CN115852037A - 鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的引物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的引物组合物及其应用。本发明属于基因生物技术领域，具体涉及鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的引物组合物及其应用。通过检测待测水稻基因组中SNP位点的多态性或基因型(等位基因)，根据基因型鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性，SNP位点为水稻6号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为A或G，为序列表中序列4的第23位核苷酸。该引物组合物可用于预测水稻对白叶枯病的抗性和进行水稻育种。可将检测SNP位点多态性和基因型的物质与其他物质(如检测其他与水稻抗白叶枯病相关的分子标记的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备鉴定水稻抗白叶枯病品种产品。
Description
技术领域
本发明属于基因生物技术领域，具体涉及鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的引物组合物及其应用。
背景技术
由水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)引起的水稻白叶枯病是全球稻作栽培中一种重要的细菌性病害，在我国华南和东南亚稻区危害严重。一般年份可导致水稻减产10％左右，严重时减产50％-60％。长期以来，选育和种植抗病品种在防治白叶枯病害中起到了重要作用。开发检测水稻白叶枯病抗性的分子标记，对于筛选抗白叶枯病的水稻种质资源以及在育种过程中快速鉴定抗白叶枯病植株的研究中具有重要的应用价值。
KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可用于检测SNP位点和InDel位点。与SSR、RFLP、InDel等分子标记相比，KASP标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点。KASP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳检测方法的步骤相对繁琐，低通量的缺点，适用于高通量分子检测平台。因此，鉴定与水稻白叶枯病抗性相关的功能SNP位点，开发适合于高通量分子检测平台的水稻白叶枯病抗性KASP分子标记对于提高我国水稻的育种效率和育种水平具有重要应用价值。
发明内容
本发明所要解决的问题是如何鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性。
为了解决以上技术问题，本发明首先提供了检测水稻基因组中SNP的多态性或基因型的物质在如下任一中的应用，
(1)鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性；
(2)筛选或选育抗白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种；
(3)筛选或选育感白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种；
(4)水稻育种；
(5)制备鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的产品；
(6)制备筛选或选育抗白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品；
(7)制备筛选或选育感白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品；
(8)制备水稻育种的产品。
所述SNP位点为水稻6号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为A或G，为序列表中序列4的第23位核苷酸。
以日本晴基因组序列为参考基因组，所述SNP位点为水稻6号染色体12116672bp处(具体为序列表中序列4第23位)。
本发明还提供了鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的方法，包括检测待测水稻基因组中SNP位点的基因型，根据所述基因型鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性，所述基因型为AA或GG，所述AA是所述SNP位点为A的纯合型，所述GG是所述SNP位点为G的纯合型。
可选地，根据上述方法，所述根据所述基因型鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性可为如下任一种方式：
1)所述SNP的基因型为AA的待测水稻为或候选为抗白叶枯病的水稻，
2)所述SNP的基因型为GG的待测水稻为或候选为感白叶枯病的水稻；
3)所述SNP的基因型为AA的待测水稻的白叶枯病抗性高于所述SNP的基因型为GG的待测水稻的。
作为一种实施方案，所述鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的方法可包括如下步骤：
(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，采用下述引物组合物进行KASP；所述引物组合物由引物A、引物B和引物C组成；
所述引物A为核苷酸序列是序列表中序列1的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列1的第22-44位的单链DNA；
所述引物B为核苷酸序列是序列表中序列2的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-43位的单链DNA；
所述引物C核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA分子。
(2)完成步骤(1)后，进行荧光检测，确定待测水稻的所述SNP的基因型；
(3)根据基因型结果进行鉴定待测水稻的白叶枯病抗性：所述SNP的基因型为AA的待测水稻的白叶枯病抗性高于所述SNP的基因型为GG的待测水稻。
上述方法中，引物溶解与配制方法可为：先将3条引物分别用ddH2O稀释成100mM，再按如下配制引物工作液：引物A12μL、引物B12μL、引物C 30μL、ddH2O 46μL。
上述方法中，KASP的反应体系可为：模板溶液1μL、引物工作液0.14μL、KASPHiGeno 2x Probe Mix 5μL、无菌超纯水3.86μL。
上述方法中，KASP可在BIO-RAD T100 Thermal Cycler PCR扩增仪上进行。
上述方法中，KASP的反应程序可为：
第一步：94℃预变性10min；
第二步：94℃20s、61℃40s，94℃20s、60.4℃40s，94℃20s、59.8℃40s，94℃20s、59.2℃40s，94℃20s、58.6℃40s，94℃20s、58℃40s，94℃20s、57.4℃40s，94℃20s、56.8℃40s，94℃20s、56.2℃40s，94℃20s、61℃40s，94℃20s、55.6℃40s；
第三步：94℃变性20s、55℃退火40s，34个循环。
上述方法中，确定待测水稻所述SNP的基因型的方法可为：在ABI7500荧光定量PCR仪进行荧光读板，温度为35℃，保持30s，采用终末端读取荧光值进行基因分型。
上述的方法在水稻育种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了水稻育种的方法。
本发明所提供的水稻育种的方法为M1或M2：
M1、所述方法包括检测水稻基因组中所述SNP的基因型，选择所述SNP的基因型为AA的水稻作为亲本进行育种，所述AA是所述SNP位点为A的纯合型，所述方法的育种的目包括选育具有白叶枯病抗性的水稻；；
M2、所述方法包括检测水稻基因组中所述SNP的基因型，选择所述SNP的基因型为GG的水稻作为亲本进行育种，所述GG是所述SNP位点为G的纯合型，所述方法的育种的目的包括选育感白叶枯病的水稻。
作为一种实施方法，水稻育种的方法可包括如下步骤：
(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，采用上述引物组进行KASP；
(2)完成步骤(1)后，进行荧光检测，确定待测水稻所述SNP的基因型；
(3)选择AA基因型水稻进行育种。
所述方法中，引物溶解与配制方法可为：先将3条引物分别用ddH2O稀释成100mM，再按如下配制引物工作液：引物A12μL、引物B12μL、引物C 30μL、ddH2O 46μL。
所述方法中，KASP的反应体系可为：模板溶液1μL、引物工作液0.14μL、KASPHiGeno 2x Probe Mix 5μL、无菌超纯水3.86μL。
所述方法中，KASP可在Bio-Rad T100 Thermal Cycler PCR扩增仪上进行。
所述方法中，KASP的反应程序可为：
第一步：94℃预变性10min；
第二步：94℃20s、61℃40s，94℃20s、60.4℃40s，94℃20s、59.8℃40s，94℃20s、59.2℃40s，94℃20s、58.6℃40s，94℃20s、58℃40s，94℃20s、57.4℃40s，94℃20s、56.8℃40s，94℃20s、56.2℃40s，94℃20s、61℃40s，94℃20s、55.6℃40s；
第三步：94℃变性20s、55℃退火40s，34个循环。
所述方法中，确定待测水稻所述SNP的基因型的方法为：在ABI7500荧光定量PCR仪进行荧光读板，温度为35℃，保持30s，采用终末端读取荧光值进行基因分型。
本发明还提供了用于检测水稻基因组中SNP位点的多态性或基因型的产品。
本发明所提供的用于检测水稻基因组中所述SNP位点的多态性或基因型的产品，为上述检测水稻基因组中SNP位点的多态性或基因型的物质，所述产品可为任一种：
C1)检测水稻白叶枯病抗性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
C2)鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的产品；
C3)用于水稻育种的产品；
C4)筛选或选育抗白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品；
C5)筛选或选育感白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品；
上述应用、方法和产品中，所述物质可为通过下述至少一种方法确定所述SNP位点的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。
可选地，所述物质可为如下D1)、D2)或D3)：
D1)含有扩增包括所述SNP位点在内的水稻基因组DNA片段的引物组合物；
D2)含有D1)所述引物组合物的PCR试剂；
D3)含有D1)所述引物组合物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
可选地，所述扩增可为PCR扩增。所述引物组合物由所述引物A、所述引物B和所述引物C组成。
D3)所述试剂盒还可包括特异探针组。所述特异探针组包括荧光探针A、淬灭探针A、荧光探针B和淬灭探针B；荧光探针A如序列表的序列5所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针B如序列表的序列6所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针A和荧光探针B中的荧光基团不同；淬灭探针A如序列表的序列7所示，3’末端连接淬灭基团；淬灭探针B如序列表的序列8所示，3’末端连接淬灭基团。荧光探针A具体可连接FAM荧光基团。荧光探针B具体可连接HEX荧光基团。淬灭探针A具体可连接淬灭基团BHQ。淬灭探针B具体可连接淬灭基团BHQ。
D3)所述试剂盒还可包括KASP HiGeno 2x Probe Mix。
上述应用、方法和产品中，所述引物组合物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。如所述引物组合物可为由核苷酸序列是序列表中序列1的第22-44位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中序列2的第22-43位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA组成的引物组合物，所述引物组合物也可为由序列表中序列1所示的单链DNA、序列表中序列2所示的单链DNA和由序列表中序列3所示的单链DNA的引物组。序列表中序列1由44个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为FAM序列(作为标记物)，第22-44位核苷酸为特异序列；序列表中序列2由43个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为HEX序列(作为标记物)，第22-43位核苷酸为特异序列。
本发明还提供了DNA分子，核苷酸序列如序列表的序列4所示。
上述的DNA分子的应用也属于本发明的保护范围之内。所述应用具体为在如下任一中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性；
(2)筛选或选育抗白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种；
(3)筛选或选育感白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种；
(4)水稻育种；
(5)制备鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的产品；
(6)制备筛选或选育抗白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品；
(7)制备筛选或选育感白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品；
(8)制备水稻育种的产品。
可选地，在上述应用中，该DNA分子作为检测靶标。
本文中，抗白叶枯病的水稻的白叶枯病抗性可高于感白叶枯病的水稻。
本文中，抗白叶枯病的水稻具体也可为抗病性试验中叶片病斑长度小于等于3cm的水稻。
本文中，感白叶枯病的水稻具体也可为抗病性试验中叶片病斑长度大于等于20cm的水稻。
所述抗病性试验为：在水稻植株分蘖盛期，采用剪叶法，用白叶枯病菌的菌悬液接种待测水稻品种的叶片，接种后3周测量叶片的病斑长度。
所述白叶枯病菌株具体可为菌株GIV。
所述菌悬液的浓度具体可为108cfu/mL。
所述菌悬液的制备方法具体可为：将菌株GIV接种于PSA固体培养基上，28℃静置培养48h，用无菌水将菌落洗脱，制备得到菌悬液。
所述人工剪叶法具体可参照参考文献“Kauffman H E,Reddy A P K,Hsieh S P,et al.A improved technique for evaluation of resistance of rice varieties toXanthomonas oryzea[J].Plant Dis Rep,1973,57:537-541”。
以上任一所述白叶枯病具体可为由GIV或其他菌株引起的白叶枯病。
以上任一所述待测水稻具体可为如下水稻材料中的任意一种：DV 86::IRGC8840-1、DHARIAL::IRGC 34034-1、DL 5::IRGC 8593-1、UCP 41::IRGC 8742-1、ARC14901::IRGC41811-1、CHILE BORO::IRGC 45297-2、DD 126::IRGC 8667-1、LAL SAR::IRGC 16185-1、M142::IRGC 35054-1、BAO DAM::IRGC 89352-1、R 146::IRGC38606-1、NS 252::IRGC68878-1、PAGAIYAHAN::IRGC 8267-1、MAKALIOKA STANDARD::IRGC 12768-1、DANGAR::IRGC76296-1、MUGA::GERVEX 1099-C1、DORELLA::GERVEX 100-C1、TSIVIMBININA::IRGC 69890-1、FIDJI::GERVEX 1636-C1、SALVO::GERVEX 1672-C1、SUPER::GERVEX 1304-C1、ARC11424::IRGC 21380-2、79UPLA::GERVEX 154-C1、GANIGI::IRGC 48698-C1、KITRANA1007::IRGC 68517-1、LACASSINE::GERVEX 1660-C1、HAI NA::IRGC 107117-1、GLADIO::GERVEX 1652-C1、MAK KHEUA KANG::IRGC 107712-1、GOOLARAH::GERVEX 500-C1、GRALDO::GERVEX 108-C1、MAK KHEUA DENG::IRGC 107709-1、RUBI::GERVEX 1247-C1、B 106::IRGC31352-1、BUAGKOG::IRGC 74318-1、FAMILIA 181::GERVEX 901-C1、CHA LOY OE::C1、BERYA::IRGC99970-1、IR 63380-16::C1、TOPAZIO::GERVEX 1332-C1、SLAVA::GERVEX 1287-C1、ROJOKELY::GERVEX 8410-C1、T 757::GERVEX 1316-C1、B 6311A 5553-16-2::IRGC14541-1、ARC 12493::IRGC 22098-1。
以上所述待测水稻为以如下水稻材料中的任意一种或两种为亲本得到的后代：DV86::IRGC 8840-1、DHARIAL::IRGC 34034-1、DL 5::IRGC 8593-1、UCP 41::IRGC 8742-1、ARC 14901::IRGC 41811-1、CHILE BORO::IRGC 45297-2、DD 126::IRGC 8667-1、LALSAR::IRGC 16185-1、M 142::IRGC 35054-1、BAO DAM::IRGC 89352-1、R 146::IRGC38606-1、NS 252::IRGC 68878-1、PAGAIYAHAN::IRGC 8267-1、MAKALIOKA STANDARD::IRGC12768-1、DANGAR::IRGC 76296-1、MUGA::GERVEX 1099-C1、DORELLA::GERVEX 100-C1、TSIVIMBININA::IRGC 69890-1、FIDJI::GERVEX 1636-C1、SALVO::GERVEX 1672-C1、SUPER::GERVEX 1304-C1、ARC 11424::IRGC 21380-2、79UPLA::GERVEX 154-C1、GANIGI::IRGC 48698-C1、KITRANA 1007::IRGC 68517-1、LACASSINE::GERVEX 1660-C1、HAI NA::IRGC 107117-1、GLADIO::GERVEX 1652-C1、MAK KHEUA KANG::IRGC 107712-1、GOOLARAH::GERVEX 500-C1、GRALDO::GERVEX 108-C1、MAK KHEUA DENG::IRGC 107709-1、RUBI::GERVEX 1247-C1、B 106::IRGC 31352-1、BUAGKOG::IRGC 74318-1、FAMILIA 181::GERVEX901-C1、CHA LOY OE::C1、BER YA::IRGC99970-1、IR 63380-16::C1、TOPAZIO::GERVEX1332-C1、SLAVA::GERVEX 1287-C1、ROJOKELY::GERVEX 8410-C1、T 757::GERVEX 1316-C1、B 6311A 5553-16-2::IRGC 14541-1、ARC 12493::IRGC 22098-1。
可将检测所述SNP位点多态性和基因型的物质与其他物质(如检测其他与水稻抗白叶枯相关的分子标记的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备鉴定水稻抗白叶枯品种产品。
本发明提供了一种引物组合物，还提供了利用引物组合物鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的方法。本发明建立的方法可用于预测水稻对白叶枯病的抗性，可以对待筛选水稻进行早期筛选，可用于水稻分子标记辅助育种，在发掘抗白叶枯病水稻种质资源和选育抗白叶枯病水稻品种的研究中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为基因型检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下实施例中的水稻材料均已经在参考文献：Wang W,Mauleon R,Hu Z,etal.Genomic variationin 3010diverse accessions of Asian cultivated rice,Nature,2018,557(7703):43-49.中公开记载；公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
白叶枯病菌菌株GIV，记载在“方中达,许志刚,过崇俭,殷尚智,伍尚忠,徐羡明,章琦.中国水稻白叶枯病菌致病型的研究.植物病理学报,1990,20(2):81-88”一文中，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
HiGeno 2x Probe Mix：北京嘉程生物科技有限公司，货号：AQP-001S。
实施例1、利用SNP检测水稻对白叶枯病抗性
1、从已测序(平均深度14×)的全球水稻核心种质资源(Wang W,Mauleon R,Hu Z,et al.Genomic variationin 3010diverse accessions of Asian cultivated rice,Nature,2018,557(7703):43-49.)中选取340份水稻品种作为实验材料，接种水稻Xoo菌株GIV；基于高密度的SNP基因型，对340份水稻品种对白叶枯病的抗感表型进行全基因组关联分析，结合连锁不平衡(Linkage disequilibrium，LD)分析，发现第6染色体上与水稻白叶枯病抗性相关区间,选取该区间内与水稻白叶枯病抗性最显著相关的的SNP位点进一步分析。以日本晴基因组序列为参考基因组，该SNP位点位于6号染色体12116672bp处。该SNP位点(简称SNP-12116672)及其附近的核苷酸如序列表的序列4所示，其中第23位核苷酸为SNP位点，为A/G多态。该SNP位点的基因型有如下两种：AA或GG。所述AA是所述SNP位点为A的纯合型，所述GG是所述SNP位点为G的纯合型。该SNP位点基因型为AA的水稻品种的白叶枯病抗性显著高于该SNP位点基因型为GG的水稻品种。
2、将SNP标记转换为KASP标记并设计用于检测该标记的引物组
将SNP标记转化为KASP标记，以用于分子标记辅助选择育种。
设计基于KASP技术检测KASP标记的引物组，简称KASP引物组。KASP引物组由两条上游引物(引物A和引物B)和一条下游引物(引物C)组成。
引物A的核苷酸序列如序列表的序列1所示。
序列1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAACTGGTTCTCGGAGGTCGA-3’。
引物B的核苷酸序列如序列表的序列2所示。
序列2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGAACTGGTTCTCGGAGGTCGG-3’。
引物C的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
序列3：5’-CCATACTTGAGTAGACACGGAGGCC-3’。
SNP-12116672位于水稻基因组中的序列表的序列4所示DNA分子的第23位核苷酸。
引物A为5’端带有FAM荧光标签序列(下划线为直线的碱基)的引物，和引物C扩增SNP-12116672为A的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到FAM基团的荧光信号；
引物B为5’端带有HEX荧光标签序列(下划线为直线的碱基)的引物，和引物C扩增SNP-12116672为G的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到HEX基团的荧光信号。
3、水稻对白叶枯病抗性检测方法的建立
3.1、提取待测水稻的叶片的基因组DNA，经稀释得到模板溶液。模板溶液中的DNA浓度为30-40ng/μL。
3.2、进行KASP。
引物工作液：先将3条引物分别用ddH2O稀释成100mM，再按如下配方配制引物工作液：引物A 12μL、引物B 12μL、引物C 30μL、ddH2O 46μL。
KASP HiGeno 2x Probe Mix为北京嘉程生物科技有限公司产品(货号AQP-001S)。KASP HiGeno 2x Probe Mix中含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B、高保真Taq酶、dNTP、Mg2+等。荧光探针A的序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，5’末端连接FAM荧光基团。荧光探针B的序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接HEX荧光基团。淬灭探针A的序列为5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。淬灭探针B的序列为5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。
KASP的反应体系：模板溶液1μL、引物工作液0.14μL、KASP HiGeno 2x Probe Mix5μL、无菌超纯水3.86μL。
KASP在Bio-Rad T100 Thermal Cycler PCR扩增仪上进行，采用Touch down PCR扩增程序。
KASP的反应程序：
第一步：94℃预变性10min；
第二步：94℃20s、61℃40s，94℃20s、60.4℃40s，94℃20s、59.8℃40s，94℃20s、59.2℃40s，94℃20s、58.6℃40s，94℃20s、58℃40s，94℃20s、57.4℃40s，94℃20s、56.8℃40s，94℃20s、56.2℃40s，94℃20s、61℃40s，94℃20s、55.6℃40s；
第三步：94℃变性20s、55℃退火40s，34个循环。
实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置2个或多个空白对照。
3.3、进行荧光扫描。
完成步骤2后，在ABI7500荧光定量PCR仪进行荧光读板，温度为35℃，保持30s，采用终末端读取荧光值进行基因分型。
FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm。HEX激发波长为535nm，发射波长为556nm。系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。
若显示只有HEX基团的荧光信号，则所述待测水稻的SNP-12116672基因型为GG(即基因组中SNP-12116672为G的纯合型)；若显示只有FAM基团的荧光信号，则所述待测水稻的SNP-12116672的基因型为AA(即基因组中SNP-12116672为A的纯合型)。
4、水稻白叶枯病抗性鉴定
4.1、将菌株GIV接种于PSA固体培养基上，28℃静置培养48h，用无菌水将菌落洗脱，制备得到浓度为108cfu/mL的菌悬液。
4.2、选择表1中的55份水稻材料作为实验材料，将待测水稻的种子播于装有淋过土壤杀菌剂的营养土壤的育秧盘中，在温室中培养约25天后移栽至网室中进行种植，每个品种设置3次重复，每个重复种植2行，每行移栽6株。
4.3、在步骤2水稻植株的分蘖盛期时，取步骤1得到的菌悬液，采用人工剪叶法(方法参照文献：Kauffman H E,Reddy AP K,Hsieh S P Y,et al.A improved techniqueforevaluation ofresistance ofrice varieties to Xanthomonas oryzea[J].PlantDisRep,1973,57:537-541)对水稻植株进行人工接种，每株接种5-6张叶片。
4.4、完成步骤3后继续培养21天，21天后测量各植株叶片的病斑长度，每个叶片沿叶脉有一个病斑，每个植株测量3张接种叶片的病斑长度，每个重复调查6株，病斑长度取平均值。根据方中达等(1990)的分级标准划分水稻品种的抗感类型：病斑长度<3cm、3cm≤病斑长度<5cm、5cm≤病斑长度<10cm、10cm≤病斑长度<15cm和病斑长度≥15cm分别划分为抗病，中抗，中感，感病，和高度感病(方中达,许志刚,过崇俭,殷尚智,伍尚忠,徐羡明,章琦.中国水稻白叶枯病菌致病型的研究.植物病理学报,1990,20(2):81-88)。
结果见表1。45份水稻材料中，9份为抗白叶枯病材料，36份为感白叶枯病材料。
5、利用SNP-12116672鉴定水稻白叶枯病抗性。
按照步骤3的方法检测待测水稻的SNP-12116672的基因型。根据基因型结果进行鉴定待测水稻的白叶枯病抗性：若待测水稻的SNP-12116672的基因型为AA，则该待测水稻为抗白叶枯病水稻。若待测水稻的SNP-12116672的为GG，则该待测水稻为感白叶枯病水稻。所述抗白叶枯病水稻的白叶枯病抗性高于所述感白叶枯病水稻。
结果见表1、2和图1。图1中，AA为水稻材料的SNP-12116672的基因型为AA，GG为水稻材料的SNP-12116672基因型为GG的水稻，NTC为反应体系中不添加模板DNA的空白对照。
表1水稻种质资源接种白叶枯病菌GIV后的叶片病斑长度和SNP位点基因型
上述结果表明，9份抗白叶枯病水稻SNP-12116672的基因型均为AA；36份感白叶枯病水稻SNP-15471465的基因型为GG。SNP-12116672的基因型为AA的水稻的对白叶枯病抗性显著高于SNP-12116672的基因型为GG的水稻。依据方中达等对水稻白叶枯病抗性水平的分级标准(方中达,许志刚,过崇俭,殷尚智,伍尚忠,徐羡明,章琦.中国水稻白叶枯病菌致病型的研究.植物病理学报,1990,20(2):81-88)，SNP-12116672的基因型为GG的水稻品种对白叶枯病的抗性水平表现为抗病。
本发明利用SNP-12116672鉴定水稻白叶枯病抗性的结果与实际测定水稻白叶枯病抗性的结果一致。因此，利用检测水稻基因组中SNP-12116672的多态性或基因型的物质可以快速、准确地鉴定水稻白叶枯病抗性。
在选育白叶枯病抗性水稻的育种中，最好选择所述SNP位点的基因型为AA的水稻作为亲本进行育种；在选育感白叶枯病的水稻育种中，最好选择所述SNP位点的基因型为GG的水稻作为亲本进行育种。
表2、SNP-12116672的基因型与水稻白叶枯病抗性关系分析
| 基因型 | 病斑长度(cm) | 对白叶枯病的抗性 |
| AA | 2.24±0.29b | 抗病 |
| GG | 34.2±0.88a | 高度感病 |
注：同列上标不同字母表示差异显著(P<0.05)。
从表2中可以看出：纯合基因型AA水稻品种的平均病斑长度分别为2.24cm,AA基因型对白叶枯病抗性均表现抗病；纯合基因型GG水稻品种的平均病斑长度为34.2cm，均为感病品种。两种基因型的病斑长度存在显著差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.检测水稻基因组中SNP位点的多态性或基因型的物质在如下任一中的应用，
(1)鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性；
(2)筛选或选育抗白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种；
(3)筛选或选育感白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种；
(4)水稻育种；
(5)制备鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的产品；
(6)制备筛选或选育抗白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品；
(7)制备筛选或选育感白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品；
(8)制备水稻育种的产品；
所述SNP位点为水稻6号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为A或G，为序列表中序列4的第23位核苷酸。
2.鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的方法，其特征在于：包括检测待测水稻基因组中SNP位点的基因型，根据所述基因型鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性，所述SNP位点为水稻6号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为A或G，为序列表中序列4的第23位核苷酸。
3.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的方法，其特征在于：所述SNP的基因型为AA或GG，所述AA是所述SNP位点为A的纯合型，所述GG是所述SNP位点为G的纯合型；
所述根据所述基因型鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性为如下任一种方式：
1)所述SNP的基因型为AA的待测水稻为或候选为抗白叶枯病的水稻；
2)所述SNP的基因型为GG的待测水稻为或候选为感白叶枯病的水稻；
3)所述SNP的基因型为AA的待测水稻的白叶枯病抗性高于所述SNP的基因型为GG的待测水稻的。
4.权利要求2或3所述的方法在水稻育种中的应用。
5.水稻育种的方法，其特征在于：所述方法为M1或M2，
M1、所述方法包括检测水稻基因组中权利要求1中所述SNP的基因型，选择所述SNP的基因型为AA的水稻作为亲本进行育种，所述AA是所述SNP位点为A的纯合型，所述方法的育种的目包括选育具有白叶枯病抗性的水稻；
M2、所述方法包括检测水稻基因组中权利要求1中所述SNP的基因型，选择所述SNP的基因型为GG的水稻作为亲本进行育种，所述GG是所述SNP位点为G的纯合型，所述方法的育种的目的包括选育感白叶枯病的水稻。
6.含有检测水稻基因组中SNP位点的多态性或基因型的物质的产品，其特征在于：所述产品为如下任一种，
C1)检测水稻白叶枯病抗性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
C2)鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的产品；
C3)用于水稻育种的产品；
C4)筛选或选育抗白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品；
C5)筛选或选育感白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品。
7.根据权利要求1所述的应用或权利要求6所述的产品，其特征在于：所述物质为如下D1)、D2)或D3)：
D1)含有扩增包括所述SNP位点在内的水稻基因组DNA片段的引物组合物；
D2)含有D1)所述引物组合物的PCR试剂；
D3)含有D1)所述引物组合物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的应用、方法或产品，其特征在于：所述引物组合物由引物A、引物B和引物C组成；
所述引物A为核苷酸序列是序列表中序列1的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列1的第22-44位的单链DNA；
所述引物B为核苷酸序列是序列表中序列2的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-43位的单链DNA；
所述引物C核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA分子。
9.DNA分子，其特征在于：核苷酸序列如序列表的序列4所示。
10.权利要求9所述的DNA分子在如下任一中的应用，
(1)鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性；
(2)筛选或选育抗白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种；
(3)筛选或选育感白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种；
(4)水稻育种；
(5)制备鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的产品；
(6)制备筛选或选育抗白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品；
(7)制备筛选或选育感白叶枯病的水稻单株或株系或品系或品种的产品；
(8)制备水稻育种的产品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211606767.XA CN115852037A (zh) | 2022-12-13 | 2022-12-13 | 鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的引物组合物及其应用 |
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Family Applications (1)
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2022
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