CN115919915A - 鬼针草或鬼针草提取物在医学中的新应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鬼针草或鬼针草提取物在医学中的新应用。所述鬼针草或鬼针草提取物可用于预防或治疗肠道病毒71型感染或者治疗由肠道病毒71型引起的手足口病。本发明通过大量的研究，意外发现鬼针草提取物在具备较低细胞毒性的同时，对肠道病毒71型具有显著抑制作用，发明人采用CPE观察法进行测定，并结合MTT法进行验证，表明鬼针草提取物在治疗、预防和直接杀毒模式下均对肠道病毒71型具有显著抑制效果，预示其具有广阔的治疗手足口病的临床应用前景。

Description

鬼针草或鬼针草提取物在医学中的新应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及鬼针草或鬼针草提取物在医学中的新应用。

背景技术

肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV-71)是单股正链RNA病毒，全基因组长度约7500个碱基，属于小RNA病毒科肠道病毒属，其感染可引起包括T细胞系、人胚胎横纹肌瘤细胞(human embryonal rhabdomyosarcoma cell line，RD)、胶质母细胞瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、Hela细胞、T淋巴细胞和人微血管内皮细胞系等在内的多种细胞凋亡，一旦EV-71进入宿主细胞内，其RNA的翻译就开始启动，产生的病毒蛋白参与病毒RNA的复制，并通过胱冬酶9活化的线粒体途径诱导细胞凋亡。

EV-71作为手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的主要病原体之一，是目前威胁儿童健康的重要病原体，其感染性强、致病率高，神经毒性仅次于脊髓灰质炎病毒。除引发手足口症状外，还可以引起疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样的麻痹性疾病、神经源性肺水肿或肺出血、心肌炎、急性呼吸道疾病等多种疾病。其中枢神经系统症状主要表现为肌震颤、共济失调、颅神经受累乃至心肺功能衰竭，患儿可能留下永久性神经系统后遗症甚至死亡。而另一类严重并发症为肺水肿或出血，表现为患儿发病后数天内突然发生心动过速、呼吸困难、紫绀和休克，出现双侧对称性非心源性肺水肿，这可能与脑干组织特定结构被破坏、植物神经功能紊乱有关。EV-71感染能引发广泛的临床症状，表现为口腔黏膜、手和足等多部位孢疹，已有大量客观证据表明重症EV-71感染的病变与神经系统的病变高度相关性，而且还有研究表明疾病的严重程度与病毒感染的路径和模式相关。

EV-71传播活跃，主要感染5岁以下的儿童及婴儿，多数情况下患儿表现出的病症为局部性的疱疹炎症和轻微的发热，通常能够自愈。然而，在发生EV-71重症感染时，患儿体内的炎症因子风暴会被激活，导致脑炎、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎等等一系列炎性病症的产生，致使患儿心肺功能衰竭甚至死亡。目前，临床上对于EV-71重症感染的治疗主要通过免疫球蛋白、糖皮质激素、干扰素等广谱抗病毒药物的注射来实现，而这些治疗手段的效果非常有限。在面对EV-71重症感染时，仍没有治疗效果较好的特效药物。因此，用于EV-71感染的治疗药物开发工作刻不容缓。

鬼针草又名金盏盘、三叶鬼针草，鬼骨针，婆婆针，是一年生草本，为菊科植物鬼针草(bidens pilosa L.)的全草。鬼针草是一种很常见的中草药，在《本草拾遗》和《泉州本草》两本中草药书明确对其记载，分别是：味苦，平，无毒；性温，味苦，无毒。其具有清热解毒，祛风除湿，活血消肿之功效。用于咽喉肿痛，泄泻，痢疾，黄疸，肠痈，疔疮肿毒，蛇虫咬伤，风湿痹痛，跌打损伤。随着临床的发展和研究，对鬼针草更多的作用也在开发中，以期望获得更多对人类有益的用途。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提出鬼针草及其提取物在医学中的新应用。

包括如下技术方案。

本发明的第一个方面，是提供了鬼针草或鬼针草提取物在制备预防或者治疗肠道病毒71型感染的药物中的应用。

在其中一些实施例中，所述鬼针草提取物为鬼针草提取物的水提取物或者醇提取物。

本发明的第二个方面，是提供了一种预防或者治疗肠道病毒71型感染的制剂，其包括以鬼针草或鬼针草提取物的活性成分。

在其中一些实施例中，所述鬼针草提取物为鬼针草的水提取物、和/或有机溶剂提取物，优选地，有机溶剂可为醇类，例如甲醇或者乙醇。

本发明中，所述鬼针草提取物可以为本领域技术人员常规所知的任一种提取方法获得的相应提取物。

在其中一些实施例中，所述鬼针草的水提取物为：取干燥的鬼针草全草，经粉碎后，加8～12倍量的纯净水，在98℃～100℃的恒温水浴锅中加热1～1.5小时，过滤后得到的药渣再加8～12倍量的纯净水加热1～1.5小时，合并滤液，即得。

在其中一些实施例中，所述制剂为膳食补充剂或药物。

在其中一些实施例中，所述制剂包括但不限于水剂、颗粒、粉末、胶囊或膏剂。

本发明的第三个方面，是提供了上述制剂在制备预防或者治疗手足口病的药物中的应用。

本发明的第四个方面，是提供了鬼针草或鬼针草提取物在制备预防或者治疗手足口病的药物中的应用。

本发明的发明人及课题组团队在进行中药及病毒学探索研究时，意外发现鬼针草提取物在具备较低细胞毒性的同时，对肠道病毒71型具有显著抑制作用，经进一步研究发现，当鬼针草提取物浓度低至1.953mg/mL(1/512)时，分别在治疗模式、直接杀毒模式、预防模式下，其均对肠道病毒71型具有显著抑制作用；当鬼针草提取物浓度低至0.488mg/mL(1/2048)时，分别在治疗模式、直接杀毒模式下，其均对肠道病毒71型仍具备有效抑制作用。表明鬼针草提取物在体外细胞水平上具有抑制肠道病毒71型的致细胞病变作用，预示其具有广阔的治疗手足口病的临床应用前景。

附图说明

图1为实施例1中鬼针草提取物对RD细胞的细胞毒性测定CPE结果。

图2为实施例1中鬼针草提取物对RD细胞的细胞毒性测定MTT统计图。

图3为实施例1中利巴韦林对RD细胞的细胞毒性测定CPE结果。

图4为实施例1中利巴韦林对RD细胞的细胞毒性测定MTT统计图。

图5为实施例2中鬼针草提取物对EV-71感染细胞病变效应的影响结果，其中A为EV71感染后给药方式下的MTT结果统计图，B为鬼针草提取物与EV71同时作用后的MTT结果统计图，C为EV71感染前给药方式下的MTT结果统计图。

图5D为EV71感染后给药方式下的CPE结果图。

图5E为鬼针草提取物与EV71同时作用后的CPE结果图。

图5F为EV71感染前给药方式下的CPE结果图。

图6为实施例2中鬼针草提取物在三种加药方式下对EV-71VP1 RNA相对含量的影响检测统计结果。

图7为实施例2中鬼针草提取物在治疗模式下对EV-71不同作用时间下的CPE结果图。

图8为实施例2中鬼针草提取物在治疗模式下对EV-71不同作用时间下的VP1 RNA相对含量的检测统计结果。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1鬼针草提取物的细胞毒性作用

1.材料

鬼针草提取物的制备：精确称取干燥的鬼针草全草70g，用中药材粉碎机粉碎，加10倍量的纯净水，在100℃的恒温水浴锅加热，加热一小时后，用纱布包裹药渣过滤，药渣再加10倍量纯净水后加热一小时，再用纱布包裹药渣过滤，合并滤液，通过两次布氏漏斗抽滤，将滤液使用旋转蒸发仪浓缩至70mL，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后作为药物原液(1g生药量/mL)，分装使用。

阳性对照药物：利巴韦林(粉剂，购自sigma)。

阳性对照药物的前期处理方法：采用灭菌过的PBS缓冲液进行配制成1mg/ml的药液。

细胞与病毒

EV-71手足口病毒和RD细胞(人恶性胚胎横纹肌瘤细胞)由广东省疾病预防控制中心提供，用细胞培养液培养。其中，细胞培养液(GM)为含10％血清的MEM培养液，细胞维持液(MM)为含2％血清的MEM培养液。

2.方法

2.1鬼针草提取物对RD细胞的毒性测定

2.1.1实验步骤

RD细胞接种于96孔板，细胞浓度约为1×10⁵/mL，100μL/孔，置36℃，5％CO₂培养箱中过夜培养至长成单层细胞。次日，弃掉培养液，加入细胞维持液(MM)100μL，并将鬼针草提取物和阳性对照药物(利巴韦林)用细胞维持液稀释(鬼针草提取物稀释成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128的7个梯度)，分别加入已长成单层RD细胞的96孔培养板中，每孔100μL，每个滴度设三孔，同时设立正常细胞对照组，置36℃、5％CO₂培养箱培养，采取CPE法每日在倒置显微镜下观察细胞形态，连续观察7天。Reed-Muench法计算求出药物的最大无毒浓度(TD0)，试验重复三次。

2.1.2实验结果

细胞病变效应(CPE)观察结果如下图1和表1-1所示，鬼针草提取物稀释度从1:2稀释度至1:64稀释度组的大部分细胞变形脱落，表明此等浓度药物菌对细胞的毒性依然较强，在稀释度为1:128时细胞表面形态完好无损，生长正常且与细胞对照组(cell组)比无差异。因此我们选取1:128稀释度定位最大无毒性稀释度，作为鬼针草提取物抗病毒活性检测的起始有效浓度。

表1-1鬼针草提取物对RD细胞的毒性试验CPE结果

注：“－”表示阴性，细胞无病变；“+”表示阳性，细胞表示病变，下同。

利巴韦林对RD细胞的毒性测定试验中，细胞病变效应(CPE)观察结果如下图2和表1-2所示，高浓度利巴韦林对RD细胞生长抑制作用显著，当1mg/mL利巴韦林溶液稀释至1:8时，细胞形态与对照组相比，基本一致。因此将1:8稀释度定位利巴韦林的最大无毒稀释度。

表1-2利巴韦林对RD细胞的毒性试验CPE结果

为了进一步对上述CPE结果进行验证，同时进行了MTT试验，检测EV-71经药物预处理后感染细胞作用后的细胞存活率。取RD细胞，接种到96孔细胞培养板中，每孔1.5×10⁵个，待细胞长满单层，用PBS清洗1遍，加不同浓度的鬼针草提取物(用维持液稀释)，每个浓度3个重复，培养48h，取出。

MTT法：每孔加入5mg/mL的MTT液1mL；继续培养4h。取出，每孔加入DMSO液150μl，将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值(检测波长490nm)。MTT检测结果如图3-4所示，与CPE结果一致，当利巴韦林稀释至1：16时(62.5mg/mL)时，鬼针草在稀释至1/128时，细胞存活率大于50％，通过Graph pad作图，计算得出利巴韦林(1g/mL)对RD细胞的CC50为64.4mg/mL，鬼针草(1g/mL)对RD细胞的CC50为8.83mg/mL，为便于后续试验操作，因此以鬼针草提取物稀释128倍，作为进行抗病毒作用检测的初始浓度，即给药浓度为7.81mg/mL。

实施例2鬼针草提取物的抗病毒作用

1、肠道病毒EV-71的毒力测定

第一天：将生长状态良好的RD细胞消化计数后稀释至1×10⁶/mL，加入96孔板，100μL/孔，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养；

第二天：加病毒，将EV-71做梯度稀释10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8连续6个稀释度，吸去96孔板中原有的培养基，加入稀释好的病毒液；

第三天：追加培养液在每个孔再加入100μL MM，利于细胞的生长，连续观察细胞状态并记录，每日在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)，用Reed-Muench两氏法计算病毒TCID50。

用Reed-Muench两氏法测定病毒滴度，结果如表2-1所示：

表2-1 Reed-Muench两氏法测定病毒滴度

距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)。

LgTCID50＝距离比例*稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数

EV-71：

距离比例＝(90-50)/(90-22.2)＝0.56

LgTCID₅₀＝Log10^-7+0.56×(-1)＝-7.56

TCID₅₀＝10^-7.56/100μL

100TCID₅₀＝10^-5.56/100μL。

2、设3种给药方式组分别体外模拟治疗模式、直接杀毒模式和预防模式，采用CPE法与MTT法相结合测定鬼针草提取物抗EV-71的作用效果。其中每种给药方式组包括药物组(实施例1所述鬼针草提取物100μL)、细胞对照组(100μLMM)、病毒对照组(EV-71的100TCID₅₀病毒液50μL+50μLMM)，阳性药物组(1/16利巴韦林，0.0625mg/mL)。药物浓度根据药物对细胞毒性试验结果选择，以无细胞毒性的最高药物浓度为起始浓度，根据药物浓度，药物组作1/128、1/256、1/512、1/1024、1/2048、1/4096共6个药物浓度。

(一)治疗模式(病毒先吸附后加药组)

取RD细胞，接种到96孔细胞培养板中，每孔约1.5×10⁵个，待细胞长满单层，经PBS清洗后，加100TCID50病毒液，每孔50μL，37℃5％CO₂培养箱孵育1.5h，取出，加入安全浓度内的鬼针草提取物，每个浓度3个重复，另设细胞对照和病毒对照，37℃5％CO₂培养箱培养5-7天，倒置显微镜拍照细胞病变(CPE)，同时采用MTT法测定细胞活力。

(二)直接杀病毒模式(药物与病毒同时处理组)

取RD细胞，接种到96孔细胞培养板中，每孔约1.5×10⁵个，待细胞长满单层，经PBS清洗后，加100TCID50病毒液，每孔50μL，同时加入安全浓度内的鬼针草提取物，每个浓度3个重复，37℃5％CO₂培养箱共同孵育1.5h，取出，每孔加入MM，另设细胞对照和病毒对照，37℃5％CO₂培养箱培养5-7天，倒置显微镜拍照细胞病变(CPE)，同时采用MTT法测定细胞活力。

(三)预防模式(药物预处理病毒后加入组)

取RD细胞，接种到96孔细胞培养板中，每孔约1.5×10⁵个，待细胞长满单层，经PBS清洗后，加入安全浓度内的鬼针草提取物，每个浓度3个重复，37℃5％CO2培养箱放置24h，取出，加100TCID50病毒液，每孔50μL，37℃5％CO2培养箱培养加入安全浓度内的鬼针草提取物，每个浓度3个重复，另设细胞对照和病毒对照，37℃5％CO₂培养箱孵育1.5h，取出，每孔加入MM，37℃5％CO₂培养箱培养5-7天，倒置显微镜拍照细胞病变(CPE)，同时采用MTT法测定细胞活力。

上述三种给药方式的检测结果分别如图5所示。其中，治疗模式和直接杀毒模式下的CPE及MTT结果如图5和图5D所示。结合MTT结果可知，在1/128、1/256、1/512、1/1024、1/2048稀释度下的鬼针草提取物组与病毒组相比，细胞存活率具有显著统计学差异(p<0.05)，说明在治疗模式和直接杀毒模式下，低至0.488mg/mL(1/2048)的鬼针草提取物均可有效起到抗EV-71的作用；预防模式下的CPE及MTT结果如图5E和图5F所示，经t检验，在1/128、1/256、1/512稀释度的鬼针草提取物组与病毒组相比，细胞存活率具有显著统计学差异(p<0.05)，说明在预防模式下，浓度低至1.953mg/mL(1/512)鬼针草提取物可以起到抗EV-71作用。

进一步地，运用GraphPad计算出各个给药方式下，鬼针草提取物的EC50(能够有效抑制50％细胞感染病毒的药物浓度)，CC50(使得50％的细胞发生病变时的药物浓度)和SI指数，其中选择指数(SI)为CC50/IC50，指判断药物效果的安全范围，选择指数(SI)选择指数大于1.00以上为有效，指数越大安全范围越大。

表2-2不同给药方式下选择指数

且上述实验表明，当鬼针草提取物浓度为7.81mg/mL(稀释倍数：1/128)时，采用上述三种模式，均对肠道病毒71型具有良好的抗病毒效果。由于VP1是EV-71重要结构蛋白，因此检测VP1的表达水平可代表细胞受病毒感染水平。为进一步比较鬼针草提取物在病毒感染的不同给药方式的抗病毒活性，收集上述三种给药方式下，加药剂量为7.81mg/mL(稀释倍数：1/128)下的对应孔中培养物，提取总RNA，采用如下表2-3所示引物组合，检测VP1的表达水平。本实验同时设置阳性对照组(利巴韦林，0.0625mg/mL)和病毒对照组。

表2-3 PCR引物序列

目的基因	引物序列	SEQ ID NO.
			GAPDH-forword primer	5'-AGGGCAATGCCAGCCCCAGCG-3'	1
GAPDH-reverse primer	5'-AGGCGTCGGAGGGCCCCCTC5'-3'	2
			VP1-forword primer	5'-AATTGAGTTCCATAGGTG-3'	3
VP1-reverse primer	5'-CTGTGCGAATTAAGGACAG-3'	4

上述检测结果如表2-4和图6所示。经t检验，阳性对照药物利巴韦林与病毒组相比，具有显著性差异(p<0.05，鬼针草提取物与病毒组相比，具有显著性差异(p<0.05)。PCR实验进一步确定了鬼针草提取物在三种给药方式下均具有抗EV-71作用。

表2-4三种给药方式下VP1相对含量

分组	病毒空白组	利巴韦林	鬼针草
				治疗模式	0.92±0.11	0.09±0.03	0.09±0.06
直接杀病毒模式	1.02±0.08	0.11±0.08	0.07±0.07
				预防模式	1±0.05	0.83±0.08	0.64±0.04

结合上述数据表明，鬼针草提取物对EV-71在治疗模式下具有显著效果，VP1是EV71重要结构蛋白，它是反应EV71复制的特异性指标。此外，VP1还能够在EV71结合、进入靶细胞以及病毒装配等方面发挥重要作用，近年研究表明，EV71中VP1的表达水平还可影响其神经毒力。本实验采用荧光定量PCR方法对三种给药方式下VP1基因的表达量进行检测。发现鬼针草均能降低VP1基因的表达。实验进一步验证了鬼针草抗EV71的作用，同时，实验表明鬼针草水提物可通过抑制VP1基因的表达来抗EV71。

同时，本研究发现，病毒感染后加入药物组，1.98mg/mL和0.95mg/mL的鬼针草提取物处理的感染细胞组存活率分别为(118.8±6.31)％和(118.04±1.32)％，显著高于空白对照组(p<0.05)。这种由一定浓度的鬼针草提取物处理的感染病毒的细胞，细胞存活率高于空白对照组的现象，其原因可能是鬼针草提取物中含有丰富的氨基酸、维生素及矿物质，特别是其中含有的儿童必须氨基酸—组氨酸和含量最高的谷氨酸，具有促进细胞生成的作用，因此，一定浓度的鬼针草提取物或许不仅可以抗EV71，还可以营养RD细胞，从而在一定程度上提高其细胞活性。鬼针草在民间有小儿参之称，可治小儿营养不良，如果将其应用到对小儿感染EV71的治疗中，或许可以有事半功倍的作用。

进一步地在治疗模式下，发明人通过进行给药时序实验测定(Time-of-additionassay)实验进一步地探讨鬼针草提取物对EV71的抗病毒作用机制，主要步骤如下：

1).将RD细胞接种于6孔板，密度为2.5×10⁵个/孔，每孔3mL，在5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养生长至单层。

2).弃培养基，用PBS缓冲液洗两遍后，每孔加入1mL 100TCID50病毒培养2h。

3).弃病毒液，采用PBS清洗两次，用浓度为1/128的鬼针草提取物(MM稀释)在病毒感染后不同时间段(0-2，2-4，4-6，6-8h)加入，其他时间段换成GM，并以0-8h未给药病毒感染作为对照。

4).待细胞病变后(约24小时)，弃去上清，用PBS清洗2遍后，收集6个孔中培养物。参考上述步骤，提取总RNA，采用上表2-3所示引物组合，检测VP1的表达水平。

上述检测结果如图7-8所示。结合图7CPE结果可知，随着鬼针草提取物作用时间点的延迟，RD细胞存活质量显著下降，进一步地，结合PCR结果，如图8统计可知，与病毒对照组相比，在不同时间点加入鬼针草提取物后，VP1基因表达量均较空白组减少，表明其在不同时间点内，均对EV71具备一定抑制作用。

此外，EV71的生命周期包括病毒的吸附，病毒基因组翻译，复制，病毒蛋白合成，病毒颗粒的组装和释放等多个环节，一个生命周期大约8小时。本实验在病毒感染后8小时内不同时间段加入鬼针草水提物，发现不同时间段加鬼针草提取物均可降低VP1基因表达量，差异具有显著性。且0-2h与2-4h加药组VP1基因表达量较4-6h与6-8h加药组更低。这说明鬼针草提取物可能在EV71复制周期的前期阶段作用效果更好。

即结合本试验可进一步表明，在治疗模式下，鬼针草提取物作用时间点越早，对EV-71的抗病毒效果越好。

在本发明中，为了观察鬼针草提取物对EV-71的作用，设立了细胞空白对照组和病毒对照组，即使培养基中可能出现的交互效应，通过设立对照可以消除。采用CPE观察法进行测定，并结合MTT法进行验证。本发明试验结果表明，当鬼针草提取物浓度低至1.953mg/mL(1/512)时，分别在治疗模式、直接杀毒模式、预防模式下，其均对肠道病毒71型具有显著抑制作用；当鬼针草提取物浓度低至0.488mg/mL(1/2048)时，分别在治疗模式、直接杀毒模式下，其均对肠道病毒71型仍具备有效抑制作用，充分表明鬼针草提取物在体外细胞水平上具有抑制EV-71的致细胞病变的作用，预示其具有广阔的临床应用前景。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.鬼针草或鬼针草提取物在制备预防或者治疗肠道病毒71型感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鬼针草提取物为鬼针草提取物的水提取物或者醇提取物。

3.一种预防或者治疗肠道病毒71型感染的制剂，其特征在于，包括以鬼针草或鬼针草提取物的活性成分。

4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述鬼针草提取物为鬼针草的水提取物、和/或有机溶剂提取物，优选地，所述有机溶剂为醇类。

5.根据权利要求4所述制剂，其特征在于，所述鬼针草的水提取物为：取干燥的鬼针草全草，经粉碎后，加8～12倍量的纯净水，在98℃～100℃的恒温水浴锅中加热1～1.5小时，过滤后得到的药渣再加8～12倍量的纯净水加热1～1.5小时，合并滤液，即得。

6.根据权利要求3-5任一项所述制剂，其特征在于，所述制剂为膳食补充剂或药物，其剂型为水剂、颗粒、粉末、胶囊或膏剂。

7.权利要求3-6任一项所述制剂在制备预防或者治疗手足口病的药物中的应用。

8.鬼针草或鬼针草提取物在制备预防或者治疗手足口病的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述鬼针草提取物为鬼针草提取物的水提取物或者醇提取物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为水剂、颗粒、粉末、胶囊或膏剂。

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