promega公司，Cat：E2620)；D-Luciferin Firefly，potassium salt(美国Perkin-Elmer公司，Cat：#122799)；Goat Anti-Mouse IgG，F(ab′)2fragment特异性抗体(美国Jackson公司，货号：115-066-006)；streptavidin FITC，(美国Biolegend公司)；polybrene(美国Sigma-Adrich公司)；聚乙烯亚胺盐酸(PEI)(美国Polysciences公司)；曲美替尼粉剂(美国Selleck公司)；流式荧光抗体：anti-human CD3(PE-cy7)、anti-humanCD19(APC)、anti-human CD4(APC-cy7)、anti-human CD8(PE-cy7)、anti-human CD62L(PE)、anti-human CD45RO(APC)、anti-human CD25(APC)、anti-human CD69(PE-cy7)、anti-human PD-1(APC)、anti-human TIM-3(PE)、anti-human LAG-3(PE-cy7)、anti-humanFASL(PE)、Annexin V(APC)；PE、APC、PE-cy7、APC-cy7同型对照均购自美国Biolegend公司。EasySepTM人T细胞分选试剂盒(美国Stem Cell公司，CAT#17951)；10×Annexin V bindingbuffer(美国BD bioscience公司，CAT51-66121E)。
4、溶液配制
(1)RPMI 1640完全培养基：RPMI 1640+体积百分比为10％的FBS+100U/ml青链霉素；
(2)DMEM(高糖)完全培养基：DMEM(高糖)培养基+体积百分比为10％的FBS+100U/ml青链霉素；
(3)FBS：使用前56℃水浴30min，室温冷却后分装至50ml离心管，-20℃贮存；
(4)转染试剂PEI溶液：准确称量线性化聚乙烯亚胺盐酸(Polyethylenimine，Linear，mw-25000)50mg，转移至50mL离心管中，加入50mL ddH2O，置于80℃水浴箱中将其充分溶解。调节pH至7.0，超净台内0.22μm滤膜过滤除菌，分装于无菌的1.5mL EP管中，-20℃保存；
(5)IL-2溶液配制：取1支500μg IL-2冻干粉剂，溶于1mL浓度为100mM的乙酸中，进一步加入含0.1％BSA(m/v)的PBS 49mL，储存浓度为1×106IU/mL，分装后-80℃保存；
(6)羊抗鼠IgG，F(ab′)2片段特异性抗体配置：使用500μL无菌ddH2O溶解该抗体冻干粉末，配置浓度为1.5mg/mL，分装至100μL EP管，-80℃保存；
(7)Bright-GloTM Luciferase Assay反应液配置：室温下将100mL Bright-GloTMLuciferase Assay Buffer添加至1vial Bright-GloTM Luciferase Assay Substrate中，充分溶解后分装至15mL离心管-80℃保存；
(8)体外培养所用IDH抑制剂溶液配制：将Enasidenib粉剂，溶于DMSO配制成浓度为10mmol/L的贮存液，分装后-80℃贮存。临用前使用DMSO稀释成需要的不同浓度，确保所有实验中DMSO终浓度为千分之一；体内口服的Enasidenib用含2％甲基纤维素(m/v)的无菌水重悬，并用40％功率超声5秒，间隔9秒，重复，共5分钟；
(9)小动物成像用luciferin注射液配置：临用前根据3mg/鼠计算总需要量，称取相应质量的D-Luciferin Firefly，potassium salt粉剂溶于相应体积的DPBS，配置浓度为15mg/ml，并予0.22μm滤器过滤后使用；
(10)1×Annexin V binding buffer：临用前取适量体积的10×AnnexinVbinding buffer加入9倍体积的ddH2O稀释为1×溶液后贮存于4℃冰箱。
实施例1：CAR慢病毒载体的构建与制备
1、靶向CD19的CAR DNA的合成
以靶向CD19的鼠源单链可变区序列为基础(克隆号FMC63，参见“https：//www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589097001442”)，以41-BB和CD3ζ作为T细胞激活信号，构建第二代CAR序列(序列如SEQ ID No.1所示)，并在CAR的3’端通过2A多肽(序列如SEQ ID No.2所示)连接红色荧光蛋白mCherry(序列如SEQ ID No.3所示)。CAR片段组成示意图1所示，直接进行全基因合成，并将合成后的片段作为PCR扩增模板。
2、构建CAR慢病毒载体
(1)使用上述合成的片段作为PCR扩增的模板，使用下表1中的引物序列扩增CAR-mcherry片段，同时在序列两端通过PCR分别引入EcoRI酶切位点和XbaI酶切位点用于慢病毒表达载体构建。
表1 CAR克隆引物
引物名称 5’-3’序列 引物酶切位点
CAR Mcherry F <![CDATA[ttc<u>aaattc</u>accgccaccatggcctt]]> EcoRI酶切位点gaattc
CAR Mcherry R <![CDATA[cgg<u>tctaga</u>ttactacttgtacagctcgtcc]]> XbaI酶切位点tctaga
(2)按照下表2配置PCR反应体系：
表2 PCR反应体系
成分 用量
Ex Taq HS(Takara，RR006) 1μL
10×Buffer 5μL
dNTP(25mM) 2μL
CAR F(10μM) 1μL
CAR R(10μM) 1μL
PCR模板 1μL
无菌水 39μL
总体积 50μL
(3)配置好PCR反应体系后，按照如下程序设置PCR仪：98℃预变性5min；98℃变性1min，60℃退火2.5min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃最后延伸10min。
(4)PCR反应结束，使用1％的琼脂糖凝胶(m/v)电泳分析PCR产物，并将目的片段进行胶回收。
(5)将慢病毒表达载体Lenti-EF1α及上述胶回收的PCR产物片段使用EcoRI-XbaI进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳后，回收酶切后的载体及PCR产物片段，进行T4 DNA连接酶连接。连接体系如下表3所示：
表3克隆连接体系
试剂 用量
CAR片段 5μL
Lenti-EF1α 200ng
10×T4 buffer 2μL
T4 DNA连接酶 1μL
无菌水 定容至20μL
(6)将上述T4 DNA连接体系置于16℃连接过夜后，取10μL转化至大肠杆菌Stbl3感受态细胞中，涂布氨苄抗性的LB平板后，将LB平板置于37℃过夜培养，第二天挑取单克隆细胞进行小规模摇菌培养约5mL，使用质粒小提试剂盒提取质粒DNA后，进行Sanger测序。
实施例2：CAR-T产品的制备
1、健康供者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)的分离
(1)采集健康供者外周血10-20ml；(2)使用等体积的PBS将外周血进行稀释；(3)取15ml离心管，加入5ml ficoll分离液，使用移液枪将稀释后的血样10ml沿管壁缓慢添加至ficoll分离液的上方，避免ficoll分离液与血样的混合；(4)将离心机设置为400g，设置转速上升为4档，转速下降为0档，室温离心30分钟；(5)离心结束后，轻轻吸取处于血清与ficoll分离液界面的絮状单个核细胞层并转移至一个新的离心管中，PBS洗涤细胞2次。
2、使用EasySepTM人T细胞阴选试剂盒从PBMC中分离T细胞(美国Stem Cell公司，CAT#17951)
(1)计数获取的单个核细胞，以含2％FBS(m/v)的PBS重悬细胞，调整细胞浓度至5×107/ml。(2)将样本转移到5ml无菌流式管里，每毫升样本加入50μL分离抗体组合并混匀，室温下孵育5min。(3)震荡RapidSpheresTM 30s，每毫升样本中加入40μL RapidSpheresTM并混匀，室温下孵育30s。(4)加入一定量含2％FBS(m/v)的PBS至总体积为2.5mL。(5)将装有样本的无菌流式管放入EasySepTM磁极(加拿大StemCell公司，Catalog#18000)中室温下静置3min。(6)取一根新的15ml离心管，倾倒磁极和与之相连的无菌流式管，以将无菌流式管里的细胞悬液倒入15ml离心管中。该细胞悬液即包含富集的T细胞(给细胞标记anti-humanCD3PE-cy7流式抗体，流式细胞仪检测纯度在90％以上)。(7)设置离心机参数为300g，5min，离心沉淀T细胞团块。
3、使用antiCD3/CD28Dynabeads激活T细胞
(1)计数获取的T细胞，含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬，调整细胞浓度至107/ml。(2)用体积百分比为1％的BSA/PBS溶液洗涤anti-CD3/CD28磁珠(临床研究级别：Cat#40203D，Thermo)2遍；洗涤方法：取5ml BSA/PBS溶液(体积百分比为1％)置于50ml离心管中，加入计算后所需要的anti-CD3/CD28磁珠的量，充分混匀后置于磁力架上静置1分钟，磁珠贴于两侧离心管壁，吸取弃去体积百分比为1％的BSA/PBS溶液。重复洗涤1次。(3)按照T细胞纯度为95％，磁珠：CD3(+)T细胞＝3∶1，将洗涤后的anti-CD3/CD28磁珠与T细胞充分混匀，移至T25细胞培养瓶中，置摇床轻轻摇晃30分钟，使磁珠与CD3(+)T细胞充分结合。(4)用含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬结合磁珠的CD3(+)T细胞，调整细胞浓度至1×106/ml，37℃、5％CO2(v/v)饱和湿度培养箱中培养24小时。
4、慢病毒感染T细胞
(1)离心并计数结合磁珠的CD3+T细胞，用含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬，调整细胞浓度至4×106/ml，按500μL/孔接种于12孔板。(2)按照MOI＝3，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量＝(MOI×细胞数量)/病毒滴度。(3)从-80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在12孔板中加入上述计算所得的病毒量，预留一孔T细胞不加入病毒作为未感染CAR的T细胞对照(Mock T)，给上述各孔细胞添加终浓度为6μg/mL的凝聚胺(polybrene)，充分混匀后置于37℃，5％CO2(v/v)的培养箱中，6-8小时后补充含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基至2ml，继续培养24小时。(4)24小时后，300g离心5分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至六孔板或培养瓶中，以后当培养基变黄或细胞密度超过2.5×106/ml时，对细胞进行换液，以新鲜含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基培养。(5)加入病毒感染4天后，使用5ml移液枪吹打培养瓶中CAR-T细胞，并将细胞移入50ml离心管中，置于磁力架上静置1min，磁珠被吸附于管壁后，将细胞混悬液转移至新的离心管中，离心并添加新鲜含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基继续扩大培养。(6)流式细胞分选仪分选CAR-T细胞。
实施例3：IDH2抑制剂对制备的CAR-T产品的作用
收集体外培养至第9天的CAR-T细胞，按5×105/孔接种至6孔板中，分别添加IDH2抑制剂(Enasidenib，0μM，1μM，5μM，10μM，20μM)处理，DMSO作为对照，于37℃、5％CO2(v/v)培养箱中培养。各组于处理后72h进行流式细胞术检测CAR-T细胞的亚群和耗竭指标。细胞各亚群定义如下，初始T细胞(CD45RO-CD62L+)，中心记忆T细胞(CD45RO+CD62L+)，效应记忆T细胞(CD45RO+CD62L-)，效应T细胞(CD45RO-CD62L-)，耗竭相关抑制性分子(PD-1、TIM-3、LAG-3)，均以比例表示。收集样本加入流式管中以PBS离心洗去残余培养基后，每管加入100μL 1×Annexin V binding buffer重悬细胞，每管加入1.5μL Annexin V APC在4℃避光孵育30min后流式细胞仪上机检测。结果显示Enasidenib可显著提高记忆T细胞的比例，且减少CAR-T细胞耗竭，抑制T细胞凋亡(图2-3)。
实施例4：IDH2抑制剂处理的CAR-T细胞对小鼠体内肿瘤的杀伤效果
(1)收集培养第9天CAR-T细胞，按1×106/孔接种至6孔板中，分别添加IDH2抑制剂(Enasidenib，5μM)和DMSO处理，于37℃、5％CO2(v/v)培养箱中培养，72h后收集细胞用于小鼠体内输注。
(2)ALL-NSG小鼠模型准备：6-8周龄NCG小鼠饲养于SPF级动物研究中心。取对数生长期luciferase(+)Nalm-6细胞株，配制细胞浓度至5×106/mL，按1×106/mL鼠尾静脉注射，每只鼠注射200μL。5天后小动物活体成像仪检测肿瘤负荷，按荧光强度随机分为3组，次日按照2×106/mL尾静脉注射不同处理的CAR-T细胞或Mock T细胞(“Mock”指未处理的T细胞作为CAR-T细胞的阴性对照)，每组10只。通过流式检测外周血CAR-T细胞数量及骨髓中肿瘤细胞数量。
(3)CAR-T细胞注射后第4、8、15、22、28天进行动物活体成像，观测肿瘤负荷情况，并绘制小鼠生存曲线。
IDH2抑制剂处理的CAR-T细胞对小鼠体内肿瘤的杀伤效果过程示意图如图4所示。结果显示IDH2抑制剂处理能够增强CAR-T细胞在ALL-NSG小鼠模型体内抗肿瘤作用和持久性，延长荷瘤小鼠的生存时间(图5)。
实施例5：体内IDH2抑制剂联合CAR-T细胞对肿瘤的治疗效果
(1)ALL-NSG小鼠模型准备：6-8周龄NCG小鼠饲养于SPF级动物研究中心。取对数生长期luciferase(+)Nalm-6细胞株，配制细胞浓度至5×106/mL，按1×106/mL鼠尾静脉注射，每只鼠注射200μL。5天后小动物活体成像仪检测肿瘤负荷，按荧光强度随机分为3组，次日按照2×106/mL尾静脉注射CAR-T细胞或Mock T细胞，每组10只，回输当天为day0。Dayl口服IDH2抑制剂Enasidenib，口服剂量为15mg/kg。
(2)CAR-T细胞注射后第4、8、15、22、28、35、42、50天进行小动物活体成像，观测肿瘤负荷情况，并绘制小鼠生存曲线。通过流式检测外周血CAR-T细胞数量及骨髓中肿瘤细胞数量。
结果显示IDH2抑制剂体内联合CAR-T细胞可增强抗肿瘤作用，延长荷瘤小鼠的生存时间(图6)。
综上，以5μM恩西地平处理CAR-T细胞72h可显著提高体内抗肿瘤作用。体内恩西地平剂量以15mg/kg的剂量联合CAR-T细胞能够显著增强肿瘤治疗效果，延长荷瘤小鼠的生存期。

Claims (10)

1.恩西地平在培养CAR-T细胞中的应用，所述恩西地平为恩西地平本身或药学上可接受的盐。
2.一种培养基，其特征在于，所述培养基中含有恩西地平；所述恩西地平为恩西地平本身或药学上可接受的盐。
3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述恩西地平的浓度为5-10μM。
4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述恩西地平的浓度为5μM。
5.权利要求2～4任一所述培养基在CAR-T细胞培养中的应用。
6.一种CAR-T细胞的培养方法，其特征在于，使用权利要求2～4任一项所述的培养基培养CAR-T细胞。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括恩西地平或药学上可接受的盐，以及CAR-T细胞。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中恩西地平的剂型为液体注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、口服液、膏剂、颗粒剂或敷料；CAR-T细胞为液体注射剂。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，当所述药物组合物中恩西地平的剂型为粉针剂时，恩西地平的剂量为15mg/kg；注射CAR-T细胞的剂量为2×106/mL。
10.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，在注射CAR-T细胞后的第二天再施用恩西地平。
CN202211264913.5A 2022-10-14 2022-10-14 恩西地平在培养car-t细胞中的应用 Active CN115927196B (zh)

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