CN115856160B - 一种测定复方氨甲环酸片中有关物质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明旨在提出一个操作简便、结果准确、灵敏且分析时间短的检测复方氨甲环酸片中多种有关物质含量的方法。本发明提出的一种测定复方氨甲环酸片中有关物质含量的方法，是通过高效液相色谱分析方法对所述复方氨甲环酸片进行分析，以便获得色谱图，以及基于所述色谱图，确定所述复方氨甲环酸片中有关物质的含量。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体的，本发明涉及一种测定复方氨甲环酸片中有关物质含量的方法。
背景技术
氨甲环酸是氨甲苯酸的衍生物，是一种抗纤溶的止血药物，氨甲环酸对黄褐斑也有一定的疗效，具有在水中易溶，在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中几乎不溶的特性。
复方氨甲环酸片中主要含氨甲环酸、L-半胱氨酸、抗坏血酸(维生素C)、盐酸吡哆醇(维生素B6)和泛酸钙5种成分，在生产、存储过程中产生的有关物质可能会影响到复方氨甲环酸片的质量。
因此如何准确测定复方氨甲环酸片中有关物质的种类和含量，从而实现对复方氨甲环酸片有关物质有效控制，进而有效控制复方氨甲环酸片产品的质量，成为需要解决的关键问题。
发明内容
本发明旨在提出一个操作简便、结果准确、灵敏且分析时间短的检测复方氨甲环酸片中多种有关物质含量的方法。
一方面，本发明提出了一种测定复方氨甲环酸片中有关物质含量的方法，通过高效液相色谱分析方法对所述复方氨甲环酸片进行分析，以便获得色谱图，以及基于所述色谱图，确定所述复方氨甲环酸片中有关物质的含量，其中，所述高效液相色谱采用以下条件：
色谱柱：InertSustainAQ-C18,4.6×250mm，5μm，
检测器：DAD，
检测波长：200nm，
柱温：20-35℃，
流动相A：2.5mol/L磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH为1.0-2.5，
流动相B：甲醇，
流速：1.0mL/min，
洗脱梯度为：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 97 | 3 |
| 20 | 90 | 10 |
| 50 | 50 | 50 |
| 55 | 50 | 50 |
| 56 | 100 | 0 |
| 70 | 100 | 0 |
，
运行时间：70min。
利用本发明描述的检测方法，可以简便、准确、灵敏地检测复方氨甲环酸片中多种有关物质的含量，从而实现对复方氨甲环酸片有关物质的有效控制，进而有效控制复方氨甲环酸片产品的质量。
在一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲液包含磷酸盐与离子对试剂。
在一些实施方式中，所述磷酸盐为磷酸的钠盐或钾盐，优选的，所述磷酸盐选自磷酸二氢钠或磷酸二氢钾。
在一些实施方式中，所述离子对试剂选自戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、十二烷基硫酸钠中的一种或多种，优选的，所述离子对试剂为戊烷磺酸钠。
在一些实施方式中，所述离子对试剂的浓度为0.01mol/L～0.03mol/L，优选的，所述所述离子对试剂的浓度为0.02mol/L。
在一些实施方式中，所述磷酸缓冲液的pH为1.0--2.0，优选的，所述磷酸缓冲液的pH为1.0。
在一些实施方式中，所述柱温为35℃。
在一些实施方式中，所述有关物质为下列杂质：
杂质1：
杂质2：
杂质3：
杂质4：
杂质5：
和杂质6：
可以理解，各有关物质间极性差异很大，部分有关物质极性较大，在色谱系统中保留较弱或几乎无保留，部分有关物质极性较小，在色谱系统中保留极强，不易被洗脱，利用本发明提供的测定复方氨甲环酸片中多种有关物质含量的方法，复方氨甲环酸片主峰与上述各有关物质均达到基线分离，上述各有关物质峰的分离度也较好，有关物质峰形态单一，可实现各有关物质的有效分离和含量的测定。
在一些实施方式中，所述复方氨甲环酸片是以供试品溶液的形式提供的，其中，所述供试品溶液为复方氨甲环酸片水溶液，并且基于每毫升供试品溶液，其中氨甲环酸的浓度为20mg/ml、维生素C的浓度为8mg/ml、L-半胱氨酸的浓度为6.4mg/ml、泛酸钙的浓度为0.64mg/ml、维生素B6的浓度为0.16mg/ml。
在一些实施方式中，基于色谱图，确定所述复方氨甲环酸片有关物质含量是通过以下公式确定的：有关物质的含量＝A供/A对×1％；式中：A供为供试品溶液中有关物质的峰面积，A对为对照溶液中各主成分的峰面积。
在本发明的第二方面，更为具体的提出了一种测定复方氨甲环酸片中有关物质含量的方法，包括：
(1)色谱条件
色谱柱：InertSustain AQ-C18，4.6×250mm，5μm，
检测器：DAD，
检测波长：200nm，
柱温：35℃，
流动相A：2.5mol/L含戊烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲溶液，所述含戊烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲液的pH为1.0，
流动相B：甲醇，
流速：1.0mL/min，
洗脱梯度为：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相A(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 97 | 3 |
| 20 | 90 | 10 |
| 50 | 50 | 50 |
| 55 | 50 | 50 |
| 56 | 100 | 0 |
| 70 | 100 | 0 |
，
运行时间：70min；
(2)配制系统适用性溶液
称取氨甲环酸原料药200mg，维生素C原料药84mg，置称量瓶中，加入1滴水搅拌均匀，置于105℃放置1h，全量转移至10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得所述系统适用性溶液；
(3)配制供试品溶液
取研细的复方氨甲环酸片，用水溶解并稀释制成含氨甲环酸约20mg/ml、维生素C约8mg/ml、L-半胱氨酸约6.4mg/ml、泛酸钙约0.64mg/ml、维生素B6约0.16mg/ml的溶液，即得所述供试品溶液；
(4)配置对照溶液
取供试品溶液稀释100倍，作为对照溶液；
(5)进样
将30μl供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图；
(6)计算
根据得到的各有关物质的色谱峰面积，按照1％主成分自身对照法计算得到待测样各有关物质的含量。计算公式为：有关物质的含量＝A供/A对×1％；式中：A供为供试品溶液中有关物质的峰面积，A对为对照溶液中各主成分的峰面积。
利用本发明提供的检测方法，可简便、准确、灵敏且较短分析时间的检测复方氨甲环酸片中6种有关物质含量的方法，实现各有关物质的有效分离和含量的测定。
附图说明
图1为实施例1所述的流动相A为pH＝1的2.5mol/L不含戊烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲溶液的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图2为实施例1所述的流动相A为pH＝1的2.5mol/L含戊烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲溶液的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图3为不同流动相的条件下的复方氨甲环酸片色谱图，其中3(a)为实施例1所述的流动相为2.5mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇(99:1)的条件下的复方氨甲环酸片色谱图，3(b)为实施例1所述的流动相为0.6mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(99:1)的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图4为不同流动相A的条件下的复方氨甲环酸片色谱图，其中4(a)为实施例1所述的流动相A为pH＝2的0.05mol/L含戊烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲溶液的条件下的复方氨甲环酸片色谱图，4(b)为实施例1所述的流动相A为pH＝1的0.05mol/L含戊烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲溶液的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图5为实施例1所述的柱温为20℃的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图6为实施例1所述的柱温为30℃的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图7为实施例1所述的柱温为35℃的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图8为实施例1所述的色谱柱为Titank C18的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图9为实施例1所述的色谱柱为InertSustain AQ-C18的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图10为实施例1所述的洗脱梯度1的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图11为实施例1所述的洗脱梯度2的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图12为实施例1所述的洗脱梯度3的条件下的复方氨甲环酸片色谱图；
图13为实施例2空白溶液色谱图；
图14为实施例2系统适用性溶液色谱图；
图15为实施例2供试品溶液色谱图；
图16为实施例2对照品溶液色谱图。
附图标记说明：1：维生素C出峰；2：L-半胱胺酸出峰；3：维生素B6出峰；4：氨甲环酸出峰；5：泛酸钙出峰，6：杂质1出峰；7：杂质4出峰；8：杂质5出峰；9：杂质6出峰。
具体实施方式
为了便于理解，下面将对本申请进行更全面的描述，并给出了本申请的较佳实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场获得的常规产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
在本实施例中，发明人详细介绍了测定复方氨甲环酸片中有关物质含量的方法的开发过程。
1.1缓冲盐种类及流动相A种类的考察
复方氨甲环酸片中各主成分及其有关物质种类繁多，部分化合物为强极性，在普通反相色谱下可能无保留，可能需给流动相A加入添加剂，采用ACD软件预测，结果表明维生素C和L-半胱氨酸在普通反相色谱中无保留，需添加流动相添加剂(离液剂、离子对试剂)，因此，初期在方法开发时考察了缓冲盐种类及流动相添加剂种类。
方法开发过程中使用含十二烷基硫酸钠的磷酸二氢钠缓冲溶液作为流动相A，结果维生素C在死体积内无保留；采用磷酸二氢钾缓冲溶液作为流动相A，结果L-半胱氨酸无保留；采用磷酸二氢钾含盐酸(离液剂)的缓冲液作为流动相A，结果L-半胱氨酸和维生素C均有保留，但维生素C保留较弱；采用磷酸二氢钾含戊烷磺酸钠(离子对试剂)的缓冲液作为流动相A，结果各化合物保留均增强。保留的增强为化合物的分离提供了空间，故最终优选磷酸二氢钾含戊烷磺酸钠(离子对试剂)的缓冲液作为流动相A。
1.2缓冲盐浓度及流动相B种类的考察
复方氨甲环酸片中主成分与各杂质存在羟基和氨基，而甲醇可提供氢键作用，乙腈可提供π键作用，这些作用力对分离都存在巨大影响，故方法开发时对有机相种类进行了筛选；因各化合物的离子作用存在差异，而缓冲盐浓度影响流动相中离子强度从而影响化合物的峰型，故方法开发时同时也对流动相B种类进行了筛选。
发明人对比了以2.5mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇(99:1)与0.6mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(99:1)为流动相时化合物保留、峰型及分离情况，得到的色谱图如附图3所示，结果表明：采用2.5mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇为流动相时各化合物保留均有所增强，故选择甲醇作为流动相B；虽然提供缓冲盐浓度对峰型无明显改善，但是提高缓冲液浓度可增强流动相的缓冲能力，使方法更为稳健，故优选2.5mol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相A。
1.3缓冲盐pH值的考察
因复方氨甲环酸片中氨甲环酸的pKa值为4.33、10.65，L-半胱氨酸的pKa为1.96、8.18、10.28，维生素C的pKa为4.17、11.57，维生素B6的pKa为5.00，泛酸钙的pKa为4.30，从化合物性质来看采用酸性条件有利于化合物的保留，而L-半胱氨酸存在1.96的pKa，在pH为1.0～2.0下可能存在两种形态导致峰型异常。故考察了流动相A的pH为1.0、2.0时对复方氨甲环酸片中主成分及各杂质分离及L-半胱氨酸峰型的影响，得到的色谱图如图4所示。
由图4可知，流动相A的pH为2.0时L-半胱氨酸出现多个峰，主要是由于pH为2.0时L-半胱氨酸存在多种形态，故而存在多个峰；流动相为1.0时，L-半胱氨酸峰型正常，且各物质的保留略有增强，主成分与相邻杂质分离略有提高，故优先选择流动相A的pH为1.0。
1.4柱温的考察
发明人考察了在相同梯度，不同温度下(20℃、30℃和35℃)，复方氨甲环酸主成分及其杂质的分离效果。结果表明随着柱温的升高，各化合物的分离效果越好，故优先选择柱温为35℃。
1.5色谱柱的选择与优化
考察了同规格不同厂家色谱柱对复方氨甲环酸片主成分及其有关物质的分离效果，考察的色谱柱有Agilent Zorbax AQ-C18、Titank C18、StableBond Analytical以及InertSustain AQ-C18，规格均为4.6mm×250mm，5μm。
下表为分离度较好的两根色谱柱在同一梯度下各有关物质分离比较数据：
各主成分最小分离度均大于1.0，优选InertSustain AQ-C18柱。
1.6洗脱梯度的优化
发明人在确定以上最优条件后对洗脱梯度进行了考察，以下简述了三个关键梯度的优化，根据考察结果最终选择了梯度3。
(1)洗脱梯度
梯度1：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 30 | 80 | 20 |
| 35 | 80 | 20 |
| 45 | 50 | 50 |
| 60 | 50 | 50 |
| 61 | 100 | 0 |
，
梯度2：
| 时间(分钟) | 流动相A％ | 流动相B％ |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 97 | 3 |
| 20 | 92 | 8 |
| 30 | 85 | 15 |
| 35 | 80 | 20 |
| 45 | 50 | 50 |
| 60 | 50 | 50 |
| 61 | 100 | 0 |
；
梯度3：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 97 | 3 |
| 20 | 90 | 10 |
| 50 | 50 | 50 |
| 55 | 50 | 50 |
| 56 | 100 | 0 |
| 70 | 100 | 0 |
；
(2)结果选用梯度1，梯度2和梯度3分别得到的色谱图如附图10、11、12所示。从结果可知，选用梯度1，L-半胱氨酸后出现连续峰未分离，选用梯度2，L-半胱氨酸后杂质分离优于梯度1，但仍存在2个杂质未完全分离，选用梯度3，各化合物分离良好，最终选择了梯度3。
实施例2
在本实施例中，发明人考察了实施例1所确定的测定复方氨甲环酸片中有关物质的方法的系统适用性和专属性，并详细介绍了基于实施例1所确定的色谱条件下获得的色谱图，计算得到的有关物质含量。
2.1溶液的配制
(1)配制系统适用性溶液
称取氨甲环酸原料药200mg，维生素C原料药84mg，置称量瓶中，加入1滴水搅拌均匀，置于105℃放置1h，放冷，全量转移至10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(2)配制供试品溶液
取研细的复方氨甲环酸片，用水溶解并稀释制成含氨甲环酸约20mg/ml、维生素C约8mg/ml、L-半胱氨酸约6.4mg/ml、泛酸钙约0.64mg/ml、维生素B6约0.16mg/ml的溶液，即得所述供试品溶液；
(3)配制对照溶液
取供试品溶液用水稀释100倍，作为对照溶液。
2.2色谱条件
色谱柱：岛津InertSustain AQ-C18，4.6×250mm，5μm，
流动相A：0.05mol/L磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH为1.0，
流动相B：甲醇，
检测波长：200nm，
柱温：35℃，
流速：1.0mL/min
洗脱梯度为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 97 | 3 |
| 20 | 90 | 10 |
| 50 | 50 | 50 |
| 55 | 50 | 50 |
| 56 | 100 | 0 |
| 70 | 100 | 0 |
，运行时间：70min。
2.3进样
①取30μl空白溶剂-水进样，要求不干扰杂质检测，得到色谱图如图13所示；
②取30μl系统适用性溶液进样，要求各物质分离度均大于1.2，得到色谱图14所示；
③取30μl供试品溶液进样，得到色谱图如图15所示；
④取30μl对照溶液溶液进样，得到色谱图如图16所示。
2.4计算
根据得到的各有关物质的色谱峰面积，按照1％主成分自身对照法计算得到待测样各有关物质的含量。计算公式为：含量＝A供/A对×1％；式中：A供为供试品溶液中有关物的峰面积，A对为对照溶液中各主成分的峰面积。
计算结果如下表所示：
| 有关物质归属 | 相对保留时间 | 含量(％) |
| 未知杂质 | 0.21 | 0.10 |
| L-胱氨酸 | 0.43、0.45 | 3.49 |
| 未知杂质 | 0.52 | 0.07 |
| 杂质1 | 1.18 | 0.11 |
| 杂质4 | 1.84 | 0.03 |
| 杂质5 | 1.92 | 0.03 |
| 杂质6 | 2.13 | 0.16 |
| 总杂 | 3.99 |
。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (5)
1.一种测定复方氨甲环酸片中有关物质含量的方法，其特征在于，通过高效液相色谱分析方法对所述复方氨甲环酸片进行分析，以便获得色谱图，以及基于所述色谱图，确定所述复方氨甲环酸片中有关物质的含量，其中，所述高效液相色谱采用以下条件：
色谱柱：InertSustain AQ-C18，4.6×250mm，5μm，
检测器：DAD，
检测波长：200nm，
柱温：20-35℃，
流动相A：2.5mol/L含戊烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲溶液，所述含戊烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲液的pH为1.0，
流动相B：甲醇，
流速：1.0mL/min，
洗脱梯度为：
，运行时间：70min；
所述有关物质为：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柱温为35℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复方氨甲环酸片是以供试品溶液的形式提供的，其中，所述供试品溶液为复方氨甲环酸片水溶液，并且基于每毫升供试品溶液，其中氨甲环酸的浓度为20mg/ml、维生素C的浓度为8mg/ml、L-半胱氨酸的浓度为6.4mg/ml、泛酸钙的浓度为0.64mg/ml、维生素B6的浓度为0.16mg/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于色谱图，确定所述复方氨甲环酸片有关物质含量是通过以下公式来确定的：有关物质的含量＝A供/A对×1％；式中：A供为供试品溶液中有关物质的峰面积，A对为对照溶液中各主成分的峰面积。
5.一种测定复方氨甲环酸片中有关物质含量的方法，其特征在于，包括：
(1)色谱条件
色谱柱：InertSustain AQ-C18，4.6×250mm，5μm，
检测器：DAD，
检测波长：200nm，
柱温：35℃，
流动相A：2.5mol/L含戊烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲溶液，所述含戊烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲液的pH为1.0，
流动相B：甲醇，
流速：1.0mL/min，
洗脱梯度为：
，运行时间：70min；
(2)配制系统适用性溶液
称取氨甲环酸原料药200mg，维生素C原料药84mg，置称量瓶中，加入1滴水搅拌均匀，置于105℃放置1h，全量转移至10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得所述系统适用性溶液；
(3)配制供试品溶液
取研细的复方氨甲环酸片，用水溶解并稀释制成含氨甲环酸约20mg/ml、维生素C约8mg/ml、L-半胱氨酸约6.4mg/ml、泛酸钙约0.64mg/ml、维生素B6约0.16mg/ml的溶液，即得所述供试品溶液；
(4)配置对照溶液
取供试品溶液稀释100倍，作为对照溶液；
(5)进样
将30μl供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图；
(6)计算
根据得到的各有关物质的色谱峰面积，按照1％主成分自身对照法计算得到待测样各有关物质的含量，计算公式为：有关物质的含量＝A供/A对×1％；式中：A供为供试品溶液中有关物质的峰面积，A对为对照溶液中各主成分的峰面积；
其中所述有关物质为：
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