CN114728178A

CN114728178A - 靶向il-1rap的car-t细胞及它们在急性髓系白血病(aml)中的用途

Info

Publication number: CN114728178A
Application number: CN202080053693.4A
Authority: CN
Inventors: 玛丽娜·德尚; 克里斯托夫·费朗; 法布里斯·拉洛萨; 瓦利德·沃达
Original assignee: CT HOSPITALIER UNIVERSITAIRE DE BESANCON; Fa Guoxueyejigou; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Franche-Comte
Current assignee: CT HOSPITALIER UNIVERSITAIRE DE BESANCON; Fa Guoxueyejigou; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Franche-Comte
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2022-07-08
Also published as: EP3744400A1; KR20220045109A; AU2020281757A1; WO2020239801A1; US20220235138A1; EP3976201A1; CA3141933A1; JP2022534515A

Abstract

本发明涉及用于治疗急性髓系白血病(AML)的用途的细胞，所述细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中，所述CAR包含抗体或抗体片段，所述CAR包含抗IL‑1RAP结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号转导结构域，所述细胞内信号转导结构域至少包含刺激结构域。

Description

靶向IL-1RAP的CAR-T细胞及它们在急性髓系白血病(AML)中的用途

技术领域

本发明涉及用于治疗急性髓系白血病(AML)的用途的细胞，所述细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中，所述CAR包含抗体或抗体片段，所述CAR包含抗IL-1RAP结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号转导结构域，所述细胞内信号转导结构域至少包含刺激结构域。

背景技术

急性髓系白血病(AML；也称为“急性髓系白血病”、“急性髓细胞白血病”、“急性髓母细胞白血病”、“急性粒细胞白血病”和“急性非淋巴细胞白血病”)是毁灭性的克隆性造血干细胞赘生物，其特征在于在骨髓、外周血和偶尔在其它组织中白血病母细胞(leukemicblasts)不受控制的增殖和积累。这些细胞破坏正常的造血作用并迅速导致骨髓衰竭和死亡。AML是成人中最常见的急性白血病类型，在每年的白血病死亡数中占最大数量。AML进展迅速，如果不进行治疗，通常在数周或数月内致命。2015年美国有约20,830例新发AML病例，并且10,460名患者死于该病。诊断中位年龄约为70岁。60岁以下的患者中总体5年生存率仅为约30％-40％，而对于60岁以上的患者，总体5年生存率低于10％。

目前的AML护理标准包括通过高剂量化疗或放疗进行的诱导缓解治疗，然后是巩固治疗，包括同种异体干细胞移植以及根据需要的额外化疗疗程。大多数以这种方式治疗的患者将获得完全但短暂的缓解。一旦复发，该疾病对进一步治疗的抵抗越来越强。

虽然在过去的30年里，年轻患者的结局有所改善，但老年患者的惨淡结局基本保持不变。不幸的是，大多数患有AML的患者经历疾病复发，包括实现最初完全缓解的患者。第二次缓解中的同种异体造血干细胞移植提供了长期生存的唯一机会，但这种选择对于大多数复发性AML患者都不可用，因为他们要么没有实现第二次缓解，要么无法耐受该程序。

复发性AML有多种多药化疗挽救方案(如MEC(米托蒽醌、依托泊苷和阿糖胞苷)和FLAG-IDA(氟达拉滨、阿糖胞苷、伊达比星(idarubicin)、粒细胞集落刺激因子))。然而，没有公认的护理标准，因为这些方案中没有一个优于其它方案，并且这些方案都没有实现长期生存。NCCN(美国国立综合癌症网络)以及其它指南推荐进行临床试验，并且复发性AML被广泛认为是紧迫的未满足的医疗需求。

目前正在研究多种治疗AML(特别是复发性AML)的新方法，包括抗体-药物双特异性T细胞接合抗体(T-cell-engaging antibody)(AMG330)和CAR-T细胞(CART-33细胞或CART-123细胞)。然而，由于临床毒性和/或缺乏功效，数种新方法已停滞不前。因此，存在对具有可接受的毒性特征的新的有效疗法的明确需求。

在AML中，基因表达谱、细胞表面染色、蛋白质印迹研究已揭示了由白血病、而非正常CD34⁺/CD38^-造血干细胞表达的细胞表面生物标志物(IL-1RAP、IL-1R3、C3orf13或IL-1RAcP)。此外，IL-1RAP表达与AML疾病的临床阶段以及肿瘤负荷有关。

发明内容

IL-1RAP(白介素1受体辅助蛋白，Genbank登录号AAB4059)是IL-1和IL33受体的共受体，参与IL-1信号转导，其活化不同的信号转导途径，包括MAP激酶、p38、NF-κB以及炎症和增殖中牵涉的其它基因。该蛋白在肿瘤细胞表面表达。因此，IL-1RAP是一种有前途的肿瘤相关抗原。

申请人已经发现，通过使用这种CART-IL-1RAP细胞，有可能可以治疗患有AML的患者。

因此，本发明涉及一种用于治疗急性髓系白血病(AML)的用途的细胞，所述细胞在其膜上表达编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中，所述CAR包含抗体或抗体片段，所述CAR包含抗IL-1RAP结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号转导结构域，所述细胞内信号转导结构域至少包含刺激结构域，并且其中，所述抗IL-1RAP结合结构域包含：

(i)轻链，所述轻链包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)与氨基酸序列SEQ ID NO：6具有至少80％同一性，所述互补决定区2(CDR2)与氨基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80％同一性，所述互补决定区3(CDR3)与氨基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80％同一性；以及

(ii)重链，所述重链包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)与氨基酸序列SEQ ID NO：12具有至少80％同一性，所述互补决定区2(CDR2)与氨基酸序列SEQ ID NO：13具有至少80％同一性，所述互补决定区3(CDR3)与氨基酸序列SEQ ID NO：14具有至少80％同一性。

表达CAR的T细胞在本文中称为“CAR T细胞”或“CAR修饰的T细胞”。表达靶向IL-1RAP的CAR的T细胞在本文中称为“CART-IL-1RAP细胞”或“CART-IL-1RAP修饰的T细胞”。

用于根据本发明的用途的细胞经遗传修饰以表达本文所述的CAR，从而用于治疗AML的用途。如本文所使用的，术语“遗传工程化的”或“遗传修饰的”是指将处于DNA或RNA形式的额外遗传物质添加到细胞中的总遗传物质中。

附图说明

图1：不同造血AML细胞系和CD14+细胞分选的单核细胞的蛋白质印迹。

图2：通过ELISA技术用#E3C3 mAb识别IL-1RAP重组蛋白(b)。BSA为阴性对照(a)。

图3：AML患者原始样品(primary sample)上的流式细胞术门控策略。提供了母细胞(blast)和单核细胞亚群的RFI(左)。常规AML(所有亚型)患者的同期群(n＝30)中AML母细胞和单核细胞中IL-1RAP+的百分比以及AML母细胞中CD123+和IL-1RAP+/CD123+细胞的百分比(右，上)。也提供了RFI(右，下)。

图4：使用冷冻组织阵列的特异性组织结合。分别使用高IL-1RAP表达细胞系(KU812)(a)或IL-1RAP阴性表达细胞系(Raji)(b)作为阳性对照或阴性对照。测试了以下组织：a：淋巴结；b：结肠；c：小肠；d：胎盘；e：胃；f：肺；g：脾；以及h：前列腺。

图5：携带安全盒iCASP9、#E3C3 mAb的单链可变片段(the single chainfragment variable，scFv)以及细胞表面表达的标志物ΔCD19的SIN慢病毒构建体的设计。3个转基因被2A肽剪切序列分隔开，并处于EF1启动子加SP163增强子序列的控制下。

图6：IL-1RAP转导的T细胞的亚细胞级分的CD3蛋白质印迹。a：总裂解物；b：膜；c：胞浆；d：核；(1)CAR相关CD3ζ(55kDa)；(2)内源性CD3ζ(16kDa)；(3)CD45(147kDa)；(4)核纤层蛋白(68kDa)；(5)GAPDH(35kDa)。

图7：IL-1RAP CAR转导的CEM T细胞系或原代T细胞的FACS分析检测。将生物素+/CD19+CEM细胞或T细胞的百分比(a)针对生物素标记重组蛋白的量(b)作图。

图8：二聚体化学诱导剂(Chemical Inducer Dimerizer，10nM CID)暴露后，iCASP9/AP1903自杀系统盒的安全开关。(a)293T细胞；(b)IL-1RAP CAR 293T细胞。

图9：与未转导T细胞(C0)相比，24h或48h CID暴露后IL-1RAP CART细胞的清除(***p<0.001，n＝3)。

图10：(A)流式细胞术CFSE染料稀释分析的门控策略，代表性实验。(B)分裂的CFSE阳性细胞总数的百分比。3个独立实验的平均值±SD。***p<0.001(学生检验)。

图11：(A)细胞内IFNγ细胞因子检测的门控策略，代表性实验。(B)产生细胞内IFNγ的细胞总数的百分比。CD8+和CD8-(主要为CD4+)细胞的3个独立实验的平均值±SD。***p<0.001。**p<0.01(学生检验)

图12：(A)IL-1RAP CAR T细胞裂解表达细胞表面IL-1RAP的细胞的功效研究的门控策略。(B)活靶细胞总数的百分比。3个独立实验的平均值±SD。

图13：(A)组织微阵列。美国食品药品监督管理局标准冷冻组织阵列的代表性#A3C3染色，包括每种器官3个不同供体的90个组织核心(30种器官)(US Biomax，Rockville，MD，美国)。使用UltraView Universal DAB检测试剂盒(Ventana，美国)检测免疫染色。获取图像并使用NDP.view 2.0软件进行分析。展示了在所分析的3个个体中的至少1个个体中显示出一定程度的#A3C3 mAb染色的组织(比例尺100μm)。将高IL-1RAP表达细胞系(KU812)或IL-1RAP阴性表达细胞系(Raji)分别用作阳性对照或阴性对照。(B)HMEC-1真皮内皮细胞系的IL-1RAP R&D(红)染色或#A3C3(蓝)染色。同种型IgG1(灰色)以叠加形式描绘。提供了两种染色的RFI。

图14：IL-1RAP CAR T细胞对健康造血细胞的影响以及安全自杀基因iCASP9盒的效率。(A)来自健康供体(n＝5)的外周血(左)或骨髓(右)细胞上的IL-1RAP细胞表面表达。SSC-A/CD45+使得能够将亚群区分为淋巴细胞(SSC-A低)、单核细胞(CD33+)、粒细胞(SSC-A高)或HSC(CD33-/CD34+)。由同种型染色计算RFI并提供在各窗口中。(B)全人脐带血细胞的代表性IL-1RAP染色(3个中的1个)。提供了整体的CD34+、CD34+/CD38-和CD34+/CD38+HSC脐带血亚群的IL-1RAP染色。(C)相比来自CML患者的骨髓(BM，n＝10)或外周血(PB，n＝10)的CD34+细胞，来自健康供体(n＝5)的脐带血(CB，n＝5)或BM的CD34+细胞中的IL-1RAP阳性细胞。(D)左：在自体未转导T细胞或Mock T细胞或IL-1RAP CAR T细胞以不同效应物:靶标(E:T)比存在下培养的SSC-A/CD45+粒细胞(G)、单核细胞(M)和淋巴细胞(L)亚群的点图。右：与自体Mock T细胞(虚线)或IL-1RAP CAR T细胞(实线)共培养24h的淋巴细胞(正方形)、单核细胞(圆圈)和粒细胞(三角形)中的活细胞的相对百分比，归一化至未转导自体T细胞(C0)。(E)在Mock T细胞(黑色，虚线)或IL-1RAP CAR T细胞(白色，实线)以不同E:T比存在下，单核细胞(正方形)、KU812(圆圈)或K562(三角形)亚群中活细胞的相对百分比。借助基于5000荧光珠细胞计数采集(cytometry acquisition)使用Trucount管确定的绝对细胞数来计算百分比。(F)左：CID AP1903诱导的细胞死亡的绝对计数的门控策略和分析。将未转导T细胞(C0)或IL-1RAP CAR T细胞暴露于仅培养基或培养基+CID(20nM，24h)。在采集5000个荧光珠后进行定量。将杀伤效率归一化至对照细胞(未处理细胞)。细胞杀伤如下进行计算：％死细胞＝[1-(AP1903处理的细胞中活细胞的绝对数目/未处理细胞中活细胞的绝对数目)]×100。(D)死亡率的绝对百分比。C0或IL-1RAP CAR(在CD3+/CD19+上进行门控)T细胞CID暴露24h或48h。右：结果为来自3个独立实验的平均值。**p<0.001。(G)在i.p.AP1903(白色条)处理后24小时注射入肿瘤(CML KU812，i.v.)异种移植NSG模型中的IL-1RAP CAR T细胞的绝对定量(n＝3只小鼠/组)。使用输注有对照T细胞(C0)的小鼠作为对照(n＝2只小鼠/组)。**p<0.01。提供了每mL外周血的细胞数。

图15：实验性免疫安全性人CD34+移植NOG鼠模型，用以研究自体IL-1RAP CART细胞对人CD34+脐带血细胞移植/NOG鼠模型(hu-NOG)的HSC和/或免疫细胞的特异性毒性。简而言之，输注10.10E6个自体CART细胞或对照T细胞(C0)(由人CD45+细胞产生，分选自鼠PBMC、脾或骨髓)。在输注后不同时间(第5天、第8天和第15天)通过细胞计数术评估对成熟免疫细胞(hCD3+、hCD19+、hCD56+、hCD14+、hCD11b+)的监测。由CART细胞输注前第-7天获得的免疫分型参比计算倍数变化。与外周血采集时间(第-9天)相比。与外周血采集时间(第-9天)相比，未转导细胞(C0，白色条)或IL-1RAP CART细胞(黑色条)输注后第3天、第8天和第15天时不同免疫活性细胞亚群的倍数变化。从眼球后样品收获的外周血进行细胞计数，并针对第-7天参比计算倍数变化。n.s：不显著。

图16：集落形成单位(CFU-GM)实验：该实验来自于从3个不同脐带血中获得的CD34+HSC，其单独培养(白色条)或与它们各自的自体未转导T细胞(C0，灰色条)或IL-1RAP CART细胞(黑色条)共培养。

图17：上图：通过光学显微术评价CID对转导的293T细胞的作用。下图：CID AP1903暴露后IL-1RAP CART细胞的流式细胞术分析。在对未转导T细胞(C0)以及表达或不表达IL-1RAP CAR的GMTC混合物进行CID暴露(20nM，24小时，深灰色)或不进行暴露(浅灰色)后的流式细胞术分析。CD3+/CD19+染色使得能够区分表达CAR的GMTC。

图18：根据欧洲白血病网(ELN)预后分类，AML患者原始样品上的绝对细胞表面IL-1RAP抗原位点和IL-1RAP mRNA表达。

图19：IL-1RAP CART细胞的AML母细胞毒性。表示出了门控策略。将CD34抗体用于鉴别靶AML母细胞(图19A)。还示出了显示IL-1RAP CART细胞的细胞毒性的AML母细胞事件数量(图19A)。3个独立实验的结果示于图19B。图19A和图19B的图例：FSC：前向散射，表示细胞的大小。7-AAD：7-氨基放线菌素D，细胞活力标志物。E-Fluor：染色细胞膜的染料。#1和#2实验是用由健康供体产生的同种异体IL-1RAP CART细胞进行的。#3实验是用由AML患者的T细胞产生的同种异体IL-1RAP CART细胞进行的。活细胞意味着活AML母细胞。

图20：在人AML小鼠异种移植模型中IL-1RAP CAR-T细胞的功效。对免疫缺陷NSG-S小鼠进行辐照(2.5Gy)，并在次日(第3天)注射1×10⁶个表达萤光素酶的HL-60或Molm-13或Mono-Mac-6 AML细胞。图20A：在第0天，在AML细胞注射后，不对小鼠进行处理或用对照T细胞(即MockT或UNT细胞，300μL PBS中的10×10⁶个细胞)或IL-1RAP CAR-T细胞(300μL PBS中的10×10⁶个细胞)进行处理，并在所提及的日期使用生物发光成像(BLI)对白血病发展进行监测。从第0天到第21天对不同组的小鼠进行生物发光成像分析。图例：(x)：死小鼠。

UNT或IL-1RAP CAR T细胞注射。图20B：使用生物发光成像(BLI)采集的体内生物发光信号的辐亮度(radiance)(辐亮度p/s/cm²/sr)。

具体实施方式

因此，本发明涉及一种用于治疗急性髓系白血病(AML)的用途的细胞，所述细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中，所述CAR包含抗体或抗体片段，所述CAR包含抗IL-1RAP结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号转导结构域，所述细胞内信号转导结构域至少包含刺激结构域，并且其中，所述抗IL-1RAP结合结构域包含：

(i)轻链，所述轻链包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)与氨基酸序列SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述互补决定区2(CDR2)与氨基酸序列SEQ IDNO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述互补决定区3(CDR3)与氨基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；以及

(ii)重链，所述重链包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)与氨基酸序列SEQ ID NO：12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述互补决定区2(CDR2)与氨基酸序列SEQ ID NO：13具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述互补决定区3(CDR3)与氨基酸序列SEQ ID NO：14具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

下表总结了序列标识符

表1：序列表

术语“#E3C3”和“#A3C3”应理解为相同：#E3C3能够被自由地用以指代#A3C3，反之亦然。

IgG1、IgG4、CD8α、4-1BB、CD3ζ、CD28和ICasp9基因的铰链区的序列可在Genbank上找到。

除非特别指出相反的情况，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，出于说明目的在下面对其中的许多方法进行了描述。此类技术在文献中有充分解释。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，2001)；Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)；Maniatis等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons，2008年7月更新)；Short Protocols inMolecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover，DNA Cloning：APractical Approach，vol.I&II(IRL出版社，牛津，1985)；Anand，Techniques for theAnalysis of Complex Genomes，(学术出版社，纽约，1992)；Transcription andTranslation(B.Hames&S.Higgins编，1984)；Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；Harlow and Lane，Antibodies，(冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1998)；Current Protocols in Immunology，Q.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober编，1991；Annual Review of Immunology；以及诸如Advances in Immunology等期刊的专著。

除非另有定义，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管类似或等同于本文描述的方法和材料的任何方法和材料都可用于本发明的实践或测试，本文描述了组合物、方法和材料的优选实施方式。

如本领域技术人员将理解的并且如本文中其它地方所述，完整的抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由可变区以及第一恒定区、第二恒定区和第三恒定区组成，而每条轻链由可变区和恒定区组成。哺乳动物重链分为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动物轻链分为λ或κ。包含α、δ、ε、γ和μ重链的免疫球蛋白被分类为免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完整的抗体形成“Y”形。Y的茎由结合在一起的两条重链的第二恒定区和第三恒定区(对于IgE和IgM为第四恒定区)组成，并在铰链中形成二硫键(链间)。重链γ、α和δ具有由3个串联(在一条线上)的Ig结构域组成的恒定区以及用于增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由4个免疫球蛋白结构域组成的恒定区。第二恒定区和第三恒定区分别称为“CH2结构域”和“CH3结构域”。Y的每个臂包含与一条轻链的可变区和恒定区结合的一条重链的第一恒定区和可变区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。

轻链和重链可变区包含被3个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)中断的“框架”区。可通过常规方法界定或鉴别CDR，例如通过根据Kabat等所述的序列(Wu,TT和Kabat,E.A.，J Exp Med.132(2)：211-50，(1970)；Borden,P.和Kabat E.A.，PNAS，84：2440-2443(1987)(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生与公共服务部，1991)；或者通过根据Chothia等所述的结构(Choithia,C.和Lesk,A.M.，JMol.Biol.，196(4)：901-917(1987)；Choithia,C.等，Nature，342：877-883(1989))。

不同轻链或重链的框架区的序列在物种(例如人)内相对保守。抗体的框架区(其为组成的轻链和重链的组合框架区)用于在三维空间中定位和排列CDR。CDR主要负责结合抗原表位。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始按顺序编号，并且通常还通过特定CDR所在的链来标识。因此，位于抗体重链的可变结构域中的CDR被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而位于抗体轻链的可变结构域中的CDR被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。具有不同特异性(即针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。

提及“VH”或“V_H”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、Fab或如本文所公开的其它抗体片段的可变区。

提及“VL”或“V_L”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公开的其它抗体片段的可变区。

“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单一克隆或由其中转染了单一抗体的轻链和重链基因的细胞所产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合来制造形成抗体的杂交细胞。单克隆抗体包括嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体。

冠词“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”在本文中用于指代一个/一种或者指代多于一个/一种(即指代至少一个/一种)该冠词的语法对象。

如本文所使用的，术语“约/大约(about/approximately)”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度与参比数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相差多达30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在具体实施方式中，当在数值之前时术语“约/大约”表示该值±15％、±10％、±5％或±1％的范围。

在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括/包含/含有(comprise/comprises/comprising)”将被理解为暗示包括所提到的步骤或要素或者步骤或要素的组，但不排除任何其它步骤或要素或者步骤或要素的组。

在整个本说明书中提及“一个实施方式”、“实施方式”、“具体实施方式”、“某实施方式”、“另外的实施方式”或“进一步的实施方式”或它们的组合意为结合该实施方式描述的具体特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。

为本发明的目的，通过在比较窗口中比较两个比对的序列来计算“同一性”或“同源性”。序列的比对使得能够确定比较窗口中两个序列共有的位置(核苷酸或氨基酸)的数目。然后，将共有位置的数目除以比较窗口中的总位置数并乘以100，以获得同源性百分比。序列同一性百分比的确定可手动完成或者通过使用公知的计算机程序完成。

本发明提供了用于治疗急性髓系白血病(AML)的用途的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞用载体进行了遗传工程化，所述载体被设计为表达将细胞毒性重定向至肿瘤细胞的遗传工程化受体。这些遗传工程化受体在本文中称为嵌合抗原受体(CAR)。

CAR是这样的分子：组合了针对靶抗原(例如肿瘤抗原)的基于抗体的特异性与T细胞受体活化细胞内结构域，而生成表现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白。如本文所使用的，术语“嵌合”描述由来自不同来源的不同蛋白或DNA的部分组成。

CAR的主要特征是它们重定向免疫效应细胞特异性的能力，从而引起增殖、细胞因子产生、吞噬作用、或者可以以主要组织相容性(MHC)非依赖性的方式介导表达靶抗原的细胞的细胞死亡的分子的产生，利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向能力。

如本文所使用的，术语“结合结构域”、“细胞外结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“细胞外抗原特异性结合结构域”可互换使用，并提供了CAR特异性结合至感兴趣的靶抗原的能力。结合结构域可包含拥有特异性识别并结合至生物分子(例如细胞表面受体或肿瘤蛋白、脂质、多糖或其它细胞表面靶分子，或它们的组成部分)的能力的任意蛋白、多肽、寡肽或肽。结合结构域包括感兴趣的生物分子的任何天然存在的结合伴侣、合成的结合伴侣、半合成的结合伴侣或重组产生的结合伴侣。如本文所使用的术语“特异性结合亲和力”或“特异性结合(的)(specifically binds/specifically bound/specific binding)”或“特异性靶向”描述了一个分子与另一分子以比背景结合更大的结合亲和力结合。如果结合结构域(或包含结合结构域的CAR或包含结合结构域的融合蛋白)以例如大于或等于约10⁵M^-1的亲和力或Ka(即特定结合相互作用的平衡缔合常数，以1/M为单位)与靶分子结合或缔合，则该结合结构域(或包含结合结构域的CAR或包含结合结构域的融合蛋白)“特异性结合”该靶分子。可使用常规技术例如竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)容易地确定根据本公开的结合结构域多肽和CAR蛋白的亲和力。

抗体为人抗体、鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

在某些优选实施方式中，抗体是特异性结合至肿瘤细胞的表面蛋白的嵌合抗体(例如嵌合单克隆抗体)。“嵌合”抗体是包含人框架区以及来自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。因此，可能除了CDR外，嵌合免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分实质上相同。嵌合或其它单克隆抗体可具有额外的保守氨基酸置换，所述保守氨基酸置换对抗原结合或其它免疫球蛋白功能实质上没有影响。可借助遗传工程来构建嵌合抗体(参见例如美国专利No.5,585,089)。

抗体包括其抗原结合片段，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)以及全长抗体负责抗原结合的部分。该术语还包括遗传工程化形式，例如人源化抗体、异源缀合抗体(heteroconjugate antibodies)(如双特异性抗体)以及它们的抗原结合片段。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH结构域和VL结构域，其中，这些结构域以任一取向存在于单条多肽链中(例如VL-VH或VH-VL)。

可从特异性针对期望靶标的杂交瘤的V区域基因克隆单链抗体。此类杂交瘤的生产已成为常规。可用于克隆重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的技术例如在Orlandi等，PNAS，1989；86：3833-3837中已有所描述。

通常，scFv多肽进一步包含处于VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。

本文考虑的CAR可包含1个、2个、3个、4个或5个或更多个接头。在具体实施方式中，接头的长度为约1个至约25个氨基酸、约5个至约20个氨基酸、或约10个至约20个氨基酸，或者任何介于中间的氨基酸长度。在一些实施方式中，接头的长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个氨基酸。

接头的示例性实例包括甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(Gi_sSi_5)n，其中n为至少1、2、3、4或5的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其它柔性接头。甘氨酸聚合物和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可能能够充当融合蛋白(例如本文所述的CAR)的结构域之间的中性系链(tether)。甘氨酸甚至比丙氨酸明显更容易接近phi-psi空间，并且比具有更长侧链的残基受到的限制少得多(参见Scheraga，Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。本领域普通技术人员将认识到，具体实施方式中CAR的设计可包括完全或部分柔性的接头，使得接头可包含柔性接头以及一个或多个赋予较低柔性结构的部分，以提供期望的CAR结构。

在具体实施方式中，接头在VH结构域和VL结构域之间。

在具体实施方式中，接头包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列或者由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。

在一个实施方式中，IL-1RAP结合结构域为包含轻链可变区和重链可变区的scFv，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO：4的轻链可变区氨基酸序列中具有至少1个、2个或3个修饰但不多于30个、20个或10个修饰的氨基酸序列，所述重链可变区包含在SEQ ID NO：2的重链可变区氨基酸序列中具有至少1个、2个或3个修饰但不多于30个、20个或10个修饰的氨基酸序列。

优选地，IL-1RAP结合结构域为scFv，所述scFv包含(i)轻链可变区，所述轻链可变区包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)与氨基酸序列SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性，所述互补决定区2(CDR2)与氨基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性，所述互补决定区3(CDR3)与氨基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性；以及(ii)重链可变区，所述重链可变区包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)与氨基酸序列SEQ ID NO：12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性，所述互补决定区2(CDR2)与氨基酸序列SEQ ID NO：13具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性，所述互补决定区3(CDR3)与氨基酸序列SEQ ID NO：14具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性。

CAR的结合结构域后面通常是一个或多个“铰链区”，其在将抗原结合结构域定位于远离效应细胞表面以使得能得到适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化中起作用。CAR通常在结合结构域和跨膜结构域之间包含一个或多个铰链区。铰链区可来源于天然来源、合成来源、半合成来源或重组来源。

优选地，抗IL-1RAP结合结构域通过铰链区连接至跨膜结构域。

在实施方式中，铰链区包含IgG1的铰链序列或与IgG1的铰链序列具有95％-99％同一性的序列。IgG铰链由单个外显子编码。因此，如本文所使用的术语“IgG1的铰链序列”具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义，即由IgG1外显子编码的铰链的15个氨基酸残基(基础免疫学，第五版，第3章，免疫球蛋白：结构和功能——免疫球蛋白铰链)。

在进一步的实施方式中，铰链区包含IgG4的铰链序列或与IgG4的铰链序列具有95％-99％同一性的序列。在进一步的实施方式中，铰链区还可包含IgG1或IgG4的CH2-CH3区域或者与IgG1或IgG4的CH2-CH3区域具有95％-99％同一性的序列。

在进一步的实施方式中，铰链区包含CD8α或与CD8α具有95％-99％同一性的序列。

“跨膜结构域”是CAR的一部分，其融合细胞外结合部分和细胞内信号转导结构域，并将CAR锚定至免疫效应细胞的质膜。跨膜结构域可来源于天然来源、合成来源、半合成来源或重组来源。

优选地，所编码的CAR包含选自于由以下蛋白所组成的组中的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α链、β链或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154，更优选CD28。

在具体实施方式中，本文考虑的CAR包含细胞内信号转导结构域。“细胞内信号转导结构域”是指CAR的一部分，其参与将有效的CAR与靶抗原结合的信息转导至免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括向CAR结合的靶细胞释放细胞毒性因子，或由抗原结合至细胞外CAR结构域所引起的其它细胞应答。

术语“效应物功能”是指细胞的专门功能。T细胞的效应物功能例如可为细胞溶解活性或包括细胞因子分泌在内的活性或协助。因此，术语“细胞内信号转导结构域”是指蛋白的如下部分：其转导效应物功能信号并指导细胞执行专门功能。虽然通常可使用整个细胞内信号转导结构域，但在许多情况中，没有必要使用整个结构域。就使用细胞内信号转导结构域的截短部分而言，只要其转导效应物功能信号，就可使用此类截短部分代替整个结构域。术语“细胞内信号转导结构域”旨在包括足以转导效应物功能信号的任何细胞内信号转导结构域的截短部分。

已知仅通过TCR生成的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，可以说T细胞活化是由两类不同的细胞内信号转导结构域介导的：通过TCR(例如TCR/CD3复合体)起始抗原依赖性主要活化的主要信号转导结构域；以及以非抗原依赖性方式起作用以提供次级信号或共刺激信号的共刺激信号转导结构域。在优选实施方式中，本文考虑的CAR包含细胞内信号转导结构域，所述细胞内信号转导结构域包含一个或多个“共刺激信号转导结构域”。

在实施方式中，分离的核酸分子可编码包含至少一个共刺激结构域的细胞内信号转导结构域。因此，在这种实施方式中，细胞内信号转导结构域包含至少一个共刺激结构域。

如本文所使用的，术语“共刺激信号转导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号转导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体外的细胞表面分子，其在结合至抗原后提供T淋巴细胞的有效活化和功能所需的第二信号。

优选地，功能性细胞内信号转导结构域的所述至少一个共刺激结构域由选自于由以下蛋白所组成的组中的一种或多种蛋白获得：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、CD3ζ、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1ВB(CD137)。

更优选地，由4-1ВB(CD137)获得的共刺激结构域具有与4-1BB的共刺激结构域的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。

更优选地，由CD3ζ获得的共刺激结构域具有与CD3ζ的共刺激结构域的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。

在另一实施方式中，细胞内信号转导结构域包含由4-1BB获得的共刺激结构域和/或由CD3ζ获得的共刺激结构域。

在特别优选的实施方式中，CAR包含CD3ζ主要信号转导结构域和一个或多个共刺激信号转导结构域。细胞内主要信号转导结构域和共刺激信号转导结构域可以以任何顺序串联连接至跨膜结构域的羧基末端。

可根据本发明使用的细胞可以是分离的。“分离的细胞”是指由体内组织或器官获得并且实质上不含细胞外基质的细胞。

根据本发明的用于治疗AML的细胞可以通过在宿主细胞的基因组内使用载体插入编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子来制备。

术语“载体”在本文中用于指能够转移或运输另一核酸分子的核酸分子。所转移的核酸通常连接至(例如插入至)载体核酸分子。载体可包含指导在细胞中自主复制的序列，或者可包含足以允许整合至宿主细胞DNA中的序列。

根据本发明的用于治疗AML的细胞可使用包含编码CAR的核酸分子的载体来制备，所述载体选自于DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体，优选慢病毒载体。

在一些实施方式中，载体包含启动子，优选EF-1α启动子。

逆转录病毒是基因递送的常用工具。在具体实施方式中，将逆转录病毒用于将编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸递送至细胞。如本文所使用的，术语“逆转录病毒”是指如下RNA病毒：所述RNA病毒将其基因组RNA逆转录为线性双链DNA拷贝，随后将其基因组DNA共价整合至宿主基因组中。一旦病毒整合至宿主基因组中，其被称为“前病毒(provirus)”。前病毒充当RNA聚合酶II的模板，并指导编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶的RNA分子的表达。

因此，用载体转导的T细胞能够引起稳定、长期且持久的CAR介导的T细胞应答。

在具体实施方式中，用编码CAR的逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)对T细胞进行转导。

如本文所使用的，术语“慢病毒”是指一组(或属)复杂的逆转录病毒。示例性慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括1型HIV和2型HIV)；维斯那-梅迪病病毒(visna-maedi virus，VMV)；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猴免疫缺陷病毒(SIV)。

术语“慢病毒载体”是指含有主要源自慢病毒的结构遗传元件和功能遗传元件或者它们的部分(包括LTR)的病毒载体或质粒。

“自灭活”(SIN)载体是指复制缺陷型载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，其中已对右侧(3')LTR增强子-启动子区域(称为U3区域)进行了修饰(例如通过删除或置换)，以防止第一轮病毒复制之外的病毒转录。

在一个实施方式中，优选SIN载体骨架。

优选地，使用的载体进一步包含启动子，例如EF-1α启动子。

如本文所使用的，术语“启动子”是指RNA聚合酶所结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶起始并转录与启动子可操作地连接的多核苷酸。在具体实施方式中，可期望由在T细胞中提供稳定且长期的CAR表达的启动子来表达包含CAR的多核苷酸，并且以足以将T细胞重定向至表达靶抗原的细胞的水平表达。

用于根据本发明的用途的细胞优选为T细胞(例如人T细胞)，更优选CD8+T细胞(例如人CD8+T细胞)。在优选实施方式中，用于根据本发明的用途的细胞(例如T细胞)在其膜上表达CAR。如本文所使用的术语“在其膜上”具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义，即“在细胞表面膜上”。

在具体实施方式中，在本文所述的免疫效应细胞的体外操纵或者遗传修饰之前，从受试者获得细胞来源。在具体实施方式中，用于根据本发明的用途的细胞涵盖T细胞。T细胞可获得自多种来源，包括但不限于：外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织以及肿瘤。在某些实施方式中，可使用本领域技术人员已知的任何数量的技术(例如沉淀，如FICOLL^TM分离)从收集自受试者的单位血液获得T细胞。可通过血液成分单采术(apheresis)获得来自个体循环血液的细胞。血液成分单采术的产物通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，可对通过血液成分单采术收集的细胞进行洗涤，以移除血浆级分，并将细胞置于合适的缓冲液或介质中以用于后续处理。

可通过裂解红细胞并耗尽单核细胞(例如通过经PERCOLL^TM梯度离心)，从外周血单个核细胞中分离T细胞。可通过正向选择或负向选择技术进一步分离表达一种或数种标志物(例如CD4或CD8)的特定T细胞亚群。例如，可用针对负向选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过负向选择进行的T细胞群的富集。

在本发明的一些实施方式中，带有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子的细胞利用自杀基因(包括诱导型自杀基因)来降低直接毒性(即同种异体给药环境中的移植物抗宿主病)和/或基因修饰的细胞不受控制的增殖的风险。在具体方面，自杀基因对带有所述多核苷酸或细胞的宿主不具有免疫原性。可使用的自杀基因的某些实例为诱导型半胱天冬酶-9(iCASP9)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)、CD20、截短的EGFR、半胱天冬酶8或胞嘧啶脱氨酶。可使用特定的二聚化化学诱导剂(CID)活化半胱天冬酶9。其它系统可通过对前药(更昔洛韦)进行代谢或者通过结合抗体(利妥昔单抗、西妥昔单抗(Cituximab))来活化。

本文公开了一类细胞疗法，其中，对T细胞离体进行遗传修饰以表达CAR，并将CART细胞输注至对其有需要的接受者。输注的细胞能够杀伤接受者(优选人)中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR T细胞能够在体内复制，从而导致可引起持续的肿瘤控制的长期持久性。

此外，CAR使得在通过抗体来源的受体结合后允许效应T细胞向任何细胞表面分子的重定向和活化，并且独立于MHC限制。

从患者自身的细胞(自体)开始构建用于根据本发明的用途的遗传修饰的细胞(例如T细胞)，但它们也可起源于其它同种异体供体，以在骨髓或外周造血干细胞同种异体移植物环境中提供同种异体遗传修饰的T细胞(供体淋巴细胞输注)。这些表达CAR分子的细胞可用于在哺乳动物(优选人)中治疗AML，该疾病与细胞表面IL-1RAP表达有关。

优选地，这些细胞(例如T细胞)表达包含抗原结合结构域(其为抗IL-1RAP scFv)的CAR分子，所述CAR分子包含抗IL-1RAP结合结构域、CD28蛋白的跨膜结构域、共刺激4-1BB信号转导结构域以及CD3ζ信号转导结构域，其中，所述抗IL-1RAP结合结构域包含：

(i)轻链，所述轻链包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)与氨基酸序列SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性，所述互补决定区2(CDR2)与氨基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性，所述互补决定区3(CDR3)与氨基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性；以及

(ii)重链，所述重链包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)与氨基酸序列SEQ ID NO：12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性，所述互补决定区2(CDR2)与氨基酸序列SEQ ID NO：13具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性，所述互补决定区3(CDR3)与氨基酸序列SEQ ID NO：14具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性。

AML可为根据欧洲白血病网(ELN)预后分类的任何AML和/或根据法美英(FAB)分类的任何亚型AML。

在一个实施方式中，AML为复发性/难治性AML。

在另一实施方式中，AML为具有复杂细胞遗传异常(cytogenetic abnormalities)(即根据WHO分类的细胞遗传异常)的复发性/难治性AML和/或具有TP53突变的AML。

TP53是由位于17号染色体短臂上的TP53基因编码的肿瘤抑制蛋白。TP53在维持响应于DNA损伤的基因组稳定性方面起着关键作用；它活化DNA修复程序，并触发细胞周期停滞。TP53在超过一半的人类癌症中发生突变。在AML中，突变的TP53主要在治疗相关的AML和/或在具有复杂染色体核型的患者中观察到。来自AML小鼠模型的研究表明，热点区域中的功能获得突变可促进更具侵袭性的AML。先前的研究已表明，TP53突变的存在与具有或不具有复杂染色体核型的患者中的不良生存以及对化疗的不良响应相关。在多变量分析中，在没有异常的细胞遗传异常的情况下的TP53突变的存在预示不良的总生存和较差的治疗响应。在一些实施方式中，AML为与IL-1RAP表达相关的AML(也称为“表达IL-1RAP的AML”或“IL-1RAP+AML”)。

在一些实施方式中，与IL-1RAP表达相关的AML为(i)IL-1RAP+AML的复发性/难治性形式或(ii)具有复杂细胞遗传异常的IL-1RAP+AML和/或具有TP53突变的IL-1RAP+AML。

用于根据本发明的用途的细胞可用于治疗所有年龄的患者，特别是小于60岁的患者(例如小于20岁的患者，即小儿AML)和/或60岁以上的患者。

表达IL-1RAP特异性CAR分子的细胞(例如T细胞)可用于在人中治疗AML的方法中，其中，所述人已经通过至少一种治疗线(therapy line)(例如化学疗法、免疫疗法或靶向疗法)进行治疗。化疗剂可为CPX-351；免疫疗法可为单克隆抗体，例如抗体药物缀合物(ADC)(例如连接至毒素的抗CD33(吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin))；双特异性抗体(Bites，例如抗CD33/CD3、抗CD123/CD3或其它AML抗细胞表面标志物/CD3)。靶向疗法药剂可为抗突变FLT3，例如米哚妥林(Midostaurin)或奎扎替尼(Quazartinib)；或靶向突变的IDH1/IDH2的药剂，例如IDH1抑制剂(依维替尼(ivosidenib))或IDH2抑制剂(恩西地平(enasidenib))。

因此，优选地，表达IL-1RAP特异性CAR分子的细胞(例如T细胞)可与至少一种单克隆抗体联合使用而用于在哺乳动物中治疗AML的方法中，所述单克隆抗体例如为抗检查点抑制剂(即抗PD-1、抗PDL-1或抗CTLA4)。抗PD-1、抗PDL-1或抗CTLA4可为纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)或tremelimumab。

因此，表达IL-1RAP特异性CAR分子的细胞(例如T细胞)可用于在人中治疗AML的方法中，其中，所述人已接受了移植物抗白血病、同种异体干细胞移植、供体淋巴细胞输注(DLI)，一种先前的CART细胞疗法，其并非为IL-1RAP CART细胞或者同种异体或自体造血移植。

如本文所使用的“治疗(treatment/treating)”包括对疾病或病理病症的症状或病理的任何有益或期望的效果，并且甚至可以包括所治疗的疾病或病症(例如癌症)的一种或多种可测量的标志物的最低降低。治疗可任选地包括疾病或病症的症状的减轻或缓解，或者疾病或病症的进展的延迟。“治疗”不一定指疾病或病症或者其相关症状的完全根除或治愈。

因此，本公开提供了用于治疗AML的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的细胞，所述细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中，所述CAR包含抗体或抗体片段，所述CAR包含抗IL-1RAP结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号转导结构域，所述细胞内信号转导结构域至少包含刺激结构域，并且其中，所述抗IL-1RAP结合结构域包含：

所述细胞(例如T细胞)可单独给予，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其它成分(如IL-2或其它细胞因子或细胞群)组合给予。简而言之，药物组合物可包含与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的靶细胞群。此类组合物可包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；助剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。短语“药学上可接受的”在本文中用于指这样的化合物、材料、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适于与人和动物的组织接触使用而无过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，具有合理的效益/风险比。

可将用于根据本发明的用途的细胞配制成组合物。

因此，本发明还涉及用于治疗急性髓系白血病(AML)的用途的组合物(例如药物组合物)，所述组合物包含细胞，所述细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中，所述CAR包含抗体或抗体片段，所述CAR包含抗IL-1RAP结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号转导结构域，所述细胞内信号转导结构域至少包含刺激结构域，并且其中，所述抗IL-1RAP结合结构域包含：

优选将用于根据本发明的用途的组合物配制用于肠胃外给药，例如血管内(静脉内或动脉内)给药、腹膜内给药或肌内给药。

如本文所使用的“肠胃外给药”是指不同于肠内给药和局部给药的给药方式，通常通过注射进行，并且包括但不限于血管内、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、瘤内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射以及输注。

在一个实施方式中，通过直接注射至肿瘤、淋巴结、全身循环或感染部位中而将CAR修饰的细胞或组合物给予受试者。

在一个实施方式中，可通过以下方式将CAR修饰的细胞(例如CAR修饰的T细胞)用于治疗诊断为AML的受试者：从所述受试者中移出免疫效应细胞；用如本文所述的包含编码CAR的核酸的载体对所述免疫效应细胞进行遗传修饰，从而产生经修饰的免疫效应细胞群；以及将所述经修饰的免疫效应细胞群给予同一受试者。在优选实施方式中，所述免疫效应细胞包含T细胞。

尽管可通过动物模型以及最终通过临床试验确定适当的剂量，但给药的量、频率以及与常规AML治疗的可能的联用顺序将取决于诸如患者的状况以及AML的类型和严重程度等因素。

遗传修饰的治疗性细胞的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及干细胞和祖细胞在个体中引发期望的应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过病毒或转导的治疗性细胞的任何毒性或有害效果的量。通常可指出，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以以10⁴-10⁹个细胞/kg体重、优选10⁵-10⁶个细胞/kg体重(包括这些范围内的所有整数值)的剂量给予。

参考以下实验实施例进一步对本发明进行详细描述。仅出于说明目的而提供这些实施例，除非另有指明，这些实施例不旨在进行限制。

实施例

实施例1：单克隆抗体生产

通过标准杂交瘤技术生成小鼠抗hIL-1RAP单克隆抗体。

简而言之，将BALB/c小鼠(5周，Charles River)用由IL-1RAP的细胞外部分(NM_002182.2，NCBI)和人IgG1的Fc部分(R&D Systems，Lille，法国)组成的重组融合蛋白通过足垫(n＝3)免疫或腹膜内(n＝5)免疫。收获淋巴结或脾细胞以及血液样品，并将细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合，然后通过FACS分析(Becton Dickinson)针对IL-1RAP阳性细胞系(KU812)和IL-1RAP阴性细胞系(Raji，KG1)进行筛选。

对杂交瘤的筛选使得能够选择将IL-1RAP阳性细胞系(KU812或KG-1，分别为AML或Phi⁺p²¹⁰ CML)与阴性细胞系(Tom-1、NALM-20、Jurkat或Raji，分别为Phi+^p190 B-ALL、Phi^-B-ALL、T-ALL或Burkitt淋巴瘤)区分开的5种单克隆抗体亚克隆。

-抗体的分子表征

根据Wang.Z.等的方案(J.Immunol.Methods，2000；233，第167-77页)，通过对用特异性针对FR1以及重链和轻链的恒定区的简并引物获得的克隆PCR扩增产物的Sanger测序，来进行分子表征。根据Brochet X.等(Nucleic Acids Res.，2008，36，pp 503-8)，使用V-QUEST在线工具针对

数据库比对共有核苷酸序列后，获得了V-D-J-C基因重排和CDR3区域的鉴别。分子Sanger测序显示，所有5种单克隆抗体是相同的，并共享相同的CDR3核苷酸序列。选择单克隆抗体亚克隆(#E3C3)，因为通过细胞计数术它发出最高的相对荧光强度(RFI)。

通过针对重组IL-1RAP蛋白的ELISA、蛋白质印迹、免疫组织化学、共聚焦显微术、来自正常组织(FDA正常人器官组织阵列，99个核心/33个部位/75例)和CML患者原始样品的组织微阵列(TMA)，对所选定的抗体(克隆#E3C3)进行表征。

-亚细胞级分的蛋白质印迹(图1)

将不同AML或CML(阳性对照)造血细胞系的全细胞裂解物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并电转移到聚偏二氟乙烯膜上。用IL-1RAP#A3C3一抗(以1:20稀释)过夜探测膜。在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上对20微克蛋白质进行电泳，然后将经超声的蛋白质级分悬浮在补充有蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete，Mini，无EDTA；Roche，Bale，瑞士)的RIPA缓冲液中。用β-肌动蛋白mAb染色(1:1000，克隆AC15，#A5441，Sigma-Aldrich)评价蛋白质印迹泳道中的蛋白质负载。用绵羊抗小鼠IgG多克隆二抗(#515-035-062，Jackson)进行免疫检测染色。增强化学发光检测试剂使得能够使用相机和Bio-1D软件(Vilber-Lourmat，Collegien，法国)进行检测。

-相对IL-1RAP mRNA表达(图18)

使用靶向细胞表面蛋白的mRNA变异密码子的Hs_00895050_m1Taqman qPCR基因表达测定(ThermoFisher Scientific)通过RT-qPCR确定相对IL-1RAP mRNA表达。根据欧洲白血病网(ELN)预后分类，对来自诊断时AML患者(n＝29)的全血样品或骨髓样品进行分析。K562、MonoMac-6和HEL-60mRNA分别用作阴性对照、高或低阳性对照。

-IL-1RAP抗原位点的绝对数量(图3)

IL-1RAP抗原位点的绝对数量的确定基于细胞计数珠阵列(CBA)技术。将1×10⁶个细胞/mL的不同白血病细胞系用抗IL-1RAP一抗(未标记的#A3C3，

)进行标记，并用FITC-IgG1抗小鼠二抗(目录号：55526，MP

)显示。按照建议使用Cell QuantCalibrator试剂盒进行实验(Ref 7208，Biocytex)。将未连接的IgG1同种型用作对照(目录号857-073-020，Diaclone)。使用流式细胞术(FACS Canto^TMII，用BD FACS DIVA V 7.0，BDBiosciences进行结果分析)完成分析。将KU812和K562分别用作阳性对照和阴性对照。

-通过ELISA的重组IL-1RAP蛋白的体外检测(图2)。

将抗人Fc抗体包被在塑料ELISA板的底部。用鼠和人IL-1RAP(#E3C3)抗体探测人抗体上加载的IL-1RAP蛋白，然后通过涂有辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠FC抗体进行显示。

ELISA确认了#E3C3单克隆抗体识别IL-1RAP重组蛋白。

-来自AML患者的原代细胞的流式细胞术分析(图3)

使用#A3C3 mAb和IL-1RAP鼠mAb作为染色比较，对不同造血AML细胞系进行IL-1RAP细胞表面染色。

计算IL-1RAP染色和同种型之间的相对荧光强度(RFI)。将IL-1RAP+(KU812)或IL-1RAP-(Raji)细胞系分别用作阳性对照或阴性对照。

对于AML患者骨髓或外周血的原始样品，将鼠IL-1RAP mAb(#E3C3)包含在组中以使得能够检测CD45、CD34、CD38、CD33、CD123和CD14(对于单核细胞)。通过CANTO II细胞计数仪(BD Biosciences，Le Pont-de-Claix，法国)收集染色细胞，并通过DIVA 6.1软件(BDBiosciences，Le Pont-de-Claix，法国)进行分析。

-原位检测

为了研究特异性或非靶组织结合，如前所述，对FDA标准冷冻组织阵列(包括每种器官3个不同供体的90个组织核心(30种器官)，US Biomax，Rockville，美国)进行孵育。使用UltraView Universal DAB检测试剂盒(Ventana，USA)检测免疫染色。获取图像并用NDP.view 2软件进行分析。将高IL-1RAP表达细胞系(KU812)或IL-1RAP阴性表达细胞系(Raji)分别用作阳性对照或阴性对照。染色强度分级如下：阴性(0)、弱染色(1+)、中度染色(2+)或强染色(3+)。将高IL-1RAP表达细胞系(KU812)或IL-1RAP阴性表达细胞系(Raji)分别用作阳性对照或阴性对照。

使用#E3C3单克隆抗体研究了IL-1RAP表达。在仅6种组织(淋巴结、结肠、小肠、胎盘、胃和前列腺，主要是上皮细胞或内皮细胞)中检测到不同强度的染色(图4)。

-结果

#A3C3能够对在细胞表面表达IL-1RAP的不同AML细胞系进行染色。使用#A3C3，通过蛋白质印迹，我们因此确认了不同细胞系的细胞表面的IL-1RAP表达，其具有不同强度水平的信号。有趣的是，CD14+单核细胞亚群也表达IL-1RAP。通过对AML(所有亚型，n＝30)患者同期群的流式细胞术分析，我们确认了(如先前现有技术中所示)IL-1RAP以不同百分比(84.27±17.4％)存在于AML母细胞上并具有细胞表面水平表达，而单核细胞表达水平保持稳定。通过欧洲白血病网(ELN)预后分层进行分类的AML患者的IL-1RAP抗原位点绝对计数也确认了这一点。基于这些结果，我们定义了3种不同的细胞表面表达水平：低、中和高。这些表达水平由细胞系进行建模以进行进一步研究。

实施例2：慢病毒构建体

基于VDJ或VJ重排的分子测序和CDR3核苷酸序列确定，通过将来源于实施例1的#E3C3 IL-1RAP杂交瘤的合成产生的单链可变片段(scFv)克隆至SIN-pSDY骨架中来制备CAR慢病毒构建体(pSDY-iC9-IL-1RAPCAR-dCD19)(Rossolillo P，Winter F，Simon-LoriereE，Gallois-Montbrun S，Negroni M.Retrovolution:HIV-driven evolution of cellulargenes and improvement of anticancer drug activation.PLoS Genet.2012；8(8)：e1002904)。

简而言之，构建了携带iCASP9安全盒、#E3C3单克隆抗体的单链可变片段以及细胞表面表达的标志物ΔCD19(用于监测和潜在细胞选择)的SIN慢病毒构建体。所有这3个转基因被2A肽剪切序列分隔开，并处于EF1启动子和SP163增强子序列(小鼠VEGF基因的5'UTR的部分，GenBank登录号#U41383)的控制下。

如图5所示，构建体携带如下3个不同部分：iCASP9(化学诱导型半胱天冬酶9)自杀安全盒、IL-1RAP CAR以及细胞表面选择标志物ΔCD19(截短了细胞内部分以避免信号转导的CD19)，它们被2个不同的2A核糖体跳跃序列(P2A和T2A)分隔开，并处于EF1α(延伸因子1启动子α)启动子外加SP163增强子的控制下。将scFv(由#E3C3免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)序列的可变区组成)与CD28-4.1BB-CD3z信号转导链读码框内(in frame)克隆在一起，并处于EF1α启动子和SP163增强子的控制下。IL-1RAP CAR含有单链可变片段(scFv)，其与前导序列(L)结合，标记有人流感血细胞凝集素(HA)，并通过铰链区连接至由2个共刺激结构域(修饰的跨膜和细胞内信号转导CD28和4-1BB)和CD3z细胞内信号转导结构域组成的T细胞活化结构域。Mock T由不具有IL-1RAP scFv的相同构建体构成。

实施例3：IL-1RAP CART细胞的生成

根据制造商说明，将从健康供体外周血单个核细胞中获得的CD3+T淋巴细胞用抗CD3/CD28珠(Life Technologies，法国)活化，然后在磁柱(MACS，Miltenyi Biotec，巴黎，法国)上分离。在第2天，在与上清液(SN)接触的情况下，通过使用实施例2的慢病毒载体在10℃下以2000g离心接种(spinoculation)90min，来对活化T细胞进行转导。通过进行流式细胞术分析以鉴别ΔCD19细胞表面标志物表达，来确定转导效率。转导后4天，使用MACS柱对标记有CD19微珠(Miltenyi Biotec，巴黎，法国)的CD19阳性细胞进行磁分离。在补充有8％人血清的含500UI/mL rhIL-2(Proleukin；Novartis)的完全X-vivo培养基(Lonza，Bale，瑞士)中使分离的CD19表达细胞扩增，并冷冻保存。在实验上，我们使用了TransAct T细胞试剂和补充有人IL-2、IL-7、IL-15或IL-7+IL-15的TexMACS培养基(Miltenyi Biotec，巴黎，法国)。

实施例4：供体T细胞的慢病毒转导

实施例2的慢病毒载体上清液原液通过以下方式产生：使用CaCl₂方法，用编码水疱性口炎病毒(VSV)包膜的辅助质粒(pMDG)以及GAG/POL(psPAX2)包装质粒(Addgene，分别为#12259和#12260，Trono等，Lausanne，瑞士)对近汇合(subconfluent)的293T细胞进行瞬时共转染。48小时和72小时后收获病毒上清液，使用PEG和低速离心(3000g，过夜)浓缩，然后在-80℃下保存直至使用。将不具有IL-1RAP scFv的相同慢病毒构建体(Mock)用作对照。使用SN的连续稀释液通过293T容许性细胞(permissive cell)转导来确定慢病毒上清液的滴度。

通过流式细胞术测量转导效率。根据起始细胞的数目从上清液滴度中扣除感染复数(MOI)。

对于Mock或CAR IL-1RAP上清液，使用慢病毒上清液的体外生产过程允许分别以2的MOI转导原代T细胞。

-IL-1RAP CAR表达的蛋白质印迹分析。

用小鼠抗人CD3z抗体探测从IL-1RAP转导的T细胞的膜或胞浆细胞亚级分(超速离心后获得)提取的全蛋白裂解物或蛋白。亚细胞级分的蛋白质印迹显示，IL-1RAP CAR与CD3z信号转导相关(55KDa处的信号，与预期的16KDa处的内源性CD3z信号相比)(图6)。

-流式细胞术分析

使用重组IL-1RAP生物素化蛋白分析T细胞表面的CAR表达，并使用抗生物素二抗(Miltenyi Biotec Clone#Bio3-18E7)通过流式细胞术进行显示。用Mock或CAR IL-1RAP转导CEM细胞系或原代T细胞。然后，在量逐渐增加的生物素标记的重组IL-1RAP存在的情况下对细胞进行孵育。用抗生物素荧光抗体进行染色，并通过流式细胞术进行分析。将生物素+/CD19+CEM或T细胞的百分比相对于生物素标记重组蛋白的量进行作图。提供了代表性染色(包括最大染色)的细胞计数分析的点图。将未转导T细胞(C0)或Mock T细胞用作对照。

使用生物素化IL-1RAP蛋白的系列稀释液(20ng-2.4pg/ml)进行的额外分析以及FACS分析允许检测IL-1RAP CAR转导的CEM T细胞系或原代T细胞。单个实验允许展示，募集最多的CEM(85.8％)或原代(68.5％)GMTC分别需要不同量的重组蛋白(1.25ng和0.15ng)(图7)。

相比原代T细胞，在CEM的细胞表面表达更多的CAR。此外，在E:T共培养中添加大量(1000倍>血浆浓度)的冷重组IL-1RAP蛋白导致效应物细胞毒性的显著抑制。

这些实验确认了CAR被定位于细胞表面上，并且存在对IL-1RAP蛋白的CAR特异性识别和结合。

实施例5：安全自杀基因iCASP9盒的效率

将转导细胞(IL-1RAP CAR 293T)或未转导细胞(293T)在仅培养基(-二聚体化学诱导剂(CID))或含有20nM CID AP1903的培养基中培养24h。光学显微术使得能够对培养物中活细胞或死细胞的存在和结构进行成像(×40)。

通过光学显微术，可显示利用IL-1RAP CAR转导的293T细胞培养物对CID敏感(图8)。

对未转导T细胞(C0)以及表达或不表达IL-1RAP CAR的GMTC细胞混合物进行CID暴露(20nM，24h)或不暴露(浅灰色)后的流式细胞术分析。CD3⁺/CD19⁺染色允许将表达CAR的GMTC与其它区分开。

使未转导T细胞(C0)或IL-1RAP CART细胞均暴露于仅培养基或培养基+CID(20nM，24h)。

根据制造商说明(Beckman Coulter，IM3614)，在膜联蛋白-V/7-AAD门控后，通过流式细胞术首先评估精确的细胞死亡。荧光分析在CD3⁺/CD19⁺阳性细胞上进行门控。在获取5000个荧光珠后确定定量。针对对照细胞(未处理细胞)对杀伤效率进行归一化。细胞杀伤如下进行计算：％死细胞＝[1-(AP1903处理的细胞中活细胞的绝对数目/未处理细胞中活细胞的绝对数目)]×100。对C0或IL-1RAP CART(在CD3+/CD19+上进行门控)细胞进行CID暴露24h或48h。结果显示为来自3个独立实验的平均值±SD。***：p<0.001(图9)。

细胞计数分析显示，在表达(CD19⁺)或不表达(CD19^-)IL-1RAP CAR的T细胞的混合群的24小时CID暴露后，仅CD19^-CD3⁺细胞持续存在。更具体而言，使用凋亡定量AnnV/7AAD测定，发现与未转导T细胞(C0，在24h或48h时分别为1.28％和6.13％)相比，在24h或48h CID暴露后分别清除了84.11％和88.93％的IL-1RAP CART细胞(p<0.001，n＝3)。

实施例6：IL-1RAP CART细胞的增殖能力

材料和方法

将未转导T细胞(C0)、Mock T细胞(MockT)或IL-1RAP CAR(IL-1RAP CART)在仅培养基(无靶标)中、或与IL-1RAP阴性(K562)细胞接触、或与细胞表面表达的靶细胞(KU812，CML，阳性对照)以及不同IL-1RAP细胞表面表达水平(低：HL-60；中：MOLM-13；高：EOL-1)的AML细胞系接触，以1:3的效应物:靶标(E:T)比培养3天。效应物先前用0.5M CFSE标记，无IL-2补充。在无IL-2补充的情况下共培养72小时后，通过流式细胞术测量CFSE染料稀释以评估活CD3+/CD19-(C0)和CD3+/CD19+门控细胞(MockT细胞或IL-1RAP CART细胞)的分裂。

结果

与未转导T细胞(C0)或MOCK转导T细胞(MockT)相反，无论靶细胞的IL-1RAP细胞表面表达如何，IL-1RAP CART细胞能够在AML细胞系存在的情况下特异性地被活化并分裂(图10A和图10B)。

实施例7：IFNγ的细胞内表达

材料和方法

将未转导T细胞(C0)、Mock转导T细胞(MockT)或IL-1RAP CAR(IL-1RAP CART)在仅培养基(无靶标)中、或与IL-1RAP阴性(K562)细胞接触、或与细胞表面表达的靶细胞(KU812，CML，阳性对照)以及不同IL-1RAP细胞表面表达水平(低：HL-60；中：MOLM-13；高：EOL-1)的AML细胞系接触，以1:5的效应物:靶标(E:T)比培养6小时。作为细胞因子产生的阳性对照，将用10ng/mL佛波醇(phorbol)肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和1μg/mL离子霉素(Sigma-Aldrich)刺激的细胞用作阳性对照。在布雷菲德菌素A处理和细胞透化后进行IFNγ标记。除CD8染色外，进一步在CD3+/CD19+(CAR阳性细胞)上进行门控后检测荧光IFNγ信号，以区分CD8+和CD4+(先前的CD8-)细胞。

结果

与未转导T细胞(C0)或MOCK转导T细胞(MockT)相反，无论IL-1RAP的细胞表面表达如何，CD8+或CD4+IL-1RAP CART细胞能够在AML细胞系存在的情况下特异性表达细胞内IFNγ(图11A和图11B)。

实施例8：IL-1RAP CART细胞对AML细胞系的细胞毒性

材料和方法

在共培养之前，用e-Fluor标记效应细胞。将未转导T细胞(C0)、Mock转导T细胞(MockT)或IL-1RAP CAR(IL-1RAP CART)在仅培养基(无靶标)中、或与IL-1RAP阴性(K562)细胞接触、或与细胞表面表达的靶细胞(KU812，CML，阳性对照)以及不同IL-1RAP细胞表面表达水平(低：HL-60；中：MOLM-13；高：EOL-1)的AML细胞系接触，以多种效应物:靶标(E:T)比培养24小时。针对FSC和7-AAD标记的细胞门控允许将靶细胞与效应细胞以及与活细胞区分开。在门控FSC+/7-AAD-中确定在存在或不存在效应细胞的情况下持久的靶细胞的百分比。将未转导T细胞(C0)或Mock转导T细胞(MockT)用作对照。

结果

与MOCK转导T细胞(MockT)相反，无论肿瘤抗原表达水平如何，效应CART细胞与IL-1RAP阳性靶标(AML)以多种E:T比进行共培养允许以相同效率杀伤表达IL-1RAP的靶AML细胞系(图12A和图12B)。

实施例9：由iCASP9安全开关保障的IL-1RAP-CART细胞对健康造血细胞无重大的有害作用

为了预测脱靶毒性，我们使用30种正常人组织的组织宏阵列(TMA)利用#A3C3 mAb来研究IL-1RAP表达。在仅6种组织(淋巴结、前列腺、骨骼肌、胃、结肠和小肠)以及胰腺中检测到不同强度水平的染色(排除炎性因子或坏死因子，图13A和表2)。有趣的是，微脉管HMEC-1内皮细胞系未被我们的#A3C3 IL-1RAP mAb识别出(图13B)，而R&D IL-1RAP mAb(R&D Systems-Ref#89412)清楚地检测到细胞表面表达，表明识别的是不同表位。

关于健康造血系统的靶向，即使mAb#A3C3未检测到来自健康供体(图14A、图14C)的骨髓(RFI<1.2，n＝5)或正常脐带血(图14B、图14C)中的HSC，我们注意到2/5的健康供体外周血和3/5的健康供体骨髓中单核细胞亚群的弱染色(RFI<2)(图14A)。接下来，我们通过以不同E:T比对PBMC和自体CART细胞进行共培养而研究了单核细胞的体外敏感性。在E:T比为1:1时，仅一些单核细胞被靶向，使41.45％的单核细胞存活(图14D，右，表3)；而淋巴细胞、粒细胞和K562 IL-1RAP阴性细胞系即使在较高的E:T比下也不受影响(图14D)。有趣的是，在该E:T比下杀伤了94.77％的白血病细胞(图14E)。

表2：正常组织的IL-1RAP(mAb#A3C3)免疫染色

表3：根据以不同E(Mock T细胞或IL-1RAP CART细胞):T比进行共培养的不同亚群中的活细胞百分比。

在hCD34移植鼠模型(hu-NOG)中体内确认了这些结果，其中我们证明了，尽管单核细胞在第15天下降(41±25％，n＝3，p＝n.s)，来源于hCD34+细胞的其它人免疫活性细胞未受到CART细胞影响(图15)。健康CD34+脐带血HSC与自体CART细胞(n＝3)体外共培养后的造血干细胞培养测定确认了HSC不受影响(图16)。这些结果与IL-1RAP CART细胞免疫疗法对造血系统几乎无不良影响一致。

为限制潜在毒性，我们评价了暴露于二聚体化学诱导剂(CID；10nM)后iCASP9/AP1903自杀系统盒的安全开关的功能性。首先，我们使用光学显微术注意到IL-1RAP CAR转导的293T细胞培养物对CID敏感(图17，上部)。细胞计数分析显示24小时CID暴露后，在CD19+和CD19-IL-1RAP CART细胞的混合群中仅CD19-CD3+细胞持续存在(图17，底部)。更具体而言，在凋亡定量测定中，与未转导T细胞(C0)相比(在24或48小时时分别为1.28％和6.13％)，在24小时或48小时CID暴露后分别清除了84.11％和88.93％的IL-1RAP CART细胞(p<0.001，n＝3；图14F)。最后，NSG鼠模型中的安全开关体内评价显示，AP1903 i.p.给药后可清除87±7.32％(p<0.01，n＝3)的IL-1RAP CART细胞，但在PBS给药后未受影响；对照未转导T细胞(C0)不受任一处理的影响(图14G)。

实施例10：IL-1RAP CART细胞对来自AML患者的AML母细胞的体外细胞毒性

材料和方法

将未转导T细胞(UNT细胞)、MockT细胞(即用与用于CART细胞的载体相同的载体转导的细胞，但该载体不携带CAR)和IL-1RAP CART细胞(由健康供体或AML患者的T细胞生成)离心并重悬在1mL PBS 1×中，然后加入1/1000稀释的1mL e-fluor-V450溶液(细胞增殖染料)(eBioscience)。将细胞在室温下在黑暗中孵育20分钟。然后加入8mL完全X-Vivo 15培养基(Lonza)、10％胎牛血清(GIBCO，美国)、1％青霉素-链霉素PS(GIBCO，美国)，随后在+4℃孵育5分钟并以1500rpm离心5分钟。将细胞用相同的培养基洗涤两次并悬浮在完全X-Vivo 15培养基、10％人血清、1％PBS(含白细胞介素2)中。在96孔板(圆底)中以不同的效应物:靶标比(E:T比)进行这些细胞与来自AML患者血液样品的100×10³个原代细胞(在同种异体或自体环境中)的共培养。终体积/孔＝200μL。共培养24小时后，通过用3μL 7-AAD-PerCP-Cy5.5(BD Bioscience)进行的活力标记以及用抗CD34-别藻蓝蛋白(APC)(BDBioscience)进行的膜染色来评价UNT细胞、MockT细胞和IL-1RAP CART细胞对AML母细胞的细胞毒性。如有必要，使用以下抗体(Abs)来染色、检测并区分AML母细胞与效应细胞(MockT或IL-1RAP CART细胞)：1μL抗CD3-藻红蛋白(PE)(Miltenyi Biotec，德国)和1μL抗CD19-别藻蓝蛋白(APC)(Miltenyi Biotec，德国)。效应细胞已通过e-fluor标记由靶细胞中鉴别出来。通过流式细胞术获得结果并用FACS Diva软件进行分析。在减去对照未转导T细胞(UNT)的细胞毒性后，得出IL-1RAP CART细胞的同种异体杀伤(allogenicity killing)。

对于其中从AML患者生成IL-1RAP T细胞的实验，在分离T细胞以检查T细胞和B细胞的存在与否后进行了AML母细胞的预先标记。

结果

结果在图19中示出。与其中未检测到细胞毒性的MOCKT细胞或UNT细胞相比，无论肿瘤抗原表达水平如何，与IL-1RAP CART细胞以多种E:T比进行共培养使得能够以相同效率杀伤来自AML患者的AML母细胞(低IL-1RAP表达者和中IL-1RAP表达者，先前通过流式细胞术进行鉴别(未示出))原代细胞。

有趣的是，由AML患者的T细胞生成的IL-1RAP CART细胞也能够以相同效率杀伤AML母细胞。这确认了CART细胞可由AML患者生成并用于自体环境中。

实施例11：IL-1RAP CART细胞对来自AML患者的AML母细胞的体内细胞毒性

材料和方法

用萤光素酶慢病毒载体(pLenti CMV V5-Luc Blast载体，Addgene)转导HL-60、Molm-13和Mono-Mac-6 AML(分别为低、中(int)和高IL-1RAP表达细胞系)。通过对杀稻瘟素(ThermoFisher Scientific)的抗性来选择萤光素酶阳性细胞。

在第4天对6至8周龄NSG小鼠(杰克逊实验室，Sacramento，CA，美国)进行亚致死辐照(25Gy)。在第3天，通过尾静脉对每只小鼠注射悬浮在300μL PBS中的1×10⁶个表达萤光素酶的HL-60或Molm-13或Mono-Mac-6 AML细胞。在第0天，在AML细胞注射后，不对小鼠进行处理(UT)或通过尾静脉用未转导T细胞(UNT)(300μL PBS中的10×10⁶个细胞)或IL-1RAPCAR-T细胞(300μL PBS中的10×10⁶个细胞)进行处理，并在第3、5、10、14、17和21天使用

lumina III系统(PerkinElmer)对白血病发展进行监测。

动物协议在

大学的动物护理和使用委员会的管理下进行。跟踪小鼠直到未处理组中的动物达到垂死的健康状态并且出现白血病迹象(即体重减轻>15％、活动减少和/或后肢麻痹)。小鼠实验由当地伦理委员会批准(对于NSG-S模型分别为CELEAG和协议11007R，动物健康与保护兽医服务(Veterinary Services for Animal Health&Protection))。

结果

结果在图20中示出。已经表明与未处理或UNT处理的T细胞的小鼠组相比，IL-1RAPCART细胞显著降低了AML体内异种移植小鼠模型中的白血病负荷，而与白血病细胞的IL-1RAP细胞表面表达无关。

序列表

<110> Etablissement Francis du Sang

INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE

(INSERM)

CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE DE BESANCON

UNIVERSITE DE FRANCHE COMTE

<120> 靶向IL-1RAP的CAR-T细胞及它们在急性髓系白血病（AML）中的用途

<130> 1H318460 - 0005

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码鼠抗IL-1RAP scFv的H链（VH）的核苷酸序列

<400> 1

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt caactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctt atgatgcctg gggcttcagt gaaagtgtcc 120

tgcgaggctt ctggctacac attcactgac tcctggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat cggagcgatt gatccttctg atagttatac tacctataat 240

caaaaattca cgggcaaggc cacattgagt gtagacgaat cctccaacac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag gtattactcc 360

ggtagtaact acatatcgcc ctttccttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 420

gca 423

<210> 2

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠抗IL-1RAP scFv的H链 (VH)的氨基酸序列

<400> 2

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Met Met

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Ser Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Thr Gly Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Glu Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Ser Pro Phe

115 120 125

Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135 140

<210> 3

<211> 382

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码鼠抗IL-1RAP scFv的K链（VL）的核苷酸序列

<400> 3

atggagtcac agattcaggt ctttgtattc gtgtttctct ggttgtctgg tgttgacgga 60

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcacc 120

atcacctgca aggccagtct ggatgtgagt actgctgtgg cctggtatca acagaaacca 180

ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 240

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 300

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagtc ctccattcac gttcggctcg 360

gggacaaact tggagataaa ac 382

<210> 4

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠抗IL-1RAP scFv的K链 (VL)的氨基酸序列

<400> 4

Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser

1 5 10 15

Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser

20 25 30

Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Leu Asp

35 40 45

Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr

100 105 110

Ser Pro Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH和VL结构域之间的接头

<400> 5

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp

1 5 10 15

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链的CDR1

<400> 6

Leu Asp Val Ser Thr Ala

1 5

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链的CDR2

<400> 7

Ser Ala Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链的CDR3

<400> 8

Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Phe Thr

1 5

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链的CDR1（nt）

<400> 9

ctggatgtga gtactgct 18

<210> 10

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链的CDR2（nt）

<400> 10

tcggcatcc 9

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链的CDR3（nt）

<400> 11

cagcaacatt atagtcctcc attcacg 27

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链的CDR1

<400> 12

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser Trp

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链的CDR2

<400> 13

Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr

1 5

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链的CDR3

<400> 14

Ala Arg Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Ser Pro Phe Pro Tyr

1 5 10 15

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链的CDR1（nt）

<400> 15

ggctacacat tcactgactc ctgg 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链的CDR2（nt）

<400> 16

attgatcctt ctgatagtta tact 24

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链的CDR3（nt）

<400> 17

gcaaggtatt actccggtag taactacata tcgccctttc cttac 45

<210> 18

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠抗IL-1RAP scFv的氨基酸序列（即#A3C3 CAR）

<400> 18

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Met Met

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Ser Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Thr Gly Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Glu Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Ser Pro Phe

115 120 125

Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Met Glu Ser Gln

145 150 155 160

Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly

165 170 175

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

180 185 190

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Leu Asp Val Ser Thr Ala

195 200 205

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

210 215 220

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

225 230 235 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

245 250 255

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Phe

260 265 270

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

275 280

Claims

1.一种用于治疗急性髓系白血病(AML)的用途的细胞，所述细胞在其膜上表达编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中，所述CAR包含抗体或抗体片段，所述CAR包含抗IL-1RAP结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号转导结构域，所述细胞内信号转导结构域至少包含刺激结构域，并且其中，所述抗IL-1RAP结合结构域包含：

2.用于如权利要求1所述的用途的细胞，其中，所述抗IL-1RAP结合结构域包含：

(i)轻链，所述轻链包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)与氨基酸序列SEQ ID NO：6具有至少95％同一性，所述互补决定区2(CDR2)与氨基酸序列SEQ ID NO：7具有至少95％同一性，所述互补决定区3(CDR3)与氨基酸序列SEQ ID NO：8具有至少95％同一性；以及

(ii)重链，所述重链包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)与氨基酸序列SEQ ID NO：12具有至少95％同一性，所述互补决定区2(CDR2)与氨基酸序列SEQ ID NO：13具有至少95％同一性，所述互补决定区3(CDR3)与氨基酸序列SEQ ID NO：14具有至少95％同一性。

3.用于如权利要求1或2所述的用途的细胞，其中，所述抗IL-1RAP结合结构域包含：

(i)轻链，所述轻链包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)具有氨基酸序列SEQ ID NO：6，所述互补决定区2(CDR2)具有氨基酸序列SEQ ID NO：7，所述互补决定区3(CDR3)具有氨基酸序列SEQ ID NO：8；以及

(ii)重链，所述重链包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区1(CDR1)具有氨基酸序列SEQ ID NO：12，所述互补决定区2(CDR2)具有氨基酸序列SEQ ID NO：13，所述互补决定区3(CDR3)具有氨基酸序列SEQ ID NO：14。

4.用于如权利要求1-3中任一项所述的用途的细胞，其中，所述细胞为T细胞，优选CD8+T细胞。

5.用于如权利要求1-4中任一项所述的用途的细胞，其中，所述抗IL-1RAP结合结构域选自于由以下所组成的组：抗体、Fv、scFv、Fab或另一抗体片段；优选scFv。

6.用于如权利要求1-5中任一项所述的用途的细胞，其中，所述跨膜结构域为选自于由以下蛋白所组成的组中的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α链、β链或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154；优选CD28。

7.用于如权利要求1-6中任一项所述的用途的细胞，其中，所述抗IL-1RAP结合结构域通过铰链区连接至所述跨膜结构域；优选地，所述铰链区包含IgG1的铰链序列或与所述IgG1的铰链序列具有95％-99％同一性的序列。

8.用于如权利要求1-7中任一项所述的用途的细胞，其中，所述细胞内信号转导结构域包含至少一个共刺激结构域；优选地，功能性细胞内信号转导结构域的所述至少一个共刺激结构域获得自选自于由以下蛋白所组成的组中的一种或多种蛋白：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、CD3ζ、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1ВB(CD137)；优选获得自4-1ВB(CD137)和/或获得自CD3ζ。

9.用于如权利要求1-8中任一项所述的用途的细胞，其中，所述AML为(i)难治性/复发性AML；或(ii)具有复杂细胞遗传异常的AML和/或具有TP53突变的AML。

10.用于如权利要求1-9中任一项所述的用途的细胞，其中，所述AML为表达IL-1RAP的AML，例如表达IL-1RAP的难治性/复发性AML。

11.用于如权利要求1-10中任一项所述的用途的细胞，其中，所述细胞与至少一种单克隆抗体联合使用，所述单克隆抗体例如为抗检查点抑制剂。

12.用于如权利要求1-11中任一项所述的用途的细胞，其中，所述治疗为自体治疗。