CN115836724A - 一种富含咸味肽的酱油及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含咸味肽的酱油及其制备方法，属于调味品加工技术领域；本发明提供的富含咸味肽的酱油的制备方法包括以下步骤：将蒸煮黄豆、炒制小麦粉、酵母抽提物和米曲霉菌种混合制曲，得曲料；随后将曲料与食盐水混合进行高盐稀态发酵、压榨，得富含咸味肽的酱油。本发明提供的制备方法通过在制曲的过程中同时添加酵母抽提物和米曲霉菌种进行混合制曲，从而从酿造本源上实现目标咸味肽Glu‑Leu、Leu‑Glu和Val‑Glu的定向提升，达到酱油减盐不减味的效果；并且本发明提供的制备方法无需引入其他试剂、无需其他定制设备，因此，本发明提供的制备方法操作简单、设备常规且安全性高，有利于实际工业生产。
Description
技术领域
本发明属于调味品加工技术领域，尤其涉及一种富含咸味肽的酱油及其制备方法。
背景技术
食盐是一种重要的调味剂，赋予了食物咸味，同时对于鲜味、甜味等味道都有不同的协调作用，因此被称为百味之王。但目前人们的食盐摄入量偏高，导致高血压、脑卒中、心血管疾病、心脏病、骨质疏松等患病风险明显增加。世界卫生组织建议成年人每天食盐摄入量不超过4g，《中国居民膳食指南》根据我国居民食盐摄入量及饮食习惯，提出成年人每天食盐摄入量不超过6g，但我国居民实际每日平均摄入量在12g左右，减盐任务迫在眉睫。然而，减盐必然会造成风味的减弱，如何做到减盐不减味是食品企业亟待解决的技术问题。酱油是一种高盐调味品，在我国、东亚及东南亚国家地区广泛使用，是日常烹饪过程中必不可少的调味品。随着减盐趋势逐渐明确，减盐酱油市场逐渐扩大。食盐在酱油中不仅提供咸味，在生产过程中还起到耐盐微生物的筛选以及防腐的效果，因此现有的减盐酱油往往采用正常发酵后通过电渗析等脱盐技术降低盐含量，但一旦市场需求迅速扩大，脱盐工序就会成为限制产能的瓶颈，同时盐分的降低会使得酱油风味协调性下降，影响酱油品质。
咸味肽是一类以动植物或微生物蛋白为原料加工而成的具有咸味或自身无明显呈味特征但可以显著增强体系咸味的肽类物质。根据现有研究报道，绝大部分已被证明的咸味肽在结构上都具有一定的共性，其N端或C端都含有带电氨基酸，以谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸最为常见，分子量主要以2-4肽为主，如从鱼露中分离鉴定出的咸味肽Arg-Ser、Arg-Val、Val-Arg、Arg-Met，从酵母抽提物中分离鉴定出的Asp-Asp、Glu-Asp、Asp-Asp-Asp、Ser-Pro-Glu等。一些小分子肽类经过美拉德反应后同样具有很强的咸味增强效果，如豌豆蛋白酶解产物经过美拉德反应后获得小分子肽可以降低20％食盐用量。
根据现有咸味肽相关专利报道，咸味肽的制备方式主要包括发酵法、酶解法和化学合成法，如专利《一种以南极磷虾加工副产物为原料制备咸味肽的方法》(申请号(CN201811059421.6)中使用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌对南极磷虾进行发酵、超滤、浓缩后得到1-1.2kD小分子咸味肽；专利《一种亚临界水辅助酶解面筋蛋白制备咸味肽的方法》(申请号(CN202111187754.9)中对面筋蛋白水溶液进行三阶段高温高压处理，然后碱性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶对面筋蛋白进行组合酶解，经超滤获得1kD以下的小分子咸味肽；专利《一种咸味肽的制备方法》(申请号CN201911012484.0)中使用木瓜蛋白酶、复合蛋白酶对鸡骨进行酶解，通过添加木糖、精氨酸、半胱氨酸后进行美拉德反应获得咸味肽。专利《一种咸味肽鸟氨酰牛磺酸的合成方法》(CN201810389117.1)中采用化学合成法合成了咸味肽鸟氨酰牛磺酸。其它类型的呈味肽专利有报道先采用微生物发酵获得其胞外酶系，然后利用酶系进行酶解，如专利《一种具有鲜味和增鲜特性的四肽及其用途》(申请号CN201810442917.5)中采用接种菌粉进行固态发酵后匀浆酶解的方式获得呈味肽。但是目前的制备咸味肽还存在以下问题：(1)化学合成法需要使用氯甲酸乙酯、氯甲酸异丁酯、乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿等化学试剂，需要进行精细纯化和严格的化学试剂残余量监控，成本与安全风险高，不适合作为食品添加剂使用；(2)采用亚临界水辅助酶解对于前期原料的预加工设备要求高，工艺复杂；(3)市售酶制剂复合酶解工艺中蛋白酶的酶切位点广泛，难以定向提升特定结构的咸味肽的含量；(4)采用微生物发酵获得蛋白酶进行酶解的工艺缺乏针对特定蛋白酶系的调控技术，难以定向提升特定结构咸味肽的含量；并且目前尚未有关于提升酱油中咸味肽含量的方法。因此，如何在酱油发酵过程中高效定向提升咸味肽含量是推动酱油减盐的重要技术突破点。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能够在酱油生产过程中定向调控米曲霉蛋白酶系，实现高效定向提升咸味肽含量、从而能够得到减盐不减味的富含咸味肽的酱油及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种富含咸味肽的酱油的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：将黄豆浸泡、蒸煮、冷却，得蒸煮黄豆备用，将小麦粉炒制，得炒制小麦粉备用；
(2)制曲：将蒸煮黄豆、炒制小麦粉、酵母抽提物和米曲霉菌种混合制曲，得曲料；
(3)发酵：将曲料与食盐水混合进行高盐稀态发酵，得酱醪；
(4)压榨：将酱醪压榨，得富含咸味肽的酱油。
本发明提供的一种富含咸味肽的制备方法通过在制曲的过程中同时添加酵母抽提物和米曲霉菌种进行混合制曲，酵母抽提物的添加能够实现对米曲霉菌种安全、定向、高效的诱导调控，进而调控原料蛋白的定向酶解，因此，能够从酿造本源上实现目标咸味肽的定向提升，从而实现酱油的减盐不减味；具体地，在酱油体系中，目前较为明确的具有增咸效果的咸味肽，也称咸味二肽，包括Glu-Leu、Leu-Glu和Val-Glu，而发明人研究发现，上述三种咸味二肽的形成与米曲霉菌种分泌的蛋白酶系组成高度相关，由于米曲霉菌种的胞外蛋白酶多为底物诱导表达，因此在制曲的过程中可以考虑通过底物诱导作用对米曲霉菌种的产酶特性进行一定程度的调控，基于此点，发明人研究发现，通过加入酵母抽提物，其能够很好的诱导米曲霉菌种的产酶特性，从而实现定向调控发酵工艺，提升酱油发酵过程中咸味二肽的含量，实现酱油的减盐不减味；并且本发明提供的制备方法无需引入其他试剂、无需其他定制设备，因此，本发明提供的制备方法操作简单、设备常规且安全性高。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，酵母抽提物的质量为蒸煮黄豆质量的2.3-2.6％。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，酵母抽提物中，氨基酸态氮与全氮的比值≤0.45、谷氨酸的含量为7-10g/100g。
发明人研究发现，当酵母抽提物的质量为蒸煮黄豆质量的2.3-2.6％，且酵母抽提物中的参数在上述范围内时，其能够更好的诱导分泌米曲霉菌种的胞外蛋白酶，从而使得产品中的咸味二肽的含量更高。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，米曲霉菌种的接种量为0.1-0.3％。
发明人研究发现，米曲霉菌种的接种量也会对最终产品中的咸味二肽的含量带来影响，当米曲霉菌种的接种量在本发明给出的范围内时，能够达到较高的咸味二肽含量。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，炒制小麦粉的质量为蒸煮黄豆质量的15-40％。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，制曲的环境湿度为90-95％、温度为28-34℃，制曲的时间为38-48h。
制曲的完成终点的判断为：曲料呈黄绿色、松散不发粘、曲香明显无异味，制曲的时间范围为38-48h；采用本发明技术方案得到的曲料与相同制曲工艺但不添加酵母抽提物制曲的曲料相比，其中的二肽酶5、氨基酰脯氨酰氨肽酶丰度显著提高，天冬氨酰氨肽酶丰度显著降低；说明本发明的技术方案能够高效定向诱导米曲霉菌种的胞外蛋白酶的分泌，从而实现最终产品中咸味二肽含量的提升。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，蒸煮黄豆的制备方法为：取黄豆加入黄豆质量2.5-3.5倍质量的水浸泡8-16h，然后在104-106℃下蒸煮20-45min，随后冷却，得蒸煮黄豆。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，炒制小麦粉的制备方法为：取小麦粉在120-180℃下炒制15-40min，得炒制小麦粉。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，曲料和食盐水的质量比为曲料：食盐水＝10：(14-16)，所述食盐水的质量浓度为18-22g/mL。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，高盐稀态发酵的时间为70-120天。
另外，本发明还提供了一种富含咸味肽的酱油，所述酱油采用本发明提供的制备方法制备而成。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的一种富含咸味肽的制备方法通过在制曲的过程中同时添加酵母抽提物和米曲霉菌种进行混合制曲，酵母抽提物的添加能够实现对米曲霉菌种安全、定向、高效的诱导调控，进而调控原料蛋白的定向酶解，因此，能够从酿造本源上实现目标咸味肽Glu-Leu、Leu-Glu和Val-Glu的定向提升，从而实现酱油的减盐不减味；采用本发明的制备方法得到的酱油富含目标咸味肽，其中，咸味肽的质量占总肽质量的11-14％；并且本发明提供的制备方法无需引入其他试剂、无需其他定制设备，因此，本发明提供的制备方法操作简单、设备常规且安全性高，适用于实际的工业生产。
附图说明
图1为Glu-Leu二级质谱碎片离子鉴定图谱；
图2为Leu-Glu二级质谱碎片离子鉴定图谱；
图3为Val-Glu二级质谱碎片离子鉴定图谱。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本领域常规试剂、方法和设备。
本发明实施例和对比例使用的蒸煮黄豆和炒制小麦粉都为同一批原料，其中，蒸煮黄豆和炒制小麦粉的制备方法如下：
蒸煮黄豆的制备方法为：取50kg黄豆加入150kg水浸泡12h，随后用高压锅在105℃下蒸煮35min，蒸煮完毕后冷却，得蒸煮黄豆，备用；
炒制小麦粉的制备方法为：取50kg小麦粉在150℃下炒制25min，得炒制小麦粉，备用。
本发明实施例和对比例除添加的酵母抽提物不同以外，其他工艺参数相同，具体如下：
取蒸煮黄豆8kg，炒制小麦粉2kg，与0.2kg酵母抽提物混合后，接种米曲霉菌种(沪酿3.042)，米曲霉菌种的接种量为0.2％，接种后在湿度为90％、温度为28-34℃的环境中静置培养18h，然后进行第一次翻曲，继续培养12h后进行第二次翻曲，继续培养12h后结束制曲，得曲料。
本发明实施例和对比例的酱油发酵工艺为同一条件下进行，具体如下：
取10份曲料与15份质量浓度为20g/100mL的食盐水混合，搅拌均匀后在30℃的环境中发酵80天，得酱醪，经压榨后得到酱油。
实施例1
本发明实施例提供一种富含咸味肽的酱油，其中在酱油的制曲中使用的酵母抽提物的氨基酸态氮为4.46g/100g，全氮为10.6g/100g，氨基酸态氮与全氮比值为0.42，谷氨酸含量为9.8g/100g。
实施例2
本发明实施例提供一种富含咸味肽的酱油，其与实施例1的唯一差别在于：在酱油的制备中使用的酵母抽提物的氨基酸态氮为4.75g/100g，全氮为10.5g/100g，氨基酸态氮与全氮比值为0.45，谷氨酸含量为7.5g/100g。
对比例1
本发明对比例提供一种含咸味肽的酱油，其与实施例1的唯一差别在于：在制曲阶段不添加酵母抽提物。
对比例2
本发明对比例提供一种富含咸味肽的酱油，其与实施例1的唯一差别在于：在酱油的制备中使用的酵母抽提物的氨基酸态氮为4.31g/100g，全氮为10.3g/100g，氨基酸态氮与全氮比值为0.42，谷氨酸含量为6.2g/100g。
对比例3
本发明对比例提供一种富含咸味肽的酱油，其与实施例1的唯一差别在于：在酱油的制备中使用的酵母抽提物的氨基酸态氮为4.49g/100g，全氮为10.7g/100g，氨基酸态氮与全氮比值为0.42，谷氨酸含量为11.6g/100g。
对比例4
本发明对比例提供一种富含咸味肽的酱油，其与实施例1的唯一差别在于：在酱油的制备中使用的酵母抽提物的氨基酸态氮为4.73g/100g，全氮为10.1g/100g，氨基酸态氮与全氮比值为0.47，谷氨酸含量为9.8g/100g。
效果例
本发明验证实施例1-2和对比例1-4制备得到的酱油的效果，具体包括以下方面。
1、酱油中咸味肽的相对丰度检测
用色谱级纯水对实施例1-2和对比例1-4中得到的酱油样品进行40倍稀释，然后用0.22μm PES过滤器过滤，使用Agilent 1290II-6545UHPLC-Q-TOF液质联用系统进行肽定性和相对定量，分析条件如下：
(1)液相色谱条件：色谱柱：Agilent AdvanceBio Peptide Mapping 2.1*100mm2.7μm；进样量：3μL；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动B：甲醇，流速0.3ml/min，分离条件为0-5min 98％ A，5-10min 98-20％ A，10-15min 20-0％ A；
(2)一级质谱条件：ESI正离子模式，Fragmentor电压125V，Skimmer电压65V，MS m/z扫描范围为100-3000；
(3)二级质谱条件：在一级质谱条件基础上，设置Collision电压为10、20、30V，采用Auto-Scan模式进行全组分扫描，MS/MS m/z扫描范围为50-1000。
(4)定性分析：使用Agilent MassHunter Qualitative Analysis数据分析软件进行肽分子识别，并根据二级质谱中的碎片离子特征对Glu-Leu、Leu-Glu、Val-Glu进行定性；
(5)定量分析：以一级质谱信号峰高度代表肽分子的含量，计算Glu-Leu、Leu-Glu、Val-Glu占所有肽分子一级质谱信号峰高之和的百分比。
其中，Glu-Leu、Leu-Glu、Val-Glu二肽，其二级质谱碎片离子图谱分别如图1、图2和图3所示；定量分析得到的结果如表1所示；其中，肽占比总和＝(Glu-Leu肽占比)+(Leu-Glu肽占比)+(Val-Glu肽占比)；
表1
从表1中可以看出，当采用本发明的技术方案时，得到的三种咸味肽的占比都较高，其中三种咸味肽的占比总和在11-14％之间；从实施例1和对比例1中可以看出，当在制曲的过程中不添加酵母抽提物时，得到的肽占比总和明显下降，相较于实施例1中肽占比总和下降幅度达42.45％；从实施例1和对比例2中可以看出，当加入的酵母抽提物中的谷氨酸含量过少时，Glu-Leu的含量会显著下降，尽管对Leu-Glu和Val-Glu有轻微提升作用，但咸味肽的总和占比相较于实施例1中的还下降了31.69％；从实施例1和对比例3中可以看出，当加入的酵母抽提物中的谷氨酸含量过多时，三种咸味肽的含量均有所下降；从实施例1和对比例4中可以看出，当加入的酵母抽提物中氨基酸态氮与全氮比值过高时，三种咸味肽含量都有不同程度的下降。
2、曲料中蛋白酶的相对丰度检测
取实施例1-2和对比例1-4中的曲料各10g，加入20g去离子水充分振荡5min，在4℃中静置浸提1h，然后12000rpm离心2min，取上清进行SDS-PAGE分离，对蛋白进行切胶回收，进行胰酶酶解与蛋白质谱分析，通过酶切产物的多肽氨基酸序列进行蛋白质数据库比对，对其中的蛋白酶进行定性和相对定量对比，结果如表2所示；
表2
从表2中的数据也可以看出，采用本发明的制备方法得到的曲料中，与对比例1中的数据相比，含有更高含量的二肽酶5、亮氨酰氨肽酶和氨基酰脯氨酰氨肽酶表达量，含有更低含量的天冬氨酰氨肽酶表达量。从实施例1和对比例1-4中可以看出，添加酵母抽提物有助于促进二肽酶5、氨基酰脯氨酰氨肽酶的表达，但当添加的酵母抽提物氨氮和全氮比值过高或谷氨酸含量过高时，其提升效果不明显，因此不利于肽分子的释放。此外，适当提升酵母抽提物的谷氨酸含量有助于抑制天冬氨酰氨肽酶的表达，从而更好地提升Glu-Leu肽的含量。
3、咸味肽对酱油的咸味强度和鲜味强度的影响探究
为了更直观地体现Glu-Leu、Leu-Glu、Val-Glu的增咸效果，本效果例对上述三个二肽进行固相合成与制备液相分离纯化。将上述三个二肽按照2:1.5:1的比例进行混合，添加到含盐量为13％的减盐酱油中，添加后终浓度为400mg/L，同时与空白、添加0.5％、1％食盐的减盐酱油进行感官对比，选取10名专业的感官鉴评人员对咸味和鲜味进行感官评分，以空白组5分为参照；得到的评分结果如表3所示；
表3
从表3中可以看出，咸味肽组合物在减盐酱油中的增咸效果较为显著，添加量为0.04％咸味肽与添加1％食盐所增加的咸度相当，与此同时，咸味肽组合物对于鲜味同样具有较明显的提升作用，这是因为上述三个二肽已被报道具有一定的增鲜效果，这与其含有谷氨酸残基密切相关，与之相比，食盐对鲜味的提升效果十分有限。
4、酱油的感官评价
选取10名感官鉴评经验丰富的人员，以采用酱油常规发酵工艺的酱油(对比例1中的酱油)为参照(分值为5分)，对实施例1-2和对比例2-4发酵所得酱油进行咸味强度评分，分值越高咸味越重，鉴评结果如表4所示；
表4
从表4中可以看出，采用本发明的技术方案得到的酱油相比与传统工艺生产的酱油其咸味有不同程度的提升，说明本发明的酱油生产工艺可显著提升酱油咸味，达到减盐不减味的效果。
最后应当说明的是，以上实施例以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种富含咸味肽的酱油的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：将黄豆浸泡、蒸煮、冷却，得蒸煮黄豆，备用；将小麦粉炒制，得炒制小麦粉，备用；
(2)制曲：将蒸煮黄豆、炒制小麦粉、酵母抽提物和米曲霉菌种混合制曲，得曲料；
(3)发酵：将曲料与食盐水混合进行高盐稀态发酵，得酱醪；
(4)压榨：将酱醪压榨，得富含咸味肽的酱油。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，酵母抽提物的质量为蒸煮黄豆质量的2.3-2.6％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，酵母抽提物中，氨基酸态氮与全氮的比值≤0.45、谷氨酸的含量为7-10g/100g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，米曲霉菌种的接种量0.1-0.3％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，炒制小麦粉的质量为蒸煮黄豆质量的15-40％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，制曲的环境湿度为90-95％、温度为28-34℃，制曲的时间为38-48h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，蒸煮黄豆的制备方法为：取黄豆加入黄豆质量2.5-3.5倍质量的水浸泡8-16h，然后在104-106℃下蒸煮20-45min，随后冷却，得蒸煮黄豆。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，炒制小麦粉的制备方法为：取小麦粉在120-180℃下炒制15-40min，得炒制小麦粉。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，曲料和食盐水的质量比为曲料：食盐水＝10：(14-16)，所述食盐水的质量浓度为18-22g/mL。
10.一种富含咸味肽的酱油，其特征在于，所述酱油采用如权利要求1-9任一项所述的制备方法制备而成。
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