CN115876930A

CN115876930A - 醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的hplc检测方法

Info

Publication number: CN115876930A
Application number: CN202310197199.0A
Authority: CN
Inventors: 魏学立; 王爱霞; 刘钢
Original assignee: Zibo Baiji Rongchuang Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Zibo Baiji Rongchuang Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2023-03-03
Filing date: 2023-03-03
Publication date: 2023-03-31

Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，所述方法包括用二氯甲烷萃取盐酸羟胺的水溶液，取水层在酸性条件下与苯甲醛衍生化制成对照品溶液；取待测品用二氯甲烷溶解，用水萃取，在酸性条件下，与苯甲醛衍生化制成供试品溶液；取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，在柱温：35℃‑45℃；流速：0.9‑1.1mL/min；进样体积：9‑11μL；检测波长：252‑256nm；条件下检测，记录色谱图，按限度检查法，比较供试品溶液与对照品溶液中对应盐酸羟胺的峰面积，以此评估盐酸羟胺的含量。

Description

醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法。

背景技术

醛（酮）肟反应中经常会用到盐酸羟胺，盐酸羟胺的残留，导致产品中存在该杂质的残留。该杂质具有基因毒性。目前对于盐酸羟胺的检测，主要有TLC法，离子色谱-电化学法，高效液相色谱串联质谱法，离子色谱柱后补液-脉冲安培法。TLC法检测灵敏度低，不能准确反映样品中盐酸羟胺的残留量，其他分析检测方法需要具备专门的分析检测设备，工厂实验室往往不能满足条件。

柱前衍生测定中没有紫外吸收或者吸收较弱的化合物，往往会因产物中存在的相关醛（酮）类杂质干扰，影响盐酸羟胺的测定，导致分析方法开发与样品检测的失败。为了更好的控制产品（尤其医药中间体或原料药）的安全性，在生产过程中建立HPLC方法，对该杂质进行有效控制，因此，提出了一种醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法。

发明内容

根据以上现有技术中的不足，本发明提供一种醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，能够高效、经济的检测醛（酮）肟反应中潜在的盐酸羟胺含量。

基因毒性杂质在产品中的安全限度主要根据ECHA数据库中毒性数据或药理毒理实验进行制定，其具体制定方法参考ICH《M7：评估和控制药物中DNA反应性（致突变）杂质以限制潜在致癌风险》，计算方法如下：

盐酸羟胺的NOAEL值最小为3.29mg/kg×bw/day（rat）；

ICH《M7：评估和控制药物中DNA反应性（致突变）杂质以限制潜在致癌风险》PDE计算公式：

；

根据毒理数据：

F1为物种间差异因子：从大鼠外推到人，故F1值取5；

F2为个体差异因子：本指导原则中一律为10，故F2值取10；

F3为短期暴露的毒性研究的可变因子：未查到相关数据，故按照严格的F3值取10；

F4为非遗传毒性致癌性、神经毒性或致畸性等严重毒性的情况下可应用的因子：未查到相关数据，故按照严格的F4值取10；

F5为未确定无反应水平时可应用的可变因子：因该化合物可以查到NOAEL值，故F5值取1；

计算盐酸羟胺的PDE值为：

=0.0329mg/day；

按照剂量为200mg/7day计算，所以盐酸羟胺的限度为：

×100=0.115%；

为了保证安全性，将该限度订为0.1%。

在本发明中，待测品的结构为：

。

其中，含有的醛类杂质的结构为：

。

检测盐酸羟胺含量时，为了避免醛类杂质干扰盐酸羟胺的测定，采用样品前处理手段即萃取操作，将萘醛类杂质与盐酸羟胺分离；

为了进一步排除萘醛类杂质与盐酸羟胺反应的可能性，萘醛类杂质与盐酸羟胺反应活性低于苯甲醛，衍生化在室温条件下进行，温度控制到25℃左右，衍生化时间控制在15min以上。

衍生化方法测定基因毒性杂质盐酸羟胺的原理为：醛基与盐酸羟胺反应生成肟，具体如下：

。

本发明所述的醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，包括以下步骤：

（1）空白溶液制备：

量取二氯甲烷，置于量瓶中，加水稀释，上下振摇，静置备用；

取水层，置于量瓶中，加入乙酸溶液，加入苯甲醛溶液，混合反应，加乙腈稀释，摇匀；

（2）对照品溶液制备：

量取盐酸羟胺溶液，置于量瓶中，加入二氯甲烷，用水稀释，上下振摇，静置备用；

取水层，置于量瓶中，加入乙酸溶液，加入苯甲醛溶液，混合反应，加乙腈稀释，摇匀，获得每1mL中含1.2-1.8μg盐酸羟胺衍生物的对照品溶液；

（3）供试品溶液制备：

取待测品，置于量瓶中，加入二氯甲烷，用水稀释，上下振摇，静置备用；

（4）色谱条件：

采用高效液相色谱仪进行检测；

检测器：DAD检测器；

色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；对色谱柱的柱温、流速、进样体积、检测波长进行参数设置；

洗脱方式：梯度洗脱；

流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液；

（5）测定方法：

分别精密量取所述空白溶液、对照品溶液、供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算盐酸羟氨的含量。

进一步的，所述梯度洗脱时间为20min，所述梯度洗脱程序如下：

时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%)

0 75 25

11 75 25

12 0 100

15 0 100

15.1 75 25

20 75 25。

进一步的，所述甲酸水溶液为0.05%体积浓度的甲酸水溶液；所述甲酸乙腈溶液为0.05%体积浓度的甲酸乙腈溶液。

进一步的，所述柱温为35-45℃。

进一步的，所述流速为0.9-1.1mL/min。

进一步的，所述注入液相色谱仪的体积为9-11μL。

进一步的，所述乙酸溶液为1%体积浓度的乙酸溶液。

进一步的，所述苯甲醛溶液的溶剂为乙腈，所述苯甲醛溶液为0.05%体积浓度的苯甲醛溶液。

进一步的，所述采用高效液相色谱仪进行检测的检测波长为252-256nm。

本发明的有益效果如下：

本发明采用了HPLC检测方法对醛（酮）肟反应中盐酸羟胺进行检测，方法学验证结果符合要求；盐酸羟胺可以与醛、酮化合物中的羰基以及苯肼中的氨基进行亲核加成反应，生成苯甲醛肟，该化合物的分子结构中均存在较大的π-π共轭体系，在紫外-可见光光区有特征吸收；并且在样品前处理过程中使用萃取手段，将样品中存在的盐酸羟胺与样品得到分离，方法回收率在80-120%范围内，避免了样品基质或样品中存在的结构类似物发生副反应，影响盐酸羟胺的测定；本方法能够专属、快速、有效、经济的检测醛（酮）肟反应中潜在的盐酸羟胺，以便更好的控制药物的质量。

本发明还采用甲酸溶液作为流动相，该流动相不易引起基线的漂移，并且对色谱柱寿命没有影响，分析方法具有更好的经济性；采用甲酸溶液作为流动相，酸性更弱，能够减少色谱柱中苯甲醛肟产物向苯甲醛的逆向反应，增加苯甲醛肟检测的灵敏度。

附图说明

图1为本发明中实施例2的空白溶剂色谱图；

图2为本发明中实施例2的对照品溶液色谱图；

图3为本发明中实施例2的供试品溶液色谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

稀释剂为乙腈；盐酸羟胺对照品为麦克林C13219156，含量为99%，是上海麦克林生化科技股份有限公司的市售产品；

盐酸羟胺贮备液：取盐酸羟胺对照品适量，加水溶解，并定量稀释成每1mL含1mg的溶液。

盐酸羟胺溶液：精密量取盐酸羟胺贮备液3mL，用水定量稀释成每1mL含盐酸羟胺30μg的溶液。

1%乙酸溶液：取乙酸0.5mL，用水定量稀释成每100mL含乙酸1mL的溶液。

苯甲醛贮备液：取苯甲醛5mL，用乙腈稀释成每100mL含苯甲醛为5mL的溶液。

0.05%苯甲醛溶液：精密量取苯甲醛贮备液，用乙腈稀释成每100mL含苯甲醛0.05mL的溶液。

空白贮备液：精密量取二氯甲烷2mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，上下强力振摇30次，静置，备用。

空白溶液：取空白贮备液水层4mL，置10mL量瓶中，加1%乙酸溶液20μL，加苯甲醛溶液3mL，混合均匀后，室温反应15min，加乙腈稀释至刻度，摇匀。

对照品贮备液：精密量取盐酸羟胺溶液0.8mL，置10mL量瓶中，精密加二氯甲烷2mL，用水稀释至刻度，上下强力振摇30次，静置，备用。

对照品溶液：取对照品贮备液水层4mL，置10mL量瓶中，加1%乙酸溶液20μL，加苯甲醛溶液3mL，混合均匀后，室温反应15min，加乙腈稀释至刻度，摇匀。

供试品贮备液：取化合物约24mg，置10mL量瓶中，精密加二氯甲烷2mL使溶解，用水稀释至刻度，上下强力振摇30次，静置，备用。

供试品溶液：取供试品贮备液水层4mL，置10mL量瓶中，加1%乙酸溶液20μL，加苯甲醛溶液3mL，混合均匀后，室温反应15min，加乙腈稀释至刻度，摇匀。

精密量取空白溶液，对照品溶液，供试品溶液各9μL，注入液相色谱仪。

色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为35℃，以0.05%甲酸水溶液为流动相A，以0.05%甲酸乙腈为流动相B按下如下梯度洗脱程序进行洗脱，

时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%)

0 75 25

11 75 25

12 0 100

15 0 100

15.1 75 25

20 75 25。

运行时间20min；流速0.9mL/min，检测波长为252nm，记录色谱图。

空白溶液色谱图在对照品溶液色谱图盐酸羟胺衍生物保留时间处，无色谱峰。

记录供试品与对照品溶液中盐酸羟胺衍生物色谱峰面积并对峰面积进行比较。

实施例2

对照品贮备液：精密量取盐酸羟胺溶液1mL，置10mL量瓶中，精密加二氯甲烷2mL，用水稀释至刻度，上下强力振摇30次，静置，备用。

供试品贮备液：取化合物约30mg，置10mL量瓶中，精密加二氯甲烷2mL使溶解，用水稀释至刻度，上下强力振摇30次，静置，备用。

精密量取空白溶液，对照品溶液，供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪。

色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为40℃，以0.05%甲酸水溶液为流动相A，以0.05%甲酸乙腈为流动相B按下如下梯度洗脱程序进行洗脱，

时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%)

0 75 25

11 75 25

12 0 100

15 0 100

15.1 75 25

20 75 25。

运行时间20min；流速1.0mL/min，检测波长为254nm，记录色谱图。

实施例3

对照品贮备液：精密量取盐酸羟胺溶液1.2mL，置10mL量瓶中，精密加二氯甲烷2mL，用水稀释至刻度，上下强力振摇30次，静置，备用。

供试品贮备液：取化合物约36mg，置10mL量瓶中，精密加二氯甲烷2mL使溶解，用水稀释至刻度，上下强力振摇30次，静置，备用。

精密量取空白溶液，对照品溶液，供试品溶液各11μL，注入液相色谱仪。

色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为45℃，以0.05%甲酸水溶液为流动相A，以0.05%甲酸乙腈为流动相B按下如下梯度洗脱程序进行洗脱，

时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%)

0 75 25

11 75 25

12 0 100

15 0 100

15.1 75 25

20 75 25。

运行时间20min；流速1.1mL/min，检测波长为256nm，记录色谱图。

实施例4

专属性实验：分别测定空白溶液，对照品溶液与供试品溶液，考察空白溶液对对照品溶液与供试品溶液的干扰情况，空白溶液与供试品溶液均不能对盐酸羟胺的测定形成干扰。

实施例5

灵敏度实验：考察盐酸羟胺的检测限和定量限。采用信噪比来确定检测限及定量限，稀释盐酸羟胺溶液为限度的10%，进行衍生化，作为定量限。该浓度信噪比(S/N)不小于10，重复考察6次，要求6次所得的色谱图中盐酸羟胺衍生物峰面积的相对标准偏差不大于10%，证实定量限测定结果的精密度。

将定量限溶液配制过程中使用的盐酸羟胺溶液稀释5倍，进行衍生化，作为检测限，重复考察3次，要求检测限S/N≥3；定量限S/N≥10，定量限浓度小于限度浓度的30%，6次测定峰面积RSD≤10%。

定量限试验结果见表1。

检测限试验结果见表2。

表1定量限试验结果

表2检测限试验结果

实验结果表明，本方法的灵敏度良好。

实施例6

准确度实验：在限度浓度的100%与150%水平，回收率在80～120%之间；限度浓度150%峰面积大于100%限度浓度峰面积。

盐酸羟胺准确度验证结果见表3：

表3盐酸羟胺准确度试验结果

实验结果表明，本方法的准确度良好。

实施例7

稳定性实验：将供试品溶液和对照品溶液于室温下放置25小时，分别在0h、2h、6h、10h、14h、25h进样测定，考察稳定性，为供试品溶液和对照品溶液的放置时间提供依据，供试品溶液中盐酸羟胺含量的RSD值应≦10%，稳定性实验结果见表4：

表4稳定性试验结果

对照品溶液室温条件下放置25h，峰面积RSD为1.18%，供试品溶液室温条件下放置25h，峰面积RSD为0.47%，符合验证要求，说明在25h内溶液稳定性良好。

实施例8

耐用性实验：色谱条件参数变化影响：适当改变波长(±2nm)、流速(±0.1mL/min)、柱温(±5℃)，测定供试品溶液，评估测定条件参数有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，盐酸羟胺溶液耐用性试验结果见表5：

表5盐酸羟胺溶液耐用性试验结果

实验结果表明，本方法的耐用性良好。

Claims

1.一种醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）空白溶液制备：

（2）对照品溶液制备：

（3）供试品溶液制备：

（4）色谱条件：

采用高效液相色谱仪进行检测；

检测器：DAD检测器；

洗脱方式：梯度洗脱；

（5）测定方法：

2.根据权利要求1所述的醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱时间为20min，所述梯度洗脱程序如下：

时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%)

0 75 25

11 75 25

12 0 100

15 0 100

15.1 75 25

20 75 25。

3.根据权利要求1所述的醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，其特征在于，所述甲酸水溶液为0.05%体积浓度的甲酸水溶液；所述甲酸乙腈溶液为0.05%体积浓度的甲酸乙腈溶液。

4.根据权利要求1所述的醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，其特征在于，所述柱温为35-45℃。

5.根据权利要求1所述的醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，其特征在于，所述流速为0.9-1.1mL/min。

6.根据权利要求1所述的醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，其特征在于，所述注入液相色谱仪的体积为9-11μL。

7.根据权利要求1所述的醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，其特征在于，所述乙酸溶液为1%体积浓度的乙酸溶液。

8.根据权利要求1所述的醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，其特征在于，所述苯甲醛溶液的溶剂为乙腈，所述苯甲醛溶液为0.05%体积浓度的苯甲醛溶液。

9.根据权利要求1所述的醛（酮）肟反应中基因毒性杂质盐酸羟胺的HPLC检测方法，其特征在于，所述采用高效液相色谱仪进行检测的检测波长为252-256nm。