CN115850502A - 蛋白酶响应的gpcr受体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白酶响应的GPCR受体及其应用。本发明的蛋白酶响应的GPCR受体,包括胞外蛋白酶识别结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域;所述胞外蛋白酶识别结构域包含蛋白酶水解的肽段;所述胞内信号结构域包含HCV酶水解肽段、核定位序列NLS、Cas蛋白酶和偶联核转录因子。本发明蛋白酶响应的GPCR受体能够通过响应细胞外蛋白酶,诱导内源性dCas9组装入核激活调节自然杀伤细胞内的嵌合抗原受体信号通路,为开发新的精确免疫细胞疗法提供新的解决方案。
Description
技术领域
本发明涉及免疫细胞疗法技术领域,尤其是涉及蛋白酶响应的GPCR受体及其应用。
背景技术
细胞通过感知周围信号并将其转化为基因表达的变化来对环境做出反应,近年来,在原核和真核系统中都设计了合成网络,用于创造新功能并用于特定的应用,其中重新设计细胞传感器以触发非自然反应成为了细胞治疗的基础工程学。相关技术中,对于增强嵌合抗原受体免疫细胞功能的研究主要集中在人工合成受体的改进,但工程细胞的设计仍然缺乏高效多功能分子器件。
聚集的规则间隔的短回文重复序列CRISPR/Cas技术的进步彻底改变了基因表达的功能研究。相关研究表明,内切酶失活的dCas9偶联转录因子(例如VP64-P65)可用于控制特定基因的表达,使得dCas9激活系统成为精确控制细胞信号通路的强大工具。研究者利用CRISPR/dCas9偶联G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors,简称GPCRs)设计了Tango、ChaCha人工信号系统用于响应细胞外可溶性的小分子。然而,这些设计只利用了GPCR的人工或天然配体小分子,而对于设计人工蛋白酶响应的人工改造GPCR受体还少有报道。
因此,需要进一步的研究细胞信号通路来改善免疫细胞疗法,本发明期望通过设计人工蛋白酶响应的人工改造GPCR受体,进一步拓展人工信号通路的应用,为肿瘤免疫治疗提供新思路。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出蛋白酶响应的GPCR受体,能够通过感知和响应细胞外蛋白酶,诱导内源性dCas9组装入核激活调节免疫细胞内的GPCR受体信号通路,为开发新的精确制导免疫细胞疗法提供创新解决方案。
本发明还提供了蛋白酶响应的GPCR受体组合物。
本发明还提供了编码上述蛋白酶响应的GPCR受体或GPCR受体组合物的核酸分子。
本发明还提供了编码上述蛋白酶响应的GPCR受体或GPCR受体组合物的核酸分子慢病毒颗粒。
本发明还提供了重组蛋白,包括上述蛋白酶响应的GPCR受体或GPCR受体组合物。
本发明还提供了上述蛋白酶响应的GPCR受体、蛋白酶响应的GPCR受体组合物、编码上述蛋白酶响应的GPCR受体或GPCR受体组合物的核酸分子、编码上述蛋白酶响应的GPCR受体或GPCR受体组合物的慢病毒颗粒或含上述蛋白酶响应的GPCR受体或GPCR受体组合物的重组细胞在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
根据本发明的第一方面实施例的蛋白酶响应的GPCR受体,所述GPCR受体包括胞外蛋白酶识别结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域;
所述胞外蛋白酶识别结构域包含蛋白酶水解的肽段;
所述胞内信号结构域包含丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,简称HCV)蛋白酶水解肽段;
所述HCV酶水解肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一些实施例,至少具有以下有益效果:该蛋白酶响应的GPCR受体能够通过响应胞外蛋白酶信号,调控诱导内源性dCas9组装入核激活调节免疫细胞内的GPCR受体信号通路,可为开发新的精确制导免疫细胞疗法提供创新解决方案。
根据本发明的一些实施例,所述胞内信号结构域还包含核定位序列NLS;
优选的,所述核定位序列NLS的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
根据本发明的一些实施例,所述胞内信号结构域还包含Cas蛋白酶。
根据本发明的一些实施例,所述胞内信号结构域还包含偶联核转录因子。
根据本发明的一些实施例,所述蛋白酶水解的肽段包括烟草蚀刻病毒蛋白酶(Tobacco Etch Virus protease,简称TEV蛋白酶)水解肽段、凝血酶(Thrombin)水解肽段、MMP1水解肽段、PLAU尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(Urokinase plasminogen activator,简称PLAU)水解肽段、MMP13水解肽段、解整合素金属蛋白酶10水解肽段、解整合素金属蛋白酶17水解肽段、肠激酶水解肽段、凝血因子Xa水解肽段、弗林蛋白酶水解肽段、丙型肝炎病毒蛋白酶水解肽段、人鼻病毒3C蛋白酶水解肽段、李痘病毒蛋白酶水解肽段和向日葵温和花叶病毒蛋白酶水解肽段中的至少一种。
优选的,所述TEV蛋白酶水解肽段的氨基酸序列为:ENLYFQG(SEQ ID NO.2);
优选的,所述凝血酶水解肽段的氨基酸序列为:ENLYFQG(SEQ ID NO.20);
所述MMP1水解肽段的氨基酸序列为:GTAGLIGQ(SEQ ID NO.25);
所述PLAU水解肽段的氨基酸序列为:GGGRR(SEQ ID NO.27);
所述MMP13水解肽段的氨基酸序列为:GPAGLYEK(SEQ ID NO.30);
所述解整合素金属蛋白酶10水解肽段的氨基酸序列为:PRAEALKGG(SEQ IDNO.31);
所述解整合素金属蛋白酶17水解肽段的氨基酸序列为:PRAAAVKSP(SEQ IDNO.32);
所述肠激酶水解肽段的氨基酸序列为:DDDDK(SEQ ID NO.33);
所述凝血因子Xa水解肽段的氨基酸序列为:IEGD(SEQ ID NO.34)或INGD(SEQ IDNO.35);
所述弗林蛋白酶水解肽段的氨基酸序列为:RXRR(SEQ ID NO.36)或RXKR(SEQ IDNO.37);
所述丙型肝炎病毒HCV蛋白酶水解肽段的氨基酸序列为:DEMEECSQHL(SEQ IDNO.3);
所述人鼻病毒3C蛋白酶水解肽段的氨基酸序列为:LEVLFQP(SEQ ID NO.38)或LEVLFGP(SEQ ID NO.39);
所述李痘病毒蛋白酶水解肽段的氨基酸序列为:NVVVHQA(SEQ ID NO.40);
所述向日葵温和花叶病毒蛋白酶水解肽段的氨基酸序列为:EEIHLQS(SEQ IDNO.41)或EEIHLQG(SEQ ID NO.42)。
根据本发明的一些实施例,所述跨膜结构域包括GPR56跨膜肽段、ADGRL3跨膜肽段、CD97跨膜肽段、EMR1跨膜肽段中的至少一种。
优选的,所述跨膜结构域包括GPR56跨膜肽段。
根据本发明的一些实施例,所述蛋白酶水解的肽段为TEV蛋白酶水解的肽段时,胞外蛋白酶识别结构域-跨膜结构域肽段(TEV-GPCR肽段)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中氨基酸序列SEQ ID NO.1中下划线部分为TEV蛋白酶水解肽段。
优选的,所述蛋白酶水解的肽段为凝血酶水解肽段时,胞外蛋白酶识别结构域-跨膜结构域肽段(凝血酶-GPCR肽段)氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。
其中氨基酸序列SEQ ID NO.19中下划线部分为凝血酶水解肽段。
优选的,所述蛋白酶水解的肽段为MMP1水解肽段时,胞外蛋白酶识别结构域-跨膜结构域肽段(MMP1-GPCR肽段)氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
其中氨基酸序列SEQ ID NO.24中下划线部分为MMP1水解肽段。
优选的,所述蛋白酶水解的肽段为PLAU水解肽段时,胞外蛋白酶识别结构域-跨膜结构域肽段(PLAU-GPCR肽段)氨基酸序列为如SEQ ID NO.26所示。
其中氨基酸序列SEQ ID NO.26中下划线部分为PLAU水解肽段。
根据本发明的一些实施例,所述Cas蛋白酶包括dCas9蛋白酶或dCas12蛋白酶;
优选的,所述Cas蛋白酶为dCas9蛋白酶;
优选的,所述dCas9蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
根据本发明的一些实施例,所述偶联核转录因子包括VP64、MCP、P65、T2A和Puromycin中的至少一种。
根据本发明的一些实施例,所述VP64的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
根据本发明的一些实施例,所述MCP的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
根据本发明的一些实施例,所述P65的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
根据本发明的一些实施例,所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
根据本发明的一些实施例,所述Puromycin的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
优选的,所述偶联核转录因子为“VP64-MCP-P65”序列;
优选的,所述“VP64-MCP-P65”序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
根据本发明的一些实施例,所述dCas9蛋白酶的sgRNA序列为gagcactgtcctccgaacgt(SEQ ID NO.29)。
根据本发明的一些实施例,所述蛋白酶响应的GPCR受体的获取方法包括以下步骤:
步骤S1:将编码含有蛋白酶水解的肽段的胞外识别序列和编码跨膜结构域的基因整合到慢病毒表达载体,获得含有目的基因的表达载体;
步骤S2:将所述含有目的基因的表达载体转染宿主细胞获得蛋白酶响应的GPCR受体。
根据本发明的第二方面实施例的一种蛋白酶响应的GPCR受体组合物,包括第一蛋白酶响应的GPCR受体和第二蛋白酶响应的GPCR受体;其中,
所述第一蛋白酶响应的GPCR受体为上述的蛋白酶响应的GPCR受体,其中所述Cas蛋白酶的肽段为Cas蛋白酶N端肽段;
所述第二蛋白酶响应的GPCR受体为上述的蛋白酶响应的GPCR受体,其中所述Cas蛋白酶的肽段为Cas蛋白酶C端肽段;
优选的,所述Cas蛋白酶为dCas9蛋白酶,所述Cas蛋白酶N端肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示;所述Cas蛋白酶C端肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。
根据本发明的一些实施例,所述蛋白酶响应的GPCR受体组合物,包括第一蛋白酶响应的GPCR受体和第二蛋白酶响应的GPCR受体;
所述第一蛋白酶响应的GPCR受体为上述蛋白酶响应的GPCR受体,其中所述Cas蛋白酶的肽段为dCas9蛋白酶N端肽段;所述dCas9蛋白酶N端肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示;
所述第二蛋白酶响应的GPCR受体为上述的蛋白酶响应的GPCR受体,其中所述Cas蛋白酶的肽段为dCas9蛋白酶C端肽段;所述dCas9蛋白酶C端肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO.22所示。
根据本发明的一些实施例,所述第一蛋白酶响应的GPCR受体的偶联核转录因子包括T2A和Puromycin。
根据本发明的一些实施例,所述第二蛋白酶响应的GPCR受体的偶联核转录因子包括VP64、MCP和P65。
根据本发明的一些实施例,所述第一蛋白酶响应的GPCR受体和所述第二蛋白酶响应的GPCR受体中的胞外蛋白酶识别结构域中的蛋白酶水解的肽段相同或不同。
优选的,所述第一蛋白酶响应的GPCR受体和所述第二蛋白酶响应的GPCR受体中的胞外蛋白酶识别结构域中的蛋白酶水解的肽段不同。
根据本发明的一些实施例,所述第一蛋白酶响应的GPCR受体中的蛋白酶和所述第二蛋白酶响应的GPCR受体中的蛋白酶相同或不同。
根据本发明的一些实施例,所述第一蛋白酶响应的GPCR受体中的蛋白酶和所述第二蛋白酶响应的GPCR受体中的蛋白酶不同。
根据本发明的第三方面实施例的一种编码上述的蛋白酶响应的GPCR受体或编码上述的蛋白酶响应的GPCR受体组合物的核酸分子。
由于所述核酸分子编码了上述实施例的蛋白酶响应的GPCR受体或蛋白酶响应的GPCR受体组合物,因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
根据本发明的第四方面实施例的一种慢病毒颗粒,包含编码所述的蛋白酶响应的GPCR受体的核苷酸序列或编码所述的蛋白酶响应的GPCR受体组合物的核苷酸序列。
优选的,所述慢病毒颗粒还包含编码衔接蛋白的核苷酸序列。
优选的,所述慢病毒颗粒还包含编码HCV酶的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例,所述衔接蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
根据本发明的一些实施例,所述HCV酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
根据本发明的一些实施例,所述慢病毒颗粒的获得方法包括以下步骤:
步骤S1:构建表达蛋白酶水解肽段和跨膜肽段的慢病毒载体;
步骤S2:构建表达衔接蛋白偶联HCV酶的慢病毒载体;
步骤S3:将步骤S1和步骤S2中获得的慢病毒载体包装后转染宿主细胞,获得所述慢病毒颗粒。
优选的,所述慢病毒载体为pHR慢病毒载体。
优选的,所述pHR慢病毒载体含CMV或EFS启动子。
优选的,所述跨膜肽段选自GPR56跨膜肽段、ADGRL3跨膜肽段、CD97跨膜肽段、EMR1跨膜肽段中的至少一种。
根据本发明的第五方面实施例的一种重组细胞,表达上述的蛋白酶响应的GPCR受体和蛋白酶响应的GPCR受体组合物;
优选的,所述重组细胞还表达衔接蛋白偶联HCV酶。
优选的,所述衔接蛋白偶联HCV酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
根据本发明的一些实施例,所述重组细胞包括自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、调节性T细胞和γδT细胞。
优选的,所述重组细胞为NK-92自然杀伤细胞。
根据本发明的第六方面实施例的一种上述蛋白酶响应的GPCR受体在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
根据本发明的第七方面实施例的一种上述蛋白酶响应的GPCR受体组合物在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
根据本发明的第八方面实施例的一种编码上述的蛋白酶响应的GPCR受体或编码上述蛋白酶响应的GPCR受体组合物的核酸分子在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
根据本发明的第九方面实施例的一种上述慢病毒颗粒在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
根据本发明的第十方面实施例的一种上述重组细胞在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
根据本发明的一些实施例,至少具有以下有益效果:
1、本发明通过构建人工蛋白酶或天然蛋白酶响应的模块化改造GPCR受体,逻辑设计在转录后水平调节基因表达,促使哺乳动物细胞以一种可预测的方式对细胞外输入作出反应,克服癌症免疫治疗与智能细胞植入等应用的挑战。
2、本发明通过使用改造的粘附型GPCR受体来感知和响应细胞外不同浓度的蛋白酶,用于设计诱导内源性dCas9组装入核激活调节自然杀伤细胞内的嵌合抗原受体信号通路。这种蛋白酶响应方式介导的嵌合抗原受体信号通路将为合成生物学提供有用的工具、为开发新的精确制导免疫细胞疗法提供创新解决方案。
此外,本发明的基于蛋白酶响应方式介导的嵌合抗原受体信号转导方法将极大扩展免疫细胞治疗的抗原识别谱,为肿瘤微环境过量表达蛋白酶激活嵌合抗原受体表达提供新模式。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述,并且,部分地从说明书中变得显而易见,或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1是本发明实施例构建的TEV蛋白酶响应的人共改造GPCR受体载体示意图和受体激活后招募的接蛋白(Arrestin)-HCV蛋白酶复合物的载体示意图。
图2是本发明实施例TEV蛋白酶响应的人共改造GPCR受体介导dCas9入核激活嵌合抗原受体基因表达示意图,其中PCS为TEV蛋白酶切肽段;HCS为HCV蛋白酶切肽段。
图3是本发明实施例构建的TEV蛋白酶和凝血酶共响应的人共改造GPCR受体载体、及受体激活后招募的接蛋白(Arrestin)-HCV蛋白酶复合物的载体示意图。
图4是本发明实施例TEV蛋白酶和凝血酶共响应的人共改造GPCR受体介导dCas9入核激活嵌合抗原受体基因表达示意图,其中PCS1为TEV蛋白酶切肽段;PCS2为凝血酶切肽段;HCS为HCV蛋白酶切肽段。
图5是本发明实施例构建的MMP1和PLAU蛋白酶共响应的人共改造GPCR受体载体、受体激活后招募的接蛋白(Arrestin)-HCV蛋白酶复合物载体,以及dCas9激活的嵌合抗原受体载体示意图,其中CAR为嵌合抗原受体基因。
图6是本发明实施MMP1和PLAU蛋白酶共响应的人共改造GPCR受体介导dCas9入核激活嵌合抗原受体基因表达示意图,其中PCS1为MMP1蛋白酶切肽段;PCS2为PLAU蛋白酶切肽段;HCS为HCV蛋白酶切肽段。
图7是本发明实施的TEV蛋白酶响应后嵌合抗原受体在HEK293T细胞中的表达量荧光图。
图8是本发明实施例的转染细胞与未转染细胞杀伤率对比图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。
在实施方式中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术和条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未标明生产厂商的,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
除特别说明外,细胞株均来源于美国模式培养物集存库(ATCC),未改造的载体均来源于Addgene,包括包装质粒psPAX2(Addgene,#12260)和包膜质粒pMD2.G(Addgene,#12259),pHR质粒(Addg ene,#79121)。改造的pHR慢病毒载体交于生工生物工程(上海)股份有限公司合成,用于细胞培养的试剂均来源于赛默飞世尔科技(中国)有限公司,在实施例中所用的化学试剂均来源于Merk/Sigma。
实施例1一种TEV蛋白酶响应的人共改造GPCR受体
本实施例提供一种TEV蛋白酶响应的人共改造GPCR受体,具体通过以下方法获得:
1、构建含TEV-GPR56序列的慢病毒载体
利用基因工程手段将含有胞外蛋白酶识别结构域-跨膜结构域肽段(TEV-GPCR肽段)的“TEV-GPR56”核苷酸序列导入pHR慢病毒载体,本实施例中的含TEV-GPR56序列的慢病毒载体中的TEV-GPCR序列是通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成所得,其TEV-GPCR序列的氨基酸信息如下所示:
MTPQSLLQTTLFLLSLLFLVQGAHGRGHREDFRFCSQRNQTHRSSLHYKPTPDLRISIENSEEALTVHAPFPAAHPASRSFPDPRGLYHFCLYWNRHAGRLHLLYGKRDFLLSDKASSLLCFQHQEESLAQGPPLLATSVTSWWSPQNISLPSAASFTFSFHSPPHTAAHNASVDMCELKRDLQLLSQFLKHPQKASRRPSAAPASQQLQSLESKLTSVRFMGDMVSFEEDRINATVWKLQPTAGLQDLHIHSRQEEEQSEIMEYSVLLPRTLFQRTKGRSGEAEKRLLLVDFSSQALFQDKNSSQVLGEKVLGIVVQNTKVANLTEPVVLTFQHQLQPKNVTLQCVFWVEDPTLSSPGHWSSAGCETVRRETQTSCFCNHENLYFQGTYFAVLMVSSVEVDAVHKHYLSLLSYVGCVVSALACLVTIAAYLCSRRKPRDYTIKVHMNLLLAVFLLDTSFLLSEPVALTGSEAGCRASAIFLHFSLLTCLSWMGLEGYNLYRLVVEVFGTYVPGYLLKLSAMGWGFPIFLVTLVALVDVDNYGPIILAVHRTPEGVIYPSMCWIRDSLVSYITNLGLFSLVFLFNMAMLATMVVQILRLRPHTQKWSHVLTLLGLSLVLGLPWALIFFSFASGTFQLVVLYLFSIITSFQGFLIFIWYWSMRLQARGGPSPLKSNSDSARLPISSGSTSSSRI(SEQ ID NO.1)。
其中氨基酸序列SEQ ID NO.1中下划线部分为TEV蛋白酶水解肽段(SEQ IDNO.2),其前部分为GPR56的N端结构域,其后部分为GPR56的C端结构域。
将目的片段“TEV-GPR56”插入pHR慢病毒载体的多克隆位点后,其核苷酸序列如下:
GTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGCGCGTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCGGCACTGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGTTAATTAATGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACGTACGGCCACCATGAGCGCCACCATGGATGACTCCCCAGTCGCTGCTGCAGACGACACTGTTCCTGCTGAGTCTGCTCTTCCT GGTCCAAGGTGCCCACGGCAGGGGCCACAGGGAAGACTTTCGCTTCTGCAGCCAGCGGAACCAGACACACAGGAGC AGCCTCCACTACAAACCCACACCAGACCTGCGCATCTCCATCGAGAACTCCGAAGAGGCCCTCACAGTCCATGCCC CTTTCCCTGCAGCCCACCCTGCTTCCCGATCCTTCCCTGACCCCAGGGGCCTCTACCACTTCTGCCTCTACTGGAA CCGACATGCTGGGAGATTACATCTTCTCTATGGCAAGCGTGACTTCTTGCTGAGTGACAAAGCCTCTAGCCTCCTC TGCTTCCAGCACCAGGAGGAGAGCCTGGCTCAGGGCCCCCCGCTGTTAGCCACTTCTGTCACCTCCTGGTGGAGCC CTCAGAACATCAGCCTGCCCAGTGCCGCCAGCTTCACCTTCTCCTTCCACAGTCCTCCCCACACGGCCGCTCACAA TGCCTCGGTGGACATGTGCGAGCTCAAAAGGGACCTCCAGCTGCTCAGCCAGTTCCTGAAGCATCCCCAGAAGGCC TCAAGGAGGCCCTCGGCTGCCCCCGCCAGCCAGCAGTTGCAGAGCCTGGAGTCGAAACTGACCTCTGTGAGATTCA TGGGGGACATGGTGTCCTTCGAGGAGGACCGGATCAACGCCACGGTGTGGAAGCTCCAGCCCACAGCCGGCCTCCA GGACCTGCACATCCACTCCCGGCAGGAGGAGGAGCAGAGCGAGATCATGGAGTACTCGGTGCTGCTGCCTCGAACA CTCTTCCAGAGGACGAAAGGCCGGAGCGGGGAGGCTGAGAAGAGACTCCTCCTGGTGGACTTCAGCAGCCAAGCCC TGTTCCAGGACAAGAATTCCAGCCAAGTCCTGGGTGAGAAGGTCTTGGGGATTGTGGTACAGAACACCAAAGTAGC CAACCTCACGGAGCCCGTGGTGCTCACTTTCCAGCACCAGCTACAGCCGAAGAATGTGACTCTGCAATGTGTGTTC 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CAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGAC(SEQ ID NO.43)。
其中SEQ ID NO.43中下划线部分为插入的目标序列“TEV-GPCR序列”的核苷酸序列(SEQ ID NO.44)。
所制得的含TEV-GPCR序列的慢病毒载体示意图如图1中的a所示。
其中HCS为HCV酶切位点,其氨基酸序列为DEMEECSQHL(SEQ ID NO.3);
“NLS-dCas9-VP64-MCP-P65”的氨基酸序列具体信息如下:
其中氨基酸序列SEQ ID NO.4中下划线部分为NLS核定位序列:PKKKRKV(如SEQ IDNO.5所示);黑色加粗部分为dCas9序列(如SEQ ID NO.6所示);斜体加粗部分为VP64序列(如SEQ ID NO.7所示);加粗下划线部分为MCP序列(如SEQ ID NO.8所示);斜体下划线部分为P65(如SEQ ID NO.9所示)。
2、构建含衔接蛋白偶联HCV酶序列的慢病毒载体
采用基因工程手段通过linker片段将衔接蛋白与HCV蛋白酶连接,获得Arrestin-HCV酶片段,Arrestin-HCV酶片段的氨基酸序列为:
MGEKPGTRVFKKSSPNCKLTVYLGKRDFVDHLDKVDPVDGVVLVDPDYLKDRKVFVTLTCAFRYGREDLDVLGLSFRKDLFIATYQAFPPVPNPPRPPTRLQDRLLRKLGQHAHPFFFTIPQNLPCSVTLQPGPEDTGKACGVDFEIRAFCAKSLEEKSHKRNSVRLVIRKVQFAPEKPGPQPSAETTRHFLMSDRSLHLEASLDKELYYHGEPLNVNVHVTNNSTKTVKKIKVSVRQYADICLFSTAQYKCPVAQLEQDDQVSPSSTFCKVYTITPLLSDNREKRGLALDGKLKHEDTNLASSTIVKEGANKEVLGILVSYRVKVKLVVSRGGDVSVELPFVLMHPKPHDHIPLPRPQSAAPETDVPVDTNLIEFDTNYATDDDIVFEDFARLRLKGMKDDDYDDQLCGSGGGGSGGGGSGGGGSDYKDDDDKGSSGTGSGSGTSAPITAYAQQTRGLLGCIITSLTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATCINGVCWAVYHGAGTRTIASPKGPVIQMYTNVDQDLVGWPAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLCPAGHAVGLFRAAVCTRGVAKAVDFIPVENLETTMRSPVFTDNSSPPAVTLTHPITKIDTKYIMTCMSADLEVVT(SEQ IDNO.10)。
其中氨基酸序列SEQ ID NO.10下划线部分为linker片段(如SEQ ID NO.11所示);
氨基酸序列SEQ ID NO.9中linker片段前面的序列为衔接蛋白氨基酸序列(如SEQID NO.12所示);
氨基酸序列SEQ ID NO.9中linker片段后面的序列为HCV酶氨基酸序列(如SEQ IDNO.13所示)。
随后在Arrestin-HCV酶片段两端加上核外运信号NES片段,通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成后导入pHR慢病毒载体的多克隆位点BamHI与NotI即得,具体含衔接蛋白偶联HCV酶序列的慢病毒载体信息如图1中b所示,核外运信号NES片段的氨基酸序列为:LPPLERLTL(SEQ ID NO.14)。
3、转染细胞
首先将上述慢病毒载体分别克隆入DH5α感受态细胞(购买于赛默飞,货号18258012),挑选单克隆,并提取无内毒素的上述慢病毒质粒。利用该慢病毒转染HEK293T细胞制备TEV蛋白酶响应的人共改造GPCR受体,其具体制备过程具体如下:
(1)提前一天将HEK293T细胞以2.5×105个细胞/mL的速度接种在6孔板上,培养基为DMEM高糖完全培养基加上10%胎牛血清,培养至汇合率达70%。
(2)包装第一天:实验前将HEK293T细胞旧培养基吸净后PBS清洗一遍,加入培养基,然后将分别含0.75μg目的基因的两个pHR病毒载体混合,1μg包装质粒psPAX2(Addgene,#12260)和1μg包膜质粒pMD2.G(Addgene,#12259)混合于250μL Opti-MEM培养基和7.5μL Mirus TransIT-LT1转染试剂中,获得转染复合物,将上述转染复合物在室温下(37℃±1℃)培养30分钟后,然后均匀地逐滴加入HEK293T细胞培养基中,轻柔混匀后,置于37℃、5%CO2孵箱培养。
(3)包装第二天:吸净HEK293T细胞旧培养基,加入新鲜DMEM高糖完全培养基8ml,置于孵箱中继续培养。
(4)包装第三天:用无菌注射器从上清液中提取慢病毒,并通过0.45μm聚偏氟乙烯过滤器过滤,得到表达含有目的基因的慢病毒颗粒,随后立即转导靶细胞或放置-80℃冻存备用。
在制备过程中,当在转化的HEK-293T细胞培养基中加入5~20U/mL TEV蛋白酶时,dCas9响应蛋白酶入核激活含荧光蛋白的嵌合抗原受体基因表达,其具体流程图如图2所示(具体激活表达过程验证参考检测例)。通过荧光蛋白表达量可以定量分析蛋白酶激活的人工信号通路,进而把优化后的载体设计移植入免疫细胞。
实施例2TEV-凝血酶响应的人共改造GPCR受体组合物
本实施例提供两种蛋白酶响应的人共改造GPCR受体组合物,具体通过以下方法获得:
1、构建含TEV-aGPCR-dCas9(N段)序列的慢病毒载体
利用基因工程手段将作为胞外识别元件的胞外靶标分子结合结构域“TEV-GPR56”序列导入pHR慢病毒载体,本实施例中的含TEV-GPR56序列的慢病毒载体中的TEV-GPR56序列是通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成所得,其TEV-GPR56序列的氨基酸信息如SEQ ID NO.1所示,其中氨基酸序列SEQ ID NO.1中下划线部分为TEV蛋白酶水解肽段(SEQID NO.2)。
将目的片段“TEV-GPR56”插入pHR慢病毒载体的多克隆位点BamHI与NotI后所制得的含TEV-GPR56序列的慢病毒载体示意图如图3中的a所示。
其中HCS为HCV酶切位点,其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;
“NLS-dCas9(N端)-T2A-Puromycin”的氨基酸序列为:
其中,氨基酸序列SEQ ID NO.15中下划线部分为dCas9(N端)的氨基酸序列(如SEQID NO.16所示)。
氨基酸序列SEQ ID NO.15中黑色加粗部分为T2A的氨基酸序列(如SEQ ID NO.17所示);氨基酸序列SEQ ID NO.15中无下划线未且加粗部分为Puromycin的氨基酸序列(如SEQ ID NO.18所示)。
2、构建含凝血酶-aGPCR-dCas9(C端)序列的慢病毒载体
利用基因工程手段将作为胞外识别元件的胞外靶标分子结合结构域“凝血酶-GPR56”序列导入pHR慢病毒载体的多克隆位点BamHI与NotI,本实施例中的含凝血酶-GPR56序列的慢病毒载体中的凝血酶-GPR56序列是通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成所得,其凝血酶-GPR56序列的氨基酸信息如下所示:
MTPQSLLQTTLFLLSLLFLVQGAHGRGHREDFRFCSQRNQTHRSSLHYKPTPDLRISIENSEEALTVHAPFPAAHPASRSFPDPRGLYHFCLYWNRHAGRLHLLYGKRDFLLSDKASSLLCFQHQEESLAQGPPLLATSVTSWWSPQNISLPSAASFTFSFHSPPHTAAHNASVDMCELKRDLQLLSQFLKHPQKASRRPSAAPASQQLQSLESKLTSVRFMGDMVSFEEDRINATVWKLQPTAGLQDLHIHSRQEEEQSEIMEYSVLLPRTLFQRTKGRSGEAEKRLLLVDFSSQALFQDKNSSQVLGEKVLGIVVQNTKVANLTEPVVLTFQHQLQPKNVTLQCVFWVEDPTLSSPGHWSSAGCETVRRETQTSCFCNHLVPRGSTYFAVLMVSSVEVDAVHKHYLSLLSYVGCVVSALACLVTIAAYLCSRRKPRDYTIKVHMNLLLAVFLLDTSFLLSEPVALTGSEAGCRASAIFLHFSLLTCLSWMGLEGYNLYRLVVEVFGTYVPGYLLKLSAMGWGFPIFLVTLVALVDVDNYGPIILAVHRTPEGVIYPSMCWIRDSLVSYITNLGLFSLVFLFNMAMLATMVVQILRLRPHTQKWSHVLTLLGLSLVLGLPWALIFFSFASGTFQLVVLYLFSIITSFQGFLIFIWYWSMRLQARGGPSPLKSNSDSARLPISSGSTSSSRI(SEQ ID NO.19)。
其中氨基酸序列SEQ ID NO.19中下划线部分为凝血酶水解肽段(SEQ ID NO.20)。
将目的片段“凝血酶-GPR56”插入pHR慢病毒载体的多克隆位点后所制得的含凝血酶-GPR56序列的慢病毒载体示意图如图3中的b所示。
其中HCS为HCV酶切位点,其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;
“NLS-dCas9(C端)-VP64-MCP-P65”的氨基酸序列为:
PKKKRKVKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHD LLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRD KQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELV KVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYV DQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKARGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVR EINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITL ANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDP KKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLF ELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRV ILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLY ETRIDLSQLGGDDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLINGTASGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPVSKLMASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQKRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYSAGGGGSGGGGSGGGGSGPKKKRKVAAAGSPSGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPLAQPPAPAPVLTPGPPQSLSAPVPKSTQAGEGTLSEALLHLQFDADEDLGALLGNSTDPGVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVSMSHSTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGTSGLPNGLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISSSGQGGGGSGFSVDTSALLDLFSPSVTVPDMSLPDLDSSLASIQELLSPQEPPRPPEAENSSPDSGKQLVHYTAQPLFLLDPGSVDTGSNDLPVLFELGEGSYFSEGDGFAEDPTISLLTGSEPPKAKDPTVS(SEQ ID NO.21)
其中氨基酸序列SEQ ID NO.21中有下划线部分为dCas9(C端)的氨基酸序列(如SEQ ID NO.22所示);无下划线部分为VP64-MCP-P65的氨基酸序列(如SEQ ID NO.23所示)。
3、构建含衔接蛋白偶联HCV酶序列的慢病毒载体
采用基因工程手段将衔接蛋白通过linker片段与HCV蛋白酶连接,获得Arrestin-HCV酶片段,Arrestin-HCV酶片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
随后在Arrestin-HCV酶片段两端加上核外运信号NES片段后通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成后导入pHR慢病毒载体的多克隆位点即得,其中linker片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示,核外运信号NES片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
4、转染细胞
首先将上述慢病毒载体分别克隆入DH5α感受态细胞(购买于赛默飞,货号18258012),挑选单克隆,并提取无内毒素的上述慢病毒质粒。使用该慢病毒转染HEK293T细胞的方法制备TEV蛋白酶响应的人共改造GPCR受体,其具体制备过程具体如下:
(1)提前一天将HEK293T细胞以2.5×105个细胞/mL的速度接种在6孔板上,培养至汇合率达70%。
(2)包装第一天:实验前将HEK293T细胞旧培养基吸净后PBS清洗一遍,加入DMEM高糖完全培养基8ml,然后将分别含目的序列各0.75μg的3个pHR慢病毒载体混合,1μg包装质粒psPAX2和1μg包膜质粒pMD2.G混合于250μL Opti-MEM培养基和7.5μL Mirus TransIT-LT1转染试剂中,获得转染复合物,将上述转染复合物在室温下孵育30分钟后,然后均匀地逐滴加入HEK293T细胞培养基中,轻柔混匀后,置于37±1℃、5%CO2孵箱培养。
(3)包装第二天:吸净HEK293T细胞旧培养基,加入新鲜DMEM高糖完全培养基8ml,置于孵箱中继续培养。
(4)包装第三天:用无菌注射器从上清液中提取慢病毒,并通过0.45μm聚偏氟乙烯过滤器过滤,得到表达含有目的基因的慢病毒颗粒,放置-80℃冻存备用。
采用上述方法分别获得含有Arrestin-HCV酶片段的慢病毒颗粒、含有TEV-aGPR56-dCas9(N端)片段慢病毒颗粒和含有凝血酶-aGPR56-dCas9(C端)片段慢病毒颗粒,并将其转染HEK-293T细胞,筛选阳性克隆子,当蛋白酶响应后,其dCas9蛋白酶入核激活含荧光蛋白的嵌合抗原受体基因表达,具体流程图如图4所示。
实施例3MMP1-PLAU蛋白酶响应的人共改造GPCR受体组合物
1、构建含MMP1-GPCR-dCas9序列的慢病毒载体
利用基因工程手段将作为胞外识别元件的胞外靶标分子结合结构域“MMP1-GPR56”序列导入pHR慢病毒载体的多克隆位点BamHI与NotI,本实施例中的含MMP1-GPR56序列的慢病毒载体中的MMP1-GPR56序列是通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成所得,其MMP1-GPR56序列的氨基酸信息如下所示:
MTPQSLLQTTLFLLSLLFLVQGAHGRGHREDFRFCSQRNQTHRSSLHYKPTPDLRISIENSEEALTVHAPFPAAHPASRSFPDPRGLYHFCLYWNRHAGRLHLLYGKRDFLLSDKASSLLCFQHQEESLAQGPPLLATSVTSWWSPQNISLPSAASFTFSFHSPPHTAAHNASVDMCELKRDLQLLSQFLKHPQKASRRPSAAPASQQLQSLESKLTSVRFMGDMVSFEEDRINATVWKLQPTAGLQDLHIHSRQEEEQSEIMEYSVLLPRTLFQRTKGRSGEAEKRLLLVDFSSQALFQDKNSSQVLGEKVLGIVVQNTKVANLTEPVVLTFQHQLQPKNVTLQCVFWVEDPTLSSPGHWSSAGCETVRRETQTSCFCNHGTAGLIGQTYFAVLMVSSVEVDAVHKHYLSLLSYVGCVVSALACLVTIAAYLCSRRKPRDYTIKVHMNLLLAVFLLDTSFLLSEPVALTGSEAGCRASAIFLHFSLLTCLSWMGLEGYNLYRLVVEVFGTYVPGYLLKLSAMGWGFPIFLVTLVALVDVDNYGPIILAVHRTPEGVIYPSMCWIRDSLVSYITNLGLFSLVFLFNMAMLATMVVQILRLRPHTQKWSHVLTLLGLSLVLGLPWALIFFSFASGTFQLVVLYLFSIITSFQGFLIFIWYWSMRLQARGGPSPLKSNSDSARLPISSGSTSSSRI(SEQ ID NO.24)。
其中氨基酸序列SEQ ID NO.24中下划线部分为MMP1水解肽段(SEQ ID NO.25)。
将目的片段“MMP1-GPR56”插入pHR慢病毒载体的多克隆位点后所制得的含MMP1-GPR56序列的慢病毒载体示意图如图5中的a所示。
其中HCS为HCV酶切位点,其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;“NLS-dCas9(N端)-T2A-Puromycin”的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
2、构建含PLAU-aGPCR-dCas9序列的慢病毒载体
利用基因工程手段将作为胞外识别元件的胞外靶标分子结合结构域“PLAU-GPR56”序列导入pHR慢病毒载体的多克隆位点BamHI与NotI,本实施例中的含GPR56-T PLAU序列的慢病毒载体中的PLAU-GPR56序列是通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成所得,其PLAU-GPR56序列的氨基酸信息如下所示:
MTPQSLLQTTLFLLSLLFLVQGAHGRGHREDFRFCSQRNQTHRSSLHYKPTPDLRISIENSEEALTVHAPFPAAHPASRSFPDPRGLYHFCLYWNRHAGRLHLLYGKRDFLLSDKASSLLCFQHQEESLAQGPPLLATSVTSWWSPQNISLPSAASFTFSFHSPPHTAAHNASVDMCELKRDLQLLSQFLKHPQKASRRPSAAPASQQLQSLESKLTSVRFMGDMVSFEEDRINATVWKLQPTAGLQDLHIHSRQEEEQSEIMEYSVLLPRTLFQRTKGRSGEAEKRLLLVDFSSQALFQDKNSSQVLGEKVLGIVVQNTKVANLTEPVVLTFQHQLQPKNVTLQCVFWVEDPTLSSPGHWSSAGCETVRRETQTSCFCNHGGGRRTYFAVLMVSSVEVDAVHKHYLSLLSYVGCVVSALACLVTIAAYLCSRRKPRDYTIKVHMNLLLAVFLLDTSFLLSEPVALTGSEAGCRASAIFLHFSLLTCLSWMGLEGYNLYRLVVEVFGTYVPGYLLKLSAMGWGFPIFLVTLVALVDVDNYGPIILAVHRTPEGVIYPSMCWIRDSLVSYITNLGLFSLVFLFNMAMLATMVVQILRLRPHTQKWSHVLTLLGLSLVLGLPWALIFFSFASGTFQLVVLYLFSIITSFQGFLIFIWYWSMRLQARGGPSPLKSNSDSARLPISSGSTSSSRI(SEQ ID NO.26)。
其中氨基酸序列SEQ ID NO.26中下划线部分为PLAU水解肽段(SEQ ID NO.27)。
将目的片段“PLAU-GPR56”插入pHR慢病毒载体的多克隆位点后所制得的含PLAU-GPR56序列的慢病毒载体示意图如图5中的b所示。
其中HCS为HCV酶切位点,其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;
“NLS-dCas9(C端)-VP64-MCP-P65”的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。
3、构建含衔接蛋白偶联HCV酶序列的慢病毒载体
采用基因工程手段将衔接蛋白通过linker片段与HCV蛋白酶连接,获得Arrestin-HCV酶片段,Arrestin-HCV酶片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
随后在Arrestin-HCV酶片段两端加上核外运信号NES片段后通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成后导入pHR慢病毒载体的多克隆位点即得,具体载体信息参见图5中c所示,其中linker片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示,核外运信号NES片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
4、转染细胞
首先将上述慢病毒载体分别克隆入DH5α感受态细胞(购买于赛默飞,货号18258012),挑选单克隆,并提取无内毒素的上述慢病毒质粒。使用该慢病毒转染HEK293T细胞的方法制备TEV蛋白酶响应的人共改造GPCR受体,其具体制备过程具体如下:
(1)提前一天将HEK293T细胞以2.5×105个细胞/mL的速度接种在6孔板上,培养至汇合率达70%。
(2)包装第一天:实验前将HEK293T细胞旧培养基吸净后PBS清洗一遍,加入DMEM高糖完全培养基中,然后将分别含目的序列各0.75μg的3个pHR慢病毒载体混合,1μg包装质粒psPAX2和1μg包膜质粒pMD2.G混合于250μL Opti-MEM培养基和7.5μL Mirus TransIT-LT1转染试剂中,获得转染复合物,将上述转染复合物在室温下37℃±1℃培养30min后,然后均匀地逐滴加入HEK293T细胞培养基中,轻柔混匀后,置于37℃±1℃、5%CO2孵箱培养。
(3)包装第二天:吸净HEK293T细胞旧培养基,加入新鲜DMEM高糖完全培养基8ml,置于孵箱中继续培养。
(4)包装第三天:用无菌注射器从上清液中提取慢病毒,并通过0.45μm聚偏氟乙烯过滤器过滤,得到表达含有目的基因的慢病毒颗粒,放置-80℃冻存备用。
在本实施例中通过把目的片段导入含CMV或EFS启动子的慢病毒pHR载体,然后转染HEK-293T细胞或者免疫细胞,筛选阳性克隆表达细胞,在细胞培养过程中当同时存在MMP1与PLAU蛋白酶时,dCas9的组装入核与VP64-GAL4正交转录因子结合,促进嵌合抗原受体在自然杀伤细胞的表达,具体流程可参见图6所示。此外,本实施例通过在载体(Addgene##85427)中插入嵌合抗原受体基因,来检测dCas9激活嵌合抗原受体的表达。其GAL4上游激活序列具体核苷酸序列为:GGAGCACTGTCCTCCGAACG(SEQ ID NO.28)。
检测例
为了验证蛋白酶响应的人共改造GPCR受体激活人工信号通路,本实施例采用了上述实施例1所获得的慢病毒载体颗粒,并将其转染到HEK293T细胞,验证人工改造GPCR受体激活嵌合抗原受体的表达。其中,本实施例中dCas9的sgRNA的核苷酸序列为GAGCACTGTCCTCCGAACGT(SEQ ID NO.29),sgRNA序列克隆入lenti U6-sgRNA/EF1a-mCherry载体(Addgene,#114199)。
1、蛋白酶响应的嵌合抗原受体的表达量检测
本实例中表达携带mEGFP标签的嵌合抗原受体的HEK293T细胞是通过在载体(Addgene#79123)中将mCherry替换为含mEGFP的嵌合抗原受体基因(参照图5中的d),通过流式细胞仪筛选BFP阳性细胞获得。
本实施例中采用荧光显微镜检测mEGFP荧光蛋白用于表征嵌合抗原受体的表达量,具体检测方法如下:
(1)在检测前48小时,将HEK293T细胞旧培养基吸净后PBS清洗一遍,加入DMEM高糖完全培养基中,然后加入1.5μg含sgRNA序列的lenti U6-sgRNA/EF1a-mCherry载体慢病毒载体,1μg包装质粒psPAX2和1μg包膜质粒pMD2.G混合于250μL Opti-MEM培养基和7.5μLMirus TransIT-LT1转染试剂中,获得转染复合物,将上述转染复合物在室温(28℃±2℃)下培养30分钟后,然后均匀地逐滴加入HEK293T细胞培养基中,轻柔混匀后,置于37℃、5%CO2孵箱培养。
(2)在检测前12小时,加入10U/mL的TEV蛋白酶至细胞培养基,继续置于37℃±1℃培养12小时后,置于荧光显微镜下观察。
检测结果如图7所示,从图7中可以看出,未加入蛋白酶的对照组中(左图),荧光蛋白表达量很少,在加入TEV蛋白酶后,含绿色荧光蛋白mEGFP标签的嵌合抗原受体表达量显著提升(右图)。
2、抗肿瘤效果验证
首先分别将未转染和转染的NK-92细胞(2×105细胞/孔)与MDA-MB-231细胞在96孔板共培养8h,其中效应细胞(NK-92细胞)与靶细胞(MDA-MB-231细胞)的比例为3:1、5:1和10:1。其中MDA-MB-231细胞培养条件为高糖DMEM培养基加上10%胎牛血清和1%青霉素与链霉素;NK-92细胞培养条件为α-MEM培养基加上200U/ml人Ⅱ型干扰素、10%马血清、10%胎牛血清。所有细胞培养在5%CO2和37℃±1℃湿培养箱中。
通过收集共培养体系细胞,采用流式细胞仪检测CD107a脱颗粒、IFNγ干扰素和TNFα的表达水平。其中对于CD107a的表达,其具体检测方法为:
(1)将20μL抗体CD107a-FITC加入80μL NK-92细胞共培养悬液中(2×106细胞/ml~3×106细胞/ml),得到抗体细胞混悬液。
(2)将抗体细胞混悬液加入平底96孔板中,向每孔中注入2μL CD28/CD49d共刺激抗体。此外,将浓度为64μg/ml的100μL CEF肽添加到溶液中作为CEF处理对照组,相同量的细胞培养液作为阴性对照组。在37℃条件下,在5%CO2培养箱中培养60min,然后添加0.5μL含monensin的BD-GolgiStop,继续培养120min。
(3)洗涤后,使用CD3-APC和CD8 PreCP抗体(1:200)与细胞共孵育培养30min。细胞离心后,丢弃上清液,并将其重新悬浮在130μL细胞培养基中,随后采用流式细胞仪分析,至少收集记录5万个事件。
对于IFNγ干扰素和TNFα的表达水平,其具体检测方法为:采用100μL BD-Cytofix/Cytoperm溶液固定细胞,并在4℃黑暗中孵育20min。洗涤和离心后,将细胞悬浮在Perm/Wash缓冲液中,加入20μL IFN-γ-PE和20μL TNF-α-PE抗体(1:200),并在4℃黑暗中孵育30min,随后采用流式细胞仪分析,至少收集记录5万个事件。
如图8所示,结果表明:相比于未转染NK-92细胞,转染后的NK-92细胞在靶细胞与肿瘤细胞比例在1:3、1:5、1:10时都具有显著的肿瘤细胞杀伤效率,并且随着NK-92与肿瘤细胞比例的提高而杀伤效率上升。
综上所述,本发明通过构建人工蛋白酶或天然蛋白酶响应的模块化改造GPCR受体,逻辑设计在转录后水平调节基因表达,促使哺乳动物细胞以一种可预测的方式对细胞外输入作出反应,克服癌症免疫治疗与智能细胞植入等应用的挑战。
此外,本发明建立了细胞外微环境蛋白酶联合响应的嵌合抗原受体在免疫细胞中的表达,通过使用改造的粘附型GPCR受体来感知和响应细胞外不同浓度的蛋白酶,用于设计诱导内源性dCas9组装入核激活调节自然杀伤细胞内的嵌合抗原受体信号通路。该蛋白酶响应平台将为合成生物学提供有用的工具、为开发新的精确制导免疫细胞疗法提供创新解决方案。
上面对本发明实施例作了详细说明,但本发明不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (11)
1.蛋白酶响应的GPCR受体,其特征在于,所述GPCR受体包括胞外蛋白酶识别结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域;
所述胞外蛋白酶识别结构域包含所述蛋白酶的水解肽段;
所述胞内信号结构域包含HCV酶水解肽段;
所述HCV酶水解肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶响应的GPCR受体,其特征在于,所述胞内信号结构域还包含核定位序列NLS;
优选的,所述核定位序列NLS的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示;
优选的,所述胞内信号结构域还包含Cas蛋白酶;
优选的,所述胞内信号结构域还包含偶联核转录因子。
3.根据权利要求1所述的蛋白酶响应的GPCR受体,其特征在于,所述蛋白酶的水解肽段包括TEV蛋白酶水解肽段、凝血酶水解肽段、MMP1水解肽段、PLAU水解肽段、MMP13水解肽段、解整合素金属蛋白酶10水解肽段、解整合素金属蛋白酶17水解肽段、肠激酶水解肽段、凝血因子Xa水解肽段、弗林蛋白酶水解肽段、丙型肝炎病毒蛋白酶水解肽段、人鼻病毒3C蛋白酶水解肽段、李痘病毒蛋白酶水解肽段和向日葵温和花叶病毒蛋白酶水解肽段中的至少一种;
所述TEV蛋白酶水解肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述凝血酶水解肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示;
所述MMP1水解肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示;
所述PLAU水解肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示;
所述MMP13水解肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示;
所述解整合素金属蛋白酶10水解肽段的氨基酸序列如SEQID NO.31所示;
所述解整合素金属蛋白酶17水解肽段的氨基酸序列如SEQID NO.32所示;
所述肠激酶水解肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示;
所述凝血因子Xa水解肽段的氨基酸序列为如SEQID NO.34或SEQ ID NO.35所示;
所述弗林蛋白酶水解肽段的氨基酸序列为如SEQ ID NO.36或SEQ IDNO.37所示;
所述丙型肝炎病毒蛋白酶水解肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;
所述人鼻病毒3C蛋白酶水解肽段的氨基酸序列如SEQID NO.38或SEQ ID NO.39所示;
所述李痘病毒蛋白酶水解肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示;
所述向日葵温和花叶病毒蛋白酶水解肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.41或SEQIDNO.42所示。
4.根据权利要求1所述的蛋白酶响应的GPCR受体,其特征在于,所述跨膜结构域包括黏附型GPCR跨膜肽段;
优选的,所述黏附型GPCR跨膜肽段包括GPR56跨膜肽段、ADGRL3跨膜肽段、CD97跨膜肽段、EMR1跨膜肽段中的任一种。
5.根据权利要求2所述的蛋白酶响应的GPCR受体,其特征在于,所述Cas蛋白酶包括dCas9蛋白酶或dCas12蛋白酶。
6.一种蛋白酶响应的GPCR受体组合物,其特征在于,包括第一蛋白酶响应的GPCR受体和第二蛋白酶响应的GPCR受体;其中,
所述第一蛋白酶响应的GPCR受体为权利要求1-4任一项所述的蛋白酶响应的GPCR受体,其中所述Cas蛋白酶的肽段为Cas蛋白酶N端肽段;
所述第二蛋白酶响应的GPCR受体为权利要求1-4任一项所述的蛋白酶响应的GPCR受体,其中所述Cas蛋白酶的肽段为Cas蛋白酶C端肽段;
优选的,所述Cas蛋白酶为dCas9蛋白酶,所述Cas蛋白酶N端肽段的氨基酸序列如SEQID NO.16所示;所述Cas蛋白酶C端肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。
7.一种核酸分子,其特征在于,包含编码如权利要求1-5中任一项所述的蛋白酶响应的GPCR受体的核苷酸序列或编码如权利要求6所述的蛋白酶响应的GPCR受体组合物的核苷酸序列。
8.一种慢病毒颗粒,其特征在于,包含编码如权利要求1-5中任一项所述的蛋白酶响应的GPCR受体的核苷酸序列或编码如权利要求6所述的蛋白酶响应的GPCR受体组合物的核苷酸序列;
优选的,所述慢病毒颗粒还包含编码衔接蛋白的核苷酸序列,所述衔接蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示;
优选的,所述慢病毒颗粒还包含编码HCV酶的核苷酸序列,所述HCV酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
9.一种重组细胞,其特征在于,表达如权利要求1-5中任一项所述的蛋白酶响应的GPCR受体或权利要求6所述的蛋白酶响应的GPCR受体组合物;
优选的,所述重组细胞还表达衔接蛋白偶联HCV酶。
10.根据权利要求9所述的重组细胞,其特征在于,所述重组细胞包括自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、调节性T细胞和γδT细胞。
11.a~e任一种在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用,
a、如权利要求1-5任一项所述蛋白酶响应的GPCR受体;
b、如权利要求6所述蛋白酶响应的GPCR受体组合物;
c、如权利要求7所述的核酸分子;
d、如权利要求8所述的慢病毒颗粒;
e、如权利要求9或10所述的重组细胞。
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