CN115836732A - 一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶，采用西藏高原地域传统食物青稞、牦牛肉、芫根、雪莲花的提取物为基础原料，以青稞β‑葡聚糖、魔芋胶作为胶体剂，与结构优化的蛋白源、糖源、维生素、矿物质、耐缺氧增强免疫兼具的功能因子等复合制备而成的高原型功能胶。使用低压氧舱加载小鼠游泳箱先采用单因素筛选兼具耐缺氧增强免疫力的功能性因子，再采用四因素三水平的正交试验筛选功能组合为有效成分的质量比3:4:2:3的桑黄多糖、雪莲花多糖、山楂黄酮和牦牛肉蛋白五肽。胶体高温灭菌、其他常温过滤除菌，避免维生素与功能活性成分的破坏，以低温工艺灌装而成耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶，耐缺氧增免疫功能突出。
Description
技术领域
本发明涉及食品领域，尤其涉及一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶及其制备方法。
背景技术
外来人群到高原地区活动容易出现高原反应，常见的症状有头痛、失眠、疲倦、心悸、气短、食欲减退、消化不良、手足麻木和颜面水肿等，有时发生心律失常或短暂性昏厥，大多经3～10天的习服后症状逐渐消失。但部分人群不及时干预，特别容易感冒，出现呼吸困难，可发展成高原肺水肿和(或)高原脑水肿，甚至危及生命。驻扎在高原的部队官兵即使经过几个月的习服，可以进行一些轻体力劳动，但因训练或作战任务需要进行高强度运动，会再次出现类似高原反应。在出现高原反应之前或发生时及时干预，可以降低高原反应发生率或减轻高原反应造成的危害，同时可以提高作业效能。虽然预防高原反应的药物或食物较多，但凝胶类食品因携带、食用的便捷性、口感佳与加工性能好，具有其他类食品的不可替代性，也不具备药物的不良反应。
凝胶类食品(或果冻类)是以水、糖和增稠剂等为原料加工而成的休闲食品，历史悠久，一般使用卡拉胶、琼脂等作为凝胶剂，随着人民生活水平改善，凝聚类食品开始向保健方向发展，研究最多的是可以改善人体机能的保健果冻,如具有辅助降血糖、辅助降血脂、辅助抗肿瘤、提高人体免疫力等功效，相关的资料较多。与高原相关的食品专利也相对较多，具有耐缺氧或增强免疫力功能食品也非常多，但与高原相关的具有耐缺氧或增强免疫力功能凝胶类食品极少。CN 111728221 A公布了一种适用于高原地区体能补充的凝胶状食物及其制备方法，配方包含明胶5-10份、水50-70份、低聚糖5-10份、电解质1-5份、复合维生素5-10份、矿物质1-5份、牛磺酸1-10份、蛋白质5-10份、多肽1-10份、氨基酸10-20份、富硒酵母粉1-10份。富营养物质，适于战时食用和饮用，能够满足当天的90％的能量需要、100％维生素微量元素的需要和70％人体每天最低饮用水量的需要。相关的文件还有CN112471507A公布了一种用于高原环境运动训练的电解质补充组合物，包括氯化钠、柠檬酸钾、硫酸镁、乳酸钙、复合维生素、葡萄糖酸锌、赖氨酸、柠檬酸、食用香精。CN 111728221A主要是体能补充剂与维生素矿物质补充剂，112471507A为电解质补充组合物，这些凝胶类食品没有涉及针对高原低氧环境易出现的缺氧与免疫力降低等问题，同上也没有考虑冬季野外低温凝胶食品可能出现的结冰问题，后杀菌的生产工艺会破坏配方中的维生素等营养物质，达不到配方宣称的营养效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶及其制备方法。本发明使用低压氧舱加载小鼠游泳箱构建缺氧模型，采用单因素耐缺氧增强免疫兼具的功能性因子，再采用4因素3水平的正交试验筛选组合，依据药食同源原理，以西藏等高原地域青稞、牦牛肉、芫根、雪莲花为原料，结合现代提取工艺，添加耐缺氧抗疲劳功能因子，采用低温灌装的生产工艺研究耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子，所述复合功能性因子是由桑黄多糖、雪莲花多糖、山楂黄酮和牦牛肉蛋白五肽，按质量比3:4:2:3的比例混合而成。
一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶，主要由如下重量份数的原料制成：
胶体粉5～10份、水50～70份、蛋白源2～5份、糖源5～10份、复合矿物质0.5～2份、多种维生素0.1～0.5份、所述兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子1～3份、甜味剂、香精适量。
功能胶配方的优选方案，胶体粉6份、水55份、蛋白源3份、糖源7份、复合矿物质0.5份、多种维生素0.2份、兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子2份、甜味剂、香精适量。
进一步地，所述兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子为桑黄多糖、雪莲花多糖、山楂黄酮和牦牛肉蛋白五肽，按质量比3:4:2:3的比例混合而成。
进一步地，所述牦牛肉蛋白五肽采用中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶牦牛肉浆多级酶解，离心、1000Da超滤膜浓缩，HPLC纯化，送生物公司测氨基酸序列并用多肽合成仪合成，氨基酸序列TyrAsnSerGlyAsp(YNSGD),分子量626Da。
进一步地，所述的胶体粉为青稞β-葡聚糖与魔芋胶，按5:2质量比例混合而成。
进一步地，所述蛋白源为精氨酸、酪氨酸、芫根蛋白低聚肽、青稞蛋白多肽、乳清蛋白，按1:1:2：3：8质量比例混合而成。
进一步地，所述糖源为葡萄糖、麦芽糖、低聚异麦芽糖按1:1:1：3质量比例混合而成。
进一步地，所述复合矿物质为氯化钠、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖酸钙，按4:2:1:1质量比例混合而成。
进一步地，所述多种维生素为维生素B1、B2、B6、烟酸、维生素C，按2:1:2:10：50质量比例混合而成。
上述一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶的制备方法，具体如下：
步骤一，将蛋白源、糖源、复合矿物质、复合功能性因子按照配方分别称量，混合均匀后备用；
步骤二，按照比例称取青稞β-葡聚糖与魔芋胶，进行混合制备成胶体粉，备用；
步骤三，在调配缸中泵入85℃左右的饮用水，按9％的重量比例加入上述步骤二制备的胶体粉，充分溶解，所得溶液用50目筛过滤，105-108℃高压灭菌30min，65℃保温备用；
步骤四，将称量好的蛋白源、糖源、复合矿物质、多种维生素、兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子以及甜味剂、香精加常温饮用水，水的体积为步骤三的1/2，搅拌充分溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，滤液升温到65℃，备用；
步骤五，将步骤三和步骤四所得的溶液混合，搅拌均匀；
步骤六，步骤五的混合液罐装后密封，自然冷却至室温，即得到所述高原型功能胶。
有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点在于：本发明是使用低压氧舱加载小鼠游泳箱模型先采用单因素筛选兼具耐缺氧增强免疫力的功能性因子，再采用四因素三水平的正交试验筛选功能组合为有效成分的质量比3:4:2:3的桑黄多糖、雪莲花多糖、山楂黄酮和牦牛肉蛋白五肽。采用西藏高原地域传统食物青稞、牦牛肉、芫根、雪莲花的提取物为基础原料，与筛选的耐缺氧增强免疫兼具的功能因子组合、结构优化的蛋白源、糖源、维生素、矿物质等复合制备而成的高原型功能胶。糖源采用梯度供能，即“单糖+双糖+低聚糖+多糖”，氮源采用“支链氨基酸+低聚肽+多肽+蛋白质”梯度供能供养模式，以冷压工艺压制而成耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶。本发明充分常规的考虑后杀菌工艺对功能因子与营养成分的破坏影响，对这些充分以过滤除菌，避免高温破坏。本发明也考虑到冬季野外低温对凝胶的结冰破坏，本发明的功能胶-10℃不结冰。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
制备例1兼具耐缺氧增强免疫力功效的功能因子组合的筛选
通过文献调研以及以前的研究数据，选择有耐缺氧抗疲劳作用或增强免疫力的10种食品级功能因子进行试验，分别是桑黄多糖、灵芝多糖、雪莲花多糖、枸杞多糖、山楂黄酮、沙棘黄酮、红景天苷、人参皂苷和牦牛肉蛋白五肽。
1.材料
1.1功能因子
桑黄多糖、纯度70.0％，西安奥肽生物科技有限公司产品；灵芝多糖，纯度77.6％，湖北金力康生物科技有限公司；雪莲花提取物均购自西安世泽源生物科技有限公司，多糖含量68.3％；枸杞多糖，多糖含量51.6％，购自陕西金康泰生物科技有限公司；沙棘黄酮，总黄酮含量40.3％，购自北京宝得瑞健康产业有限公司；红景天苷、人参皂苷、山楂黄酮，均购自陕西夏州生物科技有限公司，其中，红景天苷含量98％，人参皂苷含量80％，山楂黄酮65.8％；牦牛肉蛋白五肽，由杭州中肽生物科技有限公司合成，HPLC纯化，纯度99.85％。
1.2免疫检测试剂
白细胞介素-1(IL-1)试剂盒、巨噬细胞吞噬功能和NK细胞杀伤活性检测试剂盒购自美国ADL公司，免疫球蛋白(IgG)放免分析药盒购自原子高科股份有限公司。
1.3其他试剂
刀豆蛋白A(ConA，上海Aladdin公司，批号为D1325032)；二硝基氟苯(上海西亚试剂有限公司，批号为20170687)；RPMI 1640培养液(Gibco公司，批号为6193018)；小牛血清(杭州天杭生物科技有限公司，批号为191216)；YAC-1细胞株(上海名劲生物科技有限公司)；Giemsa染液(美国Sigma公司，批号为BCBF9190)。
2.方法
2.1缺氧复合应激模型建立
采用proOx-810L低压氧舱(上海塔正科技有限公司)，可模拟海拔2000米至10000米之间任意高度的低压低氧环境，内部可加载小鼠跑台或游泳箱，营造低温低氧环境下的疲劳应激，以药食两用资源筛选、分离、纯化同时具有耐缺氧抗疲劳与增强免疫力作用的功能因子。本项目设定海拔4000米，气压0.61atm，设定游泳试验，水箱30cm×50cm，高度60cm，水深30cm，温度25±1℃。小鼠跑台(上海塔正科技有限公司)：每条跑道长580毫米，宽85毫米，高120毫米。跑道速度小鼠15米/分，跑台倾角15°，刺激电压50V。
昆明小鼠，雄性，SPF级，华中科技大学动物实验中心，SCXK(鄂)2016—0009，体重21.2±2.1g。
2.2缺氧疲劳试验
随机分为19组，每组10只，给每只鼠编号，供给实验食物及饮水。环境温度(25±1)℃，相对湿度(70±2)％，适应喂养3d。其中三组在每天固定时间(19：00)以不同剂量供试物质水溶液连续ig给药7d，每天1次，每次为0.4ml；另一组为对照组，给与等体积生理盐水。末次给予后1h，进行缺氧疲劳试验。容器为30×50cm，高60cm玻璃水箱，水深30cm,保持气压0.61atm。小鼠称重，将小鼠尾部固定体重6％的铅片，记录小鼠放置时间及游泳时间，以及小鼠下沉并停止运动时间，以头部沉没水中6s为试验终点。
2.3免疫功能检测
根据《保健食品检验与评价技术规范(国家市场监督管理总局2020)》要求，分别进行细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞吞噬能力及自然杀伤(NK)细胞活性的测定。依据缺氧疲劳试验结果，选取延长游泳时间最长的5组进行免疫功能检测试验，分别是桑黄多糖、山楂黄酮、雪莲花多糖、牦牛肉蛋白五肽和人参皂苷的高剂量组，另设蒸馏水做空白对照。给小鼠灌胃给药，对照组以等体积纯净水灌胃，连续30d。试验方法参见技术规范p17-29。
2.3.1脏器指数测定
实验结束后处死小鼠，取胸腺、脾脏称重，计算脏器指数。
2.3.2脾淋巴细胞转化实验
处死小鼠后无菌取脾，制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为3×106个/mL。按照MTT法在570nm波长处测OD值，用ConA孔的OD值与不加ConA孔的OD值的差值表示淋巴细胞的增殖能力。
2.3.3迟发型变态反应实验
采用足跖增厚法进行迟发型变态反应实验。小鼠腹腔注射0.2mL 2％SRBC进行免疫，4d后测量左后足跖部厚度，再在测量部位皮下注射20μL 20％SRBC，24h后测量左后足趾部厚度，测量3次，取平均值。计算攻击前后足跖厚度差值。足跖肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。
2.3.4血清溶血素测定
采用血凝法进行血清溶血素测定实验，免疫方法同2.3.3。5d后于小鼠眼球取血，收集血清。将血清用生理盐水按照所需浓度稀释，将其分别置于血凝实验板内，加入等量SRBC悬液，置37℃CO2培养箱3h，观察血球凝集程度，并计算抗体积数，抗体积数越大，表示血清溶血素(抗体)水平越高。
抗体积数＝(S1+2S2+3S3+……+nSn)
式中：1、2、3……n代表血清稀释的指数；S代表凝集程度的级别。
2.3.5抗体生成细胞检测
抗体生成细胞检测的免疫方法同2.3.3。5d后处死小鼠，无菌取脾制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×106个/mL。按照Jerne改良玻片法，计数溶血空斑数。
2.3.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
采用半体内法进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。小鼠腹腔注射1mL 20％鸡红细胞悬液，0.5h后处死，固定于鼠板，剪开腹壁皮肤，注射2mL生理盐水，转动鼠板1min，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于载玻片上，置于37℃CO2培养箱30min。用生理盐水漂洗晾干，在油镜下计数吞噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数。吞噬率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。
2.3.7碳廓清实验
小鼠尾静脉注射稀释的墨汁，2min(t1)和10min(t2)后分别从内眦静脉丛取血20μL，将其加入Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白对照，在600nm波长处测光密度值，以吞噬指数a表示小鼠碳廓清的能力。
式中：K为碳廓清指数；OD1和OD2分别为2min和10min所取血样的光密度值。
2.3.8NK细胞活性测定
处死小鼠后无菌取脾，制成单个细胞悬液，按乳酸脱氢酶法，用酶标仪在490nm处测OD值，计算NK细胞活性。
2.3.9数据统计
数据结果以平均值±标准差表示，以便结果与分析使用。实验数据用SPSS 24.0统计软件进行方差分析，方差不齐者用秩和检验。
2.4正交试验
选取耐缺氧抗疲劳试验与免疫检测结果均突出的4个功能因子作为组合，考虑三个水平，选用L9(34)四因素三水平表。动物小鼠同前。
根据前文的研究结果，确定各物质的三个水平如下：桑黄多糖A1：100mg/kg、A2：150mg/kg、A3：200mg/kg；山楂黄酮B1：100mg/kg、B2：150mg/kg、B3：200mg/kg；雪莲花多糖C1：100mg/kg、C2：150mg/kg、C3：200mg/kg；牦牛肉蛋白五肽D1：100mg/kg、D2：150mg/kg、D3：200mg/kg(表1、表2)。
表1桑黄多糖、雪莲花多糖、山楂黄酮和牦牛肉蛋白五肽因素与水平
表2桑黄多糖、雪莲花多糖、山楂黄酮和牦牛肉蛋白五肽正交试验设计
| No. | A | B | C | D |
| 1 | A1 | B1 | C1 | D1 |
| 2 | A1 | B2 | C2 | D2 |
| 3 | A1 | B3 | C3 | D3 |
| 4 | A2 | B1 | C2 | D3 |
| 5 | A2 | B2 | C3 | D1 |
| 6 | A2 | B3 | C1 | D2 |
| 7 | A3 | B1 | C3 | D2 |
| 8 | A3 | B2 | C1 | D3 |
| 9 | A3 | B3 | C2 | D1 |
3.结果及分析
3.1单因素耐缺氧抗疲劳试验
各功能因子的小鼠游泳试验结果见表3。
表3各功能因子活性成分对小鼠缺氧疲劳复合应激条件下游泳时间的影响(
n＝10)
注：a,p<0.05，b,p<0.01，与对照组(蒸馏水组)比较
从表3结果可知，较高剂量组的效果较好的依次是桑黄多糖(24.3％)、山楂黄酮(20.8％)、雪莲花多糖(20.3％)、牦牛肉蛋白五肽(20.1％)、人参皂苷(19.3％)、沙棘黄酮(17.7％)、枸杞多糖(17.0％)、红景苷(16.7％)、灵芝多糖(11.2％)，其中桑黄多糖、山楂黄酮、雪莲花多糖、牦牛肉蛋白五肽和人参皂苷均达到差异极显著水平(p≤0.01)，红景天苷、枸杞多糖和沙棘粉黄酮达到差异显著水平(p≤0.05)；低剂量组延长游泳时间的效果较好的依次是桑黄多糖(9.3％)、牦牛肉蛋白五肽(9.2％)、人参皂苷(8.9％)、山楂黄酮(8.6％)、枸杞多糖(7.7％)、沙棘黄酮(7.5％)、雪莲花多糖(7.4％)、红景苷(6.9％)、灵芝多糖(5.0％)，均低于10％，差异无显著水平(p≧0.05)。这些结果表明，各组30mg的低剂量达不到耐缺氧抗疲劳的有效剂量，120mg的剂量组基本可以达到有效剂量。
3.2小鼠免疫功能检测
各组免疫功能检测试验结果见表4.
表4各功能因子对小鼠免疫功能的影响(
n＝10)
注：a,p<0.05，b,p<0.01，与对照组(蒸馏水组)比较
如表4所示，各功能因子对小鼠的脾指数和胸腺指数与空白对照组相比无显著性差异，表明对小鼠免疫器官的质量均无明显影响；桑黄多糖与山楂黄酮的OD差值(脾淋巴细胞转化)与空白对照组相比有显著性差异，说明桑黄多糖与山楂黄酮对小鼠的淋巴细胞增殖能力有明显促进作用；5个功能因子的小鼠足跖增厚程度显著高于空白对照组(P<0.05),说明均可显著提高小鼠迟发型变态反应程度；5个功能因子的小鼠抗体积数均显著高于空白对照组(P<0.05)，说明能明显提高小鼠血清溶血素水平；5个功能因子的小鼠溶血空斑数显著高于空白对照组(P<0.05)，溶血空斑数反映抗体生成细胞数，表明5个功能因子对小鼠抗体生成细胞增殖有明显作用；5个功能因子的结合其腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力实验，仅桑黄多糖与牦牛肉蛋白五肽的结果与空白对照组相比有显著性差异，说明桑黄多糖与牦牛肉蛋白五肽可以提高机体的非特异性免疫功能；5个功能因子的吞噬指数仅桑黄多糖与雪莲花多糖与空白对照组相比有显著性差异，说明桑黄多糖与雪莲花多糖对小鼠碳廓清能力有明显影响；5个功能因子小鼠NK细胞活性与空白对照组相比有显著性差异。
结论：根据《保健食品检验与评价技术规范(国家市场监督管理总局2020)》规定的有助于增强免疫力功能判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，通过表4中脾淋巴细胞转化(细胞免疫)、小鼠血清溶血素(体液免疫)、巨噬细胞吞噬率与碳廓清(单核—巨噬细胞功能)及NK细胞活性可判定该受试样品具有有助于增强免疫力功能作用。因此，本实施例的5个功能因子均可以判定有助于增强免疫力。
在预实验中，我们将含人参皂苷的组合按小鼠试验剂量的1/10添加到固体饮料与胶体食品中，普遍反映苦味太重，受试者普遍接受度差，因此，下面的正交试验我们选择桑黄多糖、山楂黄酮、雪莲花多糖与牦牛肉蛋白五肽这4种功能因子进行组合。
3.3四因素三水平正交试验结果及分析
由表5可知，A2B3C1D2及A3B2C1D3组合小鼠游泳时间最长，分别40.6±4.2min和40.3±2.6min，较对照组(27.7±3.9min)增加46.5％和45.6％，达到极显著差异水平(P<0.01)。其他组合分别比对照组延长22.9-38.9％不等，均达到极显著差异水平(P<0.01)。综合分析，以A2B3C1D2组合最优，其次A3B2C1D3。
由表6可知，所有组合均显著提高小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面能力，也是A2B3C1D2及A3B2C1D3的两个组合相对更佳(P<0.01)。
综合2项试验结果，优选A2B3C1D2及A3B2C1D3的两个组合组合，即桑黄多糖150mg/kg、山楂黄酮200mg/kg、雪莲花多糖100mg/kg和与牦牛肉蛋白五肽150mg/kg以及桑黄多糖150mg/kg、山楂黄酮200mg/kg、雪莲花多糖100mg/kg和与牦牛肉蛋白五肽200mg/kg。A2B3C1D2的剂量比A3B2C1D3稍低，最终选择A2B3C1D2组合。
表5正交试验不同组合对小鼠游泳时间的影响Tab.5Effects of LCP,COS,SBFand GBF on swimming time of anoxia mice(
n＝12)
| No. | 组合 | 游泳时间(min) | 延长率(％) |
| 1 | A1B1C1D1 | 34.0±3.2 | 22.9 |
| 2 | A1B2C2D2 | 36.1±3.6 | 30.2 |
| 3 | A1B3C3D3 | 37.7±4.4a | 36.4 |
| 4 | A2B1C2D3 | 36.7±3.4 | 32.5 |
| 5 | A2B2C3D1 | 38.5±4.1a | 38.9 |
| 6 | A2B3C1D2 | 40.6±4.2b | 46.5 |
| 7 | A3B1C3D2 | 35.9±1.9 | 29.8 |
| 8 | A3B2C1D3 | 40.3±2.6b | 45.6 |
| 9 | A3B3C2D1 | 35.5±5.2a | 28.2 |
| 10 | 对照 | 27.7±3.9 | / |
注：a,p<0.05，b,p<0.01，与对照组比较
表6正交试验不同组合对小鼠免疫水平的影响(
n＝10)
注：a，p<0.05，b，p<0.01，与对照组比较
制备例2胶体成型试验
根据药理学基本原理，以动物灌胃剂量的1/10作为人的推荐剂量，采用制备例1的A2B3C1D2组合，人体用量即桑黄多糖15mg/kg、山楂黄酮20mg/kg、雪莲花多糖10mg/kg和与牦牛肉蛋白五肽15mg/kg，按人体60kg均重计算，即每个功能胶含桑黄多糖900mg、山楂黄酮1200mg、雪莲花多糖600mg和与牦牛肉蛋白五肽900mg。
多种文献证实，青稞β-葡聚糖有一定抗疲劳作用，可以作为胶体食品成胶的原材料。对于高原型功能胶，有时使用会很紧急，既要成型还要有防噎、可吸的特性，凝胶强度和黏度不能太大。同时考虑到高原环境体外低温，水溶液易结冰，影响口感与食用方便性，防结冰也是需要考虑的因素之一。传统果冻使用明胶或琼脂不易做到，本试验使用青稞β-葡聚糖与魔芋胶进行配比，目标是25℃成型不化、37℃水化。
1、不同浓度青稞β-葡聚糖与魔芋胶在25℃和37℃成胶性
将青稞β-葡聚糖或魔芋胶按重量称好，分别加入85℃左右的饮用水，充分溶解，定容到100ml，混均，倒入模具中，分别放入25℃和37℃温度下观察胶体形成情况，用筷子夹来确认硬度。从下表可知，青稞β-葡聚糖、魔芋胶及其1:1混合物在25℃5％浓度下凝胶基本都能成形，以6％浓度相对满足要求。
表7不同浓度青稞β-葡聚糖与魔芋胶在25℃和37℃成胶性
2、青稞β-葡聚糖与魔芋胶的配比
根据上面不同浓度青稞β-葡聚糖与魔芋胶在25℃和37℃成胶性试验，确定青稞β-葡聚糖与魔芋胶粉总浓度为6％。
将青稞β-葡聚糖与魔芋胶按下表称好，加入85℃左右的饮用水，充分溶解，定容到100ml，混均，倒入模具中，放入4～10℃冷却成形。成形后取出，分别放-20℃、-10℃、0℃、15℃、25℃、30℃、35℃、40℃30分钟，观察凝胶的成形性或溶解性。结果见表8。从表可知，青稞β-葡聚糖与魔芋胶最佳配比是5：2或5:3，可以达到目标。
表8青稞β-葡聚糖与魔芋胶的配比
实施例1～6一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶的制备
本实施例涉及的氨基酸、维生素与矿物质均为药(食)用级，购自医药公司；青稞β-葡聚糖购自西安威斯博生物科技有限公司，含量85％；魔芋胶粉购自江苏天利华兴生物科技有限公司，含量99％；芫根蛋白低聚肽与青稞蛋白多肽均购自青海鸿运生物科技有限公司，分子大小分别为1000-1500Da和1500-3000Da,净含量分别为98.5％和99.6％；乳清蛋白、麦芽糖醇(山东顾诚)、低聚果糖(山东百龙创园)、低聚异麦芽糖(山东百龙创园)购自安徽宏达生物工程有限公司，均为食品级，净含量分别为99.9％、93.7％、96.2％和96.5％，保质期均为24个月。
实施例1～6的高原型功能胶，由如下质量百分比的成分组成，各实施例具体配方见表9：胶体粉5～10份、水50～70份、蛋白源2～5份、糖源5～10份、复合矿物质0.5～2份、多种维生素0.1～0.5份、兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子1～3份、甜味剂、香精适量。配方中所述的胶体粉为青稞β-葡聚糖与魔芋胶，按照5:2比例进行混合；蛋白源为精氨酸、酪氨酸、芫根蛋白低聚肽、青稞蛋白多肽、乳清蛋白，按1:1:2：3：8质量比例混合而成；糖源为葡萄糖、麦芽糖醇、低聚果糖、低聚异麦芽糖按1:1:1:3质量比例混合而成；复合矿物质为氯化钠、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钙，按4:2:1:1比例混合而成；多种维生素为维生素B1、B2、B6、烟酸、维生素C，按2:1:2:10：50比例混合而成；兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子为桑黄多糖、雪莲花多糖、山楂黄酮和牦牛肉蛋白五肽，按质量比3:4:2:3的比例混合而成。
表9实施例1-6配方表
按照下述步骤制备各实施例高原型功能胶：
1、蛋白源的制备：按1:1:2:3：8质量比例称取精氨酸、酪氨酸、芫根蛋白低聚肽、青稞蛋白多肽、乳清蛋白，混合均匀后备用；
2、糖源的制备：按1:1:1:3质量比例称取葡萄糖、麦芽糖醇、低聚果糖、低聚异麦芽糖，混合均匀后备用；
3、复合矿物质的制备：按4:2:1:1质量比例称取氯化钠、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖酸钙，混合均匀后备用；
4、多种维生素的制备：按2:1:2:10：50质量比例称取维生素B1、B2、B6、烟酸、维生素C，混合均匀后备用；
5、复合功能性因子的制备：按3:4:2:3的质量比例称取桑黄多糖、雪莲花多糖、山楂黄酮和牦牛肉蛋白五肽，混合均匀后备用；
6、按照5:2质量比例称取青稞β-葡聚糖与魔芋胶，进行混合制备成胶体粉，备用；
7、在调配缸中泵入85℃左右的饮用水，按9％的质量比例加入上述步骤6制备的胶体粉，充分溶解，所得溶液用50目筛过滤，105-108℃高压灭菌30min，65℃保温备用；
8、将步骤1制备的蛋白源、步骤2制备的糖源、步骤3制备的复合矿物质、步骤4制备多种维生素和步骤5制备的兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子以及甜味剂、香精加常温饮用水，水的体积为步骤7的1/2，搅拌充分溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，滤液升温到65℃，备用；
9、将步骤7和步骤8所得的溶液按体积比2:1进行混合，搅拌均匀；
10、步骤9的混合液罐装后密封，自然冷却至室温，即得到所述高原型功能胶。
11、实施例1-6制备的高原型功能胶的评价
从表10可知，实施例1配方为优化配方。
表10实施例1～6外观与口感评价
应用例1本发明高原型功能胶的人群试食实验
人体试食试验经试验所在西部某医院伦理委员会批准，因考虑高原激烈运动的风险性，伦理委员会仅批准标准日常训练的对照试验，测试食用前后的耐缺氧抗疲劳与免疫学指标。在西部海拔3650米的某单位，以62名年龄18-19岁的青年男性为受试对象，随机分为2组，每组31人，采用受试者单盲试验，每组分别摄食本发明实施例1制备的高原型功能胶以及按实施例1制备的不含复合功能性因子的胶体，两者外形、色泽、口感基本相同，早晚饭时每人各食用一块胶体食品，连续食用15天。食用期间由专业的医护人员组织，以班为单位，2人一组，相互监督，填写食用记录单及换发功能胶食品并回收功能胶包装袋的方式跟踪随访。在整个实验期间所有受试者均进行统一的标准日常运动训练，于实验前后分别进行运动测试和指标测定。采肘部静脉血，检测超氧化物歧化酶、丙二醛、乳酸和尿素氮的含量，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；IL-1和IL-6检测，放免药盒由北京华英生物技术研究所提供，测定按照试剂盒说明书进行操作。表11为超氧化物歧化酶、丙二醛、乳酸和尿素氮的试验前后的差值与分析。
表11受试者食用前后耐缺氧抗疲劳指标测定(
n＝31)
超氧化物歧化酶是机体清除自由基体系中重要的抗过氧化酶，对机体细胞具有较好的保护作用，其活性的高低能间接反映机体清除自由基的能力，超氧化物歧化酶活性越高，耐缺氧能力越强。丙二醛(MDA)是多不饱和脂肪酸过氧化物的降解产物，是自由基作用于脂质发生过氧化反应的终产物；MDA含量的高低能够反映细胞受自由基攻击和损伤的严重程度，MDA含量越低，机体耐缺氧能力越强。尿素氮是哺乳动物体内蛋白质和氨基酸分解代谢的终产物，在长时间大强度运动时，血尿素的变化范围明显，血尿素与机体机能、疲劳程度以及负荷量大小呈正相关，是评定人体机能状态的重要指标，身体机能状态好者，运动后BUN上升幅度小，减少通过蛋白质等含氮化合物的分解代谢供能，从而起到了抗疲劳的作用。乳酸是机体内糖无氧酵解供能体系的终产物；在肌肉剧烈收缩时，因供氧不足单靠有氧氧化不能满足能量的要求，必须加速糖酵解的供能过程，在缺氧情况下，肌肉在通过糖酵解反应得到能量的同时，也产生了大量的乳酸；乳酸的增加使肌肉中H+浓度上升，pH下降，进而引起一系列生化变化，是导致疲劳的重要原因，乳酸在肌肉中堆积越多，疲劳程度就越严重，所以能够降低血乳酸含量的物质，可以起到减少疲劳的作用。
从表11结果可知，服用本发明实施例1的高原功能胶后可以显著提高超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛、乳酸和尿素氮含量，差异有显著性意义(P<0.01)。说明本发明的功能胶耐缺氧抗疲劳作用突出。
表12受试者食用前后免疫功能的变化
白细胞在人体血液中的主要作用是防御功能，可以防止病原体的入侵，相当于人体的一个屏障，有利于提高疾病的免疫抵抗力；淋巴细胞由淋巴器官产生，是机体免疫应答功能的重要细胞成分，是淋巴系统几乎全部免疫功能的主要执行者，是对抗外界感染和监控体内细胞变异的一线“士兵”；白介素-1(IL-1)是重要的内生致热原，其引起发热的机制之一，可能与脑内PGE和前列腺素E受体EP3有关。IL-6可参与免疫调节反应，能诱导B细胞增殖、分化并产生抗体，并能可诱导杀伤性T细胞活性，使未成熟的胸腺细胞发育成CTL。
从表12结果可知，实施例1制备的高原型功能胶组(实验组)的淋巴细胞、白细胞数较食用前均显著升高(P<0.05)，提示可能食用高原功能胶后出现提高淋巴细胞、白细胞的趋势，说明高原型功能胶可以提高人体的基础免疫。实验组IL-6在食用后明显升高(P<0.01)，IL-1虽有升高但无显著性差异(P>0.05)，提示高原型功能胶能够提高机体细胞免疫力，从而达到预防保健作用。
Claims (10)
1.一种兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子，其特征在于，所述复合功能性因子是由桑黄多糖、雪莲花多糖、山楂黄酮和牦牛肉蛋白五肽，按质量比3:4:2:3的比例混合而成。
2.一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶，其特征在于，主要由如下重量份数的原料制成：
胶体粉5～10份、水50～70份、蛋白源2～5份、糖源5～10份、复合矿物质0.5～2份、多种维生素0.1～0.5份、权利要求1所述的兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子1～3份、甜味剂、香精适量。
3.根据权利要求1所述的一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶，其特征在于，主要由如下重量份数的原料制成：
胶体粉6份、水55份、蛋白源3份、糖源7份、复合矿物质0.5份、多种维生素0.2份、兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子2份、甜味剂、香精适量。
4.根据权利要求2所述的一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶，其特征在于，所述兼具耐缺氧增强免疫的桑黄多糖、雪莲花多糖、山楂黄酮和牦牛肉蛋白五肽组合是使用低压氧舱加载小鼠游泳箱模型先采用单因素筛选兼具耐缺氧增强免疫力的功能性因子，再采用四因素三水平的正交试验筛选。
5.根据权利要求2所述的一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶，其特征在于，所述牦牛肉蛋白五肽采用中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶牦牛肉浆多级酶解，离心、1000Da超滤膜浓缩，HPLC纯化，通过测氨基酸序列并用多肽合成仪合成，氨基酸序列TyrAsnSerGlyAsp(YNSGD),分子量626Da。
6.根据权利要求2所述的一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶，其特征在于，所述的胶体粉为青稞β-葡聚糖与魔芋胶，按5:2质量比例混合而成。
7.根据权利要求2所述的一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶，其特征在于，所述蛋白源为精氨酸、酪氨酸、芫根蛋白低聚肽、青稞蛋白多肽、乳清蛋白，按1:1:2：3：8质量比例混合而成。
8.根据权利要求2所述的一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶，其特征在于，所述糖源为葡萄糖、麦芽糖醇、低聚果糖、低聚异麦芽糖按1:1:1:3质量比例混合而成。
9.根据权利要求2所述的一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶，其特征在于，所述复合矿物质为氯化钠、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖酸钙，按4:2:1:1质量比例混合而成；
所述多种维生素为维生素B1、B2、B6、烟酸、维生素C，按2:1:2:10：50质量比例混合而成。
10.一种耐缺氧增强免疫兼具的高原型功能胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、蛋白源的制备：按比例称取精氨酸、酪氨酸、芫根蛋白低聚肽、青稞蛋白多肽、乳清蛋白，混合均匀后备用；
(2)、糖源的制备：按比例称取葡萄糖、麦芽糖醇、低聚果糖、低聚异麦芽糖，混合均匀后备用；
(3)、复合矿物质的制备：按比例称取氯化钠、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖酸钙，混合均匀后备用；
(4)、多种维生素的制备：按比例称取维生素B1、B2、B6、维生素C，混合均匀后备用；
(5)、复合功能性因子的制备：按比例称取桑黄多糖、雪莲花多糖、山楂黄酮和牦牛肉蛋白五肽，混合均匀后备用；
(6)、按照比例称取青稞β-葡聚糖与魔芋胶，进行混合制备成胶体粉，备用；
(7)、在调配缸中泵入85℃左右的饮用水，按9％的重量比例加入上述步骤(6)制备的胶体粉，充分溶解，所得溶液用50目筛过滤，105-108℃高压灭菌30min，65℃保温备用；
(8)、按比例依次加入上述制备的蛋白源、糖源、复合矿物质、多种维生素、兼具耐缺氧增强免疫的复合功能性因子以及甜味剂、香精，搅拌至完全溶解；加常温步骤二体积的1/3饮用水，搅拌充分溶解，以0.22μm滤膜过滤除菌，滤液升温到65℃，备用；
(9)、步骤(7)和(8)所得溶液混合，搅拌均匀，无菌罐装后密封，自然冷却至室温，即得到所述高原型功能胶。
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