CN115844938A - 黑沙蒿总黄酮及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种黑沙蒿总黄酮及其制备方法与应用。其制备方法包括：以黑沙蒿地上部分为原料，粉碎，得黑沙蒿原粉；将黑沙蒿原粉放入索氏提取器，用石油醚脱脂脱色，得黑沙蒿粉；黑沙蒿粉以料液比1:15‑40浸泡在浓度为40‑90％乙醇溶液中，在30‑80℃、200W功率下超声辅助提取20‑120min，过滤，滤液经减压浓缩、真空冷冻干燥，制得粉末，即为黑沙蒿总黄酮。本发明提供的黑沙蒿总黄酮具有良好的抗氧化活性，由于黑沙蒿来源广泛，黑沙蒿总黄酮用作提高动物抗氧化能力的饲料添加剂是切实可行的，具有极大应用推广价值。
Description
技术领域
本发明实施例植物提取技术领域，具体涉及一种黑沙蒿总黄酮及其制备方法与应用。
背景技术
动物生产为人类消费提供了宝贵而丰富的产品。在动物有机体中，氧化反应通常由细胞代谢产生的活性氧或活性氮引发，这是众多生化途径和细胞功能的基础。动物通过促氧化和内源性抗氧化机制维持最佳的组织氧化还原平衡。当身体受到导致抗氧化系统失衡的内部和外部条件的压力时，就会发生氧化应激，导致细胞成分的氧化损伤。氧化损伤主要表现为DNA、蛋白质和脂质的改变，包括DNA的碱基修饰、蛋白质的羰基化和脂质过氧化后丙二醛的形成。几十年来，氧化过程一直是动物和肉类科学家关注的焦点，因为由氧化应激引起的氧化损伤可以直接导致畜禽机体免疫力低下、慢性炎症等疾病，致使畜禽的生产性能下降，影响畜产品品质，造成巨大的经济损失。基于营养控制或在饲料中应用具有抗氧化潜力的植物化学物质、矿物质元素、维生素等的抗氧化策略被认为是目前处理这些不良反应的安全方法。
黑沙蒿为菊科蒿属植物，是传统的民间药物，常用于止血、清热、祛湿和拔脓，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、降血脂、抗溃疡和增强免疫等多种药理功效。黑沙蒿主要含有多糖类、黄酮类和萜类物质，其中黄酮类化合物是发挥抗氧化作用的主要活性成分。黄酮类化合物作为一类天然的多酚单体，因其富含酚羟基故具极强的抗氧化活性，目前公开报道的黑沙蒿黄酮类化合物主要包括野樱素、异野樱素、圣草素-7-甲醚、芫花素等。
CN102265906B公开了一种黑沙蒿杀菌剂及其制备方法，用于防治果树、蔬菜及花卉上的霜霉病和灰霉病；CN110960565A公开了一种黑沙蒿根提取物及其制备方法和应用，用于治疗过敏性鼻炎。经检索，尚未见黑沙蒿总黄酮提取物的制备及其在抗氧化活性方面的相关报道。
发明内容
为此，本发明提供一种黑沙蒿总黄酮及其制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，本发明提供一种黑沙蒿总黄酮的制备方法，包括：
以黑沙蒿地上部分为原料，粉碎，得黑沙蒿原粉；
将黑沙蒿原粉放入索氏提取器中，用石油醚脱脂脱色，得黑沙蒿粉；
黑沙蒿粉以料液比1:15-40浸泡在浓度为40-90％乙醇溶液中，在30-80℃、200W功率下超声辅助提取20-120min，过滤，滤液经减压浓缩、真空冷冻干燥，制得粉末，即为黑沙蒿总黄酮。
进一步地，所述黑沙蒿粉以料液比1:30浸泡在浓度为60％乙醇溶液中，在50℃、200W功率下超声辅助提取60min。
进一步地，所述脱脂脱色在回流条件下进行，时间为10-15h。
进一步地，将黑沙蒿地上部分洗净后，于室温下自然阴干，粉碎，过50-100目筛，得黑沙蒿原粉。
进一步地，采用0.45μm过滤器进行过滤。
根据本发明实施例的第二方面，本发明提供一种黑沙蒿总黄酮，其由如上任一项所述的方法制成。
根据本发明实施例的第三方面，本发明提供如上所述的黑沙蒿总黄酮在制备具有抗氧化活性的饲料添加剂中的应用。
本发明实施例具有如下优点：
本发明对黑沙蒿总黄酮的提取工艺进行了优化，能够提高黑沙蒿总黄酮的提取率。同时对黑沙蒿总黄酮的抗氧化活性进行检测，结果显示，其具有良好的还原力和清除DPPH自由基的能力，并能提高肉仔鸡血清过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量。由于黑沙蒿来源广泛，黑沙蒿总黄酮用作提高动物抗氧化能力的饲料添加剂是切实可行的，具有极大应用推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例提供的芦丁标准曲线；
图2为本发明实施例提供的超声时间对黑沙蒿总黄酮提取量的影响；
图3为本发明实施例提供的超声温度对黑沙蒿总黄酮提取量的影响；
图4为本发明实施例提供的乙醇浓度对黑沙蒿总黄酮提取量的影响；
图5为本发明实施例提供的料液比对黑沙蒿总黄酮提取量的影响；
图6为本发明实施例提供的黑沙蒿总黄酮总还原能力；
图7为本发明实施例提供的黑沙蒿总黄酮对DPPH自由基的清除作用；
图8为本发明实施例提供的黑沙蒿总黄酮对肉仔鸡血清CAT和GSH-Px含量的影响。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1黑沙蒿总黄酮的制备
1.1原料
新鲜的黑沙蒿(地上部分)洗净后室温下自然阴干，粉碎过筛(60目)，筛下物即为黑沙蒿原粉。
1.2方法
1.2.1黑沙蒿总黄酮的制备
将黑沙蒿原粉在索氏提取器中用石油醚于回流条件下脱脂脱色12h，过滤，收集固相，室温下干燥，以防止石油醚残留，得黑沙蒿粉。将1g黑沙蒿粉浸泡在30mL 60％的乙醇溶液中(料液比为1:30)，在50℃、200W功率下超声辅助提取1h，过滤，收集提取液，之后通过0.45μm过滤器过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩后经真空冷冻干燥，制得粉末，即为黑沙蒿总黄酮。
1.2.2总黄酮含量的测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法，即在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在下，黄酮与铝盐生成螯合物，加入氢氧化钠显橙红色。以芦丁为标准品，准确吸取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL芦丁标准品原液分别置于1.5mL的离心管中，再分别补加0.8、0.6、0.4、0.2和0mL的60％乙醇溶液，封盖混匀，得到不同浓度的芦丁标准溶液。分别取300μL放在1.5mL的离心管中，加入5％亚硝酸钠溶液30μL，充分混匀后反应6min；加入10％硝酸铝溶液40μL，充分混匀后反应6min；最后加入4％的氢氧化钠溶液100μL，充分混匀后反应10min。每个样品各取200μL，加入到96孔板中，标记每个孔中芦丁原液的浓度，放入全自动酶标仪中，设置波长为510nm，测得吸光度值，以芦丁标准溶液质量浓度(x)为横坐标，吸光度值(y)为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线回归方程y＝2.2543x+0.0631，相关系数为R2＝0.9996。
1.2.3黑沙蒿总黄酮提取量的测定
准确称取1.00g黑沙蒿粉，经乙醇溶液浸泡，超声提取，将所得提取液抽滤后定容至50mL，即得含黑沙蒿总黄酮的滤液。测定滤液的吸光度，根据标准曲线方程，求得相应总黄酮的浓度，计算黑沙蒿总黄酮的提取量：
A(mg/g)＝(C×V×n)/m
式中：A为黑沙蒿总黄酮提取量(mg/g)，C为对应总黄酮的浓度(mg/mL)，V为滤液总体积(mL)，n为稀释倍数，m为黑沙蒿粉样品质量(g)。
1.2.4超声辅助提取工艺优化
采用1.2.1中超声提取步骤方法，固定其他因素不变，对超声辅助提取黑沙蒿中总黄酮，进行乙醇浓度、料液比、超声温度、超声时间单因素试验优化提取工艺条件，每组平行3次，各因素提取条件见表1。
表1
对不同超声时间所提取的黑沙蒿总黄酮的提取量进行测定，结果见图2。由图2可知，其他单因素条件不变，黑沙蒿总黄酮的提取量在超声时间20～60min内呈上升趋势，当超声时间超过60min，总黄酮提取量降低，总黄酮提取量在超声60min时提取效果最佳。这可能是因为黑沙蒿总黄酮随着超声时间变长，能在提取溶剂中充分析出，当超声时间到达一定值时，超声时间过长会使本身具有抗氧化性的黄酮类化合物部分氧化，进而使得提取量降低。
对不同超声温度所提取的黑沙蒿总黄酮的提取量进行测定，结果见图3。由图3可知，其他单因素提取条件不变，黑沙蒿总黄酮提取量随着超声温度升高而逐渐增大，当超声温度超过50℃后，总黄酮提取量呈下降趋势，提取效果在50℃达到最佳。温度升高，会促进分子的运动加快，从而促进黄酮类化合物溶出；温度超过50℃后，过高的温度可能会破坏黄酮类物质的分子结构，同时可能促使其他杂质溶出，故总黄酮提取量会受到影响。
对不同乙醇浓度所提取的黑沙蒿总黄酮的提取量进行测定，结果见图4。由图4可知，乙醇浓度为40～60％时，总黄酮提取量呈上升趋势；乙醇浓度高于60％，总黄酮提取量呈下降趋势，总黄酮提取量在60％乙醇浓度时提取率最高。这可能是因为乙醇浓度越高，醇溶性杂质、色素及亲脂性强的组分浸出量会增加，导致总黄酮类化合物提取率下降。
对不同料液比所提取的黑沙蒿总黄酮的提取量进行测定，结果见图5。由图5可知，在料液比为1:30(g/mL)时达到最高，随着溶剂体积的增大，总黄酮提取量降低。这可能是因为适当增加溶剂体积，总黄酮提取量增加；当提取溶剂的体积到达一定值时，总黄酮提取量就会达到饱和，随着溶剂体积增大，可能溶出了其他醇溶性的杂质，影响显色反应降低吸光度。
综上所述，选取在超声温度50℃，料液比1:30(g/mL)，乙醇浓度60％，超声时间60min条件下提取黑沙蒿总黄酮，黑沙蒿总黄酮提取量较优。
实施例2黑沙蒿总黄酮体外抗氧化活性检测
2.1还原力测定
取上述优化条件下的提取物浓缩冻干成粉，使用60％的乙醇复溶并稀释，得浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的黑沙蒿总黄酮的待测样品溶液，使用相应浓度的Vc作对照试验。取1％的铁氰化钾2.5mL与0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液0.2mL，加入待测样品溶液，50℃恒温放置30min，加入2.5mL 10％的三氯乙酸，离心取上清液1mL，加入1mL的0.1％氯化铁、4mL蒸馏水混匀，静置10min，于700nm处测吸光度。还原力计算公式：还原力＝A1-A2；其中，A1为样品组吸光度，A2为样品本底吸光度(以等体积蒸馏水代替氯化铁溶液)。
对黑沙蒿总黄酮和Vc的总还原能力进行测定，结果见图6。物质的抗氧化能力和还原能力呈正比。由图6可知，质量浓度在0.1～1.0mg/mL的时候，黑沙蒿总黄酮和Vc的还原能力随着其相对应浓度的增加而逐渐变大，并且还原力与总黄酮质量浓度呈正相关。
2.2DPPH自由基清除作用
取10mL的试管6个，分别加入3mL 0.1mmol/L的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液和不同浓度的黑沙蒿总黄酮3mL，混合均匀，放置30min。调零(用无水乙醇)，在517nm处测定其吸光度记为Ai；测定3mL无水乙醇和3mL不同质量浓度黑沙蒿总黄酮样品液的混合液，517nm处的吸光度记为Aj；测定3mL无水乙醇和3mL DPPH溶液的混合液在517nm处的吸光度记为A0。根据公式DPPH自由基清除率＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％计算，Vc为做阳性对照，计算清除率。
对黑沙蒿总黄酮和Vc的DPPH自由基清除率进行测定，结果见图7。由图7可知，黑沙蒿总黄酮对DPPH自由基的清除能力随着黑沙蒿总黄酮质量浓度的增加逐渐增强。相同质量浓度的黑沙蒿总黄酮对DPPH自由基的清除能力和Vc相比较而言略低。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
实施例3黑沙蒿总黄酮体内抗氧化活性检测
3.1材料与方法
3.1.1试验材料
黑沙蒿总黄酮自备：取上述优化条件下的提取物浓缩冻干成粉。
3.1.2试验设计
3.1.2.1试验动物及营养水平
试验采用单因子随机区组试验设计，选取192只1日龄AA肉仔鸡，随机分为4个处理，每个处理6个重复，每个重复8只鸡。其中对照组(CON)饲喂基础日粮，ATF1、ATF2和ATF3组在CON组的基础上分别添加250、500和750mg/kg的黑沙蒿总黄酮，试验期42天。本发明的基础日粮组成及营养水平见表2，日粮为本领域常用的日粮配方，本领域技术人员可根据实际需要对各组分进行调整。
表2基础日粮组成及营养水平(风干基础)％
注：1)预混料为每千克日粮中提供：维生素A 9000IU，维生素D3 3000IU，维生素E26mg，维生素K3 1.20mg，维生素B1 3.00mg，维生素B28.00 mg，维生素B6 4.40mg，维生素B12 0.012mg，烟酸45mg，叶酸0.75mg，生物素0.20mg，泛酸钙15mg，铁100mg，铜10mg，锌108mg，锰120mg，碘1.5mg，硒0.35mg。
2)粗蛋白为实测值，其余为计算值。
3.1.3样品采集与测定指标
于试验第42天从每个重复随机选取一只鸡采集血样，制备血清，采用南京建成生物工程研究所研发的商业用试剂盒测定CAT和GSH-Px的活性。
3.1.4数据统计
利用SAS9.2进行单因素方差分析(Oneway-ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较。P<0.05表示组间差异显著，P>0.05表示组间差异不显著。
3.2结果
如图8所示，与CON组相比，ATF1、ATF2和ATF3组的CAT含量显著升高(P<0.05)，且ATF3组显著高于ATF1和ATF2组(P<0.05)；与CON组相比，ATF2和ATF3组的GSH-Px含量显著升高(P<0.05)。注：数据柱形图未标注字母或标注相同字母表示为差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Claims (7)
1.一种黑沙蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，包括：
以黑沙蒿地上部分为原料，粉碎，得黑沙蒿原粉；
将黑沙蒿原粉放入索氏提取器，用石油醚脱脂脱色，得黑沙蒿粉；
黑沙蒿粉以料液比1:15-40浸泡在浓度为40-90％乙醇溶液中，在30-80℃、200W功率下超声辅助提取20-120min，过滤，滤液经减压浓缩、真空冷冻干燥，制得粉末，即为黑沙蒿总黄酮。
2.根据权利要求1所述的黑沙蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，所述黑沙蒿粉以料液比1:30浸泡在浓度为60％乙醇溶液中，在50℃、200W功率下超声辅助提取60min。
3.根据权利要求1所述的黑沙蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，所述脱脂脱色在回流条件下进行，时间为10-15h。
4.根据权利要求1所述的黑沙蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，将黑沙蒿地上部分洗净后，于室温下自然阴干，粉碎，过50-100目筛，得黑沙蒿原粉。
5.根据权利要求1所述的黑沙蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，采用0.45μm过滤器进行过滤。
6.一种黑沙蒿总黄酮，其特征在于，其由权利要求1-5任一项所述的方法制成。
7.权利要求6所述的黑沙蒿总黄酮在制备具有抗氧化活性的饲料添加剂中的应用。
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2022
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