CN115927027A - 一种产视黄醛的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产视黄醛的解脂耶氏酵母基因工程菌，所述基因工程菌是以能生产β‑胡萝卜素的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)为出发菌株，将来源于海洋细菌(marine bacterium)或盐古杆菌(Halobacterium sp)的blh基因的优化序列转化入出发菌株中而获得，其中：所述blh基因的优化序列如SEQ ID No.1、3或5所示。本发明首次以解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)为出发菌株，将来源于海洋细菌(marine bacterium)或盐古杆菌(Halobacterium sp)的blh基因的优化序列转化入出发菌株中，成功获得了能够发酵生产视黄醛的解脂耶氏酵母基因工程菌，为生物法合成维生素A(视黄醛)奠定了良好的基础。

Description

一种产视黄醛的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可利用葡萄糖生产视黄醛的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。

背景技术

维生素A是一种脂溶性维生素，是人体必需的微量营养素，被广泛应用于动物饲料强化、抗衰老化妆品和治疗皮肤病等多个领域。维生素A并不是单一的化合物，而是一系列包括视黄醇(retinol)、视黄醛(retinal)、视黄酸(retinoic acid)、视黄醇乙酸酯(retinyl acetate)和视黄醇棕榈酸酯(retinyl palmitate)等在内的视黄醇的衍生物。维生素A的生产方法主要包括化学合成法和生物合成法两种。利用化学法合成维生素A由帝斯曼和巴斯夫等少数公司垄断，同时还存在试剂成本高、纯化工艺复杂、环境污染严重的问题。因此更加经济和环保的生物合成法越来越受到广泛关注。

近年来，随着合成生物学和代谢工程的迅猛发展，利用微生物细胞工厂生产类胡萝卜素及其衍生物成为热点。在海洋透光区中存在一些细菌和古细菌，它们具有完整的视黄醛合成途径，但是一方面这些海洋微生物的视黄醛合成能力有限，另一方面这些海洋微生物不适合高密度发酵，所以不适合于大规模生产。

解脂耶氏酵母是一种专性需氧菌，适合于高密度发酵的方式培养。同时含有天然的MVA途径，能够提供大量的DMAPP以及IPP，在萜类物质的生物合成方面有优势。因此利用解脂耶氏酵母生产视黄醛具有巨大潜力。但是，以解脂耶氏酵母细胞为底盘菌株，进行视黄醛的生物合成的研究尚未有报道。

发明内容

有鉴于现有技术中所存在的上述不足，本发明致力于以解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)为出发菌株，开发其生产维生素A的能力。

为实现上述目的，本发明的第一个方面，提供了一种生产视黄醛的解脂耶氏酵母基因工程菌，该基因工程菌以能生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)为出发菌株，将来源于海洋细菌(marine bacterium)或盐古杆菌(Halobacterium sp)的blh基因的优化序列转化入出发菌株中而获得，其中：所述blh基因的优化序列如SEQ IDNo.1、3或5所示。

优选的，所述blh基因来源于海洋细菌(marine bacterium 66A03)，其优化序列如SEQ ID No.1所示。

根据本发明的优选实施例，所述blh基因的优化序列经构建到质粒pINA1269中后，再转化入所述解脂耶氏酵母出发菌株中。

进一步的，所述blh基因的优化序列构建到质粒pINA1269中后的序列如SEQ IDNo.2、4或6所示。

优选的，所述blh基因的优化序列经构建到质粒pINA1269中后的序列如SEQ IDNo.2所示。

根据本发明，所述出发菌株为能生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17，或者是尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母。

根据本发明的优选实施例，所述出发菌株为能生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17。

本发明的第二个方面，提供了所述的解脂耶氏酵母基因工程菌用于发酵生产视黄醛的应用。

根据本发明，所述发酵生产视黄醛是以葡萄糖为碳源。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次以解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)为出发菌株，将来源于海洋细菌(marine bacterium)和盐古杆菌(Halobacterium sp)的blh基因的优化序列转化入出发菌株中，成功获得了能够发酵生产视黄醛的解脂耶氏酵母基因工程菌，为生物法合成维生素A(视黄醛)奠定了良好的基础。

附图说明

图1为引入视黄醛合成基因后解脂耶氏酵母生成视黄醛的代谢途径。

图2为菌株WBR61以葡萄糖为碳源的摇瓶发酵生产β-胡萝卜素的结果示意图。

图3为菌株WBR61以葡萄糖为碳源的摇瓶发酵生产视黄醛的结果示意图。

图4为菌株WBRN1和WBR41以葡萄糖为碳源的摇瓶发酵生产β-胡萝卜素的结果示意图。

图5为菌株WBRN1和WBR41以葡萄糖为碳源的摇瓶发酵生产视黄醛的结果示意图。

图中：retinal：视黄醛；β-carotene：β-胡萝卜素；DCW：干细胞重量；Content：得率。

具体实施方式

下面通过具体实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

以下实施例中，β-胡萝卜素的测定方法参见Zhang X K,Wang D N,Chen J,etal.Metabolic engineering of beta-carotene biosynthesis in Yarrowia lipolytica[J].Biotechnol Lett.2020,42(6):945-956,doi:10.1007/s10529-020-02844-x。

以下实施例中，视黄醛的测定方法参见Lee J H,Choi J G,Kim Y S,etal.Enhancement of retinal production by supplementing the surfactant Span80using metabolically engineered Escherichia coli[J].J Biosci Bioeng.2012,113(4):461-6,doi:10.1016/j.jbiosc.2011.11.020。

以下实施例中所使用的菌株和质粒来源如下：

1、生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17的获得参见专利申请号为202010107322.1的发明专利申请。

2、质粒pINA1269的获得参见Madzak C,Gaillardin C,Beckerich JM.Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeastYarrowia lipolytica:a review[J].J Biotechnol.2004,109(1-2):63-81，doi:10.1016/j.jbiotec.2003.10.027，质粒pINA1269是基于pBR322整合平台的单拷贝整合载体，该质粒能够在Po1f的LEU2终止子区域进行整合，该质粒针对大肠杆菌的筛选标记为氨苄霉素抗性，针对解脂耶氏酵母的筛选标记均为Leu。并且该质粒上保留有ClaI、SacII、BamHI、PmlI、EcoNI、NotI等常用的酶切位点。

应当说明，以下实施例尽管采用XK17作为出发菌株，但是常规的尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)均能够作为出发菌株，用以转化，以进行本发明的实施例中的试验。

以下实施例中所用的试剂和原料均市售可得。其中：转化使用的试剂盒Frozen EZYeast Transformation IITM购自Zymo Research，并按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。

以下实施例中所涉及的基因如下：

本发明中涉及到的β-胡萝卜素15,15’裂解单加氧酶基因有三条，分别为：

1、blh-66A03优化核苷酸序列，如SEQ ID No.1所示；

2、blh-49E08优化核苷酸序列，如SEQ ID No.3所示；

3、blh-NRC1优化核苷酸序列，如SEQ ID No.5所示。

以下实施例中所涉及的培养基及配制：

YPD培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，溶剂为去离子水。

YNB固体培养基：10g/L的葡萄糖，1.5％琼脂和0.67％的YNB，溶剂为去离子水。

配制：将各成分溶于去离子水中，搅拌溶解，灭菌，即得。

本发明构建的视黄醛合成途径的示意图如图1所示。

实施例1：解脂耶氏酵母中视黄醛合成途径构建

1、将来源于海洋细菌(marine bacterium 66A03)的blh基因进行优化，根据宿主菌解脂耶氏酵母自身的密码子偏好性，通过去除稀有密码子、调整整体的G/C含量等方式对上述基因的密码子进行优化，经过优化后的序列为blh-66A03，如SEQ ID No.1所示。

2、通过酶切位点BamHI/PmlI，使用对应的限制性内切酶对质粒pINA1269进行酶切，从而将优化后的blh基因优化序列blh-66A03构建到质粒pINA1269中，得到质粒pINA1269-blh-66A03。

3、将步骤2所得的质粒pINA1269-blh-66A03，利用限制性内切酶NotΙ进行单酶切线性化，得到pINA1269-blh-66A03的线性化片段，其序列如SEQ ID No.2所示。

4、将步骤3所得的pINA1269-blh-66A03的线性化片段，利用酵母转化试剂盒(Frozen EZ Yeast Transformation IITM)进行解脂耶氏酵母感受态细胞的制备并转化入能生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17中，获得能够合成视黄醛的WBR61菌株，操作步骤按试剂盒的说明书，具体如下：

(1)将需要转化的解脂耶氏酵母菌株XK17在YPD平板上划线，然后将平板置于30℃摇床中培养24h；

(2)待平板上长出单菌落后，挑取单菌接种到含有3mL YPD液体培养基的试管中，置于30℃摇床中培养24h；

(3)取500μL的菌液转接至含有3mL YPD液体培养基的试管中，培养6h至菌液OD₆₀₀值达到0.8-1.0；

(4)取700μL菌液转移到1.5mL EP管中，转速4000rpm离心4min，去除上清液；

(5)向菌体中加500μL Solution I(试剂盒自带)，轻轻吹打混匀后，转速4000rpm离心4min，去除上清液；

(6)向菌体中加50μL Solution ΙΙ(试剂盒自带)重悬，轻轻吹打混匀，至此解脂耶氏酵母细胞的感受态制备完成；

(7)向制备好的细胞感受态中，加入0.2-1μg的pINA1269-blh-66A03的线性化片段；

(8)向混合液中加入500μL Solution ΙΙI(试剂盒自带)，吹打混匀；

(9)将混合液置于30℃水浴锅中，每隔30min涡旋振荡一次，持续2-3h；

(10)将上述液体涂布在加入尿嘧啶的YNB固体平板，将平板放置在30℃培养箱中恒温培养2-3天，此时平板上的浅黄色菌落即为工程改造后的基因工程菌株。

5、验证：对步骤4得到的基因工程菌株进行酵母基因组的提取，并选择SEQ IDNo.1两端20bp的序列作为验证引物，进行PCR验证，具体操作如下：

(1)取1-2mL过夜培养的酵母菌液，加入1.5mL的EP管中，转速8000rpm离心1min，吸除上清液，收集菌体；

(2)向菌体中加入600μL Lysis Y Buffer，加入5μL Lyticase，吹打混匀后转移到30℃水浴锅等待30min；

(3)破壁处理结束后，转速4000rpm离心10min，吸除上清液；

(4)向上述管中加入200μL TBM溶液，吹打混匀，加入220μL Lysis Solution，混匀，再加20μL蛋白酶K溶液，吹打混匀，将管置于70℃金属浴10min；

(5)待上述溶液变清亮且冷却至室温后，加入220μL无水乙醇，吹打混匀后涡旋振荡；

(6)将溶液连同絮状沉淀一起加入吸附柱中，转速12000rpm离心30sec，弃去收集管中的废液；

(7)转速8000rpm离心1min，取出吸附柱，弃去收集管中的废液；

(8)将吸附柱装回收集管中，加入500μL洗脱液，转速8000rpm离心1min，取出吸附柱，弃去收集管中的废液；

(9)重复步骤8；

(10)将吸附柱装回收集管中，转速12000rpm离心2min；

(11)将吸附柱放在1.5mL的EP管中，在65℃烘箱中开盖放置10min；

(12)向吸附柱中央加入50μL的超纯水，转速12000rpm离心2min，即可获得酵母基因组DNA；

(13)将上步重提取得到的酵母基因组DNA作为模板，按照下表中的PCR体系进行配制：

(14)将配置好的体系置于PCR仪中，Taq酶PCR系统验证的程序如下：

预变性温度设置为95℃时长为3min，变性温度为95℃时长为15s，退火温度为60℃时长为15s，延伸温度为72℃时长根据片段长度决定，一般为60sec/kb，整个变性退火延伸的过程设定为30-35次循环，彻底延伸温度为72℃时长5min，最后设置4℃下保存。

(15)电泳结果显示，扩增出的条带长度与blh-66A03(828bp)长度相一致，表明blh-66A03基因已经成功整合在基因组上，视黄醛生产菌株构建成功。

实施例2：重组菌株WBR61发酵生产视黄醛

将实施例1获得的重组菌株WBR61进行摇瓶发酵，具体的摇瓶发酵方法如下：

挑取100μL重组菌株WBR61的甘油保藏菌液，接种于含有2mL YPD培养基的试管中，30℃培养16小时后按1％的接种量接种于50mL YPD培养基中，初始OD₆₀₀为0.01，于30℃培养72小时后，测定摇瓶发酵的视黄醛和β-胡萝卜素产量(Titer)、干细胞重量(DCW)及视黄醛和β-胡萝卜素得率(Content)，结果见图2和图3。

图2和图3的结果显示，重组菌株WBR61能够以葡萄糖为碳源异源合成视黄醛。整合了blh-66A03基因的WBR61菌株的β-胡萝卜素产量为28.2mg/L，与出发菌株XK17相比降低了83.3％，同时细胞干重并没有明显变化。WBR61菌株产物中能够检测到视黄醛，并且视黄醛的产量达到了90.3mg/L，同时此菌株的β-胡萝卜素到视黄醛的转化率达到了64.4％。

实施例3：视黄醛合成途径中blh基因的来源筛选

1、将海洋细菌(marine bacterium HF10 49E08)和盐古杆菌(Halobacterium spNRC-1)来源的blh基因、根据解脂耶氏酵母的密码子偏好性，通过去除稀有密码子、调整整体的G/C含量等方式进行优化，经过优化后的序列分别为blh-49E08和blh-NRC1，如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.5所示。

2、通过酶切位点BamHI/PmlI，使用对应的限制性内切酶对质粒pINA1269进行酶切，从而将优化后的blh基因优化序列构建到质粒pINA1269中，并利用限制性内切酶NotΙ进行单酶切线性化，得到pINA1269-blh-49E08和pINA1269-blh-NRC1的线性化片段，其序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.6所示；

3、将步骤2所得的pINA1269-blh-49E08和pINA1269-blh-NRC1的线性化片段，使用实施例1中的方法，利用酵母转化剂盒进行解脂耶氏酵母感受态细胞的制备并转化入能生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17中，获得WBRN1和WBR41菌株。

4、按照实施例1中的方法提取步骤3中获得的重组菌株WBRN1和WBR41的基因组，并利用Taq酶PCR系统验证，最终确定blh-49E08和blh-NRC1基因已经成功整合在基因组上，重组菌株WBRN1和WBR41构建成功。

5、将步骤3中获得的重组菌株WBRN1和WBR41同实施例1中的WBR61菌株按照实施例1中的发酵方法进行摇瓶发酵，30℃培养72小时后，测定摇瓶发酵的视黄醛和β-胡萝卜素产量(Titer)、干细胞重量(DCW)及视黄醛和β-胡萝卜素得率(Content)，结果见图4和图5。

WBR41菌株的β-胡萝卜素产量为75.6mg/L，比出发菌株XK17相比降低了55.2％；细胞干重并没有明显变化；工程菌株WBR41的视黄醛产量为4.8mg/L；WBRN1菌株的β-胡萝卜素的产量为77.5mg/L，比出发菌株XK17相比降低了54.0％。而WBRN1菌株的视黄醛产量为1.0mg/L。

由此可见，使用来源于海洋细菌(marine bacterium HF10 49E08)和盐古杆菌(Halobacterium sp NRC-1)的blh基因转化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，得到的基因工程菌都具有生产视黄醛的能力，虽然产量有差异，WBR41菌株和WBRN1菌株的视黄醛产量均远低于实施例1中的WBR61菌株，但这一研究成果为后续进一步开发用于生物法合成维生素A(视黄醛)的方法奠定了良好的基础。

Claims (9)

1.一种生产视黄醛的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以能生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)为出发菌株，将来源于海洋细菌(marine bacterium)或盐古杆菌(Halobacterium sp)的blh基因的优化序列转化入出发菌株中而获得，其中：所述blh基因的优化序列如SEQ ID No.1、3或5所示。

2.根据权利要求1所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述blh基因来源于海洋细菌(marine bacterium 66A03)，其优化序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述blh基因的优化序列经构建到质粒pINA1269中后，再转化入所述解脂耶氏酵母出发菌株中。

4.根据权利要求3所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述blh基因的优化序列构建到质粒pINA1269中后的序列如SEQ ID No.2、4或6所示。

5.根据权利要求4所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述blh基因的优化序列经构建到质粒pINA1269中后的序列如SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求1或2所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株为解脂耶氏酵母基因工程菌XK17，或者是尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母。

7.根据权利要求6所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株为解脂耶氏酵母基因工程菌XK17。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌的应用，其特征在于，用于发酵生产视黄醛。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵生产视黄醛是以葡萄糖为碳源。

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