CN102688271A

CN102688271A - 一种白莲蒿总黄酮微波辅助提取方法

Info

Publication number: CN102688271A
Application number: CN2012101571379A
Authority: CN
Inventors: 郝文芳; 黄静; 舒志明; 梁宗锁
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2012-09-26

Abstract

本发明公开了一种白莲蒿总黄酮微波辅助提取方法，将白莲蒿地上部分除去杂质后、阴干、粉碎过40目筛，称取粗粉置于三角瓶中，加石油醚浸泡过夜脱脂，倾去浸提液，于通风橱中挥去石油醚，晾干，保存于干燥处备用；采用乙醇水溶液进行微波提取，提取时间2min、25倍液料比(单位mL/g)、乙醇水溶液体积浓度为40％、微波功率280W。本发明以乙醇水溶液为提取溶剂，通过单因素试验考察微波处理时间、液料比、乙醇体积分数及微波功率四个因素对白莲蒿总黄酮提取得率的影响，以此为基础，采用响应面法优化微波提取白莲蒿总黄酮的工艺参数，以期为白莲蒿资源的开发与利用提供理论依据。

Description

一种白莲蒿总黄酮微波辅助提取方法

技术领域

本发明涉及的是一种白莲蒿总黄酮微波辅助提取方法。

背景技术

白莲蒿(Artemisia sacrorum Ledeb.)，又名万年蒿、铁杆蒿，系属菊科(Compositae)蒿属(Artemisia)半灌木状草本植物，资源丰富，除高寒地区外，全国各地均有分布，常作为民间药使用，具有清热、解毒、祛风、利湿之功效。近年来药理实验证实，白莲蒿的乙醇提取物可降低四氯化碳、对乙酰氨基酚所致肝损伤的小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶及TNF-α活性，减轻肝组织损伤，且对肝癌细胞HepG-2增殖有一定的抑制作用，有保肝护肝之功效^[2]。白莲蒿化学成分丰富，富含黄酮类化合物^[3]，该类化合物在自然界广泛存在，具有保护肝损伤、抗肿瘤、抗菌、抗疟原虫、消炎和抗氧化等显著的药理活性，已受到广泛关注^[4，5]。此外，黄酮类化合物还可抑制油脂及富含油脂食品的脂质过氧化，具有天然抗氧化剂的作用，避免了人工合成抗氧化剂毒性和致癌性等缺陷^[6]，具有重要的开发价值。因此，为了最大程度的获得白莲蒿中的黄酮类化合物，寻求合适的提取工艺技术极其重要。但是迄今为止，有关白莲蒿中黄酮类化合物提取工艺的研究却鲜有报道。

微波辅助提取(Microwave-assisted Extraction Technique，MAE)作为一种新型的提取方法，具有省时，提取率高，操作简便，溶剂消耗少、低污染等优点^[7，8]，已被广泛应用于天然活性成分的提取。响应面分析法(Response Surface methodology，RSM)是优化工艺参数的一种有效统计方法，采用多元回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，分析因素间的交互作用，进而确定最优工艺参数。响应面分析法因其设计合理、试验次数少和试验时间短，已被逐渐关注并应用于工艺优化中^[9]，常用设计如Central CompositeDesign(CCD)、Box-Benhnken Design(BBD)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的不足提供一种白莲蒿总黄酮微波辅助提取方法。

本发明的技术方案如下：

一种白莲蒿总黄酮微波辅助提取方法，将白莲蒿地上部分除去杂质后、阴干、粉碎过40目筛，称取粗粉置于三角瓶中，加石油醚浸泡过夜脱脂，倾去浸提液，于通风橱中挥去石油醚，晾干，保存于干燥处备用；采用乙醇水溶液进行微波提取，提取时间2min、25倍液料比(单位mL/g)、乙醇水溶液体积浓度为40％、微波功率280W。

本发明以乙醇水溶液为提取溶剂，通过单因素试验考察微波处理时间、液料比、乙醇体积分数及微波功率四个因素对白莲蒿总黄酮提取得率的影响，以此为基础，采用响应面法优化微波提取白莲蒿总黄酮的工艺参数，以期为白莲蒿资源的开发与利用提供理论依据。

附图说明

图1时间对总黄酮提取得率的影响；

图2料液比对总黄酮提取得率的影响；

图3乙醇体积分数对总黄酮提取得率的影响；

图4微波功率对总黄酮提取得率的影响；

图5为两因素交互作用对总黄酮提取得率影响的响应曲面；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1材料与方法

1.1材料与试剂

白莲蒿：2010年9月下旬采自陕西省安塞县；芦丁标准品(纯度≥98％)：上海晶纯试剂有限公司；DPPH·：Sigma公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2主要仪器设备

MG5017M微波炉(LG电器有限公司)；752紫外-可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；标准检验筛(浙江上虞市金鼎标准筛具厂)；RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；FW-200粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)。

1.3试验方法

1.3.1芦丁标准曲线的制备

称取芦丁标准品20.00mg，经30％乙醇溶解并定容至100mL，摇匀即得0.20mg/mL芦丁标准溶液。分别吸取芦丁标准液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL于具塞试管中，30％乙醇补充至12.5mL，各加入5％NaNO₂试液0.7mL，混匀后静置6min；加入0.7mL10％Al(NO₃)₃溶液，摇匀后静置6min；加入4％NaOH溶液5mL，再加入30％乙醇溶液定容至25mL，静置10min，510nm下测定吸光度，得线性回归方程：A＝11.927C+0.0004，R²＝1，式中A为吸光度、C(mg/mL)为质量浓度。

1.3.2提取工艺流程

白莲蒿→去杂→阴干→粉碎→过筛→除脂→晾干→乙醇水溶液浸提→微波辐射处理→过滤→浓缩→定容→总黄酮提取液。

1.3.3样品的预处理

将白莲蒿地上部分除去杂质后、阴干、粉碎过40目筛，称取100g粗粉置于1L三角瓶中，加500mL石油醚浸泡过夜脱脂，倾去浸提液，于通风橱中挥去石油醚，晾干，保存于干燥处备用。

1.3.4白莲蒿总黄酮的微波提取及含量计算

准确称取白莲蒿粗粉1.0g，按一定的液料比加入乙醇水溶液，常温下浸泡20min后，于设定功率和时间下进行间歇式微波提取，考察提取时间(0～5min)、液料比(10～35倍(mL/g)、乙醇水溶液体积分数(30％～60％，V/V)和微波功率(0～720W)对总黄酮提取得率的影响。冷却提取液，抽滤，减压浓缩，残渣经30％乙醇水溶液溶解并定容至100mL，摇匀，测定总黄酮提取得率。计算公式如下：

式中：C-总黄酮质量浓度(mg/mL)；m-样品质量(g)；V-检测时所取试液体积(mL)。

1.3.5响应面法试验设计

在单因素试验基础上，综合考虑各因素对白莲蒿总黄酮提取得率的影响，根据Box-Benhnken试验设计原理，以提取时间、液料比、乙醇体积分数和微波功率为考察变量，总黄酮提取得率为响应值，进行响应面优化，试验因素及水平见表1。按公式x_i＝(X_i-X₀)/ΔX_i(i＝1，2，3)确定四个变量编码值，其中，x_i-自变量代码值；X_i-自变量真实值；X₀-试验中心点自变量真实值；ΔX_i-自变量的变化步长^[12]。

表1Box-Benhnken试验设计因素水平表

1.4数据处理方法

采用Excel和DPS7.05数据处理系统进行数据统计分析(α＝0.05)；采用Design-Expert 7.1.6软件进行响应面设计及优化。

2结果与分析

2.1单因素试验及结果

2.1.1提取时间对白莲蒿总黄酮提取得率的影响

称取样品6份，加入60％乙醇水溶液20mL，于微波功率280W下分别提取0(即常温下浸泡20min)、1、2、3、4、5min后，测定总黄酮提取得率。如图1所示，总黄酮提取得率随着提取时间的延长呈先升高后降低的趋势。在最初的1min内，总黄酮提取得率显著增加，且较无微波处理上升22.9％；延长提取时间，总黄酮得率缓慢降低，2～4min内降低幅度不显著。一般来说，提取时间越长，有效成分溶解越充分，提取率越高。但是，延长微波辐射时间，提取溶剂将因高温挥发损失，溶剂极性改变，有效成分溶出不完全，提取量降低，同时高温时间过长也可能会引起黄酮的母核结构破坏^[9]，所以随着微波处理时间的延长总黄酮提取得率并未继续升高。综合考虑，选择提取时间1、2、3min三个水平进行响应面优化。

2.1.2液料比对白莲蒿总黄酮提取得率的影响

称取样品6份，按10、15、20、25、30、35倍液料比加入60％乙醇溶液，于微波功率280W下提取2min后，测定总黄酮提取得率。由图2可知，在10～20倍液料比范围内，总黄酮提取得率呈显著上升的趋势；继续增大液料比，提取得率则增加不显著。液料比较低时，目标物溶解不充分，提取量偏低；增加溶剂用量，固液质量浓度差增大，有利于目标物扩散溶出^[9]；继续增大液料比，浓度差增幅降低，提取量增加平缓，此外，液料比过大将增加能耗，浪费溶剂。因此，选择20、25、30倍的液料比进行响应面优化。

2.1.3乙醇体积分数对白莲蒿总黄酮提取得率的影响

称取样品6份，按20倍液料比分别加入30％、45％、60％、75％、90％、100％的乙醇水溶液，于微波功率280W下提取2min后，测定总黄酮提取得率。由图3可知，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取得率呈先升高后降低的趋势，在体积分数为45％时达到最高值，与其它处理相比，差异达到显著水平；≥45％后，提取得率迅速下降，且各处理间差异显著，无水乙醇提取时总黄酮得率降至最低。较强极性时总黄酮提取得率偏高主要有两方面原因，其一，水的介电常数高于乙醇，易吸收微波能量^[19]；其二，被提取物与提取溶剂的极性相接近，易溶于提取溶剂。此外，高温条件下，乙醇浓度高时其挥发速度加快，提取得率降低。因此，选择乙醇体积分数30％、45％、60％三个水平进行响应面优化。

2.1.4微波功率对白莲蒿总黄酮提取得率的影响

称取样品6份，加入60％乙醇水溶液20mL，分别于微波功率0(即常温下浸泡20min)、140、280、420、560、700W下提取2min后，测定总黄酮提取得率。如图4所示，与无微波处理(即0W)相比，功率140W时总黄酮提取得率增加了14.39％；增加功率，提取得率呈上升趋势，当功率为560W时，提取得率显著提高。随着微波功率的增加，溶液中水分子振动加剧，体系升温加快，分子扩散速度增快，促使物料中有效成分不断浸出^[12]。但是，过高的功率将增加能耗，因此，选择微波功率140、280、300W三个水平进行响应面优化。

2.2响应面法优化结果及分析

2.2.1回归模型的建立及显著性检验

依据Box-Benhnken试验设计原理，设计试验方案(见表2)，其中1～24为析因试验点，25～27为中心试验点。采用Design-Expert软件对表2中所得数据进行多元回归拟合，经方差分析检验回归模型及各参数显著性，结果见表3。

表2Box-Benhnken试验设计及结果

表3响应面方差分析

变异来源	自由度	平方和	均方	F值	P值	显著性
							X₁	1	8.40	8.40	1.67	0.2200
X₂	1	12.88	12.88	2.57	0.1351
							X₃	1	116.44	116.44	23.22	0.0004	**
X₄	1	0.022	0.022	4.322E-003	0.9487
							X₁X₂	1	22.28	22.28	4.44	0.0568
X₁X₃	1	0.46	0.46	0.091	0.7683

X₁X₄	1	2.15	2.15	0.43	0.5253
							X₂X₃	1	0.087	0.087	0.017	0.8974
X₂X₄	1	20.52	20.52	4.09	0.0660
							X₃X₄	1	0.073	0.073	0.015	0.9060
X₁ ²	1	115.13	115.13	22.96	0.0004	**
							X₂ ²	1	86.30	86.30	17.21	0.0014	**
X₃ ²	1	259.56	259.56	51.75	＜0.0001	**
							X₄ ²	1	88.45	88.45	17.64	0.0012	**
模型	14	489.10	34.94	6.97	0.0009	**
							残差	12	60.18	5.02
总回归	26	549.28

注：*表示P＜0.05，差异显著；**表示P＜0.01，差异极显著。

经多元回归拟合，确定白莲蒿总黄酮提取得率(Y)对各试验因子的二次多项回归模型方程为：

Y＝96.62+0.84X₁+1.04X₂-3.11X₃-0.043X₄+2.36X₁X₂-0.34X₁X₃+0.73X₁X₄-0.15X₂X₃-2.27X₂X₄-0.14X₃X₄-4.65X₁ ²-4.02X₂ ²-6.98X₃ ²-4.07X₄ ²。

由方差分析(表3)可知，各因素对总黄酮提取得率的影响顺序为：X₃(乙醇体积分数)＞X₂(液料比)＞X₁(提取时间＞X₄(微波功率)。其中，乙醇体积分数的一次项及各影响因素的二次项对总黄酮提取得率的影响达到极显著水平(P＜0.01)，而各因素的交互项对提取得率的影响均不显著。回归模型的P值小于0.01，表明该模型极显著；并且该模型的回归系数R²＝0.8904，说明回归模型拟合程度良好，预测值与实测值之间具有高度的相关性，可用来分析和预测微波辅助提取白莲蒿总黄酮的工艺结果。

2.2.2因子交互效应分析

为了直观地反映因素间的交互作用对总黄酮提取得率的影响，通过响应面值Y与对应因素的3D响应曲面图进行解释(见图5：a～f)。图5(b，c，f)所示，其它因素值一定时，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取得率呈缓慢上升趋势，大于45％后，则迅速降低；当乙醇体积分数一定时，随着其它因素值的增加，提取得率则呈现缓慢的先上升后下降趋势。由此可知，乙醇体积分数是影响总黄酮提取得率的首要因素。由图5a可知，随着提取时间和液料比的增加，提取得率呈先升高后降低的趋势，两者对总黄酮提取得率的影响效应相似。图5d所示，随着微波功率增加和提取时间的延长，提取得率先升高后降低，提取时间对总黄酮提取得率的影响效应大于微波功率。由图5e可知，随着液料比和微波功率的增加，总黄酮提取得率迅速升高，超过一定值时，继续增大因素值，提取得率则略微降低，其中，液料比对总黄酮提取得率的影响效应大于微波功率。

2.2.3最优工艺参数及验证试验

经软件分析确定，微波辅助提取白莲蒿总黄酮最佳工艺条件为：提取时间2.14min、液料比25.93倍(mL/g)、乙醇体积分数41.57％、微波功率274.39W，总黄酮提取得率97.13％。考虑到试验的可行性，结合实际调整最佳提取工艺条件为：提取时间2min，25倍(mL/g)液料比、乙醇体积分数40％、微波功率280W。在此条件下，重复3次试验，得总黄酮提取得率平均值为95.33％，与预测值基本一致，相对误差仅为1.9％，表明基于响应面法优化所得的提取工艺参数准确可靠。

3结论

经响应面法优化，并结合实际条件所得微波辅助提取白莲蒿总黄酮的最优工艺条件为：原料用量1.0g，提取时间2min、25倍(mL/g)液料比、乙醇体积分数40％，微波功率280W。在此条件下，总黄酮提取得率为95.33％，与预测值基本一致，说明基于响应面法优化所得的提取工艺省时高效，稳定可靠，准确可行。此外，该工艺以乙醇为提取溶剂，成本低，无毒，故可为进一步扩大化生产提取理论和技术依据。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种白莲蒿总黄酮微波辅助提取方法，其特征在于，将白莲蒿地上部分除去杂质后、阴干、粉碎过40目筛，称取粗粉置于三角瓶中，加石油醚浸泡过夜脱脂，倾去浸提液，于通风橱中挥去石油醚，晾干，保存于干燥处备用；采用乙醇水溶液微波提取，提取时间2min、25倍液料比(单位mL/g)、乙醇水溶液体积浓度为40％、微波功率280W。