CN115843790A - 一种负载紫苏酸的抗菌水凝胶的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种负载紫苏酸的抗菌水凝胶的制备及应用。实验研究表明，紫苏酸对酸性果汁饮料中的酸土脂环酸芽孢杆菌起到确切的抑制效果，其抑制酸土脂环酸芽孢杆菌的MIC值为32μg/mL。基于紫苏酸对酸土脂环酸芽孢杆菌的抑菌效果，本发明将紫苏酸作为抑菌成分制备抗菌水凝胶，对于防止由于酸土脂环酸芽孢杆菌引起的酸性果汁饮料腐败变质起到很好的效果，为酸性果汁饮料的抑菌防腐研究提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种负载紫苏酸的抗菌水凝胶的制备与应用。
背景技术
酸土脂环酸芽孢杆菌(A.acidoterrestris)是一种革兰氏阳性、嗜热嗜酸的腐败型细菌，可产生芽孢，菌体呈杆状，主要导致酸性产品的变质，尤其是果汁、蔬菜汁和其他相关饮料。这种细菌广泛分布在生产和加工链的几乎所有组成部分，包括果园、采摘篮、水果粮仓、水果表面、清洁水、管道水、生产线、浓缩果汁、半成品和最终产品。与其他与食物相关的细菌相比，A.acidoterrestris对高温和低pH环境的耐受性更强。此外，在恶劣的生长条件下，这种微生物可以形成具有更强抗逆性的芽孢，能够在商业巴氏杀菌过程中存活，并使其成为巴氏杀菌果汁和相关饮料的关键质量控制目标。A.acidoterrestris的存在会导致果汁变质并产生愈创木酚和卤代酚化合物，从而发出难闻的刺激性气味，影响产品的质量，给饮料行业带来巨大经济损失。
紫苏酸(PA)是一种单环萜类化合物，属于柠檬烯的生物氧化产物，具有高附加值和重要的药用价值，由于具有抗菌作用，目前已经作为化妆品防腐剂上市。此外，紫苏酸具有抗炎性质，对癌细胞也具有细胞毒性，并已被证明能抑制蛋白质异戊二烯化。目前应用相对较少，并且水溶性差，可用性低，限制了紫苏酸的实际应用。
水凝胶是亲水性或水溶性高分子通过一定的物理或化学交联所形成的三维(3D)网络结构的凝胶，凭借其三维结构，水凝胶可以提供足够的容量来容纳小分子、聚合物和颗粒等材料。聚乙烯醇(PVA)是一种亲水性合成高分子材料，具有优异的生物相容性和可降解性等优点，常被制备成凝胶材料。然而单纯PVA制备的水凝胶溶胀性能不足，因此，加入水溶性的N-琥珀酰壳聚糖(NSCS)可以通过高分子之间的复合，来改善PVA水凝胶的溶胀性能。此外，小分子抗菌成分紫苏酸的引入使得水凝胶对A.acidoterrestris具备了优异的抗菌性能，甚至是杀菌效果。
本发明通过MIC实验确定了紫苏酸对A.acidoterrestris的抑制效果，并将其作为抗菌成分，以聚乙烯醇和N-琥珀酰壳聚糖为基材，通过反复冻融的物理交联方法制备出负载紫苏酸的抗菌水凝胶，通过抑菌圈实验表明其抑菌性能，为A.acidoterrestris的杀灭，以及紫苏酸的有效应用提供了新思路。此外，本发明制备的负载紫苏酸的抗菌水凝胶具有抗菌和生物可降解性等优点，可作为一种有效的食品包装材料，在果汁饮料保鲜中充分发挥抗菌功效，防止由于细菌繁殖导致的果汁腐败变质，从而延长产品货架期。
发明内容
本发明是为提供一种紫苏酸在抗A.acidoterrestris方面的应用，并将紫苏酸作为抗菌成分制备抗菌水凝胶，将抗菌水凝胶用于控制A.acidoterrestris，具有良好抑菌效果。
本发明采用的技术方案为：
(1)使用一种紫苏酸抑制A.acidoterrestris。结果显示紫苏酸对A.acidoterrestris具有明显的抑制作用，其抑制A.acidoterrestris的MIC值为32ug/mL，浓度为32ug/mL时抑制率73.1％。
(2)紫苏酸抗菌水凝胶的制备：一定量的PVA和NSCS溶于20mL水中，在加热条件下搅拌使其溶解，将混合溶液进行冷却，待冷却至室温后，加入终浓度为系列浓度的PA溶液并进行充分搅拌，使其混合均匀后，静置脱气，然后在-20℃与室温条件下进行反复冻融，得到负载PA的物理交联的水凝胶(PA-PVA-NSCS)。
(3)紫苏酸抗菌水凝胶对A.acidoterrestris的抑制：将PA-PVA-NSCS水凝胶切割成直径1cm左右的圆片用于抑菌实验。样品经紫外线照射灭菌15min后，在涂有细菌的AAM固体培养基中于45℃的恒温箱中培养24h，对菌盘进行拍照并测量水凝胶圆片周围的抑菌圈直径。
本发明的紫苏酸为柠檬烯的生物氧化产物，对A.acidoterrestris具有很好的抑制作用，将其作为抗菌成分制备抗菌水凝胶可同时具备上述优势。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的抗菌药物紫苏酸对A.acidoterrestris的抑制率
图2为本发明制备的抗菌水凝胶的扫描电镜图片
图3为本发明制得的抗菌水凝胶的热失重图
图4为本发明的抗菌水凝胶对A.acidoterrestris的抑制效果图片
具体实施方式
为进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及实施例对本发明的具体操作方式及作用结果进行详细地说明。
实施例1
紫苏酸对A.acidoterrestris的抑制MIC值及抑菌率的测定：将PA溶于DMSO中配制初始浓度为20mg/mL的PA溶液，避光保存于4℃冰箱中备用。使用时用AAM液体培养基采用倍比稀释的方法配置成所需的浓度梯度。用AAM液体培养基稀释A.acidoterrestris，最终细胞浓度为107CFU/mL。采用肉汤稀释法确定PA对A.acidoterrestris抑制的MIC值：将100μL稀释至最终浓度为128μg/mL、64μg/mL和32μg/mL的PA溶液与100μL细菌在96孔板中混合45℃培养24h后，通过肉眼观察到抑制A.acidoterrestris生长的最低PA浓度32μg/mL为MIC值，并通过测定600nm处的吸光度值来计算PA对细菌生长的抑制率。抑制率(％)＝(阳性对照OD值—试验OD值)/(阳性对照OD值—阴性对照OD)
从图1我们可以看出，当PA浓度为32ug/mL时，抑制率达到了73.1％，随着PA浓度的增加，A.acidoterrestris受到抑制的效果增加，可以看出PA对A.acidoterrestris抑制效果呈现药物浓度依赖关系，浓度越大，对细菌生长的抑制程度越大。
实施例2
负载紫苏酸的水凝胶的制备：取2.1g的PVA和0.9g的NSCS溶于20mL水中，在加热条件下进行充分搅拌，使其溶解后将混合溶液进行冷却，待冷却至室温后，加入PA溶液并进行充分搅拌，使其混合均匀后，静置脱气，然后在-20℃与室温条件下进行反复冻融，得到负载PA的物理交联的水凝胶，然后样品在预冻后于-50℃下真空干燥48h，测定其形貌以及热稳定性分析。
如图2所示，没有载药的水凝胶样品(PVA-NSCS)内表面更加粗糙，空隙较小，且孔洞较多，而PA-PVA-NSCS水凝胶样品内表面更为光滑，孔隙距离也更大。
如图3所示，纯PVA水凝胶发生失重的最大速率在260.4℃，PVA-NSCS水凝胶失重的最大速率在303.1℃，而PA-PVA-NSCS水凝胶在290.7℃失重速率最大，PA的引入降低了热稳定性，但与PVA水凝胶相比，热稳定性较好。
实施例3
负载PA的水凝胶对A.acidoterrestris的抑制：将负载紫苏酸的水凝胶切割成直径1cm左右的圆片用于抑菌实验。样品经紫外线照射灭菌15min后，在涂有细菌的AAM固体培养基中于45℃的恒温箱中培养24h，菌盘中水凝胶周围抑菌圈的大小反映水凝胶的抗菌活性。如图4所示，PA作为抗菌成分制备的负载PA的水凝胶对A.acidoterrestris具有良好的抗菌活性。
由表1可以看出当加入PA浓度为150ug/mL时，对A.acidoterrestris最好。
表1水凝胶对A.acidoterrestris的抑菌圈直径
Claims (5)
1.一种负载紫苏酸的抗菌水凝胶的制备，其特征在于，包括步骤如下：
(1)紫苏酸(PA)对酸土脂环酸芽孢杆菌的抑制：将紫苏酸溶于DMSO中，用AAM肉汤稀释至不同浓度后与一定数量的酸土脂环酸芽孢杆菌菌体细胞在96孔板中混合培养24h，确定其抑菌效果；
(2)负载紫苏酸的抗菌水凝胶的制备：取一定量的聚乙烯醇(PVA)和N-琥珀酰壳聚糖(NSCS)溶于20mL水中，在加热条件下进行搅拌使其充分溶解，然后将混合溶液进行冷却，待冷却至室温后，加入一系列浓度的紫苏酸溶液并进行充分搅拌，使其混合均匀后，静置脱气，然后在-20℃与室温条件下进行反复冻融，得到负载PA的物理交联的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种负载紫苏酸的抗菌水凝胶的制备，其特征在于：抗菌水凝胶的有效抑菌成分为紫苏酸。
3.根据权利要求1所述的一种负载紫苏酸的抗菌水凝胶的制备，其特征在于：抗菌水凝胶中添加的紫苏酸浓度分别为37.5ug/mL、75ug/mL、150ug/mL、300ug/mL。
4.根据权利要求1所述的一种负载紫苏酸的抗菌水凝胶的应用，其特征在于：负载紫苏酸的抗菌水凝胶在抑制酸土脂环酸芽孢杆菌方面的应用。
5.根据权利要求4所述的一种负载紫苏酸的抗菌水凝胶的应用，其特征在于：紫苏酸抑制酸土脂环酸芽孢杆菌的浓度为16ug/mL、32ug/mL、64ug/mL。
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| 许雨芩 等: "抗菌型高分子水凝胶研究进展", 《化工新型材料》, vol. 50, no. 9, pages 218 - 228 * |
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