CN115820451A

CN115820451A - 植物乳杆菌gk1、葡萄籽粕的发酵方法、发酵葡萄籽粕冻干粉和发酵葡萄籽粕咀嚼片

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Publication number: CN115820451A
Application number: CN202210751235.9A
Authority: CN
Inventors: 谢远红; 张红星; 周雨琪; 杨竹娘; 庞晓娜; 金君华; 刘慧�
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2022-06-28
Filing date: 2022-06-28
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明提供了一种植物乳杆菌GK1、葡萄籽粕的发酵方法、发酵葡萄籽粕冻干粉和发酵葡萄籽粕咀嚼片，涉及生物技术领域。本发明提供的植物乳杆菌GK1，安全性高，对酸、胆盐具有良好耐受性，在肠道定植能力强，具有良好的益生作用和发酵性能，能够用于葡萄籽粕的发酵，实现葡萄籽废弃物的综合利用，具有广阔的商业前景。本发明提供的葡萄籽粕的发酵方法，以植物乳杆菌GK1为发酵菌对葡萄籽粕进行发酵，发酵后葡萄籽粕抗氧化能力、总酚、总黄酮及单体酚含量较未发酵过的葡萄籽粕均有所增加。本发明提供的发酵葡萄籽粕冻干粉稳定性好，植物乳杆菌GK1存活率高，保存时间长。本发明提供的发酵葡萄籽粕咀嚼片，食用安全，感官良好。

Description

植物乳杆菌GK1、葡萄籽粕的发酵方法、发酵葡萄籽粕冻干粉和发酵葡萄籽粕咀嚼片

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种植物乳杆菌GK1、葡萄籽粕的发酵方法、发酵葡萄籽粕冻干粉和发酵葡萄籽粕咀嚼片。

背景技术

对于葡萄籽粕研究及开发大致分为两个方向，一种是作为饲料进行研究，另一种是对其营养物质进行提取。在20世纪90年代就有研究学者提出由于葡萄籽粕富含蛋白质及氨基酸可以用于饲料或营养强化剂方面，对于增加社会效益和经济效益都是非常有益的。在此后二十年间，针对饲料方面的研究涌现出来，并在2015年达到高峰。于维等对蛋鸡产蛋性能进行了研究，发现当饲料中葡萄籽粕添加量为6％时蛋鸡的产蛋性能提高了6.45％，乔利敏也得出了相似的结论。复合菌种发酵葡萄籽粕后使肉鸡饲料原料品质得到改善，提高了利用价值。Pistol等研究发现葡萄籽粕作为日粮添加到患有炎症性肠病的仔猪饲料中，发现其可以减轻仔猪结肠上皮功能性障碍并且减轻炎症。有研究指出葡萄籽粕作为理想的高纤维饲料可以直接添加于鹅日粮，有助于鹅对营养物质的吸收，经过发酵后的葡萄籽粕小肽含量显著增加，并且可以显著提高酮体品质及氨基酸利用率。葡萄籽粕作为饲料代替品喂育肥猪、肥羊、西门塔尔牛等，在降低成本的同时可以促进其生长性能。

对于葡萄籽粕中营养物质的研究及利用主要集中在原花青素和蛋白质两方面。王猛等探索了微波提取葡萄籽粕中原花青素的最优工艺，提取率优于传统水浴加热提取方式。刘霞等发现葡萄籽饼粕超微粉具有显著抑制衰老小鼠体内脂质过氧化的作用、能明显提高内源性抗氧化酶活性并且无毒副作用，其具有较好的抗氧化、抗衰老作用。现有提取蛋白质的方法有喷雾干燥法、酶辅助法、复合酶法及碱溶酸沉法，其中碱溶酸沉法对蛋白质提取率可达88.56％，喷雾干燥法适宜工业化大规模生产。除饲料及营养成分提取外，还未见有关于适宜人食用的产品开发，葡萄籽粕中含有大量的优质蛋白质、氨基酸及多酚类化合物有益于人体健康，因此开发葡萄籽粕相关食品可以大大避免资源浪费并且具有极大的市场发展潜力。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种植物乳杆菌GK1，于2022年1月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24382。

本发明的第二目的在于提供上述植物乳杆菌GK1在制备发酵产品中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种葡萄籽粕的发酵方法。

本发明的第四目的在于提供一种发酵葡萄籽粕冻干粉。

本发明的第五目的在于提供上述发酵葡萄籽粕冻干粉的制备方法。

本发明的第六目的在于提供一种发酵葡萄籽粕咀嚼片。

第一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌GK1，所述植物乳杆菌GK1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24382。

第二方面，本发明提供了一种植物乳杆菌GK1在制备发酵产品中的应用。

第三方面，本发明提供了一种葡萄籽粕的发酵方法，包括：将所述的植物乳杆菌GK1接种至葡萄籽粕发酵培养基中发酵，得到发酵液；

所述葡萄籽粕发酵培养基主要由葡萄籽粕、糖和水组成。

作为进一步技术方案，按质量份数计，所述葡萄籽粕发酵培养基包括葡萄籽粕11-15份、糖2～4份、β-环糊精0.1-0.5份和水80-87份；

优选地，按质量份数计，所述葡萄籽粕发酵培养基包括葡萄籽粕13份、糖3份、β-环糊精0.2份和水82.8份；

优选地，所述糖包括葡萄糖或蔗糖中的至少一种。

作为进一步技术方案，所述植物乳杆菌GK1的接种量为3-5lgCFU/mL，优选为5lgCFU/mL；

优选地，所述发酵的时间为16-20h，优选为18h；

优选地，所述发酵的温度为35-39℃，优选为36℃；

优选地，所述发酵的pH为5-7。

第四方面，本发明提供了一种发酵葡萄籽粕冻干粉，主要由所述的发酵液制备得到。

作为进一步技术方案，所述发酵葡萄籽粕冻干粉还包括冻干保护剂；

按质量份数计，所述冻干保护剂包括脱脂乳粉5-10份、山梨醇0.5-1.5份、聚葡萄糖2-4份和海藻糖1-3份。

优选地，按质量份数计，所述冻干保护剂包括脱脂乳粉5份、山梨醇1.5份、聚葡萄糖2份和海藻糖3份。

第五方面，本发明提供了一种发酵葡萄籽粕冻干粉的制备方法，包括：将所述冻干保护剂与所述发酵液混合，冷冻干燥后，制备得到发酵葡萄籽粕冻干粉；

所述冻干保护剂与发酵液的质量比为8.5:100-18.5:100，优选为11.5:100。

第六方面，本发明提供了一种发酵葡萄籽粕咀嚼片，按质量份数计，包括如下组分：所述的发酵葡萄籽粕冻干粉30-50份、赤藓糖醇18-22份、微晶纤维素18-22份、麦芽糊精15-20份、葡萄果粉5-15份、柠檬酸1-2份和硬质酸镁0.5-2份。

作为进一步技术方案，按质量份数计，包括如下组分：所述的发酵葡萄籽粕冻干粉30份、赤藓糖醇20份、微晶纤维素20份、麦芽糊精17.5份、葡萄果粉10份、柠檬酸1.5份和硬质酸镁1份。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的植物乳杆菌GK1，安全性高，对酸、胆盐具有良好耐受性，在肠道定植能力强，具有良好的益生作用和发酵性能，能够用于葡萄籽粕的发酵，实现葡萄籽废弃物的综合利用，具有广阔的商业前景。

本发明提供的葡萄籽粕的发酵方法，以植物乳杆菌GK1为发酵菌对葡萄籽粕进行发酵，发酵后葡萄籽粕抗氧化能力、总酚、总黄酮及单体酚含量较未发酵过的葡萄籽粕均有所增加，为开发葡萄籽粕相关产品奠定了基础。

本发明提供的发酵葡萄籽粕冻干粉稳定性好，植物乳杆菌GK1存活率高，保存时间长。

本发明提供的发酵葡萄籽粕咀嚼片，食用安全，感官良好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为植物乳杆菌GK1发酵葡萄籽粕技术路线；

图2为葡萄籽粕添加量对活菌数及DPPH自由基清除率的影响；

图3为初始接菌量对活菌数及DPPH自由基清除率的影响；

图4为蔗糖添加量对活菌数及DPPH自由基清除率的影响；

图5为发酵时间对活菌数及DPPH自由基清除率的影响；

图6为发酵温度对活菌数及DPPH自由基清除率的影响；

图7为脱脂乳粉添加量对冻干保护率的影响；

图8为山梨醇添加量对冻干保护率的影响；

图9为聚葡萄糖添加量对冻干保护率的影响；

图10为D-E抗坏血酸钠添加量对冻干保护率的影响；

图11为罗望子多糖添加量对冻干保护率的影响；

图12为海藻糖添加量对冻干保护率的影响；

图13为麦芽糊精添加量对冻干保护率的影响；

图14为葡萄籽粕冻干粉随储藏时间变化图；

图15为不同发酵葡萄籽粕咀嚼片样品硬度结果；

图16为不同发酵葡萄籽粕咀嚼片综合评定等级得分排名图；

图17为不同发酵葡萄籽粕咀嚼片综合评定感官雷达图。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌GK1，该菌株的分类命名为：植物乳杆菌GK1，拉丁文学名：Lactobacillus plantarum GK1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2022年1月28日，保藏编号：CGMCC No.24382。

本发明提供的具有良好的益生作用和发酵性能，能够用于发酵产品的制备。

所述葡萄籽粕发酵培养基主要由葡萄籽粕、糖和水组成。

该发酵方法，发酵后葡萄籽粕抗氧化能力、总酚、总黄酮及单体酚含量较未发酵过的葡萄籽粕均有所增加，为开发葡萄籽粕相关产品奠定了基础。

在一些优选的实施方式中，按质量份数计，本发明提供的葡萄籽粕发酵培养基中葡萄籽粕例如可以为，但不限于11份、12份、13份、14份或15份；糖例如可以为，但不限于2份、3份或4份；β-环糊精例如可以为，但不限于0.1份、0.2份、0.3份、0.4份或0.5份；水例如可以为，但不限于80份、82份、84份、86份或87份。

优选地，按质量份数计，所述葡萄籽粕发酵培养基包括葡萄籽粕13份、糖3份、β-环糊精0.2份和水82.8份。

通过对葡萄籽粕发酵培养基中各个组分的进一步优化和调整，使得植物乳杆菌对葡萄籽粕的发酵效果更好。

本发明中，所述糖包括但不限于葡萄糖或蔗糖中的至少一种，或者还可选用本领域技术人员所熟知的其他糖。

在一些优选的实施方式中，所述植物乳杆菌GK1的接种量例如可以为，但不限于3lgCFU/mL、4lgCFU/mL或5lgCFU/mL，优选为5lgCFU/mL；

优选地，所述发酵的时间例如可以为，但不限于16h、18h或20h，优选为18h；

优选地，所述发酵的温度例如可以为，但不限于35℃、37℃或39℃，优选为36℃；

优选地，所述发酵的pH例如可以为，但不限于5、6或7。

通过对发酵条件的进一步优化和调整，使得植物乳杆菌对葡萄籽粕的发酵效果更好。

在一些优选的实施方式中，所述发酵葡萄籽粕冻干粉还包括冻干保护剂；

按质量份数计，冻干保护剂中脱脂乳粉例如可以为，但不限于5份、7份、9份或10份；山梨醇例如可以为，但不限于0.5份、0.7份、0.9份、1.1份、1.3份或1.5份；聚葡萄糖例如可以为，但不限于2份、3份或4份；海藻糖例如可以为，但不限于1份、2份或3份。

通过对冻干保护剂各个组分的进一步优化和调整，使得制备得到的发酵葡萄籽粕冻干粉的性质更稳定，植物乳杆菌GK1存活率更高，保存时间更长。

第六方面，按质量份数计，本发明提供的发酵葡萄籽粕咀嚼片中，发酵葡萄籽粕冻干粉例如可以为，但不限于30份、35份、40份、45份或50份；赤藓糖醇例如可以为，但不限于18份、19份、20份、21份或22份；微晶纤维素例如可以为，但不限于18份、19份、20份、21份或22份；麦芽糊精例如可以为，但不限于15份、17份、19份或20份、葡萄果粉例如可以为，但不限于5份、7份、9份、11份、13份或15份；柠檬酸例如可以为，但不限于1份、1.5份或2份；硬质酸镁例如可以为，但不限于0.5份、1份、1.5份或2份。

本发明提供的发酵葡萄籽粕咀嚼片，食用安全，感官良好。

在一些优选的实施方式中，按质量份数计，包括如下组分：所述的发酵葡萄籽粕冻干粉30份、赤藓糖醇20份、微晶纤维素20份、麦芽糊精17.5份、葡萄果粉10份、柠檬酸1.5份和硬质酸镁1份。

通过对发酵葡萄籽粕咀嚼片各个组分的进一步优化和调整，使得咀嚼片的效果更好。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明实施例2-4的技术路线如图1所示。

实施例1植物乳杆菌GK1菌株的鉴定

(1)生理生化试验

将筛菌株GK1进行革兰氏染色及过氧化氢酶试验，并对其生理生化指标进行测定，试验结果对照《伯杰氏系统细菌学手册第八版》进行菌种的初步判定。试验得出该筛选菌株GK1革兰氏染色呈阳性。其理化试验结果如表1所示。

表1植物乳杆菌SD21细胞形态和理化试验结果

注：+表示阳性，即可利用此底物发酵；-表示阴性。

(2)16S r RNA鉴定

根据细菌基因DNA提取试剂盒说明操作提取未知菌株基因DNA，以基因DNA为模板进行16S r RNA基因的PCR扩增。然后将PCR扩增产物送去DNA测序。测序序列结果在NCBI数据库中用Blast软件搜索近似序列，将所测得的序列和从基因库中获得的相关种属的16S rRNA基因序列进行比对。

16S r RNA基因序列测定结果如下：

AGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAG ATGATTAGGGTGAA(SEQ ID NO.1)。

(3)pheS基因序列鉴定

pheS基因序列可以用来鉴定乳杆菌，用pheS基因序列做引物进行扩增来鉴定该株菌。

根据细菌基因DNA提取试剂盒说明操作提取未知菌株基因DNA，以基因DNA为模板进行pheS基因的PCR扩增。然后将PCR扩增产物送去DNA测序。测序序列结果在NCBI数据库中用Blast软件搜索近似序列，将所测得的序列和从基因库中获得的相关种属的pheS基因序列进行比对。

pheS基因序列测定结果如下：

CGTGCTACTACGCACGCAGACCGTCTGCTGATCAGCCGCGGTCACTTGAAAATCACGATTTTTCTAAAGGACCGCTGAAGGTCTTGTCACCTGGCCGCGTTTATCGGCGTGATACGGATGATGCAACCCATTCCCATCAATTTCATCAAATTGAAGGGTTAATTGTGGACAAGCATATTACGATGGCTGATTTGAAGGGCACCTTAATTCTGGTTGCCAAGACTTTGTTTGGCGATCAATTCGATGTTCGGCTACGGCCAAGCTTCTTTCCATTCACGGAACCATCCGTAGAAGCTGATGTAACTTGCTTTAATTGCAATGGCAAGGGCTGTGCAATCTGTAAGCAAACGGGTTGGATCGAAGTACTGGGTGCCGGCATGGTTCACCCCCAACGTGTTA(SEQ ID NO.2)。

根据该菌株的细胞形态、生理生化特征、16S r RNA基因序列、pheS基因序列等数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册第八版》，鉴定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GK1。

实施例2植物乳杆菌GK1发酵葡萄籽粕工艺优化

1试验方法

1.1菌种耐酸耐胆盐评价

(1)调pH值：用0.1mmol/L的HCl将MRS液体培养基的pH值调整为2.5。

(2)调胆盐浓度：将配制好的MRS液体培养基，按0.05％、0.1％的浓度加入对应含量的胆盐。

将活化好的菌液在4℃，6000g离心10min，菌体分别用pH值为2.5，胆盐含量为0.05％、0.1％的MRS液体培养基，洗涤1次后，重悬于对应pH值、胆盐浓度的等体积MRS液体培养基中，37℃厌氧培养。取培养时间为4h，每隔一小时检测活菌数进行梯度稀释和平板计数。

1.2葡萄籽粕发酵液工艺流程及工艺要点

葡萄籽粕打粉-过100目筛-调配-拍打均质-杀菌-冷却-接种-发酵-成品-冷藏。

工艺要点：

(1)调配：将过筛后的葡萄籽粕、水、蔗糖和β-环糊精混合均质后，食用碱调pH为6.0。

(2)灭菌：65℃巴氏杀菌40min。

(3)发酵：将保藏在实验室-80℃冰箱中的菌株植物乳杆菌GK1以4％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养12h，将活化后的菌种以2％的接种量接种于MRS培养基中，37℃培养12h，得到扩大培养液。

接种1％已活化的植物乳杆菌GK1进行发酵。

(4)发酵液基本配方

葡萄籽粕10％、水87.8％、蔗糖2％和β-环糊精0.2％。

1.3葡萄籽粕发酵液工艺优化

设计葡萄籽粕添加量为9％、11％、13％、15％、17％，初始接菌量终浓度为10⁶CFU/mL，蔗糖添加量为2％，发酵时间为24h，发酵温度为37℃，评价发酵液指标为活菌数与DPPH清除率，确定葡萄籽粕的最佳添加量。

设计初始接菌量终浓度为10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶CFU/mL，葡萄籽粕添加量为13％，蔗糖添加量为2％，发酵时间为24h，发酵温度为37℃，评价发酵液指标为活菌数与DPPH清除率，确定菌液的最佳添加量。

设计蔗糖每100mL添加量为1％、2％、3％、4％、5％，葡萄籽粕添加量为13％，初始接菌量终浓度为10⁴CFU/mL，发酵时间为24h，发酵温度为37℃，评价发酵液指标为活菌数与DPPH清除率，确定蔗糖的最佳添加量。

设计发酵时间为14h、16h、18h、20h、22h，葡萄籽粕添加量为13％，初始接菌量终浓度为10⁴CFU/mL，蔗糖添加量为3％，发酵温度为37℃，评价发酵液指标为活菌数与DPPH清除率，确定最佳发酵时间。

设计发酵温度为33℃、35℃、37℃、39℃、41℃，葡萄籽粕添加量为13％，初始接菌量终浓度为10⁴CFU/mL，蔗糖添加量为3％，发酵时间为18h，评价发酵液指标为活菌数与DPPH清除率，确定最佳发酵温度。

Plackett-Burman试验设计

在单因素试验的基础上，利用Design-expert软件进行n＝12的Plackett-Burman试验设计，其各因素与水平如表2所示。

表2Plackett-Burman试验因素水平

Box-Behnken中心组合试验

利用Plackett-Burman试验结果，设计3因素3水平优化试验，采用Box-Behnken中心组合试验进行实验条件优化。试验设计的各因素与水平如表3所示。

表3Box-Behnken试验因素水平

2实验结果

2.1植物乳杆菌GK1体外耐受性评价

实验结果如表4所示，说明植物乳杆菌GK1对酸较为敏感对胆盐耐受，4h存活率分别达到73.78％和98.20％，其在pH为2.0环境下培养2h存活率分别为81.31％和85.39，并且植物乳杆菌GK1 pH2.5处理4h后活菌数仍高于10⁶CFU/mL，因此其对酸及胆盐具有良好的耐受力。

表4植物乳杆菌GK1体外耐受活菌计数

2.2葡萄籽粕添加量对葡萄籽粕发酵液活菌数及抗氧化性的影响

试验结果如图2所示，DPPH清除率随着葡萄籽粕添加量增加而增大，葡萄籽粕添加量对抗氧化有影响。当葡萄籽粕添加量为13％时，活菌数达到最高，为8.4×10⁸CFU/mL，DPPH清除率为58％。当葡萄籽粕添加量为17％时，其DPPH清除率达到68％，但由于其添加量过多导致发酵液在体系中溶解性降低，有结块现象出现，因此综合多种因素考虑，初步确定葡萄籽粕添加量为11％～15％之间。

2.3初始接菌量对葡萄籽粕发酵液活菌数及抗氧化性的影响

试验结果如图3所示，当初始接菌量为4lgCFU/mL时，活菌数最高为8.0×10⁸CFU/mL，DPPH清除率为53％。当初始接菌量为6lgCFU/mL时，DPPH清除率最高为61％，但活菌数较低，可能是由于菌接种量过高时，底物中的营养物质消耗速度过快，使后期的植物乳杆菌生长繁殖受到抑制，影响了葡萄籽粕的发酵效果。因此选择初始接菌量为3～5lgCFU/mL之间。

2.4蔗糖添加量对葡萄籽粕发酵液活菌数及抗氧化性的影响

试验结果如图4所示，当蔗糖添加量为3％时，活菌数达到最高为8.6×10⁸CFU/mL，且DPPH自由基清除率也达到最高为53％。因此选择蔗糖添加量为2％～4％。

2.5发酵时间对葡萄籽粕发酵液活菌数及抗氧化性的影响

试验结果如图5所示，随着发酵时间的增加，DPPH自由基清除率也随之增大。当发酵时间为18h时，活菌数最高为8.3×10⁸CFU/mL，此时DPPH清除率为56％。当发酵时间为20h时，DPPH清除率最高为60％，但活菌数较低，可能因为发酵底物中提供乳酸菌生长需要的碳源及氮源消耗过多，发酵环境不利于微生物生存。因此选择发酵时间为16～20h。

2.6发酵温度对葡萄籽粕发酵液活菌数及抗氧化性的影响

试验结果如图6所示，随着温度增加，活菌数呈先增加后减少趋势，DPPH自由基清除率呈降低趋势。当发酵温度为37℃时，活菌数最高为8.6×10⁸CFU/mL，此时DPPH清除率为71％。当发酵温度为33℃时，DPPH清除率最高为76％，但活菌数较低，这是由于温度过低时，乳酸菌生长缓慢，代谢产物也较少。当发酵温度为41℃时，活菌数和DPPH清除率数值最低，这是由于温度过高时，乳酸菌生长繁殖受到抑制，发酵能力变弱，DPPH清除率也会受到影响随之下降。因此选择发酵温度范围为35～39℃。

2.7Plackett-Burman试验结果

根据以上的单因素试验，得出Plackett-Burman试验的因素与水平，结果如表5所示。由表6方差分析可知，活菌数模型的P值0.0101＜0.05，模型选择正确，葡萄籽粕添加量与初始接菌量的P值小于0.05，对活菌数影响显著，蔗糖加量、发酵温度、发酵时间对活菌数影响不显著；DPPH自由基清除率模型的P值0.0341＜0.05，模型选择正确，葡萄籽粕添加量与温度的P值小于0.05，对DPPH清除率影响显著，初始接菌量、蔗糖添加量、发酵时间对DPPH清除率影响不显著。综合考虑选择葡萄籽粕添加量、初始接菌量及发酵温度进行下一步的优化。

表5Plackett-Burman试验结果

表6方差分析结果

注：**表示极显著(P＜0.01)，*表示显著(0.01＜P＜0.05)(下同)。

2.8Box-Behnken中心组合试验结果

试验设计结果及分析

以葡萄籽粕添加量、初始接菌量及发酵温度为自变量，测定乳酸菌活菌数和DPPH清除率。试验结果如表7所示。利用Design-expert对试验结果进行分析，得到2个回归方程：Y活菌数＝+8.060E+008-2.625E+007*A-3.250E+007*B-3.625E+007*C+5.000E+006*A*B+2.750E+007+A*C+3.000E+007*B*C-9.925E+007*A；YDPPH清除率＝+77.90+0.85*A-0.46*B-6.17*C+0.47*A*B-2.68A*C-2.45*B*C-0.21*A2-2.33*B2-0.23*C22-1.368E+008*B2-1.142E+008*C2；

方差分析如表8和表9所示。乳酸菌活菌数和DPPH自由基清除率模型P值分别为0.0008和0.0022，小于0.01，表明差异极显著，说明模型具有极显著性；模型失拟项P值分别为0.6394和0.7773，结果均大于0.05，表明差异不显著，说明模型对试验拟合程度良好；相关系数R2分别为0.9525和0.9351，可以对试验结果进行预测。

表7Box-Behnken design试验结果

表8活菌数回归模型的方差分析

表9DPPH自由基清除率回归模型的方差分析

响应面3D图像与等高线分析

响应面3D曲面图与等高线图反映两两因素之间对响应值的影响作用，其中3D曲面图越陡峭，等高线坡度越大颜色变化越快说明两因素之间交互作用越明显，对试验结果影响越显著。结果表明：葡萄籽粕添加量和初始接菌量之间的交互作用显著，但对于DPPH自由基清除率指标交互作用不显著；葡萄籽粕添加量和温度对于活菌数指标交互作用明显，对于DPPH自由基清除率指标交互作用较弱；初始接菌量和温度对活菌数指标及DPPH自由基清除率指标交互作用较为明显，对试验结果产生影响。

模型预测与验证实验

利用Design-expert软件，分析3种显著因素(葡萄籽粕添加量、初始接菌量、发酵温度)的响应面和等高线。预测得到发酵培养基最佳参数为葡萄籽粕添加量12.97％，初始接菌量3.9lgCFU/mL，发酵温度35.82℃，理论最高乳酸菌活菌数可达到7.92×10⁸CFU/mL，DPPH清除率为81.31％。考虑实际限制，将葡萄籽粕添加量、初始接菌量及发酵温度调整为13％、4lgCFU/mL、36℃。为了验证响应面分析的可靠性，利用上述最佳参数进行3次平行验证，实际测定乳酸菌活菌数为7.6×10⁸CFU/mL，DPPH清除率为80.4％，接近模型预测。

发酵最优条件的确定

通过单因素试验的基础上，利用Plackett-Burman设计筛选得到葡萄籽粕添加量、初始接菌量和发酵温度这3个显著因素，利用Box-Behnken中心组合设计确定最优发酵条件，确定了优化后的葡萄籽粕发酵液生产工艺及配方：葡萄籽粕添加量为13％、初始接菌量为4lgCFU/mL、蔗糖添加量为3％、发酵温度为36℃、发酵时间为18h、β-环糊精为0.2％、水为82.8％。在此条件下乳酸菌活菌数为7.6×10⁸CFU/mL，DPPH清除率为80.4％。

2.9葡萄籽粕发酵液品质检测结果

葡萄籽粕发酵前后抗氧化能力、总酚、总黄酮结果如表10所示，在总抗氧化能力(T-AOC)测定结果显示葡萄籽粕发酵液抗氧化能力高于葡萄籽粕，葡萄籽粕发酵液的ABTS+自由基清除能力和DPPH自由基清除能力IC50值均低于葡萄籽粕，说明葡萄籽粕发酵液抗氧化能力高于葡萄籽粕。并且发酵后的葡萄籽粕总酚及总黄酮含量均高于未发酵的葡萄籽粕，说明通过植物乳杆菌GK1的发酵使葡萄籽粕多酚及黄酮物质含量增加。

表10葡萄籽粕发酵前后抗氧化能力及总酚、总黄酮变化结果

葡萄籽粕发酵前后单体酚含量如表11所示，绿原酸、阿魏酸、龙胆酸、芥子酸含量较少未能检测具体含量，在其余八种单体酚中，没食子酸、原儿茶酸、香草酸、咖啡酸、白藜芦醇含量均有所增加，其中咖啡酸发酵前后变化最为明显，较发酵前增加了55倍，没食子酸在发酵液中含量最多，达到120mg/100g。因此通过植物乳杆菌GK1的发酵使葡萄籽粕单体酚含量增加。剩余三种单体酚含量减少可能是由于发酵过程中，在酶的催化反应下，发生一些氧化、聚合、缩合反应，使部分单体酚转化为其他物质导致其含量减少。

表11葡萄籽粕发酵前后单体酚含量

注：每100mL葡萄籽粕发酵液含有13g葡萄籽粕。

实施例3发酵葡萄籽粕冻干粉工艺优化

1试验方法

1.1发酵葡萄籽粕冻干粉工艺流程及工艺要点

冻干保护剂灭菌-混合-预冻-冻干-成品-冷藏。

工艺要点：

(1)灭菌：麦芽糊精高压蒸汽灭菌121℃，15min；脱脂乳粉、罗望子多糖、D-异抗坏血酸钠高压蒸汽灭菌115℃，7min；聚葡萄糖、海藻糖、山梨醇先溶于水，后使用0.22um滤膜过滤灭菌。

(2)混合：冻干保护剂与制得的葡萄籽粕发酵液1:1进行混合。

(3)预冻：置于-80℃冰箱预冻6h至完全冻结。

(4)冻干：将完全冻结的混合发酵液于冻干温度-51℃，真空度0.200mbr条件下真空冷冻干燥48h至完全干燥状态，得到葡萄籽粕冻干粉。

1.2发酵葡萄籽粕冻干粉工艺优化

以脱脂乳粉为冻干保护剂基质，设计脱脂乳粉添加量为0％、5％、10％、15％、20％，与发酵液混合进行冻干后测定冻干存活率。

以脱脂乳粉添加量5％为冻干保护剂基质，山梨醇为冻干保护剂因子进行混合为冻干保护剂。设计山梨醇添加量为1％、2％、3％、4％、5％，与发酵液混合进行冻干后测定冻干存活率。

以脱脂乳粉添加量5％为冻干保护剂基质，聚葡萄糖为冻干保护剂因子进行混合为冻干保护剂。设计聚葡萄糖添加量为1％、2％、3％、4％、5％，与发酵液混合进行冻干后测定冻干存活率。

以脱脂乳粉添加量5％为冻干保护剂基质，D-E抗坏血酸钠为冻干保护剂因子进行混合为冻干保护剂。设计D-E抗坏血酸钠添加量为1％、1.5％、2％、2.5％、3％，与发酵液混合进行冻干后测定冻干存活率。

以脱脂乳粉添加量5％为冻干保护剂基质，罗望子多糖为冻干保护剂因子进行混合为冻干保护剂。设计罗望子多糖添加量为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％，与发酵液混合进行冻干后测定冻干存活率。

以脱脂乳粉添加量5％为冻干保护剂基质，海藻糖为冻干保护剂因子进行混合为冻干保护剂。设计海藻糖添加量为1％、2％、3％、4％、5％，与发酵液混合进行冻干后测定冻干存活率。

以脱脂乳粉添加量5％为冻干保护剂基质，麦芽糊精为冻干保护剂因子进行混合为冻干保护剂。设计麦芽糊精添加量为5％、10％、15％、20％、25％，与发酵液混合进行冻干后测定冻干存活率。

为了考察山梨醇、聚葡萄糖、海藻糖添加量3个因素对冻干保护率影响，设计了正交试验(L9(33))进行试验，测定冻干保护率及其水分活度，以综合评分为试验指标。正交试验因素表见表12。

表12正交试验因素水平表

2实验结果

2.1脱脂乳粉添加量对冻干存活率的影响

试验结果如图7所示，当脱脂乳粉添加量为5％时，冻干保护率达到74.1％，与未添加冻干保护剂即添加量为0％时相比保护率提升了12％。随着脱脂乳粉添加量增多，冻干保护率下降，因此选择脱脂乳粉添加量5％为保护剂基质最佳添加量。

2.2山梨醇添加量对冻干存活率的影响

试验结果如图8所示，当山梨醇添加量为1％时，冻干保护率达到78.9％，与只添加脱脂乳粉即添加量为0％时相比保护率有所提高。综合考虑，选择山梨醇添加量范围0.5％～1.5％。

2.3聚葡萄糖添加量对冻干存活率的影响

试验结果如图9所示，当聚葡萄糖添加量为3％时，冻干保护率最高达到73.3％，略低于只添加脱脂乳粉即添加量为0％时的保护率74.1％。综合考虑，选择聚葡萄糖添加量范围2％～4％。

2.4D-E抗坏血酸钠添加量对冻干存活率的影响

试验结果如图10所示，当D-E抗坏血酸钠添加量为1.5％时，冻干保护率最高为66.6％，低于只添加脱脂乳粉即添加量为0％时的保护率，可能是由于脱脂乳粉与D-E抗坏血酸钠共同添加时，对提高菌株的冻干存活率有负向作用，影响保护剂保护效果。因此综合考虑，不选择D-E抗坏血酸钠作为保护剂因子。

2.5罗望子多糖添加量对冻干存活率的影响

试验结果如图11所示，当罗望子多糖添加量为0.3％时，冻干保护率最高为61.2％，低于只添加脱脂乳粉即添加量为0％时的保护率，可能是由于脱脂乳粉与罗望子多糖共同添加时，对提高菌株的冻干存活率有负向作用，影响保护剂保护效果。因此综合考虑，不选择罗望子多糖作为保护剂因子。

2.6海藻糖添加量对冻干存活率的影响

试验结果如图12所示，当海藻糖添加量为2％时，冻干保护率最高达到81.6％，与只添加脱脂乳粉即添加量为0％时相比保护率提升了7％。随着海藻糖添加量增多，冻干保护率随之下降。综合考虑，选择山梨醇添加量范围1％～3％。

2.7麦芽糊精添加量对冻干存活率的影响

试验结果如图13所示，当麦芽糊精添加量为25％时，冻干保护率最高为54.3％，低于只添加脱脂乳粉即添加量为0％时的保护率，可能是由于脱脂乳粉与麦芽糊精共同添加时，对提高菌株的冻干存活率有负向作用，影响保护剂保护效果。因此不选择麦芽糊精作为保护剂因子。

2.8正交试验

根据单因素试验，得出正交试验的因素与水平，试验以植物乳杆菌的存活率与水分活度两项指标进行加权评分，综合考虑保护剂对菌株的冻干保护作用与对菌粉水分活度的影响，以达到最佳保护效果。结果如表13所示。通过直观极差分析法可以看出，影响因素依次为C(海藻糖)＞B(聚葡萄糖)＞A(山梨醇)，得出最佳配方组合为：A3B1C3，预测存活率为83.4％。因此冻干保护剂最优配方为脱脂乳粉5％，山梨醇1.5％，聚葡萄糖2％，海藻糖3％。为了验证正交试验结果的可靠性，利用上述最佳参数进行3次平行验证，实际测定冻干存活率为84.5％，水分活度为0.028±0.002，接近预测结果。

表13正交试验因素结果

*综合评分＝0.5*(水分活度min/水分活度)*100+0.5*(存活率/存活率Max)*100。

2.9发酵葡萄籽粕冻干粉品质检测结果

葡萄籽粕发酵前后抗氧化能力、总酚、总黄酮结果如表14所示，在总抗氧化能力(T-AOC)测定结果显示葡萄籽粕发酵液抗氧化能力高于葡萄籽粕冻干粉，葡萄籽粕发酵液的ABTS+自由基清除能力和DPPH自由基清除能力IC50值均低于葡萄籽粕冻干粉，说明葡萄籽粕发酵液抗氧化能力高于葡萄籽粕冻干粉。由于冷冻干燥技术的影响，葡萄籽粕冻干粉的抗氧化能力被减弱，总酚和总黄酮含量也减少到原来的42％和65％。

表14葡萄籽粕冻干前后抗氧化能力及总酚、总黄酮变化结果

葡萄籽粕发酵前后单体酚含量如表15所示，绿原酸、阿魏酸、龙胆酸、丁香酸、p-香豆酸、芥子酸含量较少未能检测具体含量，在其余六种单体酚中，原花青素和白藜芦醇含量较冻干前有所增加，原花青素发酵增加了11倍，白藜芦醇增加了9倍。其余四种单体酚受冷冻干燥技术影响较大，含量比之前减少。

表15葡萄籽粕冻干前后单体酚含量

注：每100g葡萄籽粕冻干粉含有50g葡萄籽粕发酵液。

将发酵葡萄籽粕冻干粉分别储存于常温(26℃)和冷藏(4℃)的环境中，定期测定其活菌数来评价葡萄籽粕冻干粉的储存稳定性，实验结果可以从图14得知，在室温环境中，发酵葡萄籽粕冻干粉的活菌数量下降较迅速，在9周的储藏期内，活菌数从初始的1.58×10⁹CFU/mL下降至1.62×10⁸CFU/mL，下降了75.86％，储存稳定性较低；在冷藏环境中，发酵葡萄籽粕冻干粉的活菌数量下降较为平缓，活菌数从初始的1.58×10⁹CFU/mL下降至6.10×10⁸CFU/mL，下降了51.61％。因此低温情况下有助于植物乳杆菌的存活。

实施例4发酵葡萄籽粕咀嚼片配方优化

1试验方法

以前叙优化的葡萄籽粕发酵工艺和冻干工艺制备的发酵葡萄籽粕冻干粉为原料进行产品设计。采用造粒压片方式进行压片处理，压片机转台速度为1400r/min，充填压力为25kw，充填深度为10mm，产品规格为0.6±0.006g/片。设计葡萄果粉添加量分别为5％、10％、15％，发酵葡萄籽粕冻干粉添加量为30％、40％、50％，柠檬酸添加量分别为1％、1.5％、2％，固定赤藓糖醇、微晶纤维素、硬质酸镁添加量为20％、20％、1％，麦芽糊精作为补充剂使其配方添加总量为100％。具体各成分添加量设计见表16，以硬度和感官评价(表17)为评定指标，得到合适的配比。经包装后得到一款活菌型且消费者满意度高的发酵葡萄籽粕咀嚼片产品。

表16发酵葡萄籽粕咀嚼片三种因素添加量设计表

表17发酵葡萄籽粕咀嚼片感官评价

硬度的测定

将压片处理后的发酵葡萄籽粕咀嚼片置于质构仪操作台中心，用TA10探头以触发点负载5.00g，测试距离5.00mm，测试前速度2.00mm/s进行压入测试，每个样品取5粒进行测定并按平均值分析结果。

模糊影射评价矩阵评定综合等级

选择10位(5男5女)有感官评价经验的食品专业人员对不同设计的发酵葡萄籽粕咀嚼片进行模糊综合评价，具体感官评价指标及标准如表17。其中，评价指标包括发酵葡萄籽粕咀嚼片的外观色泽、香味、咀嚼性和口感滋味，这4项标记为因素集(F)，即F＝(外观色泽F1、口感滋味F2、咀嚼性F3、香味F4)；权重(W)通过强制决定法确定4项因素集的加权数集为W＝(0.1、0.4、0.4、0.1)。此外优、良、中、差为评语集(C)，记为C＝(优、良、中、差)，同时分别赋予其分值(P)，P＝(90,80,70,50)。

从F到C的模糊映射评价矩阵(M)按式(4.1)建立，综合评定等级排名(R)按式(4.2)计算，即W的四个值分别与M的每一列对应元素的乘积之和。综合评定感官得分(S)按式(4.3)计算。

R＝W×M＝[0.10,0.40,040,0.10]×M (4.2)

式中M表示样品的模糊映射评价矩阵，m表示从F到C的模糊映射评价矩阵元素，即样品的4个指标因素集在4个评语集等级中的感官评价票数×感官评价人数。

发酵葡萄籽粕咀嚼片理化及微生物指标分析

亚硝酸盐参照GB/T 5009.33-2016中盐酸萘乙二胺法进行含量的测定。

微生物评价中，酵母菌和霉菌按照GB/T 4789.15-2016采用孟加拉红培养基，倾注平板计数法进行试验，并通过菌落生长形态对光滑菌落的酵母菌和毛球状的霉菌进行菌落计数；大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)按照GB/T 4789.41-2016采用VRBA培养基，倾注平板计数法进行定性和定量判断。

2实验结果与分析

2.1发酵葡萄籽粕咀嚼片硬度分析

根据图15可大概看出除样品3、6、9外，其余样品硬度差距并不明显，可能是由于发酵葡萄籽粕冻干粉添加量的变化对产品最终硬度产生了影响。发酵葡萄籽粕冻干粉添加量达到50％时其硬度会明显下降。也可能是由于发酵葡萄籽粕冻干粉添加量的增多，麦芽糊精添加量随之减少，当发酵葡萄籽粕冻干粉添加量为50％时，麦芽糊精添加量接近于0，导致其质构不是非常紧密。

根据表18中可大概看出9种设计发酵葡萄籽粕咀嚼片的外观色泽与香味无明显差异，但口感滋味和咀嚼性差异较大，说明柠檬酸添加量与发酵葡萄籽粕冻干粉添加量对于产品品质有较大影响。咀嚼性结果与上图基本一致。

表18发酵葡萄籽粕咀嚼片感官评价票数分布表

根据表18和公式(4.1)建立9种发酵葡萄籽粕咀嚼片感官评价模糊矩阵依次如下：

根据式(4.2)及样品矩阵M可得9种不同设计的发酵葡萄籽粕咀嚼片样品综合评定等级如下：

R1＝[0.12 0.53 0.30 0.05]；R2＝[0.04 0.56 0.31 0.09]；R3＝[0.07 0.390.31 0.23]；R4＝[0.46 0.45 0.09 0]；R5＝[0.29 0.6 0.11 0]；R6＝[0.09 0.24 0.250.42]；R7＝[0.36 0.42 0.08 0.14]；R8＝[0.11 0.48 0.33 0.08]；R9＝[0 0.4 0.430.17]；

根据R的四个结果元素，按照百分制计算后(各个元素×100％)，将以上9种发酵葡萄籽粕咀嚼片样品在四个等级(优、良、中、差)中的综合评定等级得分情况展示如图16。发酵发酵葡萄籽粕咀嚼片样品1显示有53％的感官评定员认为样品1的品质可评为良等级，有30％的感官评价者给出中立态度，仅有12％评价者将样品评为优等级，同时有5％受访者不认可该样品，给出差等级。同理分析，若9种发酵葡萄籽粕咀嚼片样品取优等级占比作为排名依据时，排名先后顺序为样品4>样品7>样品5>样品1>样品8>样品6>样品3>样品2>样品9；综合优、良等级评分之和作为综合评定等级排名依据时，总分排名依次为样品4>样品5>样品7>样品1>样品2>样品8>样品3>样品9>样品6，除样品2、6排名改变较大外，其余样品与优等级一致或浮动较小。样品2、6出现差异较大的原因可能是由于给出评分的感官评价人员喜好偏酸或偏甜的饮食习惯，样品4、5、7给出优良等级占比分别为91％、89％、78％，被评价者普遍认可。

为了进一步确定最优设计发酵葡萄籽粕咀嚼片的产品配方，通过计算综合评定感官得分进行分析，根据以上R结果并按照式(4.3)进行计算分析，结果如雷达图17所示。发酵葡萄籽粕咀嚼片在样品4和5之间得分最高，分别为83.7与81.8，显示出当葡萄籽粕冻干粉添加量为30％时，柠檬酸添加量为1.5％，当葡萄籽粕冻干粉添加量为40％时，柠檬酸添加量为2％，比例过高或过低都会影响其感官评价品质。样品1、2、3、7、8、9得分处于79-70之间，样品6评分最低为65.8，且评分最低的三个样品分别为样品3、9、6，其葡萄籽粕添加量均为50％，在其他因素相同的情况下，随着葡萄籽粕冻干粉添加量的增加其评分逐渐降低，可能是葡萄籽粕口感较为粗糙而表现出相对较低的感官评价品质。所以最佳产品设计应为葡萄籽粕冻干粉添加量30％，赤藓糖醇添加量为20％、微晶纤维素添加量为20％、麦芽糊精添加量为17.5％、葡萄果粉添加量为10％、柠檬酸添加量为1.5％、硬质酸镁添加量为1％。

2.3发酵葡萄籽粕咀嚼片理化及微生物指标分析

发酵葡萄籽粕咀嚼片经理化及微生物指标测定如表19所示，其不含有亚硝酸盐、酵母菌、霉菌及大肠杆菌，水分活度为0.119±0.002，活菌数为2.02×10⁷CFU/g，高于标准中的10⁶CFU/g，符合活菌型产品的要求。综上，各指标的合格说明发酵葡萄籽粕咀嚼片具有安全的可食用性。

表19发酵葡萄籽粕咀嚼片理化及微生物指标结果

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京农学院

<120> 植物乳杆菌GK1、葡萄籽粕的发酵方法、发酵葡萄籽粕冻干粉和发酵葡萄籽

粕咀嚼片

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）

<400> 1

agtcgaacga actctggtat tgattggtgc ttgcatcatg atttacattt gagtgagtgg 60

cgaactggtg agtaacacgt gggaaacctg cccagaagcg ggggataaca cctggaaaca 120

gatgctaata ccgcataaca acttggaccg catggtccga gtttgaaaga tggcttcggc 180

tatcactttt ggatggtccc gcggcgtatt agctagatgg tggggtaacg gctcaccatg 240

gcaatgatac gtagccgacc tgagagggta atcggccaca tgggactgag acacggccca 300

aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca 360

acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttaaa gaagaacata 420

tctgagagta actgttcagg tattgacggt atttaaccag aaagccacgg ctaactacgt 480

gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc 540

gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg gctcaaccga agaagtgcat 600

cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa 660

tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc 720

tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc ataccgtaaa 780

cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg ctgcagctaa cgcattaagc 840

attccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900

caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960

atactatgca aatctaagag attagacgtt cccttcgggg acatggatac aggtggtgca 1020

tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080

tattatcagt tgccagcatt aagttgggca ctctggtgag actgccggtg acaaaccgga 1140

ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200

caatggatgg tacaacgagt tgcgaactcg cgagagtaag ctaatctctt aaagccattc 1260

tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320

atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga 1380

gagtttgtaa cacccaaagt cggtggggta accttttagg aaccagccgc ctaaggtggg 1440

acagatgatt agggtgaa 1458

<210> 2

<211> 399

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）

<400> 2

cgtgctacta cgcacgcaga ccgtctgctg atcagccgcg gtcacttgaa aatcacgatt 60

tttctaaagg accgctgaag gtcttgtcac ctggccgcgt ttatcggcgt gatacggatg 120

atgcaaccca ttcccatcaa tttcatcaaa ttgaagggtt aattgtggac aagcatatta 180

cgatggctga tttgaagggc accttaattc tggttgccaa gactttgttt ggcgatcaat 240

tcgatgttcg gctacggcca agcttctttc cattcacgga accatccgta gaagctgatg 300

taacttgctt taattgcaat ggcaagggct gtgcaatctg taagcaaacg ggttggatcg 360

aagtactggg tgccggcatg gttcaccccc aacgtgtta 399

Claims

1.一种植物乳杆菌GK1，其特征在于，所述植物乳杆菌GK1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24382。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌GK1在制备发酵产品中的应用。

3.一种葡萄籽粕的发酵方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的植物乳杆菌GK1接种至葡萄籽粕发酵培养基中发酵，得到发酵液；

所述葡萄籽粕发酵培养基主要由葡萄籽粕、糖和水组成。

4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，按质量份数计，所述葡萄籽粕发酵培养基包括葡萄籽粕11-15份、糖2-4份、β-环糊精0.1-0.5份和水80-87份；

优选地，所述糖包括葡萄糖或蔗糖中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述植物乳杆菌GK1的接种量为3-5lgCFU/mL，优选为5lgCFU/mL；

优选地，所述发酵的时间为16-20h，优选为18h；

优选地，所述发酵的温度为35-39℃，优选为36℃；

优选地，所述发酵的pH为5-7。

6.一种发酵葡萄籽粕冻干粉，其特征在于，主要由权利要求3-5任一项中所述的发酵液制备得到。

7.根据权利要求6所述的发酵葡萄籽粕冻干粉，其特征在于，所述发酵葡萄籽粕冻干粉还包括冻干保护剂；

按质量份数计，所述冻干保护剂包括脱脂乳粉5-10份、山梨醇0.5-1.5份、聚葡萄糖2-4份和海藻糖1-3份；

8.权利要求7所述发酵葡萄籽粕冻干粉的制备方法，其特征在于，包括：将所述冻干保护剂与所述发酵液混合，冷冻干燥后，制备得到发酵葡萄籽粕冻干粉；

9.一种发酵葡萄籽粕咀嚼片，其特征在于，按质量份数计，包括如下组分：权利要求6或7所述的发酵葡萄籽粕冻干粉30-50份、赤藓糖醇18-22份、微晶纤维素18-22份、麦芽糊精15-20份、葡萄果粉5-15份、柠檬酸1-2份和硬质酸镁0.5-2份。

10.根据权利要求9所述的发酵葡萄籽粕咀嚼片，其特征在于，按质量份数计，包括如下组分：权利要求6或7所述的发酵葡萄籽粕冻干粉30份、赤藓糖醇20份、微晶纤维素20份、麦芽糊精17.5份、葡萄果粉10份、柠檬酸1.5份和硬质酸镁1份。