CN115813986B - 一种无毒副作用、安全有效的治疗失眠症中药组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药用途技术领域，为了解决目前治疗失眠症药物存在的缺乏高效、安全、毒副作用少的问题，提供了一种无毒副作用、安全有效的治疗失眠症中药组合物及其制备方法，该药物药效肯定、无毒副作用、安全性好，由如下重量份的原料制备而成：香橼3‑12份、佛手6‑15份、五味子3‑12份、白芷6‑15份、黄芩3‑9份、夏枯草3‑12份、蛇床子3‑6份。本发明确定了一个安全有效的催眠处方来源，对其催眠药效、最佳工艺参数、安全性、不良反应进行研究验证。安全性好，口服安全可靠，未发现宿醉和耐受性不良反应。
Description
技术领域
本发明属于医药用途技术领域，具体涉及发现并提供了一种无毒副作用、安全有效的治疗失眠症中药组合物及其制备方法。
背景技术
失眠已成为全球临床最常见的疾病之一，一般人群以失眠为主诉的流行率高达10%-60%，并且有10%的患者有明显的失眠综合征[1]。我国失眠的发病率也在随年龄逐年攀升，迄今发病率高达10%-20% [2]。
目前药物治疗仍是治疗失眠症最重要的方法，镇静催眠化学药物短期对症疗效确切，但用药后常见日间困倦、头昏、过度镇静、肌张力减退、跌倒等日间宿醉现象以及反跳性失眠、认知功能减退、精神损害等不良反应；长期使用易发生耐受性和依赖性等，甚者慢性中毒。由于镇静催眠化学药的滥用造成比失眠症本身更为严重的精神行为和心身疾患，其处方在国内外均已被严格限制。
理想的镇静催眠药物的特点有：催眠作用显著、无延续和蓄积效应、无耐受性、依赖性和宿醉反应，但目前尚缺乏高效、安全、毒副作用少的治疗失眠药物。中医药治疗失眠以整体观进行辩证论治，对脏腑阴阳进行调整，标本兼施达到安神功效，多靶点治疗，不良反应小。
发明内容
本发明为了解决目前治疗失眠症药物存在副作用，缺乏高效、安全、毒副作用少的治疗失眠药物的问题，提供了一种无毒副作用、安全有效的治疗失眠症中药组合物及其制备方法。
本发明由如下技术方案实现的：一种无毒副作用、安全有效的治疗失眠症中药组合物，由如下重量份的原料制备而成：香橼3-12份、佛手6-15份、五味子3-12份、白芷6-15份、黄芩3-9份、夏枯草3-12份、蛇床子3-6份。
优选：由如下重量份的原料制备而成：香橼9份、佛手12份、五味子9份、白芷12份、黄芩6份、夏枯草9份、蛇床子3份。
具体制备方法为：取各原料药物混合，用混合药物12倍质量水浸泡30min，浸泡2h，煎煮3次，每次1.5h，合并煎液，减压浓缩，70℃干燥，得干膏即可。药物混合均匀后制成胶囊、颗粒或丸药等任何所需剂型。
本发明还提供了另外一种制备方法：取各原料药物混合，用混合药物加4倍药物质量的体积浓度为60%的乙醇，加热回流2次，每次50min，滤过，滤液混合后浓缩干燥，得干膏。药物混合均匀后制成胶囊、颗粒或丸药等任何所需剂型。
与现有技术相比，本发明确定了一个安全有效的催眠处方来源，对其催眠药效、最佳工艺参数、安全性、不良反应进行研究验证。
香橼、佛手、五味子、白芷、黄芩、夏枯草、蛇床子七味药分别单独水提、60%醇提、95%醇提物几乎涵盖不同极性成分进行筛选比较，均表现出明显的催眠药效。
香橼、佛手、五味子、白芷、黄芩、夏枯草、蛇床子七味药组合后进行水提和60%醇提，两种提取物经3批动物实验也表现出明显的催眠药效，且动物实验按照人日用最大量计算，组方两种提取物相当于人日用量18.6倍和地西泮催眠作用相当于人最大用量17.5倍比较时，药效并不差。
急毒实验安全性好：处方采用最佳工艺制得的药物组分，测不出LD50，进行最大给药量试验，结果小鼠能耐受的最大容积、最大浓度的受试物48g/kg（折合生药141g/kg）灌胃，相当于成人临床日服量的141.2倍，未引起动物死亡，未见明显毒性反应，证明本品口服安全可靠。
毒副作用实验未发现宿醉和耐受性不良反应：与常用催眠西药苯二氮卓类药物地西泮相比，受试物并没有表现出用药后困倦、嗜睡不爱动的宿醉现象，以及长期用药后作用下降的耐受表现。为从中医药中发掘良好催眠药物提供市场前景。
附图说明
图1为重复使用受试物3d和15d潜伏期和睡眠时间比较图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
一、受试催眠药物单味药不同提取方法筛选
1、药物与试剂
香橼：本品为芸香科植物枸橼Citrus medicL.或香圆Citruswilsonii Tanaka的干燥成熟果实，药典用量：3~10g，批号：200401；
佛手：为芸香科植物佛手Citrus medica L. var. sarcodac-tylisSwingle的干燥果实。药典用量：3~10g，批号：200401；
五味子：为木兰科植物五味子Schisandraechinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，药典用量：2~6g，批号：200301；
白芷：本品为伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch，ex Hoffm.）Benth. etHook. f.或杭白芷Angelica dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth.et Hook. f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan的干燥根，药典用量：3~10g，批号：191201；
黄芩：本品为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。药典用量：3~10g，批号：200301；
夏枯草：本品为唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL. 的干燥果穗。药典用量：9~15g，批号：211201；
蛇床子：本品为伞形科植物蛇床Cnidiummonnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果实。药典用量：3~10g，200402。
以上中药均购自安徽省灏融中药饮片有限公司，生产许可证号：皖20160100，执行标准：《中国药典》2020年版一部及四部，以下研究内容药材来源均一致。
地西泮片：上海上药信谊药厂有限公司，批号14161201；
戊巴比妥钠：国药集团化学试剂有限公司，批号WS20050411。
2、仪器：BP-310S电子天平：德国赛多利斯；FZ102植物粉碎机：河北省黄骅市新兴电器厂；HH-60型数显恒温搅拌循环水箱：常州国华电器有限公司。
3、动物：小鼠：KM种，SPF级，雌雄各半，体重(20±2)g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2019-0008，No. 1103221911014961、110322200101645041。
4、催眠药物提取制备：
水提物制备：分别取香橼、佛手、五味子、白芷、黄芩、夏枯草、蛇床子药材各100g，用6倍量水浸泡30min，煎煮2次，每次50min，滤过，滤液浓缩干燥，计算出膏率分别为：21.5%、40.1%、36.1%、24.5%、49.5%、10.8%、15.5%，放阴凉处备用。
60%乙醇提取物制备：分别取香橼、佛手、五味子、白芷、黄芩、夏枯草、蛇床子药材各100g，粉碎后，用4倍量60%乙醇加热回流2次，每次50min，滤过，滤液浓缩干燥，计算出膏率分别为：21.8%、33.4%、46.3%、21.0%、49.8%、8.2%、15.1%，放阴凉处备用。
95%乙醇提取物制备：分别取香橼、佛手、五味子、白芷、黄芩、夏枯草、蛇床子药材各100g，粉碎后，用4倍量95%乙醇加热回流2次，每次50min，滤过，滤液浓缩干燥，计算出膏率分别为：33.3%、36.7%、32.5%、7.1%、41.6%、4.5%、13.0%，放阴凉处备用。
5、动物分组及给药：取小鼠，每组10只，雌雄各半，随机分为空白、地西泮（2.5mg/kg）（按照说明书人用催眠作用最大量10mg计算，大约相当于70kg人用量的17.5倍）、香橼水提（0.559g/kg）、佛手水提（1.043g/kg）、五味子水提（0.563g/kg）、白芷水提（0.637g/kg）、黄芩水提（1.287g/kg）、夏枯草水提（0.432g/kg）蛇床子水提（0.403g/kg）；香橼60%醇提（0.557g/kg）、佛手60%醇提（0.868g/kg）、五味子60%醇提（0.722g/kg）、白芷60%醇提（0.546g/kg）、黄芩60%醇提（1.295g/kg）、夏枯草60%醇提（0.328g/kg）、蛇床子60%醇提（0.393g/kg）；香橼95%醇提（0.866g/kg）、佛手95%醇提（0.954g/kg）、五味子95%醇提（0.507g/kg）、白芷95%醇提（0.185g/kg）、黄芩95%醇提（1.082g/kg）、夏枯草95%醇提（0.180g/kg）、蛇床子95%醇提（0.338g/kg）；（给药剂量按中国药典人日用生药最大剂量，结合人和动物体表面积折算等效剂量[3]，统一取等效剂量2倍量作为小鼠给药量，大约相当于70kg人生药日用量的18.6倍，用时按照生药出膏率计算取相应膏重），每天灌胃1次，连续3天，灌胃容积20ml/kg，空白组蒸馏水灌胃，分两批试验完成。
6、检测指标：戊巴比妥钠催眠剂量的入睡潜伏期和持续睡眠时间的观察[4-5]：第3天给药1小时后，各组小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg，睡眠以翻正反射消失为指标，以动物背向下姿势保持30s以上者，判断为翻正反射消失，记录注射戊巴比妥钠后至小鼠翻正反射消失时间作为入睡潜伏期，并观察记录翻正反射消失至觉醒的时间作为持续睡眠时间。
7、统计学处理：应用Excel处理数据，SPSS20.0统计软件进行统计学处理，计量资料用表示，多组间数据采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；方差不齐采用数据转换形式，转换后的数据采用t′检验；计数资料以例数和百分比表示，用非参数检验中的2个独立样本进行检验，计算Z值和P值，p＜0.05表示有统计学意义。
8、结果：结果显示，潜伏期地西泮、白芷水提、60%醇提、95%醇提及夏枯草95%醇提组明显短于空白组（P<0.05）；睡眠时间香橼、佛手、五味子、白芷、黄芩、夏枯草、蛇床子不同提取物均明显长于空白组（P<0.05，P<0.01，P<0.001），见表1-2。表明白芷不同提取物及夏枯草95%醇提物可以缩短睡眠潜伏期，有助于快速入眠，香橼、佛手、五味子、白芷、黄芩、夏枯草、蛇床子不同提取物均有明显的催眠作用。
表1 香橼、佛手、五味子不同提取方法催眠实验（n=10，）
注：与空白组比较：*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001。
表2 白芷、黄芩、蛇床子、夏枯草不同提取方法催眠实验（n=10，）
注：与空白组比较：*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001。
香橼、佛手、五味子、白芷、黄芩、夏枯草、蛇床子，七味药不同提取方法催眠药效结果可以看出，均有明显的催眠作用，且水提法催眠作用也很好，考虑拿到临床用药大生产时，水煎比醇提可以节约试剂，减少成本，操作简单，安全可行，所以初步决定七味药组方后用水煎法提取药物复合物用于发挥催眠作用。所以，依据临床常用剂量确定处方组成及用量为：香橼9g、佛手12g、五味子9g、白芷12g、黄芩6g、夏枯草9g、蛇床子3g。为了证明七味药组合后水提和醇提法是否存在显著差异，进一步对受试物组方水提、醇提物进行三次重复催眠试验验证。
二、受试物组方水提、醇提物三次重复催眠试验比较
1、受试物组方水提、醇提物制备：处方组成：香橼9g、佛手12g、五味子9g、白芷12g、黄芩6g、夏枯草9g、蛇床子3g。
水提物制备：取3倍的处方量，分别取药材香橼18g、佛手27g、五味子18g、白芷36g、黄芩27g、蛇床子9g，一起用6倍量水浸泡30min，煎煮2次，每次50min，滤过，滤液浓缩干燥，计算出膏率为：31.3%，放阴凉处备用。
60%乙醇提取物制备：取3倍的处方量，分别取药材香橼18g、佛手27g、五味子18g、白芷36g、黄芩27g、蛇床子9g，一起用4倍量60%乙醇加热回流2次，每次50min，滤过，滤液浓缩干燥，计算出膏率为：29.8%，放阴凉处备用。
2、动物分组与给药：取小鼠，每组10只，雌雄各半，随机分为空白、地西泮（2.5mg/kg）、受试物水提（4.99g/kg）、受试物醇提（4.75g/kg）组，（给药剂量按照人一天用一副中药量，结合人和动物体表面积折算等效剂量[2]，统一取等效剂量2倍量作为小鼠给药量，大约相当于70kg人生药日用量的18.6倍，用时按照生药出膏率计算取相应膏重），每天1次，连续3天，灌胃容积20ml/kg，空白组蒸馏水灌胃，用三批动物重复做三次实验进行比较。检测指标与统计学处理同受试催眠药物单味药不同提取方法比较中的检测指标与统计学处理方法。
3、结果如表3、表4、表5所示，结果显示：与空白组比较，受试物水提和60%醇提物，对三批小鼠催眠实验睡眠时间均有显著延长作用（P<0.01，P<0.001），且两种提取方法无统计学差异；与地西泮比较，在第一批实验受试物水提和60%醇提物睡眠时间显著延长，第二和第三批无差异。表明受试物水提和60%醇提物均有明显的催眠作用，且无差异，动物按照人日用量最大量计算，两种提取物相当于人日用量18.6倍和地西泮催眠作用相当于人最大用量17.5倍时，药效并不差。
表3 受试物水提、醇提物第一批动物催眠作用实验（n=10，）
注：与空白组比较：*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001；与地西泮比较：▲ P<0.05,▲▲ P<0.01,▲▲▲ P<0.001。
表4 受试物水提、醇提物第二批动物催眠作用实验（n=10，）
注：与空白组比较：*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001；与地西泮比较：▲ P<0.05,▲▲ P<0.01,▲▲▲ P<0.001。
表5 受试物水提、醇提物第三批动物催眠作用实验（n=10，）
注：与空白组比较：*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001；与地西泮比较：▲ P<0.05,▲▲ P<0.01,▲▲▲ P<0.001。
对受试物七味药组合后一起采用水提和60%醇提，得到的复合物催眠作用均显著，水提物仍然表现出有很好的疗效，所以进一步确定对组方水提工艺进行最佳工艺参数筛选试验。
三、受试物水提工艺研究
1、药物：处方及处理：香橼18g、佛手24g、白芷24g、五味子18g、黄芩12g、夏枯草18、蛇床子6g，七味药来源同前，水提取总处方量120g。
2、正交试验因素水平设计：根据有关资料，以黄芩苷和柚皮苷为考察指标，选择加水量(A)、煎煮时间(B) 、煎煮次数(C) 3个因素，每个因素选择3个水平进行L9（33）正交试验。对其提取工艺进行优选。见表6，表7。
表6 水提因素水平表
表7 L9（33）正交实验设计表
3、供试品溶液的制备：取各提取物约0.1g，精密称定，置于100ml量瓶中，加50%甲醇80ml，超声处理30分钟，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。
4、对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷、柚皮苷对照品适量，分别置25ml容量瓶中，加甲醇分别制成一定浓度的对照品溶液。
5、色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，4.6（Φ）×250mm，颗粒直径5μm。流动相：以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脱，（0～15min，10%→30% A；15～23min，30%→45% A；23～25min，45%→10%A；检测波长：283nm，流速：1ml/min，柱温：25℃。
6、结果：通过正交试验方差分析发现加水量(A)、煎煮时间(B) 、煎煮次数(C)对黄芩苷和柚皮苷的提取量均无显著影响，见表9，从直观分析结果可知最佳提取工艺为A3B2C2，即处方加水12倍量，提取3次，每次提取1.5小时，见表8。即香橼、佛手、五味子、白芷、黄芩、夏枯草、蛇床子七味药，加水12倍量，浸泡2h，煎煮3次，每次1.5h，合并煎液，减压浓缩，干燥，制成所需剂型。
表8 正交试验结果与分析表
表9 方差分析
处方经3因素3水平进行L9（33）正交试验，确定最佳工艺参数为：香橼、佛手、五味子、白芷、黄芩、夏枯草、蛇床子七味药，加水12倍量，浸泡2h，煎煮3次，每次1.5h，合并煎液，减压浓缩，干燥，制成所需剂型。为了解处方采用最佳工艺的安全性，进一步做小鼠急性毒性实验进行验证。
四、受试物催眠安全性实验（急性毒性试验）
1、受试药物：受试处方：香橼9g、佛手12g、五味子9g、白芷12g、黄芩6g、夏枯草9g、蛇床子3g。所用药物来源同前。
人用法用量：临床人用一副生药药量为60g，口服，一日一剂，文火煎煮2次，合并煎液，早晚两次，早上饭后服用，晚上睡前半小时服用。
受试物急毒水提物制备：取5倍的处方量，分别取药材香橼45g、佛手60g、五味子45g、白芷60g、黄芩30g、夏枯草45g、蛇床子15g，七味药共300g，加水12倍量，浸泡2h，煎煮3次，每次1.5h，合并煎液，减压浓缩，70℃干燥，得干膏102.3g，计算出膏率为：34.1%，即1g本品约相当于2.94g生药，放至阴凉处备用。用时以蒸馏水配制成40%的混悬液。
受试动物：小鼠：昆明种，SPF级，性别：雌、雄各半，体重：20±2g。来源：北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0008，动物合格证号1103222011006908。
2、方法：小鼠40只，禁食14小时后，随机分为对照组、受试物组，共二组，每组20只，受试物组一日单次灌胃给予40%水提物混悬液，0.4ml/10g（最大体积），对照组灌胃等体积的蒸馏水，观察当日，并连续观察14日，详细记录小鼠死亡以及体重、摄食、饮水、皮毛、活动、眼睛、粪便、精神状态等反应情况和出现的毒性反应。
3、结果
A、动物反应情况：受试物一日内单次灌胃后小鼠无一例死亡；除灌胃后1小时受试物组小鼠均出现水样便，3小时后恢复正常外，其活动、摄食、饮水、皮毛、呼吸、眼睛、精神状态、体重等状况均未见异常。
B、主要脏器肉眼观察：第15天杀检后肉眼观察，心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、胃、十二指肠、结肠、子宫、卵巢或睾丸、附睾、前列腺-贮精囊等主要脏器颜色、形态、大小、软硬度等均未见异常变化。
C、小鼠体重变化：小鼠体重给药前、给药后1周、2周受试物组与对照组无明显差别，见表10、11。
表10小鼠体重变化（♀）
表11小鼠体重变化（♂）
D、相当于成人日用量倍数：受试物按成人临床日服量生药量为一剂60g，相当于受试物水提物20.4g，按成人60kg计算，临床成人日服受试物水提物量为0.34g/kg，小鼠能耐受的最大浓度40%，最大体积40ml/kg体重的受试物水提物，一日内灌胃三次每隔5h给予小鼠，分别在上午9:00时，下午2:00时和7:00时灌胃，小鼠日给受试物水提物量为48g/kg，相当于临床成人日服量的141.2倍。
受试物水提物相当于临床成人用量倍数（成人按60kg计算）=小鼠日给药量/（成人日服量/60kg）=40%×40（ml/kg）×3次/[20.4g/60（kg）]=141.2(倍)。
本品测不出LD50。进行最大给药量试验，即动物能耐受该药的最大浓度( 40%)、最大体积（40ml/kg）一日内三次每隔5h灌胃给予小鼠，观察小鼠的急性毒性反应。结果：受试物水提物以最大浓度、最大体积一日内三次灌胃给予小鼠，小鼠无一例死亡；除给药后1小时给药动物出现水样便、3小时候大便恢复正常外，其活动、摄食、饮水、皮毛、呼吸、眼睛、精神状态、体重等及杀检后心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、子宫、卵巢或睾丸、前列腺等脏器的肉眼观察均未见异常，表明以小鼠能耐受的最大容积、最大浓度的受试物48g/kg（折合生药141g/kg）灌胃给予，相当于成人临床日服量的141.2倍，未引起动物死亡，未见明显毒性反应，证明本品口服安全可靠。
对于临床用于助眠的西药会出现一些宿醉反应、耐受性、依赖性等不良反应，为了进一步了解本受试物催眠药效，药效剂量有无依赖性，以及是否存在宿醉反应和耐受性不良反应，进一步做了相关研究。
五、受试物催眠作用以及宿醉反应和耐受性研究
1、药物与试剂同受试催眠药物单味药不同提取方法比较中所述药物与试剂。仪器：ZZ-6小鼠自主活动仪：成都泰盟科技有限公司。
动物：小鼠：昆明种，SPF级，性别：雌、雄各半，体重：20±2g。来源：北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0008，No. 1112512011000656、1103222011006909。
2、方法
1、受试物水提物制备同急性毒性实验。
2、动物分组及给药：取小鼠，雌雄各半，随机分为空白对照、地西泮对照（2.5mg/kg）、催眠受试物低剂量(2.72g/kg)、中剂量(5.44g/kg)、高剂量（10.9g/kg)组，（给药剂量按照人一天用一副中药量60g，1g药品约相当于2.94g生药计算，结合人和动物体表面积折算等效剂量[3]作为低剂量，低剂量的2倍、4倍量作为中、高剂量，大约相当于70kg人生药日用量的9.3、18.6、37.2倍，用时按照生药出膏率计算取相应膏重），每日1次，连续3天，灌胃容积20ml/kg，空白组灌等量蒸馏水。
3、检测指标
A、直接催眠实验[6]：末次给药后直接观察小鼠是否出现睡眠现象，睡眠以动物背向下姿势保持30s以上，作为翻正反射消失的指标，记录入睡动物数。
B、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验[6]：在末次给药1h后，各组动物经腹腔注射戊巴比妥钠30 mg /kg，观察30min内各组翻正反射消失达1 min 以上的动物数，记录入睡动物数，计算入睡率（%）。
C、戊巴比妥钠阈剂量催眠作用入睡潜伏期和持续睡眠时间的观察[4-5]：第3天给药1h后，各组小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg，睡眠以翻正反射消失为指标，以动物背向下姿势保持30s以上者，判断为翻正反射消失，记录注射戊巴比妥钠后至小鼠翻正反射消失时间作为入睡潜伏期，并观察记录翻正反射消失至觉醒的时间作为持续睡眠时间。
D、催眠宿醉反应实验：为了解药物对小鼠戊巴比妥钠睡眠的延长作用有无宿醉反应，各组于第3 d灌胃60 min后测自主活动一次，第4 d灌胃60 min后各组均腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg，测小鼠入睡潜伏期和睡眠持续时间，并观察醒后40 min每只小鼠5 min自主活动次数。
E、小鼠催眠耐受性观察[7]：各组连续给药15 d，在第3 d和第15 d上午灌胃给药60 min后，分别测小鼠入睡潜伏期和睡眠持续时间，观察重复给药后，药物催眠作用的耐受现象。
4、统计学处理方法同前。
5、结果
A、直接催眠实验：受试物各剂量组与空白对照组均没有动物出现翻正反射消失情况，均没有入睡动物数，提示该受试物没有直接使小鼠进入睡眠的作用，见表12。
表12 受试物对小鼠直接催眠实验的影响（）
注：与空白组比较：*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001。
B、戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响：戊巴比妥钠为中枢抑制药，能产生镇静催眠作用，使小鼠翻正反射消失。选其阈下催眠量30mg/kg（即90%以上动物不出现睡眠的剂量）与受试物在同一动物身上合用。如受试物具有中枢抑制作用，则可产生协同作用，提高动物的睡眠百分率。结果受试物低、中、高剂量组与空白对照组比较均有明显的协同催眠作用（P<0.05,P<0.01,P<0.01），见表12，表明受试物对戊巴比妥钠阈下剂量有协同催眠作用，具有中枢抑制作用。
表13：受试物对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响（）
/>
注：与空白组比较：*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001。
C、戊巴比妥钠阈剂量催眠实验入睡潜伏期和持续睡眠时间的观察：选择戊巴比妥钠剂量为催眠量50mg/kg（即动物均能产生翻正反射消失的剂量），因此观察指标主要为睡眠潜伏期和持续睡眠时间。结潜伏期各组间无差异，给药低、中、高剂量组明显高于空白组（P<0.05，P<0.001，P<0.001），见表14，表明给药组对戊巴比妥钠阈剂量有催眠作用，且表现出一定的剂量依赖性。
表14：受试物对小鼠戊巴比妥钠阈剂量催眠实验的影响（n=10，）
注：与空白组比较：*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001。
受试物催眠作用宿醉反应观察
结果显示：睡眠潜伏期各组间无差异；睡眠持续时间各给药组均明显高于空白组（P<0.001）；睡前自主活动地西泮和中剂量组明显低于空白组（P<0.001，P<0.01）；醒后自主活动站立次数地西泮组明显低于空白组（P<0.001），活动次数给药中、高剂量组明显高于空白组（P<0.01，P<0.05），见表15。表明各给药组均有明显的催眠作用，地西泮和中剂量组给药后睡前自主活动表现出中枢抑制作用，醒后对自主活动的抑制作用地西泮较强，给药组并没有表现出醒后自主活动抑制作用的宿醉反应现象。
表15：受试物镇静催眠作用宿醉反应的观察（ ，n=10）
与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
重复使用受试物对小鼠催眠耐受性观察：结果显示：潜伏期在给药第3 d地西泮和中剂量组明显低于空白组（P<0.01，P<0.05）；睡眠时间各组于给药第3 d和15 d均明显高于空白组（P<0.001）；第3 d和15 d比较，潜伏期前后均无差异，睡眠时间地西泮15d比3d明显缩短（P<0.05），高剂量15d比3d明显延长（P<0.001），给药低、中剂量15d比3d有延长趋势，见表16，图1。表明药物对小鼠3d和15均具有催眠作用，但地西泮随着用药时间延长对小鼠催眠作用减弱出现耐受性，而催眠中药未表现出药物耐受性。
表16：重复使用受试物对睡眠时间耐受性的影响（ ，n=10）
注：与空白对照组比较：***P<0.001；第3 d和15 d比较：▲P<0.05，▲▲ P<0.01，▲▲▲ P<0.001。
结论：
催眠作用明确：受试物没有直接催眠作用；对戊巴比妥钠协同阈下剂量及阈剂量均有催眠效果；而且表现出有一定的剂量依赖性。
未发现宿醉和耐受性不良反应：与常用催眠西药苯二氮卓类药物地西泮相比，受试物并没有表现出用药后困倦、嗜睡不爱动的宿醉现象，以及长期用药后作用下降的耐受表现。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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Claims (3)
1.一种无毒副作用、安全有效的治疗失眠症中药组合物，其特征在于：由如下重量份的原料制备而成：香橼3-12份、佛手6-15份、五味子3-12份、白芷6-15份、黄芩3-9份、夏枯草3-12份、蛇床子3-6份；
所述制备中药组合物的方法为：取各原料药物混合，用混合药物12倍质量水浸泡2h，煎煮3次，每次1.5h，合并煎液，减压浓缩，70℃干燥，得干膏即可；
或：取各原料药物混合，用混合药物加4倍药物质量的体积浓度为60%的乙醇，加热回流2次，每次50min，滤过，滤液混合后浓缩干燥，得干膏。
2.根据权利要求1所述的一种无毒副作用、安全有效的治疗失眠症中药组合物，其特征在于：由如下重量份的原料制备而成：香橼9份、佛手12份、五味子9份、白芷12份、黄芩6份、夏枯草9份、蛇床子3份。
3.根据权利要求1所述的一种无毒副作用、安全有效的治疗失眠症中药组合物，其特征在于：将干膏制成胶囊、颗粒或丸药。
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