KR101087293B1 - 소나무로부터 항산화 물질을 추출하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소나무로부터 항산화 물질을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 적송잎에 대하여 아임계 추출과정을 수행하여 얻은 추출물에 대하여 열수 추출과정을 수행하여 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)을 추출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추출방법은 소나무로부터 항산화 물질 특히, 다양한 생리활성을 가진 프로안토시아니딘을 고순도로 분리할 수 있으므로 항산화 물질이 사용되는 의약 및 기능성식품이나 화장품과 관련된 다양한 산업에 폭 넓게 이용될 수 있다.

소나무, 항산화 물질, 프로안토시아니딘, 아임계, 열수

Description

소나무로부터 항산화 물질을 추출하는 방법{A METHOD OF EXTRACTING ANTIOXIDANTS FROM PINE TREES}

본 발명은 소나무로부터 항산화 물질을 추출하는 방법에 관한 것에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 소나무로부터 프로안토시아니딘을 추출하는 고순도 및 고효율로 추출하는 방법에 관한 것이다.

의학의 발달과 더불어 평균수명이 증가하고 노령인구가 증가하여 최근 통계청이 발표한 자료에 의하면, 2005년 총인구 중에서 65세 이상 노령인구의 비율은 9.1%를 차지하고 있고, 2020년에는 평균수면이 78.1세에 달하며, 2020년에는 전체인구의 13.2%까지 증가할 것으로 추산되고 있어 노화로 인한 문제도 심각한 실정이다. 또한, 우리나라는 경제성장에 힘입어 최근 통계청이 발표한 자료에 의하면 우리나라 1인당 GNP는 2004년 14,162달러였으며, 매년 10% 정도 증가하여 국민들의 생활수준이 향상됨에 따라 식생활이 변화하여 곡류와 채소류의 섭취가 감소하고 육류 등 지방이 풍부한 음식의 섭취가 증가하는 경향을 보이고 있다. 이러한 식생활의 변화를 포함한 사회적 조건의 변화로 인해, 질병의 양상도 변화하여 과거 주요한 사망원인인 전염성 질병에 의한 사망자 수는 급격하게 즐어 들고 있는 반면에 암, 비만이나 당뇨 등의 대사증후군이나 성인병, 뇌혈관 질환 또는 관상동맥질환 등의 심혈관계 질환에 의한 사망자 수는 꾸준히 증가하고 있다.

노화, 암, 뇌혈관 질환, 심혈관계 질환 등과 같은 질환의 원인이 자유라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)인 것으로 인식되고 있다. 상기 활성산소종은 생물체에 침입된 병균 등에 의한 생물학적 스트레스나 지구 환경 악화에 따른 각종 환경 스트레스 등의 스트레스로 인하여 생물 유지에 필수적으로 요구되는 산소의 반응성이 높아진 산소를 의미할 수 있으며, 상기 반응성이 높은 산소는 심각한 생리적 장애 등을 유발할 수 있게 된다. 일 예로, 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical), 과산화수소 또는 일중항산소 등이 있다.

구체적으로, 상기 자유라디칼 또는 활성산소종은 세포를 파괴하거나 피부 진피층의 결합조직을 절단하거나 교차 결합을 일으키므로 주름형성, 아토피성 피부염, 여드름 또는 피부암과 같은 피부 관련 질병뿐만 아니라 암, 심근경색증(myocardial infarction), 뇌졸증(stroke), 죽상동맹경화증(atherosclerosis) 등을 포함하는 심혈관계질환, 근위축측삭경화증(amyotrophic laternal sclerosis)이나 파킨스씨 병(Parkinsion's disease, PD)과 같은 퇴행성 신경질환(chronic neurodegenerative disease)의 원인이 되는 것으로 보고되어 있다. 또한, 자유라디칼 또는 활성산소종은 인체 내에서 지질을 과산화시켜 과산화지질이라고 하는 해로운 물질을 생성할 수 있고, 상기 과산화지질은 혈관에 작용하여 동맥경화나 혈정과 같은 각종 성인병의 원인이 되는 것으로 보고 되어 있다.

상기한 바와 같이, 평균수명이 증가하고 사회의 노령화가 진행되면서 노화 및 퇴행성 질환과 같은 노화와 관련된 질병에 대한 관심이 증대되고 있고, 경제성장 및 식생활의 변화 등에 따라 대사증후군이나 성인병 등에 대한 관심이 증대되고 있다. 이러한 질병에 대한 관심의 증가와 함께 상기 질병의 원인으로 보고된 자유라디칼 또는 활성산소종에 대한 관심도 증대되면서, 항산화효과를 갖는 물질에 대한 관심이 증대되고 있다.

생체 내에는 이러한 자유라디칼 또는 활성산소종을 제거하는 항산화체계로 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD), 퍼옥시다제(peroxidase, POD) 또는 카탈라제(catalase, CAT) 등의 고분자 항산화 효소와 비타민 C, 비타민 E 또는 글루타치온(glutathione) 등의 항산화 물질 등이 존재한다.

그러나, 공해나 자외선 또는 상기 생물학적 스트레스를 포함하는 여러 원인 및 노화에 의해서 점차적으로 인체의 항산화체계는 정상 작동을 하지 못하게 되며, 이러한 경우 항산화 물질을 섭취함으로써 방어할 수 있도록, 활성산소종을 제거할 수 있는 물질 즉, 항산화제의 체내 공급이 요구되고 있다. 이러한 항산화제의 체내 공급 요구에 따라 항산화제 또는 항산화 효과를 갖는 식품 등을 섭취하여 상기 질병을 예방 또는 치료하거나 노화를 지연시키고 자 하는 노력이 증가하고 있는 실정이다.

종래에 뛰어난 항산화력을 지닌 합성 항산화제로는 BHA(butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxytoluene) 또는 TBHQ(tertiary butylhydropuinone) 등이 보고 되어 있다.

그러나, 상기 합성 항산화제는 체내 흡수 물질의 일부가 독성을 지니고 있어, 기형발생인자 및 발암 물질화 될 수 있고, 간 비대증을 유발하거나 간장 중 마이크로소말 효소활성(microsomal enzyme activity)을 증가시킬 수 있어, 폐나 신장 등의 장기 조직의 병리적인 해를 유발시키는 등의 안정성 문제가 제기되고 있다.

따라서, 근래에는 보다 인체에 안정하고, 항산화력이 뛰어난 항산화제를 개발하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구의 일환으로 천연 항산화제 즉, 천연물질로부터 수득한 항산화제에 대한 만은 연구가 진행되고 있다.

현재까지 천연물질 특히, 천연 식물을 대상으로 항산화 효과를 탐색한 결과 보고된 천연 항산화성분들로는 토코페롤(tocopherol) 류, 플라본(flavone) 유도체, 이소플라본(isoflavone), 플라보노이드(flavonoid) 류, 세사몰(sesamol), 고시폴(gossypol), 페놀릭산(phenolic acids), 피틱산(phytic acid), 사포닌(saponin), 트립신 저해제(trypsin inhibitor) 등이 있다.

한편, 소나무(Pinus densiflora)는 상록성 침엽교목으로서 우리나라를 비롯하여 중국이나 일본 등 전 아시아 지역의 임야에서 널리 자생하고 있다. 소나무 특히, 소나무 수피에는 자유라디칼 또는 활성산소종을 강력하게 제거하는 천연 항산화 물질 특히, 플라보노이드 류의 성분이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 저비용으로 손쉽게 얻을 수 있는 장점이 있는 소나무 수피 또는 솔잎으로부터 항산화 작용 등의 생리활성이 우수한 기능성 식품 등을 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다.

상기 솔잎은 수분 58.1%, 단백질 4.5%, 지질 3.9%, 당질 19.6%, 섬유소 13.3%로 구성되어 있으며, 주요 활성성분으로는 퀘르세틴(quercetin) 또는 캠퍼롤(kaempferol) 등의 플라보노이드 류, α-오이넨(α-oinene), β-피넨(β-pinene), 캄펜(camphene) 등의 정유 성분 및 수지, 당류, 카로틴(carotene) 또는 비타민 C 등이 있다. 솔잎의 주요 활성성분인 플라보노이드 류 중 그 기능성이 우수한 것으로 알려진 성분은 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)이다. 상기 프로안토시아니딘은 안토시아니딘(anthocyanidin)의 폴리 페놀성 물질로서 플라보노이드 생합성 경로를 통해 합성되는 식물의 이차대사산물에 해당하고, 많은 종류의 식물에 존재하며 알칼로이드 또는 단백질을 침전시키는 고분자 물질 (분자량 약 500 내지 3,000 Da) 이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 프로안토시아니딘은 일반적으로 flavon-3-ol류 및 flavan-3,4-diol류를 구성단위로 축합 또는 중합에 의한 2량체 이상의 구조를 갖는다. 상기 프로안토시아니딘은 탁월한 항산화 활성이 인정되는 항산화제로 보고되어 있고, 이외에도 항균, 항바이러스, 항암, 항염증, 항알러지, 노화방지효과 또는 혈관확장능 등의 기능성이 보고되고 있다. 구체적으로, 생체내 실험(in vivo test)에서 프로안토시아니딘은 비타민 C, 비타민 E 또는 베타카로틴 보다 우수한 활성산소 소거능이 확인되었고, 산화적 조직손상을 억제하는 능력도 월등히 높은 것으로 보고되고 있다.

식물체 중에 함유되어 있는 프로안토시아니딘은 주로 추출에 의하여 수득되고 있다. 종래에 프로안토시아니딘의 추출에 사용된 용매는 주로 유기용매가 사용되었다. 메탄올, 아세톤 또는 초산에틸 등과 같은 유기용매 또는 이들의 혼합물을 사용하여 프로안토시아니딘을 추출하는 경우, 추출물을 식품이나 의약품 또는 그 원료로 사용함에 있어서 여러 제약이 따를 뿐만 아니라 상기 유기용매의 회수 및 정제 등에 많은 비용이 발생한다는 문제점이 있었다. 한편, 물을 이용하여 식물체로부터 프로안토시아니딘을 추출하는 경우, 추출물의 사용범위에 대한 제한이 없으나, 탄수화물류가 같이 추출되어, 프로안토시아니딘의 순도와 수율이 떨어지는 문제점이 있었다. 따라서, 물을 용매로 하는 경우 프로안토시아니딘과 함께 추출되는 탄수화물류를 제거하기 위하여 흡착제를 사용하거나 탄수화물 발효 등의 공정을 수행하여 프로안토시아니딘의 순도를 높여야 하므로, 추가 공정의 수행에 따른 비용이 증가한다는 문제점이 있었다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 다양한 목적에 사용할 수 있는 용매를 이용하여 고순도의 항산화물질을 고효율로 추출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소나무로부터 항산화 물질을 추출하는 방법을 제공한다. 보다 상세하게는, 아임계 추출 단계 및 열수 추출 단계를 포함하는 소나무 잎으로부터 프로안토시아니딘을 추출하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 용매의 종류에 따라 유기용매의 회수 및 정제 등의 추가 공정이나 프로안토시아니딘과 함께 추출되는 탄수화물류를 제거하기 위한 추가 공정으로 인하여 추가적인 비용과 시간이 소요되는 종래 추출방법의 문제점을 해결하기 위한 연구를 거듭한 결과, 물을 용매로 하는 열수 추출법과 아임계 유체를 이용한 아임계 추출법을 함께 수행하는 경우 뛰어난 수율로 순도 높은 프로안토시아니딘을 추출할 수 있는 것을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 있어서, 초임계 유체(supercritical fluid)란 그 물질이 액체와 기체의 두 상태가 서로 분간할 수 없게 되는 임계 상태에서의 온도와 이때의 증기압 즉, 그 물질의 임계점 보다 높은 온도와 압력하에 있을 때 즉, 초임계 이상의 상태에 있는 유체를 의미한다. 아임계 유체(sub-supercritical fluid)란 초임계 유체와 거의 비슷한 성격을 가진 유체를 의미한다. 또한, 아임계 추출법이란 아임계 유체를 이용한 추출법을 의미한다.

본 발명의 항산화 물질 추출방법은 아임계 유체를 이용하여 아임계 추출법으로 소나무의 아임계 추출물을 제조하는 단계 및 상기 아임계 추출물에 물을 추가하고 열수 추출법을 수행하여 열수 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 아임계 유체를 이용하여 아임계 추출법으로 소나무의 아임계 추출물을 제조하는 단계 및 상기 아임계 추출물에 물을 추가하고 열수 추출법을 수행하여 열수 추출물을 제조하는 단계를 수행한 후, 추가로 상기 열수 추출물에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 첨가하고, 생성된 침전물을 제거하는 여과단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 소나무(Pinus densiflora)는 상록성 침엽교목으로서 우리나라를 비롯하여 중국이나 일본 등 전 아시아 지역의 임야에서 널리 자생하고 있다. 상기 소나무는 일 예로 적송(Pinus densiflora Sieb & Zucc.), 해송(Pinus thumbergii Parlatore), 금강소나무(Pinus densiflora Sieb & Zucc. For. erecta Uyeki), 구주소나무(Pinus sylvestris L.), 솔잣나무(Pinus pinea Cupressus Sempervirens) 등일 수 있고, 바람직하게는 적송일 수 있다. 또한, 상기 소나무는 바람직하게는 플라보노이드 류의 성분이 다량 함유되어 있는 소나무 수피일 수 있고, 더욱 바람직하게는 프로안토시아니딘이 다량 포함되어 있고, 프로안토시아니딘의 추출이 용이하며, 경제적으로 유리한 적송잎일 수 있다.

상기 적송잎은 추출용매와의 접촉면적을 최대로 증가시켜 추출수율을 높이기 위해 분말 형태일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항산화 물질 추출방법에는 상기 적송잎 분말을 제조하는 단계가 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 적송잎 분말을 제조하는 단계는 소나무의 항산화활성 물질을 최대한 유지시키기 위하여, 상기 적송잎을 50 내지 70℃, 바람직하게는 60℃에서 열풍건조하고 파쇄하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 항산화물질은 항산화활성을 가진 물질, 구체적으로 폴리페놀릭 화합물일 수 있으며, 바람직하게는 프로안토시아니딘일 수 있다.

상기 아임계 추출물을 제조하는 단계에서 사용되는 아임계 유체는 이산화탄소(CO₂), 에틸렌, 에탄, 프로판, 아세틸렌 또는 암모니아 등일 수 있고, 바람직하게는 이산화탄소일 수 있다.

상기 아임계 추출법으로 소나무의 아임계 추출물을 제조하는 단계의 조건 즉, 추출물 제조시 상기 아임계 유체의 압력은 50 내지 70 kgf/cm², 바람직하게는 55 내지 65 kgf/cm², 더욱 바람직하게는 60 kgf/cm² 이고, 온도는 50 내지 170℃, 바람직하게는 70 내지 150℃, 더욱 바람직하게는 75 내지 130℃일 수 있으며, 추출시간은 100분 내지 250분, 바람직하게는 120분 내지 225분, 더욱 바람직하게는 150분 내지 200분일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 아임계 추출법은 프로안토시아니딘의 추출 효율과 아임계 추출용매의 제거효율을 고려하여, 우선 110 내지 130℃, 바람직하게는 115 내 지 125℃의 조건에서 90분 내지 200분, 바람직하게는 110분 내지 145분 동안 프로안토시아니딘을 추출한 후, 70 내지 90℃, 바람직하게는 75 내지 85℃의 조건에서 5분 내지 100분, 바람직하게는 10분 내지 75분 동안, 더욱 바람직하게는 15분 내지 50분 동안 아임계 용매를 제거하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 아임계 추출물에 대한 열수 추출단계는 열수를 이용한 통상의 방법으로 수행할 수 있고, 구체적으로는 상기 아임계 추출법에 의해 얻어진 상기 아임계 추출물에 상기 건조 및 분쇄과정을 수행한 적송잎 100g을 기준으로 열수 500 내지 1500 ml, 바람직하게는 700 내지 1000 ml를 첨가하여 열수 추출법을 수행하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 열수 추출법의 온도 조건은 80 내지 175℃, 바람직하게는 100 내지 150℃, 더욱 바람직하게는 115 내지 135℃일 수 있고, 상기 열수 추출과정의 기간은 30분 내지 200분, 바람직하게는 50분 내지 100분일 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 아임계 유체를 이용한 아임계 추출법으로 소나무의 아임계 추출물을 제조하는 단계 및 상기 아임계 추출물에 열수를 첨가하여 열수 추출법을 수행하는 단계에 추가로 에탄올을 첨가하여 에탄올 침전법을 수행할 수 있다.

상기 에탄올 침전법은 상기 열수 추출법을 수행하여 제조된 열수 추출물에 에탄올을 첨가하고, 여과하여 침전물을 제거하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 에탄올은 에탄올 또는 에탄올 수용액일 수 있으며, 상기 에탄올 수용액은 80 내지 99%(w/w), 바람직하게는 90 내지 99%(w/w)의 에탄올 수용액일 수 있으며, 상기 에탄올은 바람직하게는 95 내지 99%(w/w) 에탄올 수용액일 수 있다.

상기 에탄올의 첨가는 상기 에탄올을 전체 혼합물, 구체적으로 상기 열수 추 출물과 에탄올의 혼합물에 포함된 에탄올의 농도가 60 내지 80 %, 바람직하게는 65 내지 75 %가 되도록 첨가하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 에탄올을 첨가한 후, 생성되는 침전물은 여과지를 이용하는 여과법으로 제거할 수 있다. 상기 여과법을 이용하여 여과를 수행하여 얻어진 여과액은 농축하여 농축액으로 제조할 수 있다.

또한, 상기 침전법을 수행한 후에, 추가로 원심분리를 행하여 상층액과 침전물로 분리함으로써, 아임계 열수추출물 상층액 또는 아임계 열수추출물 침전물을 수득할 수 있다.

상기 열수추출물 상층액의 경우, 상층액의 수율 자체가 기존의 추출방법에 비하여 현저하게 우수할 뿐만 아니라, 항산화활성을 측정한 결과, 열수 추출물에 비하여 약 100%, 아임계 추출물에 비하여 약 900% 이상의 활성이 향상되었고, 추출물에 포함된 폴리페놀성 성분이나 프로안토시아니딘의 함량도 기존 아임계 추출법에 비하여 각각 800% 및150% 향상된 것으로 확인되어 현저하게 수율이 상승되는 것으로 확인되었다.

따라서, 상기 원심분리를 수행하여 아임계 열수추출물 상층액을 수득하는 방법의 경우, 기존 방법에 비하여 현저하게 개선된 효과가 있는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 아임계 열수추출물 침전물의 경우, 항산화활성을 측정한 결과, 열수 추출물에 비하여 약 110%, 아임계 추출물에 비하여 약 1200% 이상의 활성이 향상된 것으로 확인되어 현저하게 우수한 항산화활성을 가진 물질임이 확인되었고, 전체 폴리페놀 화합물의 수득 수율이 단순 열수추출법에 비하여 약 100%, 아임계 추출법에 비하여 약 1400%가 향상된 수율을 나타내었고, 프로안토시아니딘의 수득 수율의 경우, 열수추출법에 비하여 약 110%, 아임계 추출법에 비하여 약 500%가 향상된 수율을 나타내는 것으로 확인되었다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 아임계 추출법과 열수 추출법을 함께 사용하는 항산화 물질 추출방법은 기존 방법에 비하여, 항산화능이 우수한 물질을 추출할 수 있을 뿐만 아니라, 특히 항산화활성을 가진 물질, 구체적으로 폴리페놀성 물질, 바람직하게는 프로안토시아니딘을 현저하게 상승된 수율로 수득할 수 있는 장점이 있다. 또한, 상기 사용된 용매는 에탄올 또는 그 수용액과 물이므로, 식용가능한 용매여서 다양한 용도로 사용할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명은 기존 방법에 비하여, 항산화능이 우수한 물질, 구체적으로 프로안토시아니딘을 현저하게 향상된 수율로 수득할 수 있는 방법으로, 인체에 안정하고, 항산화력이 뛰어난 천연 항산화제인 프로안토시아니딘을 우리나라 전역에 분포되어 있는 저가의 소나무로부터 우수한 효율로 수득할 수 있는 방법을 제공하는 것이어서, 활성산소 또는 항산화물질과 관련된 건강기능식품, 의약품 또는 화장품 등 다양한 산업분야에 폭 넓게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다.　 그러나, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것을 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 추출물의 제조방법

본 실험에 사용한 소나무는 2007년 7월 지리산에서 채취한 적송잎으로, 상기 적송잎을 60℃에서 열풍건조한 후 믹서로 분말화시켰 제조하였다.

비교예 1인 적송잎 열수 추출물은 적송잎 분말 743 g에 물 4,500 ml을 첨가하여 121℃에서 15분간 추출한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다. 비교예 2인 아임계(Sub-supercritical) 추출물은 적송잎 분말 232 g에 60 kgf/cm³의 CO₂ 가스를 이용하여 separator 1은 120℃로, separator 2는 80℃로 설정하여 210분간 추출을 행한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다.

본 발명인 실시예는 적송잎 분말 518 g에 60 kgf/cm³의 CO₂ 가스를 이용하여 separator 1은 120℃로, separator 2는 80℃로 설정하여 180분간 추출을 행하였고, 추출물에 물 4,000 ml를 첨가하여 121℃에서 60분간 추출을 행하였다. 상기 추출물에 99% 에탄올을 최종농도 70%가 되도록 첨가하고, 이에 따른 침전물을 Whatman 1 여과지로 여과하여 제거한 액을 Rotary Evaporator (Eyler Co. LTD., Japan)로 농축한 후 원심분리(5,000 × g, 20분)를 행하고 상층액과 침전물을 각각 따로 동결건조하여 실시예 1(아임계 열수추출 상층액, SSHS)과 실시예 2(아임계 열수추출 침전물, SSHP)을 제조하였다.

상기 추출물을 수득한 결과, 비교예 1의 경우, 원료 742.5 g으로부터 추출물 45.3 g을 획득하여 6.1%의 수율을 나타냈으며, 비교예 2는 아임계 추출물의 경우, 원료 232.0 g으로부터 추출물 8.0 g을 획득하여 3.5%의 수율을 나타내었다.

한편, 실시예 1의 경우, 원료 518.0 g으로부터 56.7 g을 획득하여 10.9%의 수율로 비교예에 비하여 현저하게 상승된 높은 수율을 나타냈다. 또한, 아임계 열수추출 침전물(SSHP)의 경우, 원료 518.0 g으로부터 2.7 g을 획득하여 0.5%의 수율을 나타내었다.

실시예 2: 항산화 성분의 농도 측정

상기 추출물인 실시예와 비교예의 총 폴리페놀성 성분의 농도는 Folin-Ciocalteu법에 의해 비색정량 하였다. 각 추출물을 70% 아세톤 용액으로 10배 희석한 후, 희석시료 50 μl와 0.25 N Folin-ciocalteu's phenol reagent(Sigma, USA) 0.475 ml를 혼합하여 실온에서 3분 동안 반응시켰다. 여기에 1 M Na₂CO₃를 0.475 ml 첨가하고 실온에서 60분간 반응시킨 후 724 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 catechin(Sigma, USA)을 사용하여 농도를 계산하였다.

또한, 프로안토시아니딘의 농도는 acid butanol에서 프로안토시아니딘의 산화적 분해(oxidative depolymerization)를 이용하여 측정하였다. 보다 구체적으로 실시예 1의 솔잎추출물 0.1 ml를 메탄올 0.9 ml와 섞은 후, 여기에 5%(v/v) HCl butanol 6 ml와 2%(w/v) FeNH₄(SO₄)₂·H₂O(in 2 M HCl) 0.2 ml를 첨가하고, 95°C에 서 40분간 반응시킨 후 실온까지 냉각시켰다. 반응액에 대해 원심분리(14,000 × g, 5분)를 행하여 불용성 성분을 제거한 상층액을 새 tube에 넣고 이를 5% HCl butanol(v/v)로 10배 희석시킨 후, 550 nm에서 즉시 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 96% proanthocyanidin(Grape seed extract, Naturex, 프랑스)을 사용하여 농도를 계산하였다.

상기 측정한 결과 및 계산한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

	전체 폴리페놀 성분의 농도 (mg/g extract)	프로안토시아니딘 함량 (mg/g extract)	전체 폴리페놀 성분 대비 프로안토시아니딘의 함량(%)
비교예 1	124.4	4.5	3.6
비교예 2	1.6	1.6	100
실시예 1	116.6	3.6	3.9
실시예 2	225.4	9.9	4.3

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 추출물 1 g 당 총 폴리페놀성 성분의 농도는 실시예 2인 아임계 열수추출 침전물은 225.4 mg으로 가장 우수한 농도를 나타내었다. 또한, 실시예 1인 아임계 열수추출 추출액의 경우에도 116.6 mg을 나타내어 기존의 아임계 추출법에 비하여 현저하게 우수하고, 열수 추출법과 대등한 농도를 나타내는 것으로 확인되었다.

한편, 프로안토시아니딘의 경우, 비교예 2인 아임계 추출물의 경우 1.6 mg 의 농도를 나타내고, 비교예 1인 열수 추출물의 경우 4.5 mg의 농도를 나타내었다. 이와 비교하여, 실시예 2인 아임계 열수추출 침전물의 경우 9.9 mg의 농도를 나타내여, 기존 아임계 추출법 및 열수 추출법에 의해 수득된 추출물에 비하여 현저하게 높은 농도를 나타내었다. 또한, 실시예 1인 아임계 열수추출 상층액의 경우 기 존 아임계 추출물에 비하여 현저하게 상승된 3.6 mg을 나타내었다.

한편, 적송잎 추출물에 포함된 총 폴리페놀성 성분에 대한 프로안토시아니딘의 함량을 계산한 결과, 총 폴리페놀성 성분의 농도가 높게 나타난 열수 추출물의 경우 3.6%의 가장 낮은 프로안토시아니딘 함량을 나타내었다. 반면, 실시예 1인 아임계 열수추출 상층액 및 실시예 2인 아임계 열수추출 침전물의 경우 각각 3.9%와 4.3%으로 열수 추출물 보다 높은 프로안토시아니딘 함량을 나타내었다.

상기 표 1에 나타낸 총 폴리페놀성 성분의 함량, 프로안토시아니딘의 함량 및 총 폴리페놀성 성분의 함량 대비 프로안토시아니딘의 함량에 대한 결과를 고려하면 수율 및 순도란 측면에서 소나무로부터 프로안토시아니딘을 효율적으로 추출하기 위해서는 기존의 열수 추출법이나 아임계 추출법 보다 아임계 열수 추출법이 더 적합한 것으로 판단되었다.

실시예 3: DPPH 법에 의한 전자 공여능 조사

적송잎 추출물의 전자 공여능은 1,1-diphenyl1-2-picrylhydrayl(DPPH, Sigma)를 사용하여 측정하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 여러 농도의 적송잎 추출물(최종농도: 500, 250, 100, 50, 10 μg/ml) 50 ㎕에 DPPH(200 μM/ml in ethanol) 150 ㎕를 혼합한 후, 10 분간 볼텍싱(vortexing)을 수행하였다. 실온 및 차광 조건에서 30분간 반응시킨 후, 528 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이에 따른 항산화 활성은 IC₅₀으로 나타내었다. 표준물질로 butylated hydroxytoluene(BHT, Sigma, USA)와 96% proanthocyanidin(Grape seed extract, Naturex, 프랑스)을 같은 농도로 사용하였으며, 상기 표준물질 측정값을 이용하여 측정된 값 및 계산값을 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.

[표 2]

추출물	항산화 활성(IC50, μg/ml)
비교예 1	113
비교예 2	>500
실시예 1	50.7
실시예 2	41.5

상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 표준물질인 BHT의 경우는 농도에 의존한 전자 공여능을 나타내었고, 500 μg/ml의 농도에서 약 80%의 높은 전자 공여능을 나타내었다. 또한, 높은 농도의 96% 프로안토시아니딘 의 경우, 100 내지 500 μg/ml에서 농도 의존성 없이 약 80%의 높은 전자 공여능을 나타내었다.

상기 표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 비교예 1의 경우 250 μg/ml 및 500 μg/ml의 농도에서 약 70% 전후의 전자 공여능을 나타냈으며, 비교예 2의 경우 50 내지 500 μg/ml의 농도에서 10 내지 20%의 비교적 낮은 전자 공여능을 나타내었다.

한편, 실시예 1의 경우 200 내지 500 μg/ml 농도에서 표준물질인 BHT의 500 μg/ml 농도와 근접한 수치가 나타냈으며, 실시예 2의 경우 50 μg/ml 의 농도에서 BHT와 96% proanthocyanidin의 10 내지 50 μg/ml 의 농도보다 우수한 항산화활성을 갖는 것으로 확인되었다. 즉, 실시예인 아임계 열수추출물의 경우, 항산화능이 우수할 뿐만 아니라, 농도 의존적 경향을 나타내었다.

또한, DPPH radical의 초기농도를 50% 감소시키는데 필요한 항산화제의 농도인 IC₅₀을 산출한 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이 비교예 1 및 비교예 2의 경우 각각 113 μg/ml 및 500 μg/ml의 농도를 나타낸 반면, 아임계 열수추출 상층액 및 아임계 열수추출 침전물의 경우 각각 50.7 μg/ml 및 41.5 μg/ml의 농도를 나타내어, 기존의 추출법에 비하여 본 발명의 추출법으로 제조된 추출물이 현저하게 우수한 항산화 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 4: Thiocyanate 에 의한 항산화 활성 조사

Osawa의 방법[19]에 따라 linoleic acid (25 mg/ml in EtOH), ferrous chloride (2.45 g/ml in 3.5% hydrochloric acid), ammonium thiocyanate (0.3 g/ml in H₂O), 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0)를 만들어 이것을 stock solution으로 사용하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 적송잎 추출물 0.2 ml과 linoleic acid 0.2 ml을 시험관에 넣고 혼합한 후, phosphate buffer 0.4 ml와 증류수 0.2 ml를 가하여 40℃에서 incubation하면서 일정간격으로 활성을 측정하였다. 활성측정방법은 혼합용액에서 0.1 ml을 취하여 시험관에 넣고 70% ethanol 3 ml, ammonium thiocyanate 용액 0.1 ml, ferrous chloride 용액 0.1 ml를 혼합한 후 정확히 3분 후에 흡광도(500 nm)를 측정하였다. 이때 활성비교를 위하여 BHT 및 96% proanthocyanidin을 표준물질로 사용하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 표준물질인 BHT는 농도에 따른 항산화 활성 차이가 없이 비슷한 수준의 높은 활성이 6일 동안 유지되었고, 또 다른 표준물질인 96% proanthocyanidin 역시 6일째 동안 높은 항산화 활성이 유지되었지만, BHT와 달리 농도 의존적인 활성 경향을 나타냈다.

한편, 비교예 1인 열수 추출물의 경우, 500 μg/ml의 가장 높은 농도에서 5일째까지 처리한 경우에서 BHT와 비슷한 정도의 강한 항산화 활성을 나타냈지만 6일째 처리에서 항산화 활성이 현저하게 감소되는 것으로 확인되었고, 비교예 2인 아임계 추출물은 처리 2일째까지는 비교적 높은 항산화 활성을 나타냈지만, 처리 3일째 이후부터는 항산화 활성이 현저하게 감소하였다. 반면에, 실시예 1인 아임계 열수추출 상층액과 실시예 2인 아임계 열수추출 침전물에서는 표준물질인 BHT와 마찬가지로 전반적인 항산화 활성에 있어 농도에 따른 항산화 활성 차이가 없이 비슷한 수준의 높은 활성이 6일 동안 유지되는 것으로 확인되어, 기존의 방법에 비하여 본 발명에 의해 제조된 추출물이 현저하게 우수한 항산화 활성이 있는 것으로 확인되었다.

실시예 5: 2- Thiobarbituric acid ( TBA )에 의한 항산화 활성 조사

TBA를 이용한 항산화 활성 측정은, 실시예 1의 적송잎 추출물 1 ml와 linoleic acid (25 mg/ml in EtOH) 1 ml를 시험관에 넣고 혼합한 후 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0) 2 ml와 증류수 1 ml를 가하여 40℃에서 incubation하면서 일정간격으로 활성을 측정하는 방법으로 수행하였다.

상기 활성측정방법은 구체적으로, 시료액 0.5 ml를 원심분리관에 넣고 35% trichloroacetic acid 0.25 ml와 0.75% aqueous TBA (Sigma) 0.5 ml를 가하여 혼합한 후, boiling water bath에서 가끔 흔들면서 15분간 처리하고 흐르는 물에 냉각시킨 후 70% trichloroacetic acid 0.5 ml를 가한 다음 20분 후 15분간 원심분 리(3,000 × g)를 행하여 상층액에 대한 흡광도(532 nm)를 측정하였다. 이때 활성비교를 위하여 BHT 및 96% proanthocyanidin을 표준물질로 사용하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

[표 4]

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, Thiocyanate에 의한 항산화 활성 측정과 마 찬가지로 표준물질인 BHT가 가장 높은 항산화 활성을 나타냈으며, 농도 의존적으로 6일 동안 높은 항산화 활성이 지속되었다. 또 다른 표준물질인 96% proanthocyanidin의 경우는 상기 실시예 4와 같이, 2일째 처리까지는 높은 항산화 활성을 나타냈지만, 3일째부터는 항산화 활성이 크게 감소하는 경향을 보였다.

한편, 비교예 1인 열수 추출물의 경우, 표준물질과 비교하여 낮은 항산화활성을 나타내었고, 비교예 2인 아임계 추출물은 가장 낮은 항산화활성을 나타내었다. 반면에, 실시예 1인 아임계 열수추출 상층액과 실시예 2인 아임계 열수추출 침전물에서는 표준물질인 BHT에 비해서는 낮은 항산화 활성을 나타냈지만, 비교예 2인 아임계 추출물은 물론 비교예 1인 열수 추출물에 비해서도 현저하게 우수한 항산화 활성을 나타낸 것으로 확인되었다. 또한, 상기 항산화활성은 농도의존적 활성 경향을 나타내었다.

상기한 바와 같이, 본 발명인 아임계 추출법과 열수 추출법을 특정 조건에서 조합한 추출법에 의해 수득된 추출물은 기존 열수 추출물이나 아임계 추출물에 비하여, 총 폴리페놀성 성분 및 프로안토시아니딘 함량을 많이 포함하고, 추출수율이 뛰어날 뿐만 아니라, 항산화 활성도 우수한 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 본 발명의 방법은 우리나라 전역에 분포되어 있는 소나무로부터 수득한 소나무 수피를 이용하여 항산화 활성인 우수한 물질을 효율적으로 수득할 수 있는 방법이므로, 솔잎을 이용한 기능성 식품의 개발, 식품 소재의 개발, 화장품 소재의 개발 등 다양한 산업분야에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 프로안토시아니딘의 화학구조를 나타낸 그림이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물 제조 공정을 나타낸 것이다.

Claims (4)

1. 소나무 잎을 60℃에서 열풍건조하고 파쇄하는 소나무 잎 분말 제조단계;

   상기 소나무 잎 분말에 50 내지 70 kgf/cm²의 아임계 유체를 이용하여 75 내지 135℃의 조건에서 150분 내지 200분 동안 아임계 추출법을 수행하여 소나무 잎 분말의 아임계 추출물을 제조하는 단계;

   상기 소나무 잎 분말의 아임계 추출물에 상기 소나무 잎 100g을 기준으로 물 700 내지 1000 ml을 첨가하고 115 내지 135℃에서 50분 내지 100분 동안 열수 추출법을 수행하여 열수 추출물을 제조하는 단계;

   상기 열수 추출물에 99% 에탄올을 상기 열수 추출물과 상기 에탄올의 혼합물에 포함된 에탄올의 농도가 70%가 되도록 첨가한 후, 생성되는 침전물을 여과법으로 제거하여 여과액을 수득하는 단계; 및

   상기 여과액을 원심분리하여 상층액과 침전물을 분리한 후, 상기 상층액을 수득하는 단계

   를 포함하는 소나무 잎으로부터 폴리페놀 성분을 포함하는 항산화물질을 추출하는 항산화물질 추출법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 폴리페놀 성분은 프로안토시아니딘인 항산화물질 추출법.
3. 삭제
4. 삭제

Images