CN115920076B - 一种马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双药抗癌药物技术领域，提供了一种马齿苋多糖‑去甲基斑蝥素‑甲氨蝶呤偶联物及其制备方法和应用。本发明以马齿苋多糖为主链，通过功能化修饰得到去甲基斑蝥素和甲氨蝶呤的多糖药物偶联物，构造了新的多糖药物体系；该药物体系能够在弱酸环境下实现甲氨蝶呤的释放，可以作为pH敏感的靶向抗癌药物使用；并且马齿苋多糖本身具有抗肿瘤活性，以其作为载体携带少量去甲基斑蝥素和甲氨蝶呤，可以提高药物小分子对肿瘤细胞的毒性，并且降低药物的使用剂量，协同多糖抑制肿瘤细胞的生长；本发明为双药联合治疗癌症提供了新的思路，在肿瘤协同治疗领域中具有广阔的应用前景。

Description

一种马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物及其制备方 法和应用

技术领域

本发明涉及双药抗癌药物技术领域，尤其涉及一种马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物及其制备方法和应用。

背景技术

现阶段，癌症是危害人类健康最主要的疾病，受到许多研究者的关注与研究。化学药物疗法又称化疗，是一种使用化学药物或生物制剂阻止肿瘤细胞生长、增殖和转移，且能够最大程度地杀死肿瘤细胞的一种临床治疗方法。

药物的溶解性、靶向性等问题容易引发不良治疗效果，导致它们的使用受到了限制。所以，解决药物的溶解性、实现靶向输送或者释放等问题可以大大的提高药物的利用率。

去甲基斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)是白色粉末呈结晶，略溶于水，是人工合成的抗癌药物，是斑蝥素经水解去二甲基后的产物，可干扰癌细胞分裂，抑制其DNA的合成，作用于细胞周期的M期。可以和其它化疗药物协同抗肿瘤，在抗癌方面较斑蝥素有更广阔的应用前景。

甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是橙黄色粉末呈结晶状，几乎不溶水，是一种抗叶酸类抗肿瘤药，主要是通过抑制二氢叶酸还原酶的生成来阻碍DNA的合成，核苷酸的复制受阻从而达到抑制肿瘤细胞生长与扩散的效果。MTX可用于治疗肺癌、头颈部癌和宫颈癌等，是临床使用的抗肿瘤药物之一。

近年来研究发现，植物多糖不仅具有生物相容性还具有抗肿瘤活性、抗氧化性等优点，作为生物大分子的植物多糖可以进行功能化修饰，构筑以多糖为载体的联合化疗药物。但是，目前还没有利用去甲基斑蝥素和甲氨蝶呤构筑多糖体系复合药物的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物及其制备方法和应用。本发明提供的马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物是一种新的多糖药物体系，具有靶向性，抗肿瘤活性好，在肿瘤协同治疗领域具有广阔的应用前景。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物，具有式I所示结构：

式I中，n表示聚合度。

本发明还提供了上述方案所述马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物的制备方法，包括以下步骤：

将马齿苋多糖、苯磺酸水溶液和去甲基斑蝥素混合进行酯化反应，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物；

将所述马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物、甲氨蝶呤、2-吗啉乙磺酸缓冲溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合进行酰胺缩合反应，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物。

优选的，所述马齿苋多糖和去甲基斑蝥素的质量比为1:(0.5～1)。

优选的，所述酯化反应的温度为25～50℃，时间为36～60h。

优选的，所述酰胺缩合反应的过程具体包括：将甲氨蝶呤、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中后进行搅拌活化，得到甲氨蝶呤活化液；将马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物溶液；将所述甲氨蝶呤活化液加入所述马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物溶液中进行酰胺缩合反应。

优选的，所述甲氨蝶呤和马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物的质量比为(0.2～0.5):1；

所述酰胺缩合反应的温度为37～50℃，时间为36～60h，所述酰胺缩合反应在氮气保护和避光条件下进行。

优选的，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为3:(1～3)；所述搅拌活化的时间为30～90min。

优选的，所述酰胺缩合反应完成后，还包括将所得产物料液在PBS缓冲液中进行透析，将透析后的液体进行冷冻干燥，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物粉末。

本发明还提供了上述方案所述的马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物或上述方案所述制备方法制备的马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述肿瘤包括乳腺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌和卵巢癌中的一种或多种。

本发明提供了一种马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物，具有式I所示结构。马齿苋多糖(Portulaca oleraceaPolysaccharides，PPS)是从马齿苋植物中提取得到的多糖，且具有抗氧化、抗癌、调节免疫、降血糖等生物活性；本发明以马齿苋多糖为主链，通过功能化修饰得到去甲基斑蝥素和甲氨蝶呤的多糖药物偶联物，构造了新的多糖药物体系；该药物体系能够在弱酸环境下实现抗癌药物的释放，可以作为潜在的靶向pH的多糖抗癌药物；并且马齿苋多糖本身具有抗肿瘤活性，本发明以其作为载体携带少剂量去甲基斑蝥素和甲氨蝶呤，可以提高药物小分子对肿瘤细胞的毒性，并且可以降低甲斑蝥素和甲氨蝶呤的使用剂量，协同多糖抑制肿瘤细胞的生长；本发明提供的新型马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物为双药联合治疗癌症提供了新的思路，在肿瘤协同治疗领域中具有广阔的应用前景。实施例结果表明，本发明提供的马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物在pH＝6.5时甲氨蝶呤的释放速率最快，且对人乳腺癌细胞、人非小细胞肺癌细胞、人宫颈癌细胞和人卵巢癌细胞均有明显的抑制作用。

本发明还提供了上述方案所述马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物的制备方法，本发明先将去甲基斑蝥素与马齿苋多糖通过酯化反应得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物，再与甲氨蝶呤进行酰胺缩合反应得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物。本发明提供的制备方法步骤简单，容易操作，且反应条件温和。

附图说明

图1为PPS-NCTD-MTX粉末、MTX、PPS-NCTD粉末、NCTD以及PPS的红外光谱；

图2为PPS-NCTD-MTX粉末、MTX、PPS-NCTD粉末、NCTD以及PPS的核磁共振氢谱；

图3为PPS、PPS-NCTD和PPS-NCTD-MTX的X射线衍射光谱图；

图4为PPS-NCTD和PPS-NCTD-MTX偶联物放大10000×和20000×的表面形貌图；

图5为PPS-NCTD-MTX偶联物的体外释放曲线；

图6为PPS-NCTD-MTX偶联物、MTX、PPS-NCTD偶联物、NCTD以及PPS的细胞增殖实验测试结果。

具体实施方式

本发明提供了一种马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物(记为PPS-NCTD-MTX偶联物)，具有式I所示结构：

式I中，n表示聚合度，优选为2000～2500。

本发明还提供了上述方案所述马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物的制备方法，包括以下步骤：

将马齿苋多糖、苯磺酸水溶液和去甲基斑蝥素混合进行酯化反应，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物；

将所述马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物、甲氨蝶呤、2-吗啉乙磺酸缓冲溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合进行酰胺缩合反应，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物。

本发明合成PPS-NCTD-MTX偶联物的路线如式II所示，下面结合式II进行具体说明。

将马齿苋多糖(PPS)、苯磺酸水溶液和去甲基斑蝥素(NCTD)混合进行酯化反应，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物(PPS-NCTD偶联物)。在本发明中，所述马齿苋多糖和去甲基斑蝥素的质量比优选为1:(0.5～1)，更优选为1:(0.6～0.8)；所述苯磺酸水溶液的浓度优选为1mg/mL，所述马齿苋多糖和苯磺酸的质量比优选为20:(0.5～1)；所述酯化反应的温度优选为25～50℃，更优选为30～45℃，所述酯化反应的时间优选为36～60h，更优选为40～50h，所述酯化反应优选在氮气氛围下进行；在本发明的具体实施例中，优选先将马齿苋多糖溶于苯磺酸水溶液中，然后加入去甲基斑蝥素进行酯化反应。

酯化反应完成后，本发明优选将所得产物料液用丙酮进行沉析，将所得沉淀物洗涤后进行冷冻干燥，得到PPS-NCTD偶联物(结构式见合成路线中的PPS-NCTD，其中n表示聚合度，取值范围优选为2000～2500)。在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选为无水乙醇，所述冷冻干燥的温度优选为-50℃，本发明对所述冷冻干燥的时间没有特殊要求，干燥至水分完全去除即可。

得到PPS-NCTD偶联物后，本发明将所述PPS-NCTD偶联物、甲氨蝶呤(MTX)、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合进行酰胺缩合反应，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物(PPS-NCTD-MTX偶联物)。在本发明中，所述MES缓冲溶液的pH值优选为6.0～8.0；所述甲氨蝶呤和马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物的质量比优选为(0.2～0.5):1，更优选为(0.3～0.4):1；所述EDC和NHS的质量比优选为3:(1～3)，更优选为3:(1.5～2.5)；所述甲氨蝶呤和EDC的质量比优选为(1～3.6):(1～3)；所述酰胺缩合反应的温度优选为37～50℃，更优选为37～45℃，所述酰胺缩合反应的时间优选为36～60h，更优选为40～48h，所述酰胺缩合反应优选在氮气保护和避光条件下进行。

在本发明的具体实施例中，所述酰胺缩合反应的过程具体包括：将甲氨蝶呤、EDC、NHS溶解于MES缓冲溶液中后进行搅拌活化，得到甲氨蝶呤活化液；将PPS-NCTD偶联物溶解于MES缓冲溶液中，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物溶液；将所述甲氨蝶呤活化液加入所述马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物溶液中进行酰胺缩合反应；所述甲氨蝶呤、EDC、NHS溶解于MES缓冲溶液中的方法优选为：先将甲氨蝶呤加入MES缓冲溶液中搅拌至完全溶解，然后加入EDC进行超声溶解，之后加入NHS进行溶解；本发明对溶解甲氨蝶呤、EDC、NHS用MES缓冲溶液以及溶解PPS-NCTD偶联物用MES缓冲溶液的体积没有特殊要求，能够保证上述原料完全溶解即可；所述搅拌活化的时间优选为30～90min。

在本发明中，所述酰胺缩合反应完成后，还包括将所得产物料液在PBS缓冲液中进行透析，将透析后的液体进行冷冻干燥，得到PPS-NCTD-MTX偶联物粉末；所述PBS缓冲液的pH值优选为7，所述透析用透析袋的分子量优选为3500Da，所述透析的时间优选为2～3天，在透析过程中，优选每隔5～6h更换新的PBS缓冲液(pH＝7)；所述冷冻干燥的温度优选为-50℃，本发明对所述冷冻干燥的时间没有特殊要求，干燥至水分完全去除即可。

本发明还提供了上述方案所述PPS-NCTD-MTX偶联物或上述方案所述制备方法制备的PPS-NCTD-MTX偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用；所述肿瘤优选包括包括乳腺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌和卵巢癌中的一种或多种，更优选为乳腺癌。本发明提供的PPS-NCTD-MTX偶联物以具有抗肿瘤活性的马齿苋多糖作为载体，携带少剂量去甲基斑蝥素和甲氨蝶呤，可以提高药物小分子对肿瘤细胞的毒性，并且可以降低药物使用剂量，协同多糖抑制肿瘤细胞的生长，并且本发明提供的PPS-NCTD-MTX偶联物能够在酸性条件下释放甲氨蝶呤，尤其是在pH值为6.5的条件下释放速度最快，而癌细胞周围的环境为弱酸性，因而本发明的PPS-NCTD-MTX偶联物可以作为pH敏感的靶向抗癌药物使用；综上所述，本发明提供的PPS-NCTD-MTX偶联物在抗恶性肿瘤领域具有广阔的应用前景。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1PPS-NCTD-MTX偶联物的制备

将300mg的去甲基斑蝥素加入已完全溶解了600mg的马齿苋多糖的苯磺酸水溶液中(水溶液中苯磺酸的质量为15mg)，在25℃下避光搅拌60h。将所得产物料液在丙酮中进行沉析，沉淀用无水乙醇洗涤数次，在-50℃条件下冷冻干燥获得马齿苋多糖-去甲基斑蝥素(PPS-NCTD)偶联物粉末；将100mg甲氨蝶呤溶于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，搅拌至完全溶解，先加入300mg EDC，超声溶解后，再加入200mgNHS，继续搅拌活化60min，活化后的甲氨蝶呤溶液加入含300mg PPS-NCTD的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，在氮气保护下，37℃油浴保温，避光反应60h。将反应液装入液透析袋(MWCO:3500Da)，在pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中透析48h，在-50℃条件下冷冻干燥，获得马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤(PPS-NCTD-MTX)粉末。

实施例2PPS-NCTD-MTX偶联物的制备

将360mg的去甲基斑蝥素加入已完全溶解了600mg马齿苋多糖的苯磺酸水溶液中，在37℃避光搅拌50h。将所得产物料液在丙酮中进行沉析，沉淀用无水乙醇洗涤数次，在-50℃条件下冷冻干燥获得马齿苋多糖-去甲基斑蝥素(PPS-NCTD)偶联物粉末；将150mg甲氨蝶呤溶于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，搅拌至完全溶解，先加入300mg EDC，超声溶解后，再加入300mg NHS，继续搅拌活化60min，活化后的甲氨蝶呤溶液加入含300mg PPS-NCTD的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，在氮气保护下，37℃油浴保温，避光反应50h。将反应液装入液透析袋(MWCO:3500Da)，在pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中透析48h，在-50℃条件下冷冻干燥，获得马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤(PPS-NCTD-MTX)粉末。

实施例3PPS-NCTD-MTX偶联物的制备

将480mg的去甲基斑蝥素加入已完全溶解了600mg马齿苋多糖的苯磺酸水溶液中(水溶液中苯磺酸的质量为20mg)，在25℃避光搅拌50h。所得产物料液在丙酮中进行沉析，沉淀用无水乙醇洗涤数次，在-50℃条件下冷冻干燥获得马齿苋多糖-去甲基斑蝥素(PPS-NCTD)偶联物粉末；将360mg甲氨蝶呤溶于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，搅拌至完全溶解，先加入100mg EDC，超声溶解后，再加入200mg NHS，继续搅拌活化30min，活化后的甲氨蝶呤溶液加入含300mg PPS-NCTD的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，在氮气保护下，37℃油浴保温，避光反应48h。将反应液装入液透析袋(MWCO:3500Da)，在pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中透析48h，在-50℃条件下冷冻干燥，获得马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤(PPS-NCTD-MTX)粉末。

实施例4PPS-NCTD-MTX偶联物的制备

将600mg的去甲基斑蝥素加入已完全溶解了600mg马齿苋多糖的苯磺酸水溶液中(水溶液中苯磺酸的质量为30mg)，在37℃避光搅拌48h。在丙酮中进行沉析，沉淀用无水乙醇洗涤数次，在-50℃条件下冷冻干燥获得马齿苋多糖-去甲基斑蝥素(PPS-NCTD)偶联物粉末；将300mg甲氨蝶呤溶于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，搅拌至完全溶解，先加入300mg EDC，超声溶解后，再加入300mgNHS，继续搅拌活化30min，活化后的甲氨蝶呤溶液加入含300mgPPS-NCTD的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，在氮气保护下，37℃油浴保温，避光反应60h。将反应液装入液透析袋(MWCO:3500Da)，在pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中透析48h，在-50℃条件下冷冻干燥，获得马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤(PPS-NCTD-MTX)粉末。

实施例5PPS-NCTD-MTX偶联物的制备

将600mg的去甲基斑蝥素加入已完全溶解了600mg马齿苋多糖的苯磺酸水溶液中(水溶液中苯磺酸的质量为30mg)，在50℃避光搅拌48h。在丙酮中进行沉析，沉淀用无水乙醇洗涤数次，在-50℃条件下冷冻干燥获得马齿苋多糖-去甲基斑蝥素(PPS-NCTD)偶联物粉末；将300mg甲氨蝶呤溶于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，搅拌至完全溶解，先加入300mg EDC，超声溶解后，再加入300mgNHS，继续搅拌活化90min，活化后的甲氨蝶呤溶液加入含300mgPPS-NCTD的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，在氮气保护下，37℃油浴保温，避光反应48h。将反应液装入液透析袋(MWCO:3500Da)，在pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中透析48h，在-50℃条件下冷冻干燥，获得马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤(PPS-NCTD-MTX)粉末。

测试例1产物表征

1、红外光谱测试

分别取15mg MTX、PPS-NCTD粉末、NCTD、PPS以及实施例1制备的PPS-NCTD-MTX粉末放入研钵中，加入等质量比的溴化钾粉末，呈细小粉末状烘干几分钟后即可压片，放入傅里叶变换红外光谱仪(BrukerVertex 80)中，选择波长范围为4000～500cm^-1进行测试。

图1为PPS-NCTD-MTX粉末、MTX、PPS-NCTD粉末、NCTD以及PPS的红外光谱；根据图1中PPS-NCTD的红外光谱曲线中可以看出，在1730cm^-1处出现了NCTD中C＝O的伸缩振动峰，这表明多糖糖环上的羟基与NCTD发生酯化反应。根据PPS-NCTD-MTX的红外光谱曲线可以看出，在1647、1610、1505cm^-1处均出现了MTX特征官能团的振动峰，这表明少量的MTX接枝到PPS-NCTD-MTX上。综上所述，NCTD和MTX成功地接枝到PPS上。

2、核磁共振氢谱测试

分别取适量MTX、PPS-NCTD粉末、NCTD、PPS以及实施例1制备的PPS-NCTD-MTX粉末溶解于氘代水或者氘代二甲基亚砜中，转移至核磁管中，使用核磁共振光谱仪(BrukerAVANCE III HD，400MHz，Germany)在25℃条件下进行测试。

图2为PPS-NCTD-MTX粉末、MTX、PPS-NCTD粉末、NCTD以及PPS的核磁共振氢谱；根据图2可以看出，PPS-NCTD谱图中出现新的在1.5～1.7ppm，是NCTD相关的特征质子峰，表明成功制备了PPS-NCTD偶联物。并且，PPS-NCTD-MTX的氢谱中出现了MTX的苯环(＝7.74、7.51ppm)、伯氨基(＝6.8ppm)的特征质子峰，共同证实成功地合成了最终产物PPS-NCTD-MTX。

3、X射线衍射光谱测试

取适量研磨后的样品PPS、PPS-NCTD和实施例1制备的PPS-NCTD-MTX平铺在测试用的载玻片上。采用X射线粉末衍射仪(Malvern Panalytical X'Pert3)对样品进行测试，设置仪器扫描范围为5～80°(2θ)。

图3为PPS、PPS-NCTD和PPS-NCTD-MTX的X射线衍射光谱图；根据图3可以看出，PPS在2θ≈19.72°处有一个宽的峰，属于非晶体材料的粉末衍射图样，具有非晶态性质的多糖是更加稳定的。PPS-NCTD的图谱没有出现新的峰，在2θ≈18.95°处呈弥散状态，NCTD修饰到PPS糖环上对其没有很大的影响。而PPS-NCTD-MTX的图谱就明显不同，出现了许多新的小衍射峰，如在2θ≈10.92、18.5、26.88°，这些峰是属于MTX的。结果表明，MTX成功地负载到PPS-NCTD偶联物上。

4、表面形貌测试

取适量实施例1制备的PPS-NCTD和PPS-NCTD-MTX样品粘贴在双面碳带上，镀金，使用扫描电子显微镜(Nova NanoSEM 450)对样品的微观形貌观察。

图4为PPS-NCTD和PPS-NCTD-MTX偶联物放大10000×和20000×的表面形貌图；根据图4可以看出，本发明制备的PPS-NCTD为疏松多孔状的形貌，而PPS-NCTD-MTX的形貌有所不同，MTX的接枝使多孔结构受到破坏，形成了许多不规则的碎片，中间产物的交联结构发生了变化。

测试例2体外释放实验

用不同pH(pH值分别为5.0、6.5和7.4)的磷酸盐缓冲溶液将实施例1制备的PPS-NCTD-MTX偶联物粉末配置成1mg/mL的溶液，将其转移至透析装置中。设置孵育温度为37℃、转速为80rpm的摇床中进行释放，在不同的时间间隔点，从透析管中取出4mL的缓冲液放入5mL的离心管中，然后补充4mL的新鲜缓冲溶液。释放结束后，通过紫外可见分光光度计测量302nm处的吸光度，利用累计释放量公式计算MTX的含量。

通过测得数据绘制MTX的累计释放曲线，结果如图5所示。根据图5可以看出，PPS-NCTD-MTX中的MTX可以在不同pH下从药物体系中释放出来，并且在pH＝6.5时，MTX的释放速率最快，因为癌细胞周围的微环境是显弱酸性的，所以PPS-NCTD-MTX药物体系可以作为潜在的靶向pH的抗癌药物。

测试例3细胞增殖实验

将人乳腺癌细胞(MCF-7)、人非小细胞肺癌细胞(A549)、人正常肝细胞(LO-2)、人宫颈癌细胞(HeLa)和人卵巢癌细胞(SKOV3)分别孵育在1640培养基或DMEM培养基在中，在37℃恒温培养箱中孵育生长24h，消化收集细胞，计量细胞密度，按照每孔100μL，约3500个细胞加入96孔板中，孵育生长24h。

采用PPS、NCDT、MTX、实施例1制备的PPS-NCTD以及实施例1制备的PPS-NCTD-MTX的测试样品，每孔分别加入100μL、样品浓度在0～2000μg/mL的1640培养基或DMEM培养基，继续孵育48h后加入20μL 5mg/mL的MTT新鲜溶液，再继续培养4h。细胞沉淀在孔的底部，吸出上清液，加入200μL的二甲基亚砜溶液，摇匀后立即用酶标仪测定490nm(OD490)处的吸光度。

使用Excel和SPSS等软件处理数据，计算出细胞最大半致死数IC₅₀，通过Origin绘制图形，能够更直观地进行比较数据，最终所得结果如图6所示；根据图6可以看出，PPS对LO-2细胞几乎无毒性，而NCTD和MTX对五株细胞的毒性都比较大，所以通过携带小剂量的药物达到类似的细胞毒性是非常有必要的策略；PPS-NCTD对LO-2、MCF-7、HeLa、A549和SKOV3细胞的IC₅₀值分别为64.0、42.64、80.2、93.28和90.8μg/mL，数值上可以对比看出其对癌细胞有明显的抑制作用，而PPS-NCTD-MTX对五株细胞的毒性都比PPS-NCTD强。而单独的NCTD和MTX对五株细胞的毒性虽然均较强，但是药物剂量较大，采用PPS-NCTD-MTX偶联物时，NCTD和MTX是偶联在PPS上，能够在显著减少药物剂量的同时得到良好的肿瘤抑制效果。综上表明，本发明提供的双药协同多糖药物体系可以抑制肿瘤的生长，减少了药物使用剂量。

以上实施例结果表明，本发明制备的PPS-NCTD-MTX偶联物药物体系可以在弱酸环境下实现释放，由于这一特点可以更好的作用于癌细胞，为多糖携带药物小分子形成复合物奠定一定的研究基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将马齿苋多糖、苯磺酸水溶液和去甲基斑蝥素混合进行酯化反应，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物；

将所述马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物、甲氨蝶呤、2-吗啉乙磺酸缓冲溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合进行酰胺缩合反应，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物；

所述马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物具有式I所示结构：

式I中，n表示聚合度；

所述马齿苋多糖和去甲基斑蝥素的质量比为1:(0.5~1)；

所述酰胺缩合反应的过程具体包括：将甲氨蝶呤、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中后进行搅拌活化，得到甲氨蝶呤活化液；将马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物溶液；将所述甲氨蝶呤活化液加入所述马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物溶液中进行酰胺缩合反应。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酯化反应的温度为25~50℃，时间为36~60h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甲氨蝶呤和马齿苋多糖-去甲基斑蝥素偶联物的质量比为(0.2~0.5):1；

所述酰胺缩合反应的温度为37~50℃，时间为36~60h，所述酰胺缩合反应在氮气保护和避光条件下进行。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为3:(1~3)；所述搅拌活化的时间为30~90min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酰胺缩合反应完成后，还包括将所得产物料液在PBS缓冲液中进行透析，将透析后的液体进行冷冻干燥，得到马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物粉末。

6.权利要求1~5任意一项所述制备方法制备的马齿苋多糖-去甲基斑蝥素-甲氨蝶呤偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括乳腺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌和卵巢癌中的一种或多种。