CN115820478A - 一种丙烯酸及其酯类废水的降解菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丙烯酸及其酯类废水的降解菌株及其应用，该菌株属于蒙氏假单胞菌，菌株代码为YJY22‑19，保藏号为CGMCC No.25096，其16S rDNA基因序列如Seq ID No:1所示。利用本发明提供的菌株制备的菌剂应用于生产涂料所产生的丙烯酸及其酯类废水的生物法处理，按照容积体积百分比为0.01‑10％投加入AO生物处理系统中的好氧体系中，8h可对初始COD为9000mg·L^‑1的丙烯酸及其酯类废水中的出水COD降至200mg·L^‑1以下，利用本发明菌株及方法，可极大提高丙烯酸及其酯类废水的生化处理效率。

Description

一种丙烯酸及其酯类废水的降解菌株及其应用

技术领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一种丙烯酸及其酯类废水的降解菌株及其应用。

背景技术

丙烯酸作为一种不饱和脂肪酸，是重要的精细化工原料和中间体，丙烯酸作为重要的有机合成原料和合成树脂单体，被用于制造丙烯酸酯类的聚合物来合成树脂、纤维、涂料等工业部门。其生产废水是典型的有毒石化废水，丙烯酸及其酯类废水由此产生。丙烯酸及其酯类废水主要包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲醛、丙烯醛、甲苯、正丁醇、乙酸乙酯、苯乙烯等十多种特征毒性物质。丙烯酸及其酯类废水由于其毒性较大(可生化性＜0.01)、COD较高(几万-几十万mg/L)、pH(3-9)涉及范围交广，其处理成为废水处理行业中亟待解决的难题。

目前，丙烯酸及其酯类废水的处理方法主要为焚烧法。但焚烧法存在投资大、处理费用较高以及产生二次污染等缺点。近年来，研究者不断开发出了包括催化湿式氧化法、离子交换纤维法、超临界水氧化法、光电子波技术、生物法等新的方法。湿式催化氧化法因其关键的催化剂，不但催化剂的费用高，对水质的要求较高，并且必须在高温高压的条件下进行等特点，在工业中鲜少被使用；离子交换纤维法是利用一种纤维作为离子交换材料，但因离子交换纤维造价昂贵，且再生能力困难，对废水的净化作用专一性较强，对成分复杂、COD较高的丙烯酸及其酯类废水难以进行工业化使用；超临界水氧化法是一种使处于高温高压状态下的液体具有极强的氧化能力和广泛的融合能力的方法，但其高温高压的环境存在安全隐患，此技术研究起步较晚，工艺不成熟，还未有工业应用的报道；光电子波技术处理工业废水的技术原理是量子力学，具有工艺简单、速度快等特点，但目前因其投资成本高、研究少、工艺不成熟等特点，还未被用于废水工业化处理中；生物法是指利用微生物自身的新陈代谢降解废水中有机物的一种处理方法，此方法无污染，可控性较强，因此可被应用于废水处理中。

丙烯酸及其酯类废水虽然具有污染物浓度高、成分复杂、毒性大、可生化性差等特点，但通过长期的驯化培养，会逐渐培养出适合该废水的微生物菌株。目前，中国专利申请号201910097792.1的申请中公开了一种丙烯酸降解菌及其应用，大肠杆菌WX在5d内对初始浓度为200-3000mg·L^-1的丙烯酸降解率可达95％-99.6％；中国专利申请号202111586413.9的申请中公开了食醚红球菌ZHC及其在降解丙烯酸甲酯中的应用，食醚红球菌ZHC对丙烯酸甲酯的降解浓度为95-475mg·L^-1；上述所公开的专利申请方案仅能对其中一种废水进行降解，且降解速率和浓度较低，而对丙烯酸及其脂类等多种污染物降解的报道尚未出现。因此，能否获得较好的丙烯酸及其酯类的降解菌株成为研究人员的重要任务之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丙烯酸及其酯类废水的降解菌株及其应用，以解决现用于降解丙烯酸的菌株只能对单一组分废水进行降解而不能处理混合废水，且降解速率和浓度均较低的问题。

为实现上述目的，本申请是通过以下技术方案实现的：

一种丙烯酸及其酯类废水的降解菌株，该菌株属于蒙氏假单胞菌，菌株代码为YJY22-19，保藏号为CGMCC No.25096，其16S rDNA基因序列如Seq ID No:1所示。

进一步的，丙烯酸及其酯类废水是指含丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲酸、丙烯酸乙酯、乙酸乙酯、丙烯酸异丙酯、甲醛、乙酸、甲苯、丙酮、丙烯醛、苯或乙醛中一种以上的废水。

进一步的，利用丙烯酸及其酯类废水的降解菌株生产降解菌剂的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将保存的菌种取出，于室温条件下活化1-3h；所述菌种为YJY22-19；

(2)种子培养：在超净工作台中，于试管斜面中挑取菌株，直接接入到100ml无菌的LB液体培养基中，160-190rpm，28-35℃下培养15-22h制备得到种子液；

(3)发酵培养：发酵罐中加入发酵培养基，121℃灭菌0.5小时，按体积比0.3％接入种子液，发酵过程中控制温度28-35℃，罐压0.03-0.05MPa，起始转速160-190rpm，溶氧≧20％，气液比1:1；待溶氧降为20％以下时，pH上升至8.5后即为发酵完成。

进一步的，发酵培养基的配方按重量百分比为：葡萄糖0.8-1.2％，玉米淀粉0.3-0.6％，豆粕2.8-4.0％，蛋白胨0.3-0.7％，硫酸铵0.2-0.5％，酵母粉0.3-0.8％，硫酸锰0.01-0.05％，余量为去离子水。

一种丙烯酸及其酯类废水的降解菌株的应用，利用丙烯酸及其酯类废水的降解菌株生产的降解菌剂，应用于降解含有丙烯酸及其酯类废水中。

进一步的，含有丙烯酸及其酯类废水中COD为20000-100000mg·L^-1。

进一步的，降解菌剂直接加入AO生物处理系统中的好氧体系中。

进一步的，所述降解菌剂的添加量为好氧体系中液体体积的0.01-10％。

本发明的有益效果是：

利用本发明提供的菌株制备的菌剂应用于生产涂料所产生的丙烯酸及其酯类废水的生物法处理，按照上述用量投加入AO生物处理系统中的好氧体系中，8h可对初始COD为9000mg·L^-1的丙烯酸及其酯类废水中的出水COD降至200mg·L^-1以下，利用本发明菌株及方法，可极大提高丙烯酸及其酯类废水的生化处理效率。

附图说明

图1为丙烯酸及其脂类废水质谱图(顶空进样)。

图2为实施例3中菌剂对丙烯酸及其脂类废水降解后样品的质谱图(顶空进样)。

图3为实施例3中空白对丙烯酸及其脂类废水降解后样品的质谱图(顶空进样)。

图4为实施例4中菌剂对丙烯酸的降解示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本申请的技术方案进行详细的说明，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

本申请涉及的菌株的保藏信息：

保藏时间：2022年6月16日；

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC No.25096；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；

分类命名:蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)。

本申请的蒙氏假单胞菌，菌株代码为YJY22-19，保藏号为CGMCC No.25096；该菌株具有高效去除丙烯酸及其酯类废水的能力，解决了丙烯酸及其酯类废水难处理、能耗高、时间久等问题，并使其变成对环境无害的CO₂和H₂O，在处理过程中，不会产生二次污染。

该菌株形态特征为：菌落为单个菌落，不透明，呈微黄色，表面光滑，边缘整齐；其16S rDNA基因序列如Seq ID No:1所示，该16S rDNA序列进行BLAST比对，结果显示，该菌株的16S rDNA的基因序列与假单胞菌属(Pseudomonas)不同菌株的基因序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)的菌株有100％的同源性。

申请人为使上述菌株进行工业化应用，确定了利用丙烯酸及其酯类废水的降解菌株生产降解菌剂的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将保存的菌种取出，于室温条件下活化1-3h；所述菌种为YJY22-19；

(2)种子培养：在超净工作台中，于试管斜面中挑取菌株，直接接入到100ml无菌的LB液体培养基中，160-190rpm，28-35℃下培养15-22h制备得到种子液；

(3)发酵培养：发酵罐中加入发酵培养基，121℃灭菌0.5小时，按体积比0.3％接入种子液，发酵过程中控制温度28-35℃，罐压0.03-0.05MPa，起始转速160-190rpm，溶氧≧20％，气液比1:1；待溶氧降为20％以下时，pH上升至8.5后即为发酵完成；

上述的发酵培养基配方按重量百分比为：葡萄糖0.8-1.2％，玉米淀粉0.3-0.6％，豆粕2.8-4.0％，蛋白胨0.3-0.7％，硫酸铵0.2-0.5％，酵母粉0.3-0.8％，硫酸锰0.01-0.05％，余量为去离子水。

具体应用时，将上述发酵获得的菌剂按液体体积的0.01-10％加入好氧体系即可。

本发明所述菌株在20h内，可对初始浓度为5000-30000mg·L^-1的丙烯及其酯类废水降解率达99.13-99.87％以上。

所述丙烯酸及其废水包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲酸、丙烯酸乙酯、乙酸乙酯、正丁醇、甲醛、乙酸、甲苯、丙酮、丙烯醛、苯乙烯、乙醛中的1种或多种，其COD为20000-100000mg·L^-1。

利用本发明提供的菌株制备的菌剂应用于生产涂料所产生的丙烯酸及其酯类废水的生物法处理，按照上述用量投加入AO生物处理系统中的好氧体系中，8h可对初始COD为9000mg·L^-1的丙烯酸及其酯类废水中的出水COD降至200mg·L^-1以下，利用本发明菌株及方法，可极大提高丙烯酸及其酯类废水的生化处理效率。

下述各实施例中所采用的培养基组成如下：

LB培养基组成：胰蛋白胨10g·L^-1，酵母粉5g·L^-1，氯化钠10g·L^-1，pH 7.2；LB固体培养基为在上述LB培养基的基础上添加1.5wt％的琼脂。

无机盐培养基组成：K₂HPO₄ 0.5g·L^-1，KH₂PO₄ 0.5g·L^-1，NaCl 0.1g·L^-1，MgSO₄0.03g·L^-1，CaCl₂ 0.02g·L^-1，FeSO₄ 0.002g·L^-1，MnSO₄ 0.002g·L^-1，pH 7.2。

上述二者中若需要加入丙烯酸及其酯类废水，可根据具体需求进行添加，一般控制其含量在5000-30000mg·L^-1。

培养基配制完成后均需在高压蒸汽灭菌锅中进行121℃，20min的灭菌，其中无机盐培养基，在灭菌完成后再进行丙烯酸及其酯类废水的添加。

实施例1

菌株从山东某农化股份有限公司厂区废水生化处理装置所取的样品中取样1g，加入到经过121℃高温灭菌20min的100mL生理盐水中进行摇床160rpm混匀，30min后静止1.5h，吸取上清后用无菌水梯度稀释至10^-3-10^-10倍，在加入丙烯酸及其酯类废水的LB固体培养基中进行涂布，置于生化培养箱中进行35℃培养18h。

挑选培养皿上具有明显差异的单菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化培养，连续纯化3次后，共得到6株单一菌株，并进行斜面和甘油管保存；对6株待选菌株分别在含有丙烯酸及其酯类废水的无机盐液体培养基中进行后续的丙烯酸及其酯类降解实验的研究，最终筛选出1株丙烯酸及其酯类废水降解效率高、易于培养且有稳定传代特性的菌株，其形态特征为：菌落不透明，呈微黄色，表面光滑，边缘整齐，将其命名为YJY22-19。

发明人对其进行了16S rDNA测序，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，该16S rDNA序列进行BLAST比对，结果显示，该菌株的16S rDNA的核苷酸序列与假单胞菌属(Pseudomonas)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)的菌株有100％的同源性。并在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心进行了生物保藏，保藏编号为CGMCC No.25096，经检测其为存活状态。

实施例2

菌株的发酵：

(1)菌种活化：将保存在斜面营养琼脂培养基中的菌株试管于4℃冰箱中取出，室温条件下活化1h-3h。

(2)液体种子制备：在超净工作台中，于试管斜面中挑取菌株，直接接入到100ml无菌的LB液体培养基中，160rpm，33℃下培养16h制备得到种子液；

(3)发酵：发酵罐中加入占罐体积1/2-2/3的发酵培养基，灭菌后，按体积比0.2％接种种子液，发酵过程中控制温度33℃，罐压0.05MPa，起始转速160rpm，溶氧≧20％，气液比1:1；待溶氧降为20％，pH上升至8.5即为发酵完成获得菌剂，所得菌剂的活菌数约为10⁸cfu/ml；

灭菌方式优选121℃灭菌0.5小时；

发酵培养基配方为：葡萄糖1.0％，玉米淀粉0.4％，豆粕3.0％，蛋白胨0.5％，硫酸铵0.4％，酵母粉0.5％，硫酸锰0.03％，余量为去离子水。

实施例3

菌剂效果验证：

将实施例2步骤(2)中获得的YJY22-19种子液直接添加到含有25000mg·L^-1丙烯酸及其酯类废水(COD为90000mg·L^-1)的无机盐培养基中，接种量体积比1％，在35℃、180rpm的条件下进行培养，设立未接种YJY22-19的空白对照，16h时根据气质测定，培养基中的丙烯酸及其酯类废水被100％降解(图2)，空白对照中的丙烯酸及其酯类废水剩余量的质谱图(图3)与丙烯酸及其脂类的质谱图(图1)基本一致，说明，空白对照中的丙烯酸及其脂类含量基本未变。

经质谱图解析，图1中根据时间顺序，丙烯酸及其脂类废水为乙醛、丙酮、乙酸甲酯、丙烯醛、异丁烯醛、苯、丙烯酸异丙酯、甲苯、乙酸和甲酸。

实施例4

菌剂对高浓度丙烯酸及其脂类废水的降解效果：

将实施例2步骤(2)中获得的YJY22-19种子液直接添加到含有30000mg·L^-1丙烯酸及其脂类的无机盐培养基中，接种量体积比1％，在34℃、180rpm的条件下进行培养，设立未接种YJY22-19的空白对照，跟踪检测，在20h测定时，培养基中的丙烯酸及其脂类废水为1.91mg·L^-1，降解率为99.99％，空白样品中的丙烯酸及其脂类的剩余量基本未发生变化(图4)，说明本发明所提供的菌株YJY22-19对30000mg·L^-1的丙烯酸及其脂类的降解率在20h时可达99％以上。

实施例5

菌剂对丙烯酸及其脂类单一废水的降解效果：

将实施例2步骤(2)中获得的YJY22-19种子液分别直接添加到含有5000mg·L^-1丙烯酸或其脂类的无机盐培养基中，(丙烯酸或其脂类单一废水分别为：丙烯醛、丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲苯、乙酸、甲醛、丙酮和乙醛共9种样品)接种量体积比1％，在34℃、180rpm的条件下进行培养，同时分别设立各目标废水未接种YJY22-19的空白对照，跟踪检测，在24h测定时，培养基中目标废水均未检出，降解率达100％，空白样品中的目标废水的剩余量基本未发生变化，说明本发明所提供的菌株YJY22-19对本文所罗列的丙烯酸及其脂类废水种的单一废水均可进行有效降解，且在24h对初始浓度为5000mg/L的目标废水可完全降解。

实施例6

菌剂应用于涂料生产废水的处理：

某涂料生产废水生化处理装置受到丙烯酸及其脂类废水(初始含量12000mg·L^-1)的冲击导致系统不能正常运行，其出水COD在2636.13mg·L^-1,氨氮在326.72mg·L^-1，发明人为验证所述菌株的处理效果，将实施例2步骤(3)制备获得的菌剂按照好氧池内液体体积比0.5％的比例加入好氧池池中进行丙烯酸及其脂类降解效果验证，好氧池温度32℃，溶解氧3.8mg·L^-1，pH 7.32，水力停留时间24h，跟踪检测体系中丙烯酸及其脂类含量；结果表明，系统中丙烯酸及其脂类含量从初始的12000mg·L^-1经20h降解为2.69mg·L^-1，系统出水指标恢复稳定，出水COD为100.27mg·L^-1，氨氮为0.31mg·L^-1，可见YJY22-19菌株极大缓解了丙烯酸及其脂类对污水处理系统的冲击作用。

对照例1

实施例6中所述的某涂料生产废水生化处理装置未添加本申请所述菌剂时，在处理浓度为500mg·L^-1的丙烯酸及其脂类废水时能够正常运行，水力停留时间24h，出水COD为439.65mg·L^-1，氨氮为2.98mg·L^-1，出水指标合格；当接受到较高浓度丙烯酸及其脂类的废水(1000-15000mg·L^-1)时，水力停留时间24h后出水COD为2369.81mg·L^-1,氨氮398.37mg·L^-1，严重超标。

为了验证本申请的菌剂功能，在接受到与上述条件相同的较高浓度丙烯酸及其脂类废水(1000-15000mg·L^-1)时，在生化处理好氧池中按照好氧池内液体体积比0.6％添加实施例2步骤(3)制备获得的YJY22-19菌剂，好氧池温度32℃，溶解氧3.8mg·L^-1，pH 7.32；处理20h后，系统出水丙烯酸及其脂类废水经气质检测后未检出，COD降为108.27mg·L^-1，氨氮为1.33mg·L^-1，出水指标合格。

可见，在接受较高浓度丙烯酸及其脂类的废水冲击后，YJY22-19菌株比好氧池中原始处理菌株能更好的维持处理效果，可在短时间内将丙烯酸及其脂类废水降解，同时不会影响对于其他污染物的处理效果，实现了短时间内对污水的高效处理效果。

对照例2

中国专利申请号201910097792.1的申请中公开了一种丙烯酸降解菌及其应用，所述大肠杆菌WX在5d内对初始浓度为200-3000mg·L^-1的丙烯酸降解率可达95％-99.6％；本发明所述的的YJY22-19可对浓度为5000mg·L^-1的丙烯酸在24h时降解完成，与大肠杆菌WX相比，本发明所述YJY22-19菌株对丙烯酸的降解速率提高了5倍，降解浓度提高了1.6-25倍。

对照例3

中国专利申请号202111586413.9的申请中公开了食醚红球菌ZHC及其在降解丙烯酸甲酯种的应用，所述食醚红球菌ZHC对丙烯酸甲酯的降解浓度为95-475mg·L^-1，而本发明所述YJY22-19菌株可对初始浓度为5000mg·L^-1的丙烯酸甲酯进行完全降解，与食醚红球菌ZHC，本发明所述YJY22-19菌株对丙烯酸甲酯的降解浓度提高了10倍。

通过上述对比可知，利用本发明菌株及方法，不仅可极大提高丙稀酸及其脂类的降解浓度，而且还可以达到对丙烯酸、丙烯醛、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯等在生产丙烯酸过程中产生的丙烯酸脂类等实现同时降解的目的。此菌剂和方法应用于丙烯酸生产产生的废水工业处理中，可极大提高工业废水的处理效率和处理成本。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种丙烯酸及其酯类废水的降解菌株，其特征在于，该菌株属于蒙氏假单胞菌，菌株代码为YJY22-19，保藏号为CGMCC No.25096，其16S rDNA基因序列如Seq ID No:1所示。

2.根据权利要求1所述的丙烯酸及其酯类废水的降解菌株，其特征在于，丙烯酸及其酯类废水是指含丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲酸、丙烯酸乙酯、乙酸乙酯、丙烯酸异丙酯、甲醛、乙酸、甲苯、丙酮、丙烯醛、苯或乙醛中一种以上的废水。

3.根据权利要求1所述的丙烯酸及其酯类废水的降解菌株，其特征在于，利用丙烯酸及其酯类废水的降解菌株生产降解菌剂的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将保存的菌种取出，于室温条件下活化1-3h；所述菌种为YJY22-19；

(2)种子培养：在超净工作台中，于试管斜面中挑取菌株，直接接入到100ml无菌的LB液体培养基中，160-190rpm，28-35℃下培养15-22h制备得到种子液；

(3)发酵培养：发酵罐中加入发酵培养基，121℃灭菌0.5小时，按体积比0.3％接入种子液，发酵过程中控制温度28-35℃，罐压0.03-0.05MPa，起始转速160-190rpm，溶氧≧20％，气液比1:1；待溶氧降为20％以下时，pH上升至8.5后即为发酵完成。

4.根据权利要求3所述的丙烯酸及其酯类废水的降解菌株，其特征在于，发酵培养基的配方按重量百分比为：葡萄糖0.8-1.2％，玉米淀粉0.3-0.6％，豆粕2.8-4.0％，蛋白胨0.3-0.7％，硫酸铵0.2-0.5％，酵母粉0.3-0.8％，硫酸锰0.01-0.05％，余量为去离子水。

5.一种丙烯酸及其酯类废水的降解菌株的应用，其特征在于，利用权利要求1至4中任一项丙烯酸及其酯类废水的降解菌株生产的降解菌剂，应用于降解含有丙烯酸及其酯类废水中。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，含有丙烯酸及其酯类废水中COD为20000-100000mg·L^-1。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，降解菌剂直接加入AO生物处理系统中的好氧体系中。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述降解菌剂的添加量为好氧体系中液体体积的0.01-10％。

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