KR20220045109A - Il-1rap를 표적화하는 car-t 세포 및 급성 골수성 백혈병(aml)에서 이의 용도 - Google Patents

Il-1rap를 표적화하는 car-t 세포 및 급성 골수성 백혈병(aml)에서 이의 용도 Download PDF

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마리나 데샹
크리스토프 페랑
파브리스 라로사
왈리드 와르다
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에따블리스망 프랑세 뒤 상
인스티튜트 내셔널 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 (인 썸)
쌍트르 오스삐딸리에 레지오날 위니베르시떼르 드 브쟝쏭
위니베르시테 드 프랑슈 콩테
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Abstract

본 발명은 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료에서 사용하기 위한, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산 분자를 발현하는 세포로서, 여기서, CAR은 항-IL-1RAP 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 막관통 도메인, 및 적어도 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포에 관한 것이다.

Description

IL-1RAP를 표적화하는 CAR-T 세포 및 급성 골수성 백혈병(AML)에서 이의 용도
본 발명의 배경
본 발명은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia: AML)의 치료에서 사용하기 위한 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)를 인코딩(encoding)하는 핵산 분자를 포함하는 세포로서, 여기서, 여기서, CAR은 항-IL-1RAP 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 막관통(transmembrane) 도메인, 및 적어도 자극 도메인을 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포에 관한 것이다.
급성 골수성 백혈병 (AML; "급성 골수성 백혈병," "급성 골수구성 백혈병(acute myelocytic leukemia)," "급성 골수모구성 백혈병(acute myeloblastic leukemia)," "급성 과립구성 백혈병(acute granulocytic leukemia)," 및 "급성 비림프구성 백혈병(acute nonlymphocytic leukemia)"로도 공지)은 골수, 말초 혈액 및 때때로 다른 조직에서 백혈병 모세포의 통제되지 않는 증식 및 축적을 특징으로 하는 파괴적인 클론 조혈 줄기 세포 신생물이다. 이 세포는 정상적인 조혈을 파괴하고, 골수 부전 및 사망을 빠르게 유발한다. AML은 성인에서 가장 흔한 유형의 급성 백혈병이며, 백혈병으로 인한 연간 사망 건수 중 가장 많은 수를 차지한다. AML은 빠르게 진행되며, 치료하지 않고 방치한다면, 전형적으로는 몇 주 또는 몇 개월 이내에 치명적이다. 2015년 미국에서는 대략 20,830건의 AML의 신규 사례가 있었고, 10,460명의 환자가 이 질환으로 사망하였다. 진단시 평균 연령은 대략 70세이다. 60세 미만 환자의 전체 5년 생존율은 약 30-40%에 불과하고, 60세 이상 환자의 경우, 10% 미만이다.
AML에 대한 현재의 표준 치료법은 고용량의 화학요법 또는 방사선에 의한 관해 유도 치료에 이어서, 동종이계 줄기 세포 및 필요에 따라 추가 화학 요법 과정으로 구성된 공고요법(consolidation)으로 구성된다. 이러한 방법으로 치료받은 환자들은 대부분 완전하지만, 일시적인 관해를 달성할 것이다. 일단 재발(relapse)하면, 추가 요법에 대한 상기 질환의 내성은 점점 더 증가한다.
젊은 환자의 결과는 지난 30년 동안 다소 개선되었지만, 고령 환자에 대한 참담한 결과는 본질적으로 변하지 않았다. 불행하게도, 초기 완전 관해를 달성한 환자를 포함하여 대다수의 AML 환자가 질환 재발을 경험한다. 2차 관해시 동종이계 조혈 줄기 세포 이식은 장기 생존을 위한 유일한 기회를 제공하지만, 이 옵션은 2차 관해를 달성하지 못하거나, 절차를 견딜 수 없기 때문에, 재발된 AML 환자들은 대부분 이 옵션을 이용할 수가 없다.
재발된 AML에 대한 다중의 다중 약제 화학요법 구제 요법이 있다 (예컨대, MEC (미토크산트론, 에토포시드, 및 시타라빈) 및 FLAG-IDA (플루다라빈, 시타라빈, 이다루비신, 과립구 콜로니 자극 인자)). 그러나, 이러한 요법들 중 어느 것도 다른 요법보다 우수하지 않고, 장기 생존화시키지 않는 바, 허용되는 표준 치료법은 없다. NCCN(미국 종합 암 네트워크: National Comprehensive Cancer Network) 및 다른 가이드라인에서 임상 시험이 권장되고 있으며, 재발된 AML은 긴급한 미충족 의학적 요구인 것으로 널리 인식되고 있다.
항체-약물 이중특이성 T 세포 결합 항체 (AMG330) 및 CAR-T 세포 (CART-33 세포 또는 CART-123 세포)를 포함하여 AML, 특히, 재발된 AML을 치료하기 위한 다수의 새로운 접근법이 현재 연구되고 있다. 그러나, 몇 가지 새로운 접근법은 임상 독성 및/또는 효능 부족으로 인해 보류되었다. 따라서, 허용가능한 독성 프로파일을 가진 새로운 효율적인 요법이 분명히 필요하다.
AML에서, 유전자 발현 프로파일링, 세포 표면 염색, 웨스턴 블롯팅 연구를 통해 백혈병 CD34+/CD38- 조혈 줄기 세포에 의해서는 발현되지만, 정상 CD34+/CD38- 조혈 줄기 세포에 의해서는 발현되지 않는 세포 표면 바이오마커 (IL-1RAP, IL-1R3, C3orf13 또는 IL-1RAcP)가 밝혀졌다. 더욱이, IL-1RAP 발현은 AML 질환의 임상 단계 뿐만 아니라, 종양 부담과도 상관관계가 있다.
본 발명의 요약
IL-1RAP (인터류킨-1 수용체 보조 단백질, 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 AAB4059)는 MAP 키나제, p38, NF-κB 및 염증 및 증식에 내재된 다른 유전자를 비롯한, 상이한 신호전달 경로를 활성화시키는, IL-1 신호전달에 관여하는 IL-1 및 IL33 수용체의 공동 수용체이다. 상기 단백질은 종양 세포 표면에서 발현된다. 따라서, IL-1RAP는 유망한 종양 연관 항원이다.
본 출원인은 상기 CART-IL-1RAP 세포를 사용함으로써 AML 환자를 치료할 수 있다는 것을 발견하였다.
그러므로, 본 발명은 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료에서 사용하기 위한, 이의 막(membrane)에서 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산 분자를 발현하는 세포로서, 여기서, CAR은 항-IL-1RAP 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 막관통 도메인, 및 적어도 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 항-IL-1RAP 결합 도메인은
(i) 아미노산 서열 서열 번호: 6과 적어도 80%의 동일성(identity)을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 7과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 8과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 경쇄, 및
(ii) 아미노산 서열 서열 번호: 12와 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 13과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 14와 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄를 포함하는 세포에 관한 것이다.
CAR을 발현하는 T 세포는 본원에서 "CAR T 세포" 또는 "CAR 변형된 T 세포"로 지칭된다. IL1-RAP를 표적화하는 CAR을 발현하는 T 세포는 본원에서 "CART-IL1-RAP 세포" 또는 "CART-IL1-RAP 변형된 T 세포"로 지칭된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 세포는 AML의 치료에 사용하기 위해 본원에 기술된 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 본원에서 사용되는 바, "유전적으로 조작된" 또는 "유전적으로 변형된"이라는 용어는 DNA 또는 RNA 형태의 외부 유전 물질의, 세포 중 전체 유전 물질 내로의 첨가를 지칭한다.
도면 설명
도 1: 상이한 조혈 AML 세포주 및 CD14+ 세포 분류된 단핵구의 웨스턴 블롯팅.
도 2: ELISA 기술에 의한 #E3C3 mAb를 이용한 IL-1RAP 재조합 단백질의 인식 (b). BSA는 음성 대조군이다 (a).
도 3: 환자의 AML 1차 샘플에 대한 유세포 분석법-게이팅 전략법. 모세포 및 단핵구 하위집단에 대한 RFI가 제공되어 있다 (좌측). 통상의 AML (모든 서브타입) 환자 코호트 (n=30)에서 AML 모세포 및 단핵구 내의 IL-1RAP+, AML 모세포 내의 CD123+ 및 IL-1RAP+/CD123+ 세포의 비율(%) (우측, 상단). RFI 또한 제공되어 있다 (우측, 하단).
도 4: 냉동 조직 어레이를 사용한 특이적인 조직 결합. 높은 IL-1RAP (KU812) (a) 또는 음성 (라지(Raji)) (b) 발현 세포주를 각각 양성 대조군 또는 음성 대조군으로 사용하였다. 하기 조직을 시험하였다. a: 림프절, b: 결장, c: 소장, d: 태반, e: 위 f: 폐, g: 비장 및 h: 전립선.
도 5: 안전 카세트 iCASP9, #E3C3 mAb의 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 및 세포 표면 발현 마커 ΔCD19를 보유하는 SIN 렌티바이러스 구축물의 디자인. 3개의 트랜스진은 2A 펩티드 절단 서열에 의해 분리되어 있고, EF1 프로모터와 SP163 인핸서 서열의 제어하에 있다.
도 6: IL-1RAP 형질도입된 T 세포의 세포하 분획에 대한 CD3 웨스턴 블롯팅. a: 전체 용해물, b: 막, c: 세포질, d: 핵, (1) CAR 연관 CD3제타 (55 kDa), (2) 내인성 CD3제타 (16 kDa), (3) CD45 (147 kDa), (4) 라민 (68 kDa), (5) GAPDH (35 kDa).
도 7: IL-1RAP CAR 형질도입된 CEM T 세포주 또는 1차 T 세포의 FACS 분석 검출. 비오틴+/CD19+ CEM 또는 T 세포의 비율(%) (a)을 표지된 비오틴 재조합 단백질의 양 (b)에 대해 플롯팅하였다.
도 8: 화학적 유도인자 이량화제 (10 nM CID) 노출 후 iCASP9/AP1903 자살 시스템 카세트의 안전 스위치. (a) 293T 세포, (b) IL-IRAP CAR 293T 세포.
도 9: 형질도입되지 않은 T 세포 (C0)와 비교하여 24h 또는 48h CID 노출 후의 IL-1RAP CART 세포의 제거 (*** p<0.001, n=3).
도 10: (a) 유세포 분석법 CFSE 염료 희석 분석 (대표 실험)을 위한 게이팅 전략법. (b) 전체 분열 CFSE-양성 세포의 비율(%). 3개의 독립 실험의 평균 ± SD. *** p<0.001 (스튜던트 검정).
도 11: (a) 세포내 IFNγ 시토카인 검출 (대표 실험)을 위한 게이팅 전략법. (b) 전체 세포내 IFNγ 생산 세포의 비율(%). CD8+ 및 CD8- (주로 CD4+) 세포에 대하여 수행된 3개의 독립 실험의 평균 ± SD. *** p<0.001. ** p<0.01 (스튜던트 검정).
도 12: (a) 세포 표면 IL-1RAP 발현 세포를 용해시키는 IL-1RAP CAR T 세포의 효능 연구를 위한 게이팅 전략법. (b) 전체 살아있는 표적 세포의 비율(%). 3개의 독립 실험의 평균 ± SD.
도 13: (a) 조직 마이크로어레이. 기관당 3명의 개인 공여자의 90개 조직 코어 (30개 기관) (US 바이오맥스 (US Biomax: 미국 메릴랜드주 록빌))를 포함하는, 미국 식품 의약국(US Food and Drug Administration)의 표준 냉동 조직 어레이의 대표적인 #A3C3 염색. 울트라뷰 유니버셜 DAB 검출 키트(UltraView Universal DAB Detection Kit) ((벤타나(Ventana: 미국)))를 사용하여 면역염색을 검출하였다. 이미지를 획득하고, NDP.view 2.0 소프트웨어로 분석하였다. 분석된 3명 중 적어도 개체 1명에서 어느 정도의 #A3C3 mAb 염색을 나타낸 조직이 제시되어 있다. (스케일 바, 100 ㎛). 고 IL-1RAP (KU812) 또는 음성 (라지) 발현 세포주를 각각 양성 대조군 또는 음성 대조군으로 사용하였다. (b) HMEC-1 피부 내피 세포주의 IL-1RAP R&D (적색) 또는 #A3C3 (청색) 염색. 이소타입 IgG1 (회색)은 오버레이로 도시되어 있다. 두 염색 모두에 대한 RFI가 제공되어 있다.
도 14: IL-1RAP CAR T 세포가 건강한 조혈 세포에 미치는 효과, 및 안전 자살 유전자 iCASP9 카세트의 효율. (a) 건강한 공여자 (n=5)로부터의 말초 혈액 (좌측) 또는 골수 (우측) 세포상에서의 IL-1RAP 세포 표면 발현. SSC-A/CD45+를 통해 하위집단을 림프구 (SSC-A 저), 단핵구 (CD33+), 과립구 (SSC-A 고), 또는 HSC (CD33-/CD34+)로서 구별할 수 있었다. 이소타입 염색으로부터 RFI를 계산하고, 각 창에 제공하였다. (b) 전체 인간 제대혈 세포의 대표적인 (3 중 1) IL-1RAP 염색. 전체 CD34+, CD34+/CD38-, 및 CD34+/CD38+ HSC 제대혈 하위집단에 대한 IL-1RAP 염색이 제공되어 있다. (c) CML 환자로부터의 BM (n=10) 또는 말초 혈액 (PB, n=10)으로부터의 CD34+ 세포와 비교된, 건강한 공여자 (n=5)로부터의 제대혈 (CB, n=5) 또는 골수 (BM) 중의 CD34+ 세포 중 IL-1RAP-양성 세포. (d) 좌측, 상이한 이펙터:표적 (E:T) 비의 자가 형질도입되지 않은 T 세포 또는 모의 또는 IL-1RAP CAR T 세포의 존재하에서 배양된 SSC-A/CD45+ 과립구 (G), 단핵구 (M), 및 림프구 (L) 하위집단의 도트 플롯. 우측, 자가 모의 T 세포 (파선) 또는 IL-1RAP CAR T 세포 (실선)와 함께 24h 공동 배양된, 형질도입되지 않은 자가 T 세포 (C0)에 대해 정규화된, 림프구 (사각형), 단핵구 (동그라미), 및 과립구 (삼각형) 중에서 살아있는 세포의 상대적인 비율(%). (e) 모의 (검은색, 파선) 또는 IL-1RAP CAR T 세포 (흰색, 실선)의 존재하의 단핵구 (사각형), KU812 (동그라미), 또는 K562 (삼각형) 하위집단 중에서 살아있는 세포의 상대적인 비율(%). 5000 형광 비드 세포측정 획득에 기반하여 트루카운트(Trucount) 튜브를 사용하여 측정된 절대 세포 개수를 사용하여 비율(%)을 계산하였다. (f) 좌측, CID AP1903 유도된 세포 사멸의 절대 계수에 대한 게이팅 전략법 및 분석. 형질도입되지 않은 세포 (C0) 또는 IL-1RAP CAR T 세포를 배지 단독 또는 배지 +CID (20 nM, 24h)에 노출시켰다. 5000 형광 비드 획득 후에 정량화를 수행하였다. 사멸 효율을 대조군 세포 (비처리 세포)에 대해 정규화하였다. 세포 사멸을 하기와 같이 계산하였다: 사멸 세포(%) = [1-(AP1903으로 처리된 세포 중 생존가능한 세포의 절대 개수/비처리 세포 중 생존가능한 세포의 절대 개수)] x 100. (d) 절대 사망률. 24 h 또는 48 h C0 또는 (CD3+/CD19+에 대해 게이팅) IL-1RAP CAR T 세포 CID 노출. 우측, 결과는 3개의 독립 실험으로부터의 평균이다. ** p<0.001. (g) i.p. AP1903 (흰색 막대) 처리 후 24 h째의 종양 (CML KU812, i.v.) 이종이식 NSG 모델에서 주사된 IL-1RAP CAR T 세포의 절대 정량화 (n=3 마우스/군). 대조군 T 세포 (C0)가 주입된 마우스를 대조군으로서 사용하였다 (n=2 마우스/군). **p<0.01. 말초 혈액 1 ml당의 세포 개수로 제공되어 있다.
도 15: 인간-CD34+ 제대혈 세포 생착된/NOG 뮤린 모델 (hu-NOG)에서 HSC 및/또는 면역 세포에 대한 자가 IL-1RAP CART 세포의 비(specific) 독성을 조사하기 위한 실험적 면역안전 인간 CD34+ 생착된 NOG 뮤린 모델. 간략하면, 10.10E6 자가 CART 세포 또는 대조군 T 세포 (C0) (뮤린 PBMC, 비장 또는 골수로부터 세포-분류된 인간 CD45+로부터 생성)를 주입하였다. 주입 후 다양한 시점 (5, 8 및 15일째)에 세포측정에 의해 성숙한 면역 세포 (hCD3+, hCD19+, hCD56+, hCD14+, hCD11b+)의 모니터링을 평가하였다. 말초 혈액 수확 시점 (-9일째)과 비교하여, CART 세포 주입 전 -7일째 획득한 면역표현형검사 참조로부터 변화 배수를 계산하였다. 말초 혈액 수확 시점 (-9일째)과 비교하여 형질도입되지 않은 T 세포 (C0, 흰색 막대) 또는 IL-1RAP CART 세포 (검은색 막대)의 3, 8, 및 15일째의 상이한 면역능력 세포 하위집단의 변화 배수. 안와후방 샘플에 의해 수확된 말초 혈액으로부터 세포 계수를 수행하고, -7일째 참조 대비로 변화 배수를 계산하였다. n.s: 유의하지 않음.
도 16: 3개의 상이한 제대혈로부터 수확되고, 단독 배양되거나 (흰색 막대), 또는 이의 각각의 자가 형질도입되지 않은 (C0, 회색 막대) 또는 IL-1RAP CART 세포 (검은색 막대)와 공동 배양된 CD34+ HSC로부터의 콜로니 형성 단위 (CFU-GM) 실험.
도 17: 상부 패널: CID가 형질도입된 293T 세포에 미치는 효과에 대한 광학 현미경법에 의한 평가. 하부 패널: 형질도입되지 않은 T 세포 (C0)에 대한, 및 IL-1RAP CAR을 발현하거나, 발현하지 않는 GMTC 혼합물에 대한, CID 노출 후 (20 nM, 24 h, 짙은 회색)의, 또는 노출되지 않은 상태 (옅은 회색)의 유세포 분석법에 의한 분석. CD3+/CD19+ 염색을 통해 CAR을 발현하는 GMTC를 구별할 수 있었다.
도 18: 유럽 백혈병 네트(European Leukemia Net: ELN) 예후 분류에 따른 AML 환자의 1차 샘플에서의 IL-1RAP mRNA 발현 및 절대 세포 표면 IL-1RAP 항원 부위.
도 19: IL-1RAP CART 세포의 AML 모세포. 게이팅 전략법이 제시되어 있다. CD34 항체를 사용하여 표적 AML 모세포를 확인하였다 (도 19a). IL-1RAP CART 세포의 세포독성을 나타내는 AML 모세포의 이벤트 수 또한 제시되어 있다 (도 19a). 3개의 독립 실험의 결과가 도 19b에 제시되어 있다. 도 19a 및 19b의 범례: FSC: 전방 산란은 세포의 크기를 나타낸다. 7-AAD: 7-아미노악티노마이신 D, 세포 생존율 마커. E-플루오르(E-Fluor): 세포막을 염색하는 염료. #1 및 #2 실험은 건강한 공여자로부터 생산된 동종이계 IL-1RAP CART 세포를 이용하여 수행하였다. #3 실험은 AML 환자의 T 세포로부터 생산된 동종이계 IL-1RAP CART 세포를 이용하여 수행하였다. 살아있는 세포는 살아있는 AML 모세포를 의미한다.
도 20: 인간 AML 마우스 이종이식 모델에서의 IL-1RAP CAR-T 세포의 효능. 면역결핍 NSG-S 마우스에 방사선을 조사하고 (2.5 Gy), 다음 날 (-3일째), 1x106개의, HL-60 또는 Molm-13 또는 Mono-Mac-6 루시퍼라제 발현 AML 세포를 주사하였다. 도 20a: 0일째, AML 세포 주사 후, 마우스를 처리하지 않거나, 또는 대조군 T 세포, 즉, 모의T 세포 또는 UNT 세포 (300 ㎕의 PBS 중 10x106개의 세포), 또는 IL-1RAP CAR-T 세포 (300 ㎕의 PBS 중 10x106개의 세포)로 처리하고, 백혈병 발병에 대해 생물발광 이미징 (BLI)을 사용하여 언급된 시점 (일)에 모니터링하였다. 마우스의 생물발광 이미징 분석을 0일째부터 21일째까지 상이한 군에 대하여 수행하였다. 범례: (x): 죽은 마우스. ▲: UNT 또는 IL-1RAP CAR T 세포 주사. 도 20b: 생물발광 이미징 (BLI)을 사용하여 수확된 생체내 생물발광 신호 (휘도 p/s/cm2/sr)의 휘도.
본 발명의 상세한 설명
그러므로, 본 발명은 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료에서 사용하기 위한, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포로서, 여기서, CAR은 항-IL-1RAP 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 막관통 도메인, 및 적어도 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 항-IL-1RAP 결합 도메인은
(i) 아미노산 서열 서열 번호: 6과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 경쇄, 및
(ii) 아미노산 서열 서열 번호: 12와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄를 포함하는 세포에 관한 것이다.
하기의 표는 서열 식별자를 요약한 것이다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
"#E3C3" 및 "#A3C3"이라는 용어는 동일한 것으로 이해된다: #E3C3은 #A3C3을 지칭하는 데 자유롭게 사용될 수 있으며, 그 반대의 경우도 그러하다.
IgG1, IgG4, CD8알파, 4-1BB, CD3 제타, CD28 및 ICasp9 유전자의 힌지 영역(hinge region)의 서열은 진뱅크에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 실시는 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 있는 화학, 생화학, 유기화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 유전학, 면역학, 및 세포 생물학의 종래 방법을 사용할 것이며, 이 중 다수는 예시 목적으로 하기에 기술되어 있다. 상기 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예컨대, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001)]; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]; [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008)]; [Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience]; [Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985)]; [Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992)]; [Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984)]; [Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; [Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991)]; [Annual Review of Immunology]; 뿐만 아니라, 예컨대, [Advances in Immunology]와 같은 저널 단행본을 참조한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 보편적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 바와 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 조성물, 방법 및 물질의 바람직한 실시양태가 본원에 기술되어 있다.
숙련가에 의해 이해되는 바와 같고, 본원 다른 곳에 기술되어 있는 바와 같이, 완전 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 영역 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역으로 이루어지는 반면, 각각의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역으로 이루어진다. 포유동물 중쇄는 α, δ, ε, γ, 및 μ로서 분류되고, 포유동물 경쇄는 λ 또는 κ로서 분류된다. 상기 α, δ, ε, γ, 및 μ 중쇄를 포함하는 면역글로불린은 면역글로불린 (Ig)A, IgD, IgE, IgG, 및 IgM으로서 분류된다. 상기 완전 항체는 "Y" 모양을 형성한다. 상기 Y의 줄기는 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역 (및 IgE 및 IgM의 경우, 제4 불변 영역)으로 이루어지며, 디술피드 결합 (쇄-간)이 힌지 중에 형성된다. 중쇄 γ 및 δ는 3개의 탠덤 (한 줄로 된) Ig 도메인으로 구성된 불변 영역, 및 가요성의 부가를 위한 힌지 영역을 가지며; 중쇄 μ 및 ε는 4개의 면역글로불린 도메인으로 구성된 불변 영역을 갖는다. 제2 및 제3 불변 영역은 각각 "CH2 도메인" 및 "CH3 도메인"으로 지칭된다. 상기 Y의 각 아암은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 상기 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로도 불리는 3개의 고가변 영역이 개재되어 있는 "프레임워크" 영역을 함유한다. 상기 CDR은 종래 방법에 의해, 예컨대, 카바트(Kabat) 등에 따른 서열 (문헌 [Wu, TT and Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970)]; [Borden, P. and Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987)]; ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991] 참조), 또는 코티아(Chothia) 등에 따른 서열 (문헌 [Choithia, C. and Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987)], [Choithia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883 (1989)])에 의해 정의 되거나, 또는 확인될 수 있다
상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 하나의 종, 예컨대, 인간 내에서 비교적 보존된다. 항체의 프레임워크 영역, 즉, 구성 경쇄 및 중쇄의 결합된 프레임워크 영역은 CDR을 3차원 공간 중에 위치시키고, 정렬시키는 작용을 한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에의 결합을 담당한다. 각 쇄의 CDR은 전형적으로 N-말단에서부터 출발하여 연속해서 넘버링하여 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭되며,이는 또한 전형적으로는 특정 CDR이 위치하는 쇄에 의해 식별된다. 따라서, 항체의 중쇄의 가변 도메인 중에 위치하는 CDR은 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로 지칭되는 반면, 항체의 경쇄의 가변 도메인 중에 위치하는 CDR은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로 지칭된다. 상이한 특이성 (즉, 상이한 항원에 대한 상이한 결합 부위)을 갖는 항체는 상이한 CDR을 갖는다.
"VH" 또는 "VH"에 대한 언급은 본원에 개시된 바와 같은 항체, Fv, scFv, Fab 또는 다른 항체 단편의 경우를 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다.
"VL" 또는 "VL"에 대한 언급은 본원에 개시된 바와 같은 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab, 또는 다른 항체 단편의 경우를 포함하는, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
"모노클로날 항체(monoclonal antibody)"는 B 림프구의 단일 클론에 의해, 또는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자로 형질감염된 세포에 의해 생산되는 항체이다. 모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 골수종 세포와 면역 비장 세포와의 융합으로부터 하이브리드 항체-형성 세포를 제조함으로써 생성된다. 모노클로날 항체는 키메라 모노클로날 항체 및 인간화 모노클로날 항체를 포함한다.
"하나("a," "an") 및 "그"는 관사는 본원에서 상기 관사의 문법상 목적어가 하나 또는 1 초과 (즉, 적어도 하나)라는 것을 지칭하는 데 사용된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "약" 또는 "대략"은 참조 정량, 수준, 값, 개수, 빈도, 비율(%), 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 대비 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼 변하는 정량, 수준, 값, 개수, 빈도, 비율(%), 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 수치에 선행할 때, + 또는 - 15%, 10%, 5%, 또는 1% 범위의 값을 가리킨다.
본 명세서 전역에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다"("comprise," "comprises") 및 "포함하는"이라는 단어는 언급된 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군을 포함하지만, 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군을 제외하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서 전역에 걸쳐 "한 실시양태"("one embodiment," "an embodiment"), "특정 실시양태"("a particular embodiment," "a certain embodiment"), "추가 실시양태" 및 "추가의 실시양태" 또는 이의 조합에 대한 언급은 상기 실시양태와 관련하여 기술된 특정한 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태에 포함됨을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해서, "동일성" 또는 "상동성"은 비교창에서 2개의 정렬된 서열을 비교함으로써 계산된다. 서열 정렬을 통해 상기 비교창에서 2개의 서열에 공통된 위치 (뉴클레오티드 또는 아미노산)의 개수를 측정할 수 있다. 이어서, 공통된 위치의 개수를 비교창 내의 위치의 총 개수로 나누고, 100을 곱하여 상동성(%)을 획득한다. 서열 동일성(%) 측정은 수동으로 또는 널리 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료에서 사용하기 위한, 세포독성이 종양 세포를 향하게 하는 유전적으로 조작된 수용체를 발현하도록 디자인된 벡터로 유전적으로 조작된 면역 이펙터 세포를 제공한다. 이들 유전적으로 조작된 수용체를 본원에서는 키메라 항원 수용체 (CAR)라고 지칭한다.
CAR은 표적 항원 (예컨대, 종양 항원)에 대한 항체 기반 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하여 특이적인 항-종양 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하는 분자이다. 본 본원에서 사용되는 바, "키메라"라는 용어는 상이한 기원으로부터의 상이한 단백질 또는 DNA의 부분들로 구성되었다는 것을 기술한다.
CAR의 주요 특징은 면역 이펙터 세포 특이성을 재유도하여, 증식, 시토카인 생성, 식세포 작용 또는 주 조직적합성 (MHC) 비의존적 방식으로 표적 항원 발현 세포의 세포 사멸을 매개할 수 있는 분자의 생성을 촉발시키고, 모노클로날 항체, 가용성 리간드 또는 세포 특이적 공동 수용체의 세포 특이성 표적화 능력을 이용하는 이의 능력이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "결합 도메인," "세포외 결합 도메인," "항원 특이적 결합 도메인," 및 "세포외 항원 특이적 결합 도메인"은 상호교환적으로 사용되며, CAR에, 관심 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 제공한다. 결합 도메인은 생물 분자 {예컨대, 세포 표면 수용체 또는 종양 단백질, 지질, 다당류, 또는 다른 세포 표면 표적 분자, 또는 이의 성분)을 특이적으로 인식하고, 그에 결합할 수 있는 능력을 갖는 임의의 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 결합 도메인은 관심 생물 분자에 대한 임의의 자연 발생, 합성, 반-합성, 또는 재조합적으로 생성된 결합 파트너를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "특이적인 결합 친화성" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합된" 또는 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 표적화한다"라는 용어는 하나의 분자가 배경 결합보다 더 큰 결합 친화성으로 또 다른 분자에 결합한다는 것을 기술한다. 결합 도메인 (또는 결합 도메인을 포함하는 CAR 또는 결합 도메인을 함유하는 융합 단백질)은 표적 분자와, 예를 들어, 약 105 M-1의 친화도 또는 Ka (즉, 1/M의 단위를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수)로 표적 분자에 결합하거나, 상기 분자와 회합한다면, 이는 표적 분자에 "특이적으로 결합"하는 것이다. 본 개시내용에 따른 결합 도메인 폴리펩티드 및 CAR 단백질의 친화도는 경쟁 ELISA (효소-연결 면역흡착 검정법)와 같은 종래 기술을 사용하여 쉽게 측정될 수 있다.
항체는 인간 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체이다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 항체는 종양 세포의 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 키메라 항체 (예컨대, 키메라 모노클로날 항체)이다. "키메라" 항체는 인간 프레임워크 영역 및 비인간 (예를 들어, 마우스, 래트 또는 합성) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린이다. 따라서, 가능하게는 CDR을 제외하고, 키메라 면역글로불린의 모든 부분은 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 키메라 또는 다른 모노클로날 항체는 항원 결합 또는 다른 면역글로불린 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가적인 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다. 키메라 항체는 유전자 조작에 의해 구축될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,585,089 참조).
항체는 이의 항원 결합 단편, 예컨대, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 단백질 ("scFv") 및 항원 결합을 담당하는 전장 항체의 일부를 포함한다. 상기 용어는 또한 유전적으로 조작된 형태, 예컨대, 인간화 항체, 이종접합체 항체 (예컨대, 이중특이적 항체) 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 중에 및 둘 중 어느 한 배향으로 존재한다 (예컨대, VL-VH 또는 VH-VL).
단일 쇄 항체를 원하는 표적에 특이적인 하이브리도마의 V 영역 유전자로부터 클로닝할 수 있다. 상기와 같은 하이브리도마의 생성은 통상적이 되었다. 가변 영역 중쇄 (VH) 및 가변 영역 경쇄 (VL)의 클로닝에 사용될 수 있는 기술은 예를 들어, 문헌 [Orlandi et al, PNAS, 1989; 86: 3833-3837]에 기술되었다.
일반적으로, scFv 폴리펩티드는 상기 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 링커를 VH 및 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다.
본원에서 고려되는 CAR은 1, 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 초과의 링커를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커의 길이는 약 1 내지 약 25개의 아미노산, 약 5 내지 약 20개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 20개의 아미노산, 또는 임의의 이들 사이의 길이의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 상기 링커 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 초과의 아미노산 길이이다.
링커의 예시적인 예로는 글리신 중합체 (G)n; 글리신-세린 중합체(Gi_sSi_5)n (여기서, n은 적어도 정수 1, 2, 3, 4, 또는 5이다); 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 비구조적인 중합체이며, 따라서, 본원에 기술된 CAR과 같은 융합 단백질의 도메인 사이의 중성 테더로서 작용할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 더욱 유의적으로 파이-사이 공간에 접근하며, 더욱 긴 측쇄를 가진 잔기보다 훨씬 덜 제한된다 (문헌 [Scheraga, Rev. Computational Chem. 1 1173-142 (1992)] 참조). 통상적인 숙련가는 특정 실시양태에서 CAR의 디자인이 완전히 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있고, 따라서, 상기 링커는 원하는 CAR 구조를 제공하기 위해 가요성 링커 뿐만 아니라, 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있음을 알 것이다.
특정 실시양태에서, 링커는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 존재한다.
특정 실시양태에서, 링커는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
한 실시양태에서, IL-1RAP 결합 도메인은 서열 번호: 4의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 및 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호: 2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 및 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 scFv다.
바람직하게는, IL-1RAP 결합 도메인은 (i) 아미노산 서열 서열 번호: 6과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (ii) 아미노산 서열 서열 번호: 12와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 scFv이다.
CAR의 결합 도메인에 이어서, 일반적으로는 하나 이상의 "힌지 영역"이 이어지며, 상기 영역은 항원 결합 도메인을 이펙터 세포 표면으로부터 떨어진 위치에 위치시켜 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화가 이루어질 수 있게 하는 역할을 한다. CAR은 일반적으로 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 하나 이상의 힌지 영역을 포함한다. 상기 힌지 영역은 천연, 합성, 반-합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
바람직하게는, 항-IL-1RAP 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결된다.
한 실시양태에서, 힌지 영역은 IgG1의 힌지 서열 또는 이의 95-99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. IgG 힌지는 단일 엑손에 의해 인코딩된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 용어 "IgG1의 힌지 서열"은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미, 즉, 힌지에 대한 IgG1 엑손에 의해 인코딩되는 15개의 아미노산 잔기라는 의미를 갖는다 (문헌 [Fundamental Immunology, Fifth edition, Chapter 3, Immunoglobulins: Structure and Function - The immunoglobulin Hinge]).
추가 실시양태에서, 힌지 영역은 IgG4의 힌지 서열 또는 이의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 힌지 영역은 또한 IgG1 또는 IgG4의 CH2-CH3 영역 또는 이의 95-99% 동일성을 갖는 서열도 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 힌지 영역은 CD8알파 또는 이의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
"막관통 도메인"은 세포외 결합부와 세포내 신호전달 도메인을 융합시키는 CAR의 부분이며, 상기 CAR을 면역 이펙터 세포의 원형질막에 고정시킨다. 막관통 도메인은 천연, 합성, 반-합성, 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
바람직하게는, 인코딩된 CAR은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질, 더욱 바람직하게는 CD28의 막관통 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 고려되는 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "세포내 신호전달 도메인"은 표적 항원에 결합하는 유효 CAR의 메시지를 면역 이펙터 세포의 내부로 전달하여 이펙터 세포 기능, 예컨대, 활성화, 시토카인 생산, 증식 및 세포독성 활성 (CAR-결합된 표적 세포로의 세포독성 인자의 방출 포함), 또는 세포외 CAR 도메인에 결합하는 항원에 의해 유도되는 다른 세포 반응을 유도하는 데 참여하는 CAR의 부분을 지칭한다.
용어 "이펙터 기능"은 세포의 특수 기능을 지칭한다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 세포용해 활성 또는 도움이거나 또는 시토카인 분비를 포함한 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 전달하고, 세포가 특수 기능을 수행하도록 유도하는 단백질 부분을 지칭한다. 대개는 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 다수의 경우에 전체 도메인을 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 말단절단된 부분이 사용되는 경우에, 상기와 같은 말단절단된 부분이, 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 전체 도메인 대신에 사용될 수 있다. 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 말단절단된 부분을 포함함을 의미한다.
TCR 단독을 통해 발생된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하며, 2차 또는 공동 자극 신호가 또한 요구되는 것으로 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 2개의 상이한 부류의 세포내 신호전달 도메인: TCR (예컨대, TCR/CD3 복합체)을 통해 항원 의존성 1차 활성화를 개시하는 1차 신호전달 도메인 및 2차 또는 공동 자극 신호를 제공하도록 항원에 의존하는 방식으로 작용하는 공동 자극 신호전달 도메인에 의해 매개된다고 할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 고려되는 CAR은 하나 이상의 "공동 자극 신호전달 도메인"을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 인코딩할 수 있다. 따라서, 본 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "공동 자극 신호전달 도메인," 또는 "공동 자극 도메인"은 공동 자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 지칭한다. 공동 자극 분자는, 항원에의 결합시 T 림프구의 효율적인 활성화 및 기능에 필요한 2차 신호를 제공하는 항원 수용체 또는 Fc 수용체 이외의 세포 표면 분자이다.
바람직하게는, 기능성 세포내 신호전달 도메인의 적어도 하나의 공동자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, CD3 제타, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 및 4-1BB (CD137)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질로부터 수득된다.
더욱 바람직하게는, 4-1BB (CD137)로부터 수득된 공동자극 도메인은 4-1BB의 공동자극 도메인의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
더욱 바람직하게는, CD3 제타로부터 수득된 공동자극 도메인은 CD3 제타의 공동자극 도메인의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB로부터 수득된 공동자극 도메인 및/또는 CD3 제타로부터 수득된 공동자극 도메인을 포함한다.
특정 바람직한 실시양태에서, CAR은 CD3ζ 1차 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동 자극 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 1차 신호전달 및 공동 자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인의 카르복시 말단에 임의의 순서로 나란히 연결될 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 세포는 단리된 것일 수 있다. "단리된 세포"는 생체내 조직 또는 기관으로부터 수득되었고, 세포외 기질이 실질적으로 없는 세포를 지칭한다.
본 발명에 따라 AML을 치료하는 데 사용되는 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산 분자를 벡터를 이용하여 숙주 세포의 게놈 내에 삽입함으로써 제조될 수 있다.
용어 "벡터"는 본원에서 또 다른 핵산 분자를 전달하거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 데 사용된다. 전달되는 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결되고, 예컨대, 벡터 핵산 분자에 내로 삽입된다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 유도하는 서열을 포함할 수 있거나, 또는 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 AML 치료에 사용되는 세포는 CAR을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 프로모터, 바람직하게는 EF-1 알파 프로모터를 포함한다.
레트로바이러스는 종래 유전자 전달 도구이다. 특정 실시양태에서, 레트로바이러스는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달하는 데 사용된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "레트로바이러스"는 이의 게놈 RNA를 선형 이중 가닥 DNA 카피로 역전사하고, 이어서, 이의 게놈 DNA를 숙주 게놈 내에 공유적으로 통합시키는 RNA 바이러스를 지칭한다. 일단 상기 바이러스가 숙주 게놈 내에 통합되고 나면, 이는 "프로바이러스"로 지칭된다. 상기 프로바이러스는 RNA 폴리머라제 II에 대한 주형으로서 작용하며, 새로운 바이러스 입자를 생성시키는 데 필요한 구조 단백질 및 효소를 인코딩하는 RNA 분자의 발현을 유도한다.
따라서, 벡터로 형질도입된 T 세포는 안정적이고, 장기적이며, 지속적인 CAR 매개된 T 세포 반응을 이끌어낼 수 있다.
특정 실시양태에서, T 세포는 CAR을 인코딩하는, 레트로바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "렌티바이러스"는 복합 레트로바이러스로 이루어진 군 (또는 속)을 지칭한다. 예시적인 렌티바이러스로는 HIV (인간 면역결핍 바이러스; HIV 1형 및 HIV 2형 포함); 비스나-메디 바이러스 (VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스 (CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV); 소 면역결핍 바이러스 (BIV); 및 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 주로 렌티바이러스로부터 유래되는 LTR을 포함하여, 구조 및 기능 유전 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다.
"자기-불활성화" (SIN) 벡터는, U3 영역으로 공지된 우측 (3') LTR 인핸서-프로모터 영역이 제1 라운드의 바이러스 복제를 벗어난 바이러스 전사를 방지하도록 (예컨대, 결실 또는 치환에 의해) 변형된 복제-결함 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다.
한 실시양태에서, SIN 벡터 백본이 바람직하다.
바람직하게는, 사용되는 벡터는 프로모터, 예컨대, EF-1 알파 프로모터를 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제가 결합하는 폴리뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. RNA 폴리머라제는 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 개시시키고, 전사시킨다. 특정 실시양태에서, T 세포에서, 상기 T 세포를 표적 항원을 발현하는 세포로 재유도하기에 충분한 수준으로 안정적이고, 장기적인 CAR 발현을 제공하는 프로모터로부터 CAR을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 세포는 바람직하게는, T 세포, 예컨대, 인간 T 세포, 더욱 바람직하게는, CD8+ T 세포, 예컨대, 인간 CD8+ T 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 세포 (예컨대, T 세포)는 이의 막에서 CAR을 발현한다. 본원에서 사용되는 바, "이의 막에서"라는 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미, 즉, "세포 표면 막에서"라는 의미를 갖는다
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 면역 이펙터 세포의 시험관내 조작 또는 유전자 변형에 앞서, 세포의 공급원을 대상체로부터 수득한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 세포는 T 세포를 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포는 당업자에게 공지된 임의의 다수의 기술, 예컨대, 피콜(FICOLL)™ 분리를 이용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 단위로부터 수득될 수 있다. 개체의 순환 혈액으로부터의 세포를 성분채집술에 의해 수득할 수 있다. 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 비롯한, 림프구를 함유한다. 한 실시양태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 후속 프로세싱을 위해 상기 세포를 적절한 완충제 또는 매질 중에 놓을 수 있다.
T 세포는, 예를 들어, 퍼콜™ 구배를 통한 원심분리에 의해 적혈구를 용해시키고, 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 단핵 세포로부터 단리될 수 있다. CD4 또는 CD8과 같은 하나 또는 수개의 마커를 발현하는 T 세포의 특정 하위집단을 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리시킬 수 있다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성적으로 선택된 세포 고유의 표면 마커에 대한 항체 조합으로 달성될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산 분자를 보유하는 세포는 직접적인 독성의 위험 (즉, 동종이계 투여 환경에서 이식편 대 숙주병) 및/또는 유전자 변형된 세포의 조절되지 않는 증식을 감소시키기 위해, 유도성 자살 유전자를 비롯한 자살 유전자를 사용한다. 구체적인 측면에서, 자살 유전자는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 세포를 보유하는 숙주에는 면역원성을 띠지 않는다. 사용될 수 있는 자살 유전자의 특정 예는 유도성 카스파제-9 (iCASP9), 헤르페스 단순 티미딘 키나제 (HSV-tk), CD20, 말단절단된 EGFR, 카스파제-8 또는 시토신 데아미나제이다. 카스파제-9는 특정한 화학적 이량체화 유도인자 (CID)를 사용하여 활성화될 수 있다. 프로드럭 (강시클로비어) 대사에 의해 또는 항체 (리툭시맙, 시툭시맙) 결합에 의해 다른 시스템이 활성화될 수 있다.
본원에서는 CAR을 발현하도록 T 세포를 생체외에서 유전적으로 변형시키고, CAR T 세포를 그를 필요로 하는 수용자에 주입하는 세포 요법의 한 유형을 개시한다. 주입된 세포는 수용자, 바람직하게는 인간에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, CAR T 세포는 생체내에서 복제하여 장기간 지속성을 생성시킬 수 있으며, 이로써, 종양 제어를 지속할 수 있다.
더욱이, CAR은 항체 유래된 수용체에 의한 결합시 이펙터 T 세포의, 임의의 세포 표면 분자를 향한 재유도 및 활성화를 허용하며, MHC 제한과 무관하다.
본 발명에 따라 사용하기 위한, 유전적으로 변형된 세포, 예컨대, T 세포는 환자 자신의 세포로부터 출발하여 구축되지만 (자가), 이는 또한 다른 동종이계 공여자로부터 기원하여 골수 또는 말초 조혈 줄기 세포 동종이식 환경에서 동종이계 유전적으로 변형된 세포를 제공할 수 있다 (공여자 림프구 주입). CAR 분자를 발현하는 이들 세포는 포유동물, 바람직하게는 인간에서, 세포 표면 IL-1RAP 발현과 연관된 질환인 AML을 치료하는 데 유용하다.
바람직하게는, 이들 세포, 예컨대, T 세포는 항-IL-1RAP 결합 도메인을 포함하는 항-IL-1RAP scFv인 항원 결합 도메인, CD28 단백질의 막관통 도메인, 공동자극 4-1BB 신호전달 도메인, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 CAR 분자를 발현하며, 여기서, 상기 항-IL-1RAP 결합 도메인은
(i) 아미노산 서열 서열 번호: 6과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 경쇄, 및
(ii) 아미노산 서열 서열 번호: 12와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나, 또는 100%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄를 포함한다.
AML은 유럽 백혈병 네트 (ELN) 예후 분류에 따른 임의의 AML, 및/또는 프랑스인 미국인 영국인(French-American-British: FAB) 분류 (FAB) 분류에 따른 임의의 서브타입 AML일 수 있다.
한 실시양태에서, AML은 재발/불응성(refractory) AML이다.
또 다른 실시양태에서, AML은 복합 세포유전학적 이상(complex cytogenetic abnormality), 즉, WHO 분류에 따른 세포유전학적 이상이 있는 재발/불응성 AML 및/또는 TP53 돌연변이가 있는 AML이다.
TP53은 17번 염색체의 짧은 아암에 위치하는, TP53 유전자에 의해 인코딩되는 종양 억제인자 단백질이다. TP53은 DNA 손상에 반응하여 게놈 안정성을 유지하는 데 중요한 역할을 하며; 이는 DNA 수복 프로그램을 활성화시키고, 세포 주기 정지를 유발한다. TP53은 인간 암의 절반 이상에서 돌연변이화되어 있다. AML에서, 돌연변이화된 TP53은 요법 관련 AML 및/또는 복합 핵형을 갖는 환자에서 주로 관찰된다. AML 마우스 모델의 연구에 따르면 핫 스팟 영역의 기능 획득 돌연변이가 더욱 공격적인 AML을 촉진할 수 있는 것으로 나타났다. 이전 연구에서는 TP53 돌연변이의 존재가 복합 핵형이 있거나 없는 환자에서 화학요법에 대한 불량한 반응 및 불량한 생존과 상관관계가 있다는 것이 입증되었다. 다변량 분석에서, 비정상적인 세포유전학적 이상이 없는 TP53 돌연변이의 존재는 불량한 전체 생존 및 치료에 대한 열등한 반응을 예측하였다. 일부 실시양태에서, AML은 IL-1RAP 발현과 연관된 AML이다 ("IL1-RAP 발현 AML" 또는 "IL1-RAP+ AML"로도 공지).
일부 실시양태에서, IL-1RAP 발현과 연관된 AML은 (i) 재발된/불응성 형태의 IL1-RAP+ AML 또는 (ii) 복합 세포유전학적 이상이 있는 IL1-RAP+ AML 및/또는 TP53 돌연변이가 있는 IL1-RAP+ AML이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 세포는 모든 연령의 환자, 특히, 60세 미만, 예컨대, 20세 미만 (즉, 소아 AML)의 환자, 및/또는 60세 이상인 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.
IL-1RAP에 특이적인 CAR 분자를 발현하는 세포, 예컨대, T 세포는 인간에서 AML을 치료하는 방법에서 사용될 수 있으며, 여기서, 인간은 화학요법, 면역요법 또는 표적 요법과 같은 적어도 하나의 요법 라인에 의해 치료를 이미 받은 적이 있는 인간이다. 화학요법제는 CPX-351일 수 있고, 면역요법은 모노클로날 항체, 예컨대, 항체 약물 접합체 (ADC) (예컨대, 독소에 연결된 항-CD33 (겜투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin))), 이중특이적 항체 (Bites, 예컨대, 항-CD33/CD3, 항-CD123/CD3 또는 다른 AML 항 세포 표면 마커/CD3)일 수 있다. 표적화된 요법 제제는 항돌연변이 FLT3, 예컨대, 미도스타우린(Midostaurin) 또는 콰자르티닙(Quazartinib) 또는 돌연변이화된 IDH1/IDH2를 표적화하는 제제, 예컨대, IDH1 억제제 (이보시데닙) 또는 IDH2 억제제 (에나시데닙)일 수 있다.
그러므로, 바람직하게는, IL-1RAP에 특이적인 CAR 분자를 발현하는 세포, 예컨대, T 세포는 적어도 하나의 모노클로날 항체, 예컨대, 항-체크포인트 억제제(anti-checkpoint inhibitor) (즉, 항 PD-1, 항-PDL-1 또는 항-CTL4)와 공동으로 포유동물에서의 AML을 치료하는 방법에서 유용하다. 항-PD-1, 항-PDL-1 또는 항-CTLA4는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 세미플리맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙 또는 트레멜리무맙일 수 있다.
그러므로, IL-1RAP에 특이적인 CAR 분자를 발현하는 세포, 예컨대, T 세포는 인간에서 AML을 치료하는 방법에서 유용하며, 여기서, 인간은 이식편 대 백혈병, 동종이계 줄기 세포 이식, 공여자 림프구 주입 (DLI), IL-1RAP CART 세포가 아닌 선행 CART 세포 요법, 또는 동종이계 또는 자가 조혈 이식을 이미 받은 적이 있는 인간이다.
본원에서 사용되는 바, "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 병적 상태의 증상 또는 병리에 대한 임의의 유익하거나, 또는 바람직한 효과를 포함하며, 심지어는 치료하고자 하는 질환 또는 병적 상태, 예컨대, 암의 하나 이상의 측정가능한 마커의 최소한의 감소를 포함할 수도 있다. 치료는 임의적으로 질환 또는 병적 상태의 증상의 감소 또는 호전, 또는 질환 또는 병적 상태 진행의 지연을 포함할 수 있다. "치료"는 반드시 질환 또는 병적 상태, 또는 그와 연관된 증상의 완전한 근절 또는 치유를 가리키는 것은 아니다.
따라서, 본 개시내용은 AML의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, CAR은 항-IL-1RAP 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 막관통 도메인, 및 적어도 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 항-IL-1RAP 결합 도메인은
(i) 아미노산 서열 서열 번호: 6과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 7과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 8과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 경쇄, 및
(ii) 아미노산 서열 서열 번호: 12와 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 13과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 14와 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄를 포함하는, AML을 치료하는 방법을 제공한다.
세포, 예컨대, T 세포는 단독으로 또는 희석제와 함께, 및/또는 다른 성분, 예컨대, IL-2 또는 다른 시토카인 또는 세포 집단과 함께 조합하여 제약 조성물로서 투여될 수 있다. 간략하면, 제약 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 표적 세포 집단을 하나 이상의 제약상 또는 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함할 수 있다. 상기 조성물은 완충제, 예컨대, 중성 완충처리된 염수, 포스페이트 완충처리된 염수 등; 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란, 만닛톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온; 애주번트 (예컨대, 수산화 알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. "제약상 허용가능한"이라는 어구는 본원에서 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제나 합병증 없이, 합리적인 이익/위험비에 비례하여, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 지칭하는 데 사용된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 세포는 조성물로 제제화될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 급성 골수성 백혈병 (AML)의 치료에서 사용하기 위한, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포를 포함하는 조성물, 예컨대, 제약 조성물로서, 여기서, CAR은 항-IL-1RAP 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 막관통 도메인, 및 적어도 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 항-IL-1RAP 결합 도메인은
(i) 아미노산 서열 서열 번호: 6과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 7과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 8과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 경쇄, 및
(ii) 아미노산 서열 서열 번호: 12와 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 13과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 14와 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 바람직하게는 비경구 투여, 예컨대, 혈관내 (정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여용으로 제제화된다.
본원에서 사용되는 바, "비경구적으로 투여된"이란, 장관 및 국소 투여 이외의 다른 투여 모드, 대개는 주사에 의한 투여를 지칭하며, 비제한적으로, 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 종양내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골하 주사 및 주입을 포함한다.
한 실시양태에서, CAR 변형된 세포 또는 조성물은 종양, 림프절, 전신 순환, 또는 감염 부위에의 직접 주사에 의해 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, CAR 변형된 세포, 예컨대, CAR 변형된 T 세포는 AML 진단을 받은 대상체로부터 면역 이펙터 세포를 제거하고, 상기 면역 이펙터 세포를, 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 유전적으로 변형시켜 변형된 면역 이펙터 세포의 집단을 생성하고, 변형된 면역 이펙터 세포의 집단을 동일한 대상체에게 투여함으로써 상기 AML 진단을 받은 대상체를 치료하는 데 유용하다. 바람직한 실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 T 세포를 포함한다.
적절한 투여량은 동물 모델에 의해서 및 최종적으로 임상 시험에 의해서 결정될 수 있지만, 투여량, 투여 빈도 및 종래 AML 치료와 가능한 연관 순서는 환자의 상태, 및 AML의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
유전적으로 변형된 치료학적 세포의 "치료 유효량"은 예컨대, 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 상기 개체에서 원하는 반응을 유도해 낼 수 있는 줄기 세포 및 전구 세포의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한 바이러스 또는 형질도입된 치료학적 세포의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료학적으로 유익한 효과가 더 큰 것이다. 일반적으로, 본원에 기술된 T 세포를 포함하는 제약 조성물은 104 내지 109개의 세포/kg (체중), 바람직하게는, 105 내지 106개의 세포/kg (체중)인 투여량 (상기 범위 내의 모든 정수 값 포함)으로 투여될 수 있다.
본 발명은 하기의 실험 실시예를 참조하여 추가로 상세히 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되는 것이며, 달리 명시되지 않는 한, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 모노클로날 항체 생성
표준 하이브리도마 기술에 의해 마우스 항-hIL-1RAP 모노클로날 항체를 생성하였다.
간략하면, BALB/c 마우스 (5주, 찰스 리버(Charles River))를 IL-1RAP (NM_002182.2, NCBI)의 세포외 부분 및 IgG1 (R&D 시스템즈(R&D Systems: 프랑스 릴))의 Fc-부분으로 구성된 재조합 융합 단백질로 발바닥에 (n=3) 또는 복강내로 (n=5) 면역화시켰다. 림프절 또는 비장 세포 및 혈액 샘플을 수확하고, 세포를 마우스 골수종 세포주와 융합시킨 후, 이어서, IL-1RAP-양성 (KU812) 및 IL-1RAP-음성 (라지, KG1) 세포주에 대해 FACS 분석 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))에 의해 스크리닝하였다.
하이브리도마를 스크리닝함으로써 음성 세포주 (Tom-1, NALM-20, 주르카트(Jurkat) 또는 라지, 각각 Phi+ p190 B-ALL, Phi-B-ALL, T-ALL 또는 버킷 림프종)로부터 IL-1RAP 양성 세포주 (KU812 또는 KG-1, 각각 AML 또는 Phi+p210 CML)를 구별하는 5개의 모노클로날 항체 서브클론을 선택할 수 있었다.
- 항체의 분자 특징화
문헌 [Wang. Z. et al (J. Immunol. Methods, 2000; 233, pages 167-77)]의 프로토콜에 따라 중쇄 및 경쇄의 FR1 및 불변 영역에 특이적인 축퇴 프라이머로 수득된 클로닝된 PCR 생성물 증폭의 생어(Sanger) 시퀀싱에 의해 분자 특징화를 수행하였다. 문헌 [Brochet X., et al. (Nucleic Acids Res., 2008, 36, pp 503-8)]에 따른 V-QUEST 온라인 도구를 사용하여 IMGT® 데이터베이스에 대한 컨센서스 뉴클레오티드 서열의 정렬 후에 V-D-J-C 유전자 재배열 및 CDR3 영역을 확인할 수 있었다. 분자 생어 시퀀싱 결과, 5개의 모노클로날 항체가 모두 동일하고, 동일한 CDR3 뉴클레오티드 서열을 공유하는 것으로 나타났다. 세포측정 결과, 최고 상대 형광 강도 (RFI)를 제공하였는 바, 모노클로날 항체 서브클론 (#E3C3)을 선택하였다.
정상 조직 (FDA 정상 인간 기관 조직 어레이, 99개 코어/33개 부위/75건 사례) 및 CML 환자의 1차 샘플로부터 웨스턴 블롯팅, 재조한 IL-1RAP 단백질에 대한 ELISA, 면역조직화학법, 공초점 현미경법, 조직 마이크로어레이 (TMA)에 의해 선택된 항체 (클론 #E3C3)를 특징화하였다.
- 세포하 분획의 웨스턴 블롯팅 (도 1)
상이한 AML 또는 CML (양성 대조군) 조혈 세포주의 전체 세포 용해물을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 전기이동시켰다. 막을 1차 IL-1RAP #A3C3 (1:20으로 희석)으로 밤새도록 프로빙하였다. 20 ㎍의 단백질을 소듐 도데실-술페이트 폴리아크릴아미드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동시킨 후, 이어서, 초음파 처리된 단백질 분획을 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 RIPA 완충제에 현탁시켰다 (완전 미니 EDTA-프리(Mini EDTA-free); 로슈(Roche: 스위스 바젤)). 웨스턴 블롯 레인의 단백질 로드를 β-액틴 mAb 염색 (1:1000, 클론 AC15, #A5441, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))으로 평가하였다. 2차 폴리클로날 항체 양 항-마우스 IgG (#515-035-062, 잭슨(Jackson))를 이용하여 면역검출 염색을 수행하였다. 증강된 화학발광 검출 시약을 통해 카메라 및 바이오-1D(Bio-1D) 소프트웨어(비버-루르마트(Vilber-Lourmat: 프랑스 꼴레지앙))를 이용하여 검출할 수 있었다.
- 상대적인 IL-1RAP mRNA 발현 (도 18)
세포 표면 단백질에 대한 mRNA 변이체 코돈을 표적화하는 Hs_00895050_m1 택맨(Taqman) qPCR 유전자 발현 검정법 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))을 사용하여 RT-qPCR에 의해 상대적인 IL-1RAP mRNA 발현을 측정하였다. 유럽 백혈병 네트 (ELN) 예후 분류에 따라 진단시 AML 환자 (n=29)의 전혈 또는 골수 샘플에 대해 분석을 수행하였다. K562, MonoMac-6 및 HEL-60 mRNA를 각각 음성 대조군, 고 양성 대조군 또는 저 양성 대조군으로서 사용하였다.
- IL-1RAP 항원 부위의 절대 개수 (도 3)
세포측정 비드 어레이즈(Cytometric Bead Arrays: CBA) 기술에 기반하여 IL-1RAP 항원 부위의 절대 개수를 측정하였다. 1.106개의 세포/mL로 상이한 백혈병 세포주를 1차 항-IL-1RAP 항체 (비표지된 #A3C3, 디아클론(Diaclone)®)로 표지하고, FITC-IgG1 항 마우스 2차 항체 (카탈로그 번호: 55526, MP 바이오메디칼즈(MP Biomedicals)®)를 이용하여 밝혀냈다. 셀 콴트 캘리브래이터(Cell Quant Calibrator) 키트를 이용하여 권고사항 (Ref 7208, 바이오사이텍스(Biocytex))에 따라 실험을 수행하였다. 비연관 IgG1 이소타입을 대조군으로서 사용하였다 (카탈로그 번호 857-073-020, 디아클론). 유세포 분석법 (FACS 칸토™ II(FACS Canto™ II), BD FACS DIVA V 7.0 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))을 이용한 결과 분석)을 이용하여 분석을 수행하였다. KU812 및 K562를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 사용하였다.
- ELISA를 통한 재조합 IL-1RAP 단백질의 시험관내 검출 (도 2)
항-인간 Fc 항체를 플라스틱 ELISA 플레이트의 바닥에 코팅하였다. 인간 항체상에 로딩된 IL-1RAP 단백질을 뮤린 및 인간 IL-1RAP (#E3C3) 항체로 프로빙한 후, 이어서, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)로 코팅된 항-마우스 FC 항체에 의해 밝혀냈다.
ELISA를 통해 #E3C3 모노클로날 항체가 IL-1RAP 재조합 단백질을 인식한다는 것을 확인한다.
- AML 환자로부터의 1차 세포에 대한 유세포 분석법에 의한 분석 (도 3)
#A3C3 mAb 및 IL-1RAP 뮤린 mAb를 염색 비교로 사용하여 상이한 조혈 AML 세포주의 IL-1RAP 세포 표면 염색을 수행하였다.
IL-1RAP 염색과 이소타입 사이의 상대 형광 강도 (RFI)를 계산하였다. IL-1RAP+ (KU812) 또는 IL-1RAP- (라지) 세포주를 각각 양성 대조군 또는 음성 대조군으로 사용하였다.
AML 환자의 골수 또는 말초 혈액의 1차 샘플의 경우, CD45, CD34, CD38, CD33, CD123, 및 CD14 (단핵구에 대해)를 검출할 수 있도록 허용하여 패널에 뮤린 IL-1RAP mAb (#E3C3)를 포함시켰다. 염색된 세포를 칸토 II 세포측정기 (BD 바이오사이언시스: 프랑스 르 퐁 드 클레)에 의해 수집하고, DIVA 6.1 소프트웨어 (BD 바이오사이언시스: 프랑스 르 퐁 드 클레)에 의해 분석하였다.
- 인시튜 검출
특이적 또는 비-표적 조직 결합을 연구하기 위해, 기관당 3명의 개인 공여자의 90개 조직 코어 (30개 기관) (US 바이오맥스 (US Biomax: 미국 메릴랜드주 록빌))를 포함하는, FDA의 표준 냉동 조직 어레이를 앞서 기술된 바와 같이 인큐베이션시켰다. 울트라뷰 유니버셜 DAB 검출 키트 (벤타나, 미국)를 사용하여 면역염색을 검출하였다. 이미지를 획득하고, NDP.view 2 소프트웨어로 분석하였다. 고 IL-1RAP (KU812) 또는 음성 (라지) 발현 세포주를 각각 양성 대조군 또는 음성 대조군으로 사용하였다. 염색 강도를 하기와 같이 등급화하였다: 음성 (0), 약한 염색 (1+), 중간 정도의 염색 (2+) 또는 강한 염색 (+3). 고 IL-1RAP (KU812) 또는 음성 (라지) 발현 세포주를 각각 양성 대조군 또는 음성 대조군으로 사용하였다.
#E3C3 모노클로날 항체를 사용하여 IL-1RAP 발현을 조사하였다. 염색은 림프절, 결장, 소장, 태반, 위 및 전립선과 같은 6개의 조직에서만, 주로 상피 또는 내피 세포에서 다양한 강도로 검출되었다 (도 4).
- 결과
#A3C3은 세포 표면에서 IL-1RAP를 발현하는 상이한 AML 세포주를 염색할 수 있다. 따라서, #A3C3을 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 상이한 강도 수준의 신호로 상이한 세포주의 세포 표면에서 IL-1RAP 발현을 확인하였다. 흥미롭게도, CD14+ 단핵구 하위집단은 IL-1RAP도 발현하였다. AML (모든 서브타입, n=30, n=30) 환자 코호트의 유세포 분석법에 의한 분석에 의해, 본 발명자들은 선행 기술에서 앞서 제시된 바와 같이, 비록 단핵구 발현 수준은 안정적인 상태 그대로 유지되지만, AML 모세포 상의 IL-1RAP는 다양한 비율(%) (84.27 ± 17.4%) 및 세포 표면 수준으로 존재한다는 것을 확인하였다. 유럽 백혈병 네트 (ELN) 예후 계층화로 분류된 AML 환자의 IL-1RAP 항원 부위의 절대 계수에 의해서도 확인하였다. 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 세포 표면 발현 수준을 3가지 상이한 수준: 낮음(저), 중간, 높음(고)으로 정의하였다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 3가지 다른 세포 표면 발현 수준을 정의했다: 낮음, 중간 및 높음. 추가 연구를 위해 상기 발현 수준을 세포주에 의해 모델링하였다.
실시예 2: 렌티바이러스 구축물
VDJ 또는 VJ 재배열의 분자 시퀀싱 및 CDR3 뉴클레오티드 서열 결정에 기반하여, 실시예 1의 #E3C3 IL-1RAP 하이브리도마로부터 유래된 합성적으로 생성된 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 SIN-pSDY 백본에 클로닝함으로써 CAR 렌티바이러스 구축물 (pSDY-iC9-IL-1RAPCAR-dCD19)을 제조하였다 (문헌 [Rossolillo P, Winter F, Simon-Loriere E, Gallois-Montbrun S, Negroni M. Retrovolution: HIV-driven evolution of cellular genes and improvement of anticancer drug activation. PLoS Genet. 2012; 8(8):e1002904]).
간략하면, 모니터링 및 잠재적인 세포 선택을 위해 안전 카세트 iCASP9, #E3C3 모노클로날 항체의 단일 쇄 가변 단편 및 세포 표면 발현 마커 ΔCD19를 보유하는 SIN 렌티바이러스 구축물을 구축하였다. 상기 3개의 트랜스진은 모두 2A 펩티드 절단 서열에 의해 분리되어 있고, EF1 프로모터와 SP163 인핸서 서열 (마우스 VEGF 유전자의 5'UTR의 부분, 진뱅크 수탁 번호 U41383)의 제어하에 있다.
도 5에 제시된 바와 같이, 구축물은, SP163 인핸서가 부가된 EF1a (신장 인자 1 프로모터 알파)의 제어하에 2개의 상이한 2A 리보솜 스킵 서열 (P2A 및 T2A)에 의해 분리되어 있는, 자살 안전 카세트 iCASP9 (화학적 유도성 카스파제 9), IL-1RAP CAR 및 ΔCD19 (신호전달을 피하는, 세포내 부분의 말단절단된 CD19)로서 세포 표면 및 선택 마커와 같은 3개의 상이한 부분을 보유한다. #E3C3 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 서열 가변 영역으로 구성된 scFv는 EF1a 프로모터 및 SP163 인핸서의 제어하에 CD28-4.1BB-CD3z 신호전달 쇄와 함께 프레임내에 클로닝된다. IL-1RAP CAR은 선도 서열 (L)과 회합되고, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)으로 태그부착되고, 2개의 공동 자극 도메인 (변형된 막관통 및 세포내 신호전달 CD28 및 4-1BB) 및 CD3z 세포내 신호전달 도메인으로 구성된 T 세포 활성화 도메인에 힌지 영역을 통해 연결된, 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 함유한다. 모의 T는 IL-1RAP scFv가 없는 동일한 구축물로 구성된다.
실시예 3: IL- 1RAP CART 세포의 생성
건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포로부터 수득된 CD3+ T 림프구를 제조사의 설명서에 따라 항-CD3/CD28 비드 (라이프테크놀로지스(Life Technologies: 프랑스))로 활성화시킨 후, 이어서, 자기 칼럼 (MACS, 밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec: 프랑스 파리)) 상에서 단리시켰다. 2일째, 활성화된 T 세포를 10℃에서 90 min 동안 2000 g로 상청액 (SN)과의 접촉하에 실시예 2의 렌티바이러스 벡터를 이용하여 스핀접종(spinoculation)에 의해 형질도입시켰다. 유세포 분석법에 의한 분석을 수행함으로써 형질도입 효율을 측정하여 ΔCD19 세포 표면 마커 발현을 확인하였다. 형질도입후 4일째, CD19 마이크로비드 (밀테니이 바이오테크: 프랑스 파리)로 표지된 CD19 양성 세포를 MACS 칼럼을 사용하여 자기에 의해 분리시켰다. 단리된 CD19 발현 세포를 8% 인간 혈청으로 보충된, 500 UI/mL rhIL-2 (프로류킨(Proleukin); 노파르티스)를 함유하는 완전 X-비보(X-vivo) 배지 (론자(Lonza: 스위스 바젤))에서 확장시키고, 냉동보관하였다. 실험적으로, 본 발명자들은 인간 IL-2; IL-7, IL-15 또는 IL-7+IL-15로 보충된 TexMACS 배지(TexMACS Medium) (밀테니이 바이오테크: 프랑스 파리) 및 트랜스액트 T 세포 시약(TransAct T Cell Reagent)을 사용하였다.
실시예 4: 공여자 T 세포의 렌티바이러스 형질도입
수포성 구내염 바이러스 (VSV) 외피를 인코딩하는 헬퍼 플라스미드 (pMDG), 및 GAG/POL (psPAX2) 패키징 플라스미드 (애드진(Addgene), 각각 #12259 및 #12260, 트로노(Trono) 등: 스위스 로잔)와 함께 CaCl2 방법을 사용하여 준전면생장(sub-confluent) 293T 세포의 일시적인 동시 형질감염에 의해 실시예 2의 렌티바이러스 벡터 상청액 스톡을 제조하였다. 바이러스 상청액을 48 및 72시간 후에 수확하고, PEG 및 저속 원심분리 (3000 g, 밤새도록)를 사용하여 원심분리시킨 후, 이어서, 사용시까지 -80℃에서 보관하였다. IL-1RAP scFv가 없는 동일한 렌티바이러스 구축물 (모의)을 대조군으로서 사용하였다. 상기 렌티바이러스 상청액의 적정을 SN의 연속 희석을 사용하여 293T 허용 세포 형질도입에 의해 확립시켰다.
형질도입 효율을 유세포 분석법에 의해 측정하였다. 감염 다중도 (MOI)를 출발 세포 개수에 따라 상청액 적정으로부터 추론하였다.
렌티바이러스 상청액을 이용하여 시험관내 생성 프로세스를 수행함으로써 1차 T 세포를 각각 모의 또는 CAR IL-1RAP 상청액에 대해서 MOI 2로 형질도입시킬 수 있다.
- IL-1RAP CAR 발현의 웨스턴 블롯 분석.
전체 단백질 용해물 또는 IL-1RAP 형질도입된 T 세포의 막 또는 세포질 세포 하위분획 (한외원심분리 후 수득)으로부터 추출된 단백질을 마우스 마우스 항-인간 CD3z 항체로 프로빙하였다. 세포하 분획에 대한 웨스턴 블롯팅 결과 IL-1RAP CAR 이 CD3z 신호전달 (16 KDa의 예상된 내인성 CD3z 신호와 비교하여 55 KDa의 신호)과 연관이 있는 것으로 나타났다 (도 6).
- 유세포 분석법에 의한 분석
T 세포 표면에서의 CAR 발현을 재조합 IL-1RAP 비오티닐화된 단백질을 사용하여 분석하고, 2차 항-비오틴 항체 (밀테니이 바이오테크 클론 #Bio3-18E7)를 사용하여 유세포 분석법에 의해 밝혀내었다. CEM 세포주 또는 1차 T 세포를 모의 또는 CAR IL-1RAP로 형질도입시켰다. 이어서, 세포를 비오틴으로 표지된 재조합 IL-1RAP의 양을 증가시키면서, 이의 존재하에서 인큐베이션시켰다. 항-비오틴 형광 항체로 염색을 수행하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 비오틴+/CD19+ CEM 또는 T 세포의 비율(%)을 표지된 비오틴 재조합 단백질의 양에 대해 플롯팅하였다. 최대치를 포함하여, 전형적인 염색에 대한 세포측정 분석의 도트 플롯을 제공하였다. 형질도입되지 않은 T 세포 (C0) 또는 모의 T 세포를 대조군으로서 사용하였다.
비오티닐화된 IL-1RAP 단백질 (20 ng/ml 내지 2.4 pg/ml)의 연속 희석액을 사용하는 추가 분석 및 FACS 분석을 통해 IL-1RAP CAR 형질도입된 CEM T 세포주 또는 1차 T 세포를 검출할 수 있다. 단일 실험을 통해 1.25 ng 및 0.15 ng과 같은 상이한 양의 재조합 단백질이 각각 최대의 CEM (85.8%) 또는 1차(68.5%) GMTC를 동원하는 데 요구된다는 것을 밝혀낼 수 있다 (도 7).
1차 T 세포에서보다 CEM의 세포 표면에서 더 많은 CAR이 발현된다. 더욱이, E:T 공동 배양물 중 다량 (1000배 > 혈장 농도)의 냉 재조합 IL-1RAP 단백질의 첨가가 이펙터 세포독성을 유의적으로 억제시킨다.
본 실험은 CAR이 세포 표면에서 다루어지며, IL-1RAP 단백질의 CAR 특이적 인식 및 결합이 존재함을 입증한다.
실시예 5: 안전 자살 유전자 iCASP9 카세트의 효율
형질도입된 세포 (IL-1RAP CAR 293T) 또는 형질도입되지 않은 세포 (293T)를 배지 단독 (화학적 유도인자 이량화제 (CID)) 또는 20 nM의 CID AP1903을 함유하는 배지 중에서 24h 동안 배양하였다. 광 현미경법을 통해 배양물 중의 살아있는 세포 또는 죽은 세포의 존재 및 구조를 이미징할 수 있다 (x40)
광학 현미경법에 의해, IL-1RAP CAR에 의해 형질도입된 293T 세포 배양물이 CID에 감수성이라는 것을 입증할 수 있다 (도 8).
형질도입되지 않은 T 세포 (C0)에 대한, 및 IL-1RAP CAR을 발현하거나, 발현하지 않는 GMTC 세포 혼합물에 대한, CID 노출 후 (20 nM, 24h)의, 또는 노출되지 않은 상태 (옅은 회색)의 유세포 분석법에 의한 분석. CD3+/CD19+ 염색을 통해 CAR을 발현하는 GMTC를 다른 것과 구별할 수 있다.
형질도입되지 않은 T 세포 (C0) 또는 IL-1RAP CART 세포 둘 모두 배지 단독 또는 배지 +CID (20 nM, 24h)에 노출시켰다.
정확한 세포 사멸을 먼저 제조사의 설명서에 따라 아넥신(Annexin)-V/7-AAD 게이팅 후에 유세포 분석법에 의해 평가하였다(벡크만 쿨터(Beckman Coulter), IM3614). CD3+/CD19+ 양성 세포에 대해 형광 분석을 게이팅하였다. 5000 형광 비드를 획득한 후, 정량화를 측정하였다. 대조군 세포 (비처리 세포)에 대해 사멸 효율을 정규화하였다. 세포 사멸을 하기와 같이 계산하였다: 사멸 세포(%) = [1-(AP1903으로 처리된 세포 중 생존가능한 세포의 절대 개수/비처리 세포 중 생존가능한 세포의 절대 개수)] x 100. 24h 또는 48h C0 또는 IL-1RAP CART (CD3+/CD19+에 대해 게이팅) 세포 CID 노출. 결과는 3개의 독립 실험으로부터의 평균 ± SD이다. ***: p<0,001 (도 9).
세포측정 분석은 IL-1RAP CAR을 발현하는 (CD19+) 또는 발현하지 않는 (CD19-) T 세포 혼합 집단의 24h CID 노출 후, 오직 CD19- CD3+ 세포만이 지속됨을 보인다26. 더욱 정확하게, 아폽토시스의 정량적 AnnV/7AAD 검정법을 사용하여, 본 발명자들은 형질도입되지 않은 T 세포 (C0) (24h 또는 48h째 각각 1.28% 및 6.13%)와 비교하여 84.11% 및 88.93%의 IL-1RAP CART 세포가 각각 24h 또는 48h CID 노출 후 제거된다고 밝혔다 (p<0.001, n=3).
실시예 6: IL- 1RAP CART 세포의 증식 능력
물질 및 방법
형질도입되지 않은 T 세포 (C0), 모의-T 세포 (모의T) 또는 IL-1RAP CAR (IL-1RAP CART)을 배지 단독하에 (표적 부재) 또는 IL-1RAP 음성 (K562) 세포와의 접촉하에, 또는 표적 세포 (KU812, CML, 양성 대조군)를 발현하는 세포 표면 및 상이한 IL-1RAP 수준의 세포 표면 발현 (저: HL-60; 중간: MOLM-13; 고: EOL-1) AML 세포주와의 접촉하에 1:3의 이펙터:표적 (E:T) 비로 3일 동안 배양하였다. 이펙터는 IL-2 보충 없이 0.5 M CFSE로 사전에 표지하였다. IL-2 보충 없이 72h 공동 배양 후, 살아있는 CD3+/CD19- (C0) 및 CD3+/CD19+ 게이팅된 세포 (MOCKT- 또는 IL-1 RAP CART 세포)의 분할을 유세포 분석으로 평가하여 CFSE 염료 희석을 측정하였다.
결과
형질도입되지 않은 T 세포 (C0) 또는 MOCK 형질도입된 T 세포 (모의T)와 달리, IL-1RAP CART 세포는 표적 세포의 IL-1RAP 세포 표면 발현이 어떻든, AML 세포주 존재하에서 활성화되고, 특이적으로 분열할 수 있었다 (도 10a 및 10b).
실시예 7: IFNγ의 세포내 발현
물질 및 방법
형질도입되지 않은 T 세포 (C0), 모의 형질도입된 T 세포 (모의T) 또는 IL-1RAP CAR (IL-1RAP CART)을 배지 단독하에 (표적 부재) 또는 IL-1RAP 음성 (K562) 세포와의 접촉하에, 또는 표적 세포 (KU812, CML, 양성 대조군)를 발현하는 세포 표면 및 상이한 IL-1RAP 수준의 세포 표면 발현 (저: HL-60; 중간: MOLM-13; 고: EOL-1) AML 세포주와의 접촉하에 1:5의 이펙터:표적 (E:T) 비로 6시간 동안 배양하였다. 시토카인 생성에 대한 양성 대조군으로서, 10 ng/mL 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) 및 1 ㎍/mL 이오노마이신 (시그마-알드리치)으로 자극된 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 브레펠딘-A 처리 및 세포 투과화 후 IFNγ 표지를 수행하였다. CD8+ 및 CD4+ (이전에 CD8-) 세포를 구별하기 위해 CD8 염색에 추가로, CD3+/CD19+ (CAR 양성 세포)에 대한 게이팅 후 형광 IFNγ 신호를 검출하였다.
결과
형질도입되지 않은 T 세포 (C0) 또는 MOCK 형질도입된 T 세포 (모의T)와 달리, CD8+ 또는 CD4+ IL-1RAP CART 세포는 IL-1RAP 세포 표면이 어떻든, AML 세포주 존재하에서 특이적으로 세포내 IFNγ를 발현할 수 있다 (도 11a 및 11b).
실시예 8: AML 세포주에 대한 IL- 1RAP CART 세포의 세포독성
물질 및 방법
이펙터 세포를 공동 배양 전에 e-플루오르로 표지하였다. 형질도입되지 않은 T 세포 (C0), 모의 형질도입된 T 세포 (모의T) 또는 IL-1RAP CAR (IL-1RAP CART)을 배지 단독하에 (표적 부재) 또는 IL-1RAP 음성 (K562) 세포와의 접촉하에, 또는 표적 세포 (KU812, CML, 양성 대조군)를 발현하는 세포 표면 및 상이한 IL-1RAP 수준의 세포 표면 발현 (저: HL-60; 중간: MOLM-13; 고: EOL-1) AML 세포주와의 접촉하에 다양한 이펙터:표적 (E:T) 비로 24시간 동안 배양하였다. FSC 및 7-AAD 표지에 대한 세포의 게이팅을 통해 이펙터 세포로부터 및 살아있는 세포로부터 표적 세포를 구별할 수 있었다. 이펙터 세포의 존재 또는 부재하에 지속되는 표적 세포의 비율(%)을 게이트 FSC+/7-AAD-에서 측정하였다. 형질도입되지 않은 T 세포 (C0) 또는 모의-형질도입된 T 세포 (모의T)를 대조군으로 사용하였다.
결과
모의 형질도입된 T 세포 (모의T)와 달리, 다양한 E:T 비로 이펙터 CART 세포를 IL-1RAP 양성 표적 (AML)과 함께 공동 배양함으로써 종양 항원 발현 수준과는 상관없이 동일한 효율로 표적 AML 세포주를 발현하는 IL-1RAP를 사멸시킬 수 있다 (도 12a 및 12b).
실시예 9: iCASP9 안전 스위치에 의해 보호되는 IL- 1RAP -CART 세포는 건강한 조혈 세포에 큰 해로운 영향을 미치지 않는다
표적외 독성을 예측하기 위해, 본 발명자들은 #A3C3 mAb를 사용하여 30개의 정상 인간 조직의 조직 마크로어레이 (TMA)를 이용하여 IL-1RAP 발현을 조사하였다. 염색은 오직 6개의 조직: 림프절, 전립선, 골격근, 위, 결장 및 소장, 및 췌장에서만 염증 또는 괴사 요소를 제외하고 다양한 강도 수준으로 염색이 검출되었다 (도 13a 및 표 2). 흥미롭게도, 미세혈관 HMEC-1 내피 세포주는 본 발명자들의 #A3C3 IL-1RAP mAb에 의해 인식되지 않은 반면 (도 13b), R&D IL-1RAP mAb (R&D 시스템즈 - Ref # 89412)는 세포 표면 발현을 명백히 검출하며, 이는 상이한 에피토프를 인식한다는 것을 시사하는 것이다.
건강한 조혈계의 표적화에 관하여, mAb #A3C3이 건강한 공여자 (도 14a, c) 또는 정상 제대혈 (도 14b, c)로부터의 골수 (RFI<1.2, n=5)에서 HSC가 검출되지 않았다면, 본 발명자들은 건강한 공여자로부터의 2/5 말초 혈액 및 3/5 골수에서 단핵구 하위집단의 약한 염색(RFI<2)에 주목하였다 (도 14a). 이어서, 본 발명자들은 다양한 E:T 비의 PBMC 및 자가 CART 세포 CART 세포의 공동 배양에 의해 단핵구의 시험관내 감수성을 연구하였다. 1:1의 E:T 비에서, 단핵구 중 단지 일부만이 표적화되었으며, 단핵구 중 41.45%가 살아남은 반면 (도 14d, 우측, 표 3), 림프구, 과립구, 및 K562 IL-1RAP-음성 세포주는 심지어 더 우수한 E:T 비에서조차 영향을 받지 않았다 (도 13d). 흥미롭게도, 상기 E:T 비에서, 백혈병 세포 중 94.77%가 사멸되었다 (도 14e).
[표 2]
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
[표 3]
Figure pct00008
이들 결과를 통해 hCD34-생착된 뮤린 모델 (hu-NOG)에서 생체내에서 확인되었으며, 여기서, 본 발명자들은 비록 단핵구가 15일째에는 감소하였지만 (41 ± 25%, n=3, p=n.s), hCD34+ 세포로부터 유래된 다른 인간 면역능력 세포는 CART 세포에 의해 영향을 받지 않았다는 것을 입증하였다 (도 15). 자가 CART 세포와 건강한 CD34+ 제대혈 HSC의 시험관내 공동 배양 후, 조혈 줄기 세포 배양 검정법을 통해 HSC는 영향을 받지 않았다는 것을 확인하였다 (도 16). 이들 결과는 조혈ㄱ께에 대해 부작용이 거의 없는 것과 연관된 IL-1RAP CART 세포 면역요법과 일치한다.
잠재적인 독성을 제한하기 위해, 본 발명자들은 화학적 유도인자 이량화제 (CID; 10 nM)에의 노출 후 iCASP9/AP1903 자살 시스템 카세트의 안전 스위치 기능을 평가하였다. 먼저, 광학 현미경법을 사용하여, 본 발명자들은 IL-1RAP CAR에 의해 형질도입된 293T 세포 배양물이 CID에 감수성이라는 점에 주목하였다 (도 17, 상단). 세포측정 분석은 CD19+ 및 CD19- IL-1RAP CART 세포의 혼합 집단에서, 오직 상기 CD19-CD3+ 세포만이 24시간의 CID 노출 후에 지속되었다는 것으로 밝혀졌다 (도 17, 하단). 더욱 정확하게, 아폽토시스의 정량적 검정법에서, 형질도입되지 않은 T 세포 (C0) (각각 24 또는 48시간째 각각 1.28% 및 6.13%; p<0.001, n=3; 도 14f)와 비교하여 84.11% 및 88.93%의 IL-1RAP CART 세포가 CID 노출 24시간 또는 48시간에도 제거되었다. 마지막으로, NSG 뮤린 모델에서 안전 스위치의 생체내 평가 결과, i.p. AP1903 투여 후에 87 ± 7.32% (p<0.01, n=3)의 IL-1RAP CART 세포가 제거될 수 있지만, PBS 투여 후에는 대조군 형질도입되지 않은 T 세포 (C0)가 어느 처리에 의해서도 영향을 받지 않는다는 것이 밝혀졌다 (도 14g).
실시예 10: AML 환자로부터의 AML 모세포에 대한 IL- 1RAP CART 세포의 시험 관내 세포독성
물질 및 방법
형질도입되지 않은 T 세포 (UNT 세포), 모의T 세포 (즉, CART 세포에 대하여 사용된 것과 동일하되, CAR을 보유하지 않는 벡러로 형질도입된 세포), 및 (건강한 공여자 또는 AML 환자의 T 세포로부터 생성된) IL-1RAP CART 세포을 원심분리하고, 1 ml PBS 1X 주에 재현탁시킨 후, 이어서, 1/1000으로 희석된 1 ml e-플루오르-V450 용액 (세포 증식 염료) (e바이오사이언스((eBioscience))을 첨가하였다. 세포를 암실에서 실온하에 20분 동안 인큐베이션시켰다. 8 ml의 완전 X-비보 15 배지 (론자), 10% 우태아 혈청 (GIBCO, USA), 1%의 페니실린-스트렙토마이신 PS (기브코(GIBCO : 미국)) 첨가한 후, 이어서, + 4℃에서 5분 동안 인큐베이션시컸다. 세포를 동일한 배지로 2회 세척하고, 완전 X-비보 15 배지, 10% 인간 혈청, 1% PBS (인터류킨 2 포함)에 현탁시켰다. 상기 세포와 AML 환자 (동종이계 환경에서 또는 자가 환경에서)의 혈액 샘플로부터의 100x103개의 1차 세포를 96 웰 플레이트 (둥근 바닥)에서 상이한 이펙터:표적 비 (E:T 비)로 공동 배양하였다. 세포 부피/웰 = 200 ㎕. 24시간 공동 배양 후, AML 모세포 대비 UNT 세포, 모의T 세포 및 IL-1RAP CART 세포의 세포독성을 3 ㎕ 7-AAD-PerCP-Cy5.5 (BD 바이오사이언스)를 이용한 생존능 표지, 및 항-CD34-알로피코시아닌 (APC) (BD 바이오사이언스)을 이용한 염색에 의해 평가하였다. 필요할 경우, 이펙터 세포 (모의T 또는 IL-1RAP CART 세포)로부터 AML 모세포를 염색, 검출 및 구별하기 위해 하기 항체 (Ab)를 사용하였다: 1 ㎕ 항-CD3-피코에리트린 (PE) (밀테니이 바이오테크: 독일) 및 1 ㎕ 항-CD19-알로피코시아닌 (APC) (밀테니이 바이오테크: 독일). e-플루오르 표지에 의해 표적 세포로부터 이펙터 세포가 확인되었다. 본 결과는 유세포 분석법에 의해 수득하였고, FACS Diva 소프트웨어로 분석하였다. 대조군 형질도입되지 않은 T 세포 (UNT)의 세포독성을 감산한 후, IL-1RAP CART 세포의 동종이계 사멸을 제공한다.
IL-1RAP T 세포가 AML 환자로부터 생성된 실험의 경우, T 및 B 세포의 존재 여부를 체크하기 위해, AML 모세포의 사전 표지를 T 세포 단리 후에 수행하였다.
결과
본 결과는 도 19에 제시되어 있다. 세포독성이 검출되지 않은 모의T 세포 또는 UNT 세포와 비교하여, 다양한 E:T 비로 IL-1RAP CART 세포와 함께 공동 배양함으로써 종양 항원 발현 수준과는 상관없이 동일한 효율로 AML 환자로부터의 AML 모세포 (저 및 중간 IL-1RAP 발현 세포(expresser), 유세포 분석법에 의해 앞서 확인 (제시되지 않음)) 1차 세포를 사멸시킬 수 있었다.
흥미롭게도, AML 환자의 T 세포로부터 생성된 IL-1RAP CART 세포 또한 동일한 효율로 AML 모세포를 사멸시킬 수 있었다. CART 세포는 AML 환자로부터 생성될 수 있고, 자가 환경에서 사용될 수 있다는 것이 확인된다.
실시예 11: AML 환자로부터의 AML 모세포에 대한 IL- 1RAP CART 세포의 생체 내 세포독성
물질 및 방법
각각 저, 중간 (int) 및 고 IL-1RAP 발현 세포주인 HL-60, Molm-13 및 Mono-Mac-6 AML에 루시퍼라제 렌티바이러스 벡터 (pLenti CMV V5-Luc 모세포 벡터, 애드진)를 형질도입시켰다. 블라스티시딘 (써모피셔 사이언티픽)에 대한 내성에 의해 루시퍼라제 양성 세포를 선택하였다.
4일째, 6 내지 8주령된 NSG 마우스 (잭슨 라보라토리(Jackson Laboratory: 미국 캘리포니아주 새크라멘토))에 준치사량 (25 Gy)으로 방사선을 조사하였다. 3일째, 각 마우스에 꼬리 정맥을 통해 300 ㎕의 PBS에 현탁된, 1x106개의 HL-60 또는 Molm-13 또는 Mono-Mac-6 루시퍼라제 발현 AML 세포를 주사하였다. 0일째, AML 세포 주사 후, 마우스를 처리하지 않거나 (UT), 또는 꼬리 정맥을 통해 형질도입되지 않은 T 세포 (UNT) (300 ㎕의 PBS 중 10x106개의 세포), 또는 IL-1RAP CAR-T 세포 (300 ㎕의 PBS 중 10x106개의 세포)로 처리하고, 3, 5, 10, 14, 17 및 21일째에 IVIS® 루미나 III 시스템(IVIS® lumina III system) (퍼킨엘머(PerkinElmer))을 이용하여 백혈병 발병에 대하여 모니터링하였다.
동물 프로토콜은 브장송 대학(University of Besancon)의 동물 관리 및 사용 위원회의 통제하에 수행되었다. 비처리군의 동물이 빈사 상태에 도달하고, 백혈병 징후가 나타날 때까지 (즉, 체중 감소 > 15%, 활동 감소, 및/또는 뒷다리 마비), 마우스를 추적하였다. 마우스 실험은 지역 윤리 위원회 (NSG-S 모델에 대하여 각각 CELEAG 및 프로토콜 11007R, 동물 건강 & 보호 수의 서비스(Veterinary Services for Animal Health & Protection))의 승인을 받았다.
결과
본 결과는 도 20에 제시되어 있다. 비처리된 마우스 군 또는 UNT 처리된 T 세포 마우스 군과 비교하였을 때, IL-1RAP CART 세포에서는 백혈병 세포의 IL-1RAP 세포 표면 발현과 상관없이 AML 생체내 이종이식 마우스 모델에서 백혈병 부담이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다.
SEQUENCE LISTING <110> Etablissement Fran?is du Sang INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE DE BESANCON UNIVERSITE DE FRANCHE COMTE <120> CAR-T CELLS TARGETING IL-1RAP AND THEIR USE IN AML <130> 1H318460 - 0005 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding chain H (VH) of murine scFv anti-IL-1RAP <400> 1 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt caactcccag 60 gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctt atgatgcctg gggcttcagt gaaagtgtcc 120 tgcgaggctt ctggctacac attcactgac tcctggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat cggagcgatt gatccttctg atagttatac tacctataat 240 caaaaattca cgggcaaggc cacattgagt gtagacgaat cctccaacac agcctacatg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag gtattactcc 360 ggtagtaact acatatcgcc ctttccttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 420 gca 423 <210> 2 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of chain H (VH) of murine scFv anti-IL-1RAP <400> 2 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Met Met 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Ser Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Thr Gly Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Glu Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Ser Pro Phe 115 120 125 Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 <210> 3 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding chain K (VL) of murine scFv anti-IL-1RAP <400> 3 atggagtcac agattcaggt ctttgtattc gtgtttctct ggttgtctgg tgttgacgga 60 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcacc 120 atcacctgca aggccagtct ggatgtgagt actgctgtgg cctggtatca acagaaacca 180 ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 240 cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 300 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagtc ctccattcac gttcggctcg 360 gggacaaact tggagataaa ac 382 <210> 4 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of chain K (VL) of murine scFv anti-IL-1RAP <400> 4 Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser 20 25 30 Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Leu Asp 35 40 45 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 100 105 110 Ser Pro Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker between the VH and VL domains <400> 5 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp 1 5 10 15 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of the light chain <400> 6 Leu Asp Val Ser Thr Ala 1 5 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of the light chain <400> 7 Ser Ala Ser 1 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of the light chain <400> 8 Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Phe Thr 1 5 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of the light chain (nt) <400> 9 ctggatgtga gtactgct 18 <210> 10 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of the light chain (nt) <400> 10 tcggcatcc 9 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of the light chain (nt) <400> 11 cagcaacatt atagtcctcc attcacg 27 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of the heavy chain <400> 12 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser Trp 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of the heavy chain <400> 13 Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr 1 5 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of the heavy chain <400> 14 Ala Arg Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Ser Pro Phe Pro Tyr 1 5 10 15 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of the heavy chain (nt) <400> 15 ggctacacat tcactgactc ctgg 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of the heavy chain (nt) <400> 16 attgatcctt ctgatagtta tact 24 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of the heavy chain (nt) <400> 17 gcaaggtatt actccggtag taactacata tcgccctttc cttac 45 <210> 18 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of murine scFv anti-IL-1RAP (i.e. #A3C3 CAR) <400> 18 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Met Met 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Ser Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Thr Gly Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Glu Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Ser Pro Phe 115 120 125 Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Met Glu Ser Gln 145 150 155 160 Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly 165 170 175 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 180 185 190 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Leu Asp Val Ser Thr Ala 195 200 205 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 210 215 220 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 225 230 235 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 245 250 255 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Phe 260 265 270 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 275 280

Claims (12)

  1. 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia; AML)의 치료에서 사용하기 위한, 이의 막(membrane)에서 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor; CAR)를 인코딩(encoding)하는 핵산 분자를 발현하는 세포로서, 여기서 CAR은 항-IL-1RAP 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 막관통(transmembrane) 도메인, 및 적어도 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 항-IL-1RAP 결합 도메인은
    (i) 아미노산 서열 서열 번호: 6과 적어도 80%의 동일성(identity)을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 7과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 8과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 경쇄, 및
    (ii) 아미노산 서열 서열 번호: 12와 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 13과 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 14와 적어도 80%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄를 포함하는 세포.
  2. 제1항에 있어서, 항-IL-1RAP 결합 도메인이
    (i) 아미노산 서열 서열 번호: 6과 적어도 95%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 7과 적어도 95%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 8과 적어도 95%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 경쇄, 및
    (ii) 아미노산 서열 서열 번호: 12와 적어도 95%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 13과 적어도 95%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 14와 적어도 95%의 동일성을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄를 포함하는, 사용하기 위한 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-IL-1RAP 결합 도메인이
    (i) 아미노산 서열 서열 번호: 6을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 7을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 8을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 경쇄, 및
    (ii) 아미노산 서열 서열 번호: 12를 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 서열 번호: 13을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 및 아미노산 서열 서열 번호: 14를 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄를 포함하는, 사용하기 위한 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포인, 사용하기 위한 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, IL-1RAP 결합 도메인이 항체, Fv, scFv, Fab, 또는 또 다른 항체 단편, 바람직하게는, scFv로 구성된 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질, 바람직하게는 CD28의 막관통 도메인인, 사용하기 위한 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IL-1RAP 결합 도메인이 힌지 영역(hinge region)에 의해 막관통 도메인에 연결되고, 바람직하게는 힌지 영역은 IgG1의 힌지 서열 또는 이의 95-99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 사용하기 위한 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하고, 바람직하게는 상기 기능성 세포내 신호전달 도메인의 적어도 하나의 공동자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, CD3 제타, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 및 4-1BB (CD137)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질로부터 수득되고, 바람직하게는 4-1BB (CD137)로부터 수득되고/거나, CD3 제타로부터 수득되는, 사용하기 위한 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, AML이 (i) 불응성/재발된(refractory/relapsed) AML, 또는 (ii) 복합 세포유전학적 이상(complex cytogenetic abnormality)이 있는 AML 및/또는 TP53 돌연변이가 있는 AML인, 사용하기 위한 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, AML이 IL1-RAP 발현 AML, 예컨대, 불응성/재발된 IL1-RAP 발현 AML인, 사용하기 위한 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 모노클로날 항체(monoclonal antibody), 예컨대, 항-체크포인트 억제제(anti-checkpoint inhibitor)와 공동으로 사용하기 위한 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 자가 치료인, 사용하기 위한 세포.
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