CN115820443A - 一种高产s-腺苷-l-蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产S‑腺苷‑L‑蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZJ10041菌株为底盘菌株，将其基因组中的SOD1基因敲除，获得高产S‑腺苷‑L‑蛋氨酸的酿酒酵母ZJ10041‑△SOD1菌株。本发明构建的酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1在500mL摇瓶发酵中产量提高在20％以上。优化后的500mL摇瓶发酵培养基培养ZJS10041△SOD1菌株的发酵生产，S‑腺苷‑L‑蛋氨酸的产量提高至1.73±0.02g/L。ZJS10041△SOD1菌株在5L发酵罐72h发酵中产量提高到了7.43g/L。

Description

一种高产S-腺苷-L-蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及S-腺苷蛋氨酸的制备，特别涉及一种高产S-腺苷-L-蛋氨酸的酿酒酵母工程菌、构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备S-腺苷-L-蛋氨酸中的应用，并优化酿酒酵母工程菌发酵培养条件，达到高产S-腺苷-L-蛋氨酸的目的。

(二)背景技术

S-腺苷蛋氨酸(SAM)是一种存在于生物体内的天然活性物质。作为体内最重要的甲基供体，SAM可通过转甲基作用、转硫基作用和转氨丙基作用，参与体内重要的生化反应，SAM分子式为C₁₅H₂₂N₆O₅S，分子量398.44。SAM在临床上应用广泛，与包括基因调控、荷尔蒙活性、神经传导和解毒在内的众多关键的身体机能密切相关，同时也对肝病、抑郁症、阿尔茨海默病等具有治疗作用。主要产品是SAM对甲苯磺酸硫酸双盐和SAM-1-4-丁二磺酸盐。

SAM的合成方法有化学合成法、生物酶合成法和微生物发酵法。其中化学法合成SAM会产生较多的副产物，分离纯化较为困难，因此难以在工业上实现大规模生产。生物酶合成法难以实现工业生产SAM的主要原因是SAM合成酶活力较低，制备困难，且需外源添加SAM合成所必需的ATP，生产成本高昂。微生物发酵法利用微生物发酵生产SAM。微生物发酵法因具有发酵工艺流程简单、SAM产量高，生产成本低等优点而被广泛应用。

随着基因工程、代谢工程技术的发展，越来越多的微生物的遗传背景已被研究。通过对菌株代谢网络的分析，能够人为地改变宿主菌的代谢途径来满足预期的需求。目前SAM的代谢途径日渐清晰，通过改变酿酒酵母等宿主菌的代谢途径可以增加细胞内SAM的产量。目前已有多种方法来增加酿酒酵母细胞中SAM的含量包括过表达有利SAM合成的基因或者敲除利于SAM消耗的相关基因。与此同时，通过在培养液中添加前体物质L-蛋氨酸在酵母细胞体内进行SAM累积合成。目前已有报道实验室利用酵母生产SAM，产量达到5.5g/L以上。

SAM是酿酒酵母细胞内的活性物质，由L-蛋氨酸和ATP在SAM合成酶的催化下合成，合成途径原理见图1。在SAM合成过程中有多种限制性因素，包括L-蛋氨酸，ATP等。

酿酒酵母作为微生物发酵生产SAM的常用菌株仍存在S-腺苷蛋氨酸产量低的问题，因此还需要通过对酿酒酵母工程菌改造以及酿酒酵母工程菌发酵生产SAM的培养基进行优化来提高工业上SAM的产量。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种高产S-腺苷-L-蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备S-腺苷-L-蛋氨酸中的应用，并在此基础上优化发酵培养基，以便于提高酿酒酵母生产SAM的产量，使之高效生产SAM，促进微生物发酵生产SAM在工业上的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种高产S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZJ10041菌株为底盘菌株，将其基因组中的SOD1基因敲除，获得高产S-腺苷-L-蛋氨酸的酿酒酵母ZJ10041-△SOD1菌株。

优选的，所述SOD1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZJS10041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020495，保藏日期为2021年7月21日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，已在申请号为202111307689.9的专利中公开。

本发明所述酿酒酵母工程菌按如下方法构建：以酿酒酵母菌ZJS10041菌株为底盘菌株，应用CRISPR-Cas9技术将其基因组中的SOD1基因敲除，获得ZJS10041-△SOD1菌株，具体包括如下的步骤：(1)通过PCR的方法更换gRNA中crRNA序列，构建可应用于SOD1基因敲除的gRNA-HYG-SOD1质粒；

(2)通过传统PCR和融合PCR构建来自酿酒酵母菌ZJ10041基因组的donorDNA重组片段；该重组片段的两端与Cas9在靶基因切口处的两端有同源序列，当Cas9在靶点处产生切口，有重组片段的存在，断裂的双链DNA会发生同源重组型修复，经过同源重组型修复后，目标基因被外源基因所替换；

(3)制备底盘菌株感受态后导入Cas9-G418质粒后重新制成感受态，并将构建好的gRNA-HYG-SOD1质粒与donorDNA重组片段一同导入酿酒酵母菌ZJ10041(+Cas9-G418)感受态中，后在含500μg/mL的潮霉素B(HYG)和700μg/mL的G418双抗板上培养，即可得到阳性单菌落，并设计引物利用菌落PCR验证，获得ZJS10041△SOD1菌株。

本发明还涉及所述酿酒酵母工程菌在微生物发酵制备S-腺苷-L-蛋氨酸中的应用，所述应用为：将所述酿酒酵母工程菌菌株接种至原始发酵培养基中，30℃、160-200rpm条件下培养20-30h后(优选30℃、180rpm、24h)，加入L-蛋氨酸，继续培养至48-72h(优选48h)，发酵结束后，发酵液离心收集酿酒酵母菌，提取获得S-腺苷-L-蛋氨酸；所述原始发酵培养基组成如下：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MnSO₄·7H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂ 0.1g/L，CuSO₄ 0.001 6g/L，柠檬酸三钠二水合物0.1g/L，溶剂为水，pH7.0。

优选的，所述L-蛋氨酸以36g/L的L-蛋氨酸水溶液形式加入，L-蛋氨酸加入量以原始发酵培养基体积计为1.3-2.0g/L，优选1.44g/L。

优选的，所述酿酒酵母工程菌发酵前，先接种至YPD液体培养基中，于30℃，150-180rpm培养12h，然后以体积浓度4％接种至原始发酵培养基中培养。

优选的，为了进一步提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量，对原始发酵培养基进行优化作为新的摇瓶发酵培养基，所述摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MnSO₄·7H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂ 0.1g/L，CuSO₄ 0.001 6g/L，柠檬酸三钠二水合物0-0.5g/L，对氨基苯甲酸0-0.6g/L，腺苷0-1.0g/L，硫酸亚铁0-0.40g/L，溶剂为水，pH5.0-7.0。

更优选的，所述摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MnSO₄·7H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂ 0.1g/L，CuSO₄ 0.001 6g/L，柠檬酸三钠二水合物0.4g/L，对氨基苯甲酸0.1g/L，腺苷0.6g/L，硫酸亚铁0.1g/L，溶剂为水，初始pH 6.5。

优选的，所述发酵采用发酵罐按如下方法进行：

将所述酿酒酵母工程菌接种到装有发酵培养基的发酵罐(优选装液量为3L发酵培养基/5L发酵罐)中，发酵过程中控制罐内温度30℃、pH6.5、搅拌转速650rpm、罐压0.05MPa，通气量8L/min，发酵过程中以6-12ml/(h·L)的速度流加500g/L葡萄糖水溶液使罐内残留糖控制在5g/L；当发酵56h后发酵液中菌体湿重达到266g/L时，以终浓度3g/L的量补加1次L-蛋氨酸，当菌体湿重达到280g/L时以终浓度1.5g/L的量补加1次L-蛋氨酸，之后每隔4小时以1.5g/L的量补加L-蛋氨酸直至发酵结束，提取获得S-腺苷-L-蛋氨酸；所述发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MnSO₄·7H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂ 0.1g/L，CuSO₄ 0.0016g/L，柠檬酸钠0.4g/L，对氨基苯甲酸0.1g/L，腺苷0.6g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，钼酸铵0.0048g/L，NaCl 0.5g/L，生物素0.0003g/L，泛酸钙0.0036g/L，0.0036g/L维生素B1，0.0036g/L维生素B6，溶剂为水，pH6.5。115℃灭菌30min，pH6.5。

所述酿酒酵母工程菌接种至发酵罐前，先进行种子扩大培养，再将种子液以体积浓度10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子扩大培养方法为：将所述酿酒酵母工程菌接种至YPD液体培养基中，30℃、150r/min摇床中培养12h；随后培养液以体积浓度4％的接种量接种至摇瓶发酵培养基中，30℃培养12小时，获得种子液。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明方法构建的酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1菌株相较于酿酒酵母菌ZJS10041更加具有生产优势，相同条件下，使用ZJS10041△SOD1菌株可以发酵获得更高产量的S-腺苷-L-蛋氨酸，在500mL摇瓶发酵中产量提高在20％以上。

根据ZJS10041△SOD1菌株的发酵特性所优化的发酵方法，发酵培养基的组成更加适配ZJS10041△SOD1菌株的发酵，有利于ZJS10041△SOD1菌株的发酵生产，S-腺苷-L-蛋氨酸在500mL摇瓶48h发酵中产量提高至1.73±0.02g/L，相较于申请号为CN202111307689.9的专利公开的酿酒酵母ZJS10041在500ml摇瓶48h产量1.21g/L有很大提升。

在5L发酵罐72h发酵中产量提高到了7.43g/L，相较于申请号为CN202111307689.9的专利公开的酿酒酵母ZJS10041在5L发酵罐72h产量5.73g/L有较大提升。申请号为2015101498076的专利中公开的一种制备S-腺苷蛋氨酸的方法既野生酿酒酵母在含有体积为1L的液体发酵培养基的发酵罐中进行发酵，SAM产量最高为2.2g/L，相比之下本发明产量有极大的提升。

(四)附图说明图

图1为S-腺苷-L-蛋氨酸合成流程图。

图2为实施例1中Cas9-delta质粒图谱。

图3为实施例1构建的gRNA转录质粒gRNA-HYG-SOD1的测序图。

图4为实施例3酿酒酵母菌ZJS10041的SOD1基因敲除前后菌落PCR电泳图，泳道1为DL2000 DNA Maker，泳道2为SOD1基因敲除前酿酒酵母菌ZJS10041上清液菌落PCR产物，泳道3为SOD1基因敲除后酿酒酵母菌ZJS10041上清液菌落PCR产物。

图5为实施例3酿酒酵母菌ZJS10041的SOD1基因敲除后基因组测序图。

图6为SAM标准曲线。

图7为酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1和酿酒酵母菌ZJS10041的关键基因水平对比。

图8为酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1和酿酒酵母菌ZJS10041的ATP总含量变化。

图9为原始发酵培养基初始pH对酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1的SAM产量和菌体量的影响。

图10为原始发酵培养基中柠檬酸钠对酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1的SAM产量和菌体量的影响。

图11为原始发酵培养基中对氨基苯甲酸对酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1的SAM产量和菌体量的影响。

图12为原始发酵培养基中腺苷对酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1的SAM产量和菌体量的影响。

图13为原始发酵培养基中七水硫酸亚铁对酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1的SAM产量和菌体量的影响。

图14为实施例13中SAM标准品HPLC图。

图15为实施例13中发酵液SAM的HPLC图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

利用CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母菌ZJ10041内实现外源基因的插入或将基因编码框完全移除，需要经过：gRNA转录质粒gRNA-HYG-SOD1的构建；donorDNA的构建；酿酒酵母菌SOD1基因敲除以及敲除后基因工程菌株发酵性能的测定和比较。

YPD液体培养基配制如下：蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉20g/L，溶剂为水，pH7。

YPD固体培养基配制如下：蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉20g/L、琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH7。

实施例1：gRNA转录质粒gRNA-HYG-SOD1的构建

gRNA-HYG具体的质粒图谱见图2，针对不同的基因进行编辑时，需要对gRNA-HYG上的gRNA序列中的crRNA序列通过PCR的方法进行更换。本实验主要利用CRISPR/Cas9系统对SOD1基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)进行编辑，SOD1的crRNA序列AATCCTTTCAAGAAGACACA(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，长度为20bp。

SEQ ID NO.1

atggttcaagcagtcgcagtgttaaagggtgatgccggtgtctctggtgttgtcaagttcgaacaggcttccgaatccgagccaaccactgtctcttacgagatcgctggtaacagtcctaacgcagaacgtgggttccacattcatgagtttggagatgccaccaatggttgtgtctctgctggtcctcacttcaatcctttcaagaagacacatggtgctccaactgacgaagtcagacatgtcggtgacatgggtaacgtaaagacggacgaaaatggtgtggccaagggctccttcaaggactctttgatcaagcttatcggtcctacctccgttgtaggcagaagcgtcgttatccacgccggccaagatgacttaggtaagggtgacactgaagaatctttgaagactggtaatgccggtccaagaccagcctgtggtgtcattggtctaaccaactaa

SEQ ID NO.2：

MVQAVAVLKGDAGVSGVVKFEQASESEPTTVSYEIAGNSPNAERGFHIHEFGDATNGCVSAGPHFNPFKKTHGAPTDEVRHVGDMGNVKTDENGVAKGSFKDSLIKLIGPTSVVGRSVVIHAGQDDLGKGDTEESLKTGNAGPRPACGVIGLTN*

通过在crRNA序列上下游设计引物(表1)，并在这对引物的5’端各加上新的20bp的crRNA序列，以原质粒gRNA-HYG为模板，经过PCR扩增后，扩增产物即为线性质粒。

将线性质粒化转入大肠杆菌DH5α环化后提取质粒，获得含有新的crRNA序列的质粒，记为gRNA-HYG-SOD1质粒。

将最终获得的gRNA-HYG-SOD1质粒进行测序，见图3，确定新获得的gRNA-HYG-SOD1质粒中crRNA序列20bp正确，-20℃保存，用于后续扩增。

表1构建质粒所用引物及测序引物

实施例2：donorDNA的构建

要利用CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母菌ZJ10041内实现外源基因的插入或将基因编码框完全移除，都需要构建重组片段，该重组片段的两端与Cas9在靶基因切口处的两端有同源序列，当Cas9在靶点处产生切口，由于有重组片段的存在，断裂的双链DNA会发生同源重组型修复，两端带有同源臂的重组片段会与被剪切的Cas9序列发生同源重组。若重组片段是由目标基因编码框两端的序列经融合PCR合成的，那么经过同源重组型修复后，目标基因会被完全移除；若重组片段是由外源基因和目标基因编码框两端的序列经融合PCR合成的，那么经过同源重组型修复后，目标基因被外源基因所替换。

以酿酒酵母菌ZJ10041基因组为模板，以表2中dDNA-top-SOD1-F和dDNA-top-SOD1-R为引物获得上游同源臂，以dDNA-bottom-SOD1-F和dDNA-bottom-SOD1-R引物获得下游同源臂。

然后以上下游同源臂为模板，以dDNA-top-SOD1-F和dDNA-bottom-SOD1-R为引物，PCR获得donorDNA，获得的donorDNA进行测序(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，序列正确可用于后续转化。-20℃保存。

SEQ ID NO.4

tcgataaggcgatgacagcgcaaatgccgcttactggaagtacagaacccgctcccttaggggcacccaccccagcacgccggggggttaaaccggtgtgtcggaattagtaagcggacatcccttccgctgggctcgccatcgcagatatatatataagaagatggttttgggcaaatgtttagctgtaactatgttgcggaaaaacaggcaagaaagcaatcgcgcaaacaaataaaacataattaatttataatggttcaagcagtcgcagtgttaaagggtgatgccggtgtctctggtgttgtcaagttatctttgaagactggtaatgccggtccaagaccagcctgtggtgtcattggtctaaccaactaatgttaatgataatatacttgaataaaaaccgtatgtaagtaagtagtaagcgcatcaattcattcattttcatttccctcgcttagatttatgtccttgatcacttcaccaagtgtgccggaggctgcggccacaagcccccaaaacggtcttgatggttccagcaccttcgatgtatactctggatggtattgagtgcccacgtagtatggatggcctttcaattcgaatatttcgcaacgctggc。

表2 donorDNA扩增的引物

实施例3：酿酒酵母菌ZJS10041的SOD1基因敲除

1、酿酒酵母菌ZJS10041感受态：

(1)挑取酿酒酵母菌ZJS10041菌落接种于5ml液体YPD培养基中，30℃180rpm振荡过夜培养。

(2)取过夜培养物0.5mL转接于新鲜的30ml液体YPD培养基中，使得OD600＝0.15，继续于30℃200rpm振荡培养约4小时至OD600＝0.5。

(3)4度5000rpm离心1min，收集菌体。

(4)预冷1×LiAc清洗菌体，5000rpm离心1min，弃上清，重复两次。

(5)将菌液分装至2.0ml EP管，再次离心，吸掉上清。

(6)向离心管中加入900μL去离子水，100μL 10×LiAc，轻柔重悬菌体，室温静置5min，以5000rpm离心1min，使用少量上清(小于100μL)重悬菌体，置于冰上，得到酿酒酵母菌ZJS10041感受态细胞。

2、转化Cas9-G418，donorDNA，gRNA-HYG-SOD1入感受态酿酒酵母的方法

(1)准备转化体系，并混匀体系为：体积浓度50％ PEG3350水溶液480μL，10×LiAc溶液72μL，ssDNA(10mg/ml)40μL，DNA片段和水共78μL。

(2)向转化体系中加入50μL酿酒酵母菌ZJS10041感受态细胞，吹吸均匀，12000rpm最高速涡旋10s；30℃培养箱中孵育30min；

(3)加入72μL的DMSO，涡旋混匀10s后42℃热激15min；

(4)3600rpm离心30s，吸出上清，加入400μL的5mM CaCl₂水溶液，重悬细胞，静置15min；

(5)3600rpm离心30s，吸出上清。

(6)向离心管中加入1ml灭菌的YPD液体培养基，轻柔悬浮沉淀，于30℃保温1h；

(7)5000prm离心30s，倒掉上清；

(8)1ml灭菌水清洗菌体，离心去上清并用100μL灭菌水悬浮菌体，涂布于选择培养基平板上(质粒Cas9-G418为G418抗性筛选；gRNA-HYG-SOD1和donorDNA为潮霉素B抗性筛选)，于30℃培养2～3天。所得菌落既是含有所需质粒或基因片段的酿酒酵母菌。选择培养基是含有500μg/mL或700μg/mL抗性的YPD培养基。

3、酿酒酵母菌ZJS10041的SOD1基因敲除

(1)采用步骤2的方法，将质粒Cas9-G418转化入酿酒酵母菌ZJS10041感受态，获得含Cas9-G418质粒的酿酒酵母ZJS10041；

(2)将实施例1制备的gRNA-HYG-SOD1质粒和实施例2制备的donorDNA导入步骤(1)获得的含Cas9-G418质粒的酿酒酵母菌ZJS10041的感受态，接种至YPD液体培养基，30℃、150r/min培养6h，获得待筛选菌液。

(3)将步骤(2)获得的菌液接种至含500μg/mL的潮霉素B(HYG)和700μg/mL的G418的YPD平板上，30℃培养48h，挑选阳性单菌落。

(4)将步骤(3)获得的阳性单菌落涂布于含500μg/mL的潮霉素B(HYG)和700μg/mL的G418的YPD平板上，30℃培养48h，长出的单菌落即为阳性转化子；

(5)将步骤(4)阳性转化子单菌落加入到20μL的质量浓度0.2％的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液中，涡旋10s后于沸水浴中煮15min，然后于-20℃放置2min，12000rpm离心1min，取上清。

(6)将步骤(5)获得的上清液作为菌落PCR的模板，以表3引物对转化子进行菌落PCR(泳道3)；同样条件下，将酿酒酵母菌ZJS10041按步骤(4)和步骤(5)制备上清液作为对照进行菌落PCR(泳道2)，电泳结果如图4，从图4可以看出，泳道3长度为872bp，而含有SOD1基因的泳道2长度为1214bp，证明SOD1基因敲除成功。

(7)对步骤(4)阳性转化子基因组为模板，以dDNA-top-SOD1-F和dDNA-bottom-SOD1-R作为引物测序，结果如图5。确认SOD1基因在ZJS10041菌株上敲除成功，获得酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1菌株。

表3菌落PCR引物序列

实施例4：酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1和酿酒酵母菌ZJS10041产量对比

酿酒酵母发酵生产S-腺苷蛋氨酸的方法：分别挑取酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1和酿酒酵母菌ZJS10041单菌落接种至YPD液体培养基中，30℃、150r/min摇床中培养12h。随后培养液以体积浓度4％的接种量接种至装有50mL原始发酵培养基的500mL摇甁中，30℃、150r/min摇床培养24h，补加36g/L的L-蛋氨酸水溶液2mL，继续培养24h，获得各自的发酵液。

原始发酵培养基组成如下：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MnSO₄·7H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂ 0.1g/L，CuSO₄ 0.001 6g/L，柠檬酸三钠二水合物0.1g/L，溶剂为水，pH7.0，115℃灭菌30min。

S-腺苷-L-腺苷蛋氨酸产量的测定：各取1mL发酵液，12000r/min高速离心2min，去上清，加入200μL超纯水，200μL乙酸乙酯，30℃金属浴振荡30min，随后加入500μL 0.35mol/L硫酸水溶液，振荡1.5h后12000r/min离心2min，取上清液，0.22μm有机膜过滤，滤液采用HPLC法测定S-腺苷-L-腺苷蛋氨酸的峰面积，根据SAM标准曲线，获得酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1和酿酒酵母菌ZJS10041的S-腺苷-L-蛋氨酸产量，见表4。

SAM标准曲线：取腺苷蛋氨酸标品，溶于水中，配制成不同浓度的标品溶液(0.1875g/L，0.375g/L，0.75g/L，1.50g/L，3.0g/L)，采用HPLC检测。以峰面积为纵坐标，S-腺苷-L-腺苷蛋氨酸浓度(g/L)为横坐标，绘制标准曲线，图6。

HPLC具体测定条件如下：色谱柱：J&K C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：含40mmol/L磷酸二氢铵，2mmol/L庚烷磺酸钠和18％(v/v)甲醇水溶液的混合溶液，检测温度：30℃，检测流速：1.0ml/min，检测波长：254nm，进样量：10μL。

表4 ZJS10041△SOD1和ZJS10041的S-腺苷-L-蛋氨酸产量(单位g/L)

实施例5：酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1和酿酒酵母菌ZJS10041关键基因转录水平

使用RNA提取试剂盒(来自诺唯赞公司)提取菌株的RNA：分别挑取酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1和酿酒酵母菌ZJS10041单菌落接种至YPD液体培养基中，30℃、150r/min摇床中培养16h后，12000r/min高速离心2min去上清；取沉淀，在超净台中用液氮冻结菌体后进行研磨，加入Buffer RL后涡旋裂解，裂解后收集到FastPure gDNA-Filter ColumnsⅢ中离心取滤液，滤液中加入一半体积的无水乙醇后收集到FastPure RNA ColumnsⅢ，离心弃滤液；随后分别使用Buffer RW1和Buffer RW1进行清洗，清洗后使用RNase-free ddH₂O进行洗脱，获得RNA，可于-80℃保存或后续实验。

使用反转录试剂盒(来自诺唯赞公司)对RNA反转录为cDNA：根据RNA浓度，计算RNA(500ng)所需体积(12μL)。先加入4×gDNA wiper Mix+RNase-free H₂O，再加入RNA混匀，42℃水浴2min。反应后于冰上加入5×HiScript III qRT SuperMix4μL。于PCR仪中按第一步50℃15min，第二步85℃5sec的程序进行，反应后获得的cDNA，可-80℃保存或立即进行qRT-PCR。

qRT-PCR体系：2×Chem Q^TM

Qpcr Master Mix 10μL，Primer F 0.4μL，Primer R 0.4μL，cDNA模板1.0μL，ddH₂O 8.2μL。表5为本文转录组学分析所用到的相关基因引物序列，UBC6基因作为参照基因。体系配完后，在StepOne software上按照程序：第一步95℃30sec，第二步95℃10sec，第三步60℃30sec，第四步95℃15sec，第五步60℃60sec，第六步95℃15sec，第二步到第三步设置40个循环数。每组设置三组重复与一组阴性对照，2^-△(△Ct)即可计算出相关基因的转录组的相对表达量，结果见图7，结果表明酿酒酵母菌ZJS10041△SOD1相较于ZJS10041的ATP基因，PIM基因和SAM2基因的转录表达水平都得到了提升。这有利于菌体中S-腺苷-L-蛋氨酸的积累。

表5转录组学分析所用到的相关基因引物

实施例6：酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1和酿酒酵母菌ZJS10041细胞内ATP含量

使用增强型ATP检测试剂盒(Enhanced ATP Assay Kit)(来自碧云天公司)检测酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1和酿酒酵母菌ZJS10041细胞内ATP含量。

标准品准备：冰浴上融解待用试剂，把ATP标准溶液用ATP检测裂解液稀释成0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μM。

样品准备：分别挑取酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1和酿酒酵母菌ZJS10041单菌落接种至YPD液体培养基中，30℃、150r/min摇床中培养16h后，分别取1mL培养液，12000r/min高速离心2min去上清；轻轻弹散细胞，加入200微升裂解液，室温裂解细胞。裂解后4℃12000rpm离心5分钟，取上清，用于后续的测定。

标准品及样品的检测：加100微升ATP检测工作液到96孔板内。室温放置3-5分钟，在检测孔内加入20微升样品或标准品，迅速用移液枪混匀，至少间隔2秒后，用化学发光仪(luminometer)检测RLU数据。绘制标曲，计算ATP浓度，结果见图8，结果表明在培养过程中酿酒酵母菌ZJS10041△SOD1相较于ZJS10041菌ATP浓度更高，ATP作为S-腺苷-L-蛋氨酸合成的前提物质。这可以为菌体的生长和发酵生产提供更多的能量来源，有利于S-腺苷-L-蛋氨酸的生产。

实施例7：原始发酵培养基初始pH值对SAM产量和菌体量的影响。

挑取酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1单菌落接种至YPD液体培养基中，30℃、150r/min摇床中培养12h。随后培养液以体积浓度4％的接种量接种至装有50mL原始发酵培养基的500mL摇甁中，30℃、150r/min摇床培养24h，补加36g/L的L-蛋氨酸水溶液2mL，继续培养24h，获得发酵液。原始发酵培养基组成同实施例4，不同之处在于调节pH为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0。

分别将不同pH原始发酵培养基培养的发酵液采用实施例4方法检测SAM产量，然后各取1mL在12000r/min高速离心2min，去上清，取沉淀在72℃烘干至恒重，检测发酵液中菌体干重含量，结果见表6和图9，当原始发酵培养基初始pH值为6.5时菌体干重为11.82g/L，产量为1.53g/L。

表6：原始发酵培养基初始pH对SAM产量和菌体量的影响

实施例8：原始发酵培养基中添加柠檬酸钠对SAM产量和菌体量的影响。

将实施例4中原始发酵培养基pH调节至6.5，然后分别添加0g/L，0.10g/L，0.20g/L，0.30g/L，0.40g/L，0.50g/L的柠檬酸钠，其他操作相同，对应的SAM产量和菌体量见表7和图10。

表7：原始发酵培养基中柠檬酸钠对SAM产量和菌体量的影响

实施例9：原始发酵培养基中添加对氨基苯甲酸对SAM产量和菌体量的影响。

将实施例4中原始发酵培养基pH调节至6.5，然后分别添加0g/L，0.05g/L，0.10g/L，0.20g/L，0.40g/L，0.60g/L的对氨基苯甲酸，其他操作相同，对应的SAM产量和菌体量见表8和图11。

表8：原始发酵培养基中对氨基苯甲酸对SAM产量和菌体量的影响

实施例10、原始发酵培养基中添加腺苷对SAM产量和菌体量的影响。

将实施例4中原始发酵培养基pH调节至6.5，然后分别添加0g/L，0.20g/L，0.40g/L，0.60g/L，0.80g/L，1.00g/L的对氨基苯甲酸，其他操作相同，对应的SAM产量和菌体量见表9和图12所示。

表9：原始发酵培养基中腺苷对SAM产量和菌体量的影响

实施例11、原始发酵培养基中添加七水硫酸亚铁对SAM产量和菌体量的影响。

将实施例4中原始发酵培养基pH调节至6.5，然后分别添加0g/L、0.05g/L、0.10g/L、0.20g/L、0.40g/L、0.60g/L的七水硫酸亚铁，其他操作相同，对应的SAM产量和菌体量见表10和图13。

表10：原始发酵培养基中七水硫酸亚铁对SAM产量和菌体量的影响

实施例12：最佳摇瓶发酵培养基组成

根据实施例9-12单因素实验结果，设计4因素3水平的正交实验(表11)，确定最佳的摇瓶发酵培养基。

参考柠檬酸钠、腺苷、对氨基苯甲酸、七水硫酸亚铁4个因素对于SAM发酵的影响，发酵培养基初始pH控制在6.5，对原始发酵培养基重新优化，确定实验因素和水平，进行L₉(3⁴)正交实验，正交实验设计见表11，正交实验结果如表12，方差分析结果如表13所示。

表11：SAM发酵条件的正交实验设计

表12：SAM发酵条件的正交优化实验结果

表13：方差分析结果

方差分析表明对氨基苯甲酸和七水硫酸亚铁是影响最为显著的因素，对SAM产量有显著影响，而柠檬酸钠和腺苷等因素对SAM发酵过程影响有一定促进作用。

在实验设计范围内，优化得到最佳的摇瓶发酵培养基成分为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MnSO₄·7H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂ 0.1g/L，CuSO₄ 0.0016g/L，柠檬酸钠0.4g/L，对氨基苯甲酸0.1g/L，腺苷0.6g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，溶剂为水，pH 6.5。

实施例13：最佳摇瓶发酵培养基的应用

为了验证培养基优化后的SAM发酵能力，使用最优的摇瓶发酵培养基，采用实施例4方法发酵了3批次的酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1，发酵液的HPLC图见图15所示，SAM标准品的HPLC图见图14，发酵结果如表14所示，经过验证，优化后摇瓶发酵培养基的SAM产量达到了1.73±0.02g/L。

表14：优化摇瓶发酵培养基验证试验结果

实施例14：高产S-腺苷-L-蛋氨酸菌株酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1在5L发酵罐中的生产情况

取实施例3筛选的酿酒酵母工程菌ZJS10041△SOD1菌种接种至YPD液体培养基中，30℃、150r/min摇床中培养12h。随后培养液以体积浓度4％的接种量接种至装有实施例12中的最佳摇瓶发酵培养基的500mL摇甁中，30℃培养12小时，获得种子液。

将种子液以10％体积比例的接种量接种到有3L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵过程中控制罐内温度30℃、pH6.5、搅拌转速650rpm、罐压0.05MPa，通气量8L/min，发酵过程中以6-12ml/(h·L)的速度流加500g/L葡萄糖水溶液使罐内残留糖控制在5g/L。当发酵56h后发酵液中菌体湿重达到266g/L时，以终浓度3g/L的量补加1次L-蛋氨酸，当菌体湿重达到280g/L时以终浓度1.5g/L的量补加1次L-蛋氨酸，之后每隔4小时以1.5g/L的量补加L-蛋氨酸直至发酵结束。发酵72h后，测定S-腺苷-L-蛋氨酸产量为：7.43g/L。

发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MnSO₄·7H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂ 0.1g/L，CuSO₄ 0.0016g/L，柠檬酸钠0.4g/L，对氨基苯甲酸0.1g/L，腺苷0.6g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，钼酸铵0.0048g/L，NaCl 0.5g/L，生物素0.0003g/L，泛酸钙0.0036g/L，0.0036g/L维生素B1，0.0036g/L维生素B6，溶剂为水，pH6.5。115℃灭菌30min，pH6.5。

Claims (10)

1.一种高产S-腺苷-L-蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZJ10041菌株为底盘菌株，将其基因组中的SOD1基因敲除，获得高产S-腺苷-L-蛋氨酸的酿酒酵母ZJ10041-△SOD1菌株。

2.如权利要求1所述的高产S-腺苷-L-蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述SOD1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种权利要求1所述酿酒酵母工程菌在微生物发酵制备S-腺苷-L-蛋氨酸中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为：将所述酿酒酵母工程菌菌株接种至原始发酵培养基中，30℃、160-200rpm条件下培养20-30h后，加入L-蛋氨酸，继续培养至48-72h，发酵结束后，发酵液离心收集酿酒酵母菌，提取获得S-腺苷-L-蛋氨酸；所述原始发酵培养基组成如下：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄5g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MnSO₄·7H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂0.1g/L，CuSO₄ 0.0016g/L，柠檬酸三钠二水合物0.1g/L，溶剂为水，pH7.0。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述L-蛋氨酸以36g/L的L-蛋氨酸水溶液形式加入，L-蛋氨酸加入量以原始发酵培养基体积计为1.3-2.0g/L。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌发酵前，先接种至YPD液体培养基中，于30℃，150-180rpm培养12h，然后以体积浓度4％接种至原始发酵培养基中培养。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述原始发酵培养基为摇瓶发酵培养基，所述摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄10g/L，MnSO₄·7H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂ 0.1g/L，CuSO₄0.001 6g/L，柠檬酸三钠二水合物0-0.5g/L，对氨基苯甲酸0-0.6g/L，腺苷0-1.0g/L，硫酸亚铁0-0.40g/L，溶剂为水，pH5.0-7.0。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH4)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MnSO₄·7H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂ 0.1g/L，CuSO₄ 0.001 6g/L，柠檬酸三钠二水合物0.4g/L，对氨基苯甲酸0.1g/L，腺苷0.6g/L，硫酸亚铁0.1g/L，溶剂为水，初始pH 6.5。

9.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵采用发酵罐按如下方法进行：所述酿酒酵母工程菌接种到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵过程中控制罐内温度30℃、pH6.5、搅拌转速650rpm、罐压0.05MPa，通气量8L/min，发酵过程中以6-12ml/(h·L)的速度流加500g/L葡萄糖水溶液使罐内残留糖控制在5g/L；当发酵56h后发酵液中菌体湿重达到266g/L时，以终浓度3g/L的量补加1次L-蛋氨酸，当菌体湿重达到280g/L时以终浓度1.5g/L的量补加1次L-蛋氨酸，之后每隔4小时以1.5g/L的量补加L-蛋氨酸直至发酵结束，提取获得S-腺苷-L-蛋氨酸；

所述发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MnSO₄·7H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂ 0.1g/L，CuSO₄ 0.0016g/L，柠檬酸钠0.4g/L，对氨基苯甲酸0.1g/L，腺苷0.6g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，钼酸铵0.0048g/L，NaCl 0.5g/L，生物素0.0003g/L，泛酸钙0.0036g/L，0.0036g/L维生素B1，0.0036g/L维生素B6，溶剂为水，pH6.5。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌接种至发酵罐前，先进行种子扩大培养，再将种子液以体积浓度10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子扩大培养方法为：将所述酿酒酵母工程菌接种至YPD液体培养基中，30℃、150r/min摇床中培养12h；随后培养液以体积浓度4％的接种量接种至摇瓶发酵培养基中，30℃培养12小时，获得种子液。

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