CN115785139B - 一种用于过氧化氢成像的近红外荧光探针及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于特异性荧光检测领域，具体涉及一种用于过氧化氢成像的近红外荧光探针及其制备方法、应用。所述近红外荧光探针的结构式为：
。本发明制备得到的近红外荧光探针对过氧化氢选择性和灵敏度高，具有抵抗其他物质干扰的能力，能够满足生物学检验；且该荧光探针具有近红外荧光（NIR）发射能力，可以穿透更深的组织并有效抵消自身背景荧光的干扰，荧光稳定性好，且能够获得更加准确及稳定的成像效果，具有广阔的应用前景。本发明提供的合成方法简单，易操作。
Description
技术领域
本发明属于特异性荧光检测领域，具体涉及一种用于过氧化氢成像的近红外荧光探针及其制备方法、应用。
背景技术
高尿酸血症是以尿酸过高为标志的代谢性疾病之一。高浓度尿酸会导致活性氧自由基(ROS)的过量产生，同时导致超氧化物歧化酶抗氧化能力的降低。同时，值得注意的是，高尿酸血症的并发症，如痛风、慢性肾病、肝损伤、心血管疾病等，对高尿酸血症患者带来了危害严重。因此，为了人类的健康，找到合适的工具来监测高尿酸血症及其并发症是非常重要的。过氧化氢（H2O2）作为生物系统中的主要活性氧之一，与其他活性氧相比是一种稳定的物种，由于其在生物体中的反应相对温和而一直受到重视。此外，过氧化氢不仅在活细胞的信号转导中起着非常重要的作用，而且是氧化应激的生物标志物。研究表明，细胞中过氧化氢的异常水平与许多疾病密切相关，包括癌症、衰老、神经退行性疾病等。越来越多的证据表明，氧化应激引起的过氧化氢的产生是高尿酸血症及其相关并发症发生发展的关键因素。开发一种实时检测过氧化氢水平的分析方法对于糖尿病及其并发症的诊断和治疗至关重要。
过氧化氢是活性氧的主要成员之一，以自由扩散形式进出细胞膜，因此难以对细胞内的过氧化氢进行原位动态检测。过氧化氢极易与细胞内活性物质反应生成其他形式的活性氧，因此，过氧化氢检测方法需要快速响应时间。分子荧光探针成像技术是一种检测生物体内小分子物质行之有效的方法，目前已成功用于检测生命系统中的活性物种。现存的过氧化氢检测的分子探针有很多，这些过氧化氢探针的检测机制主要是基于酯化反应，在痕量的内源性过氧化氢新研究方向上，呈现明显的不足之处，且无法实现活体成像。因此，必须提高探针对过氧化氢选择性和灵敏度，才能够满足生物学检验的最新要求。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种用于过氧化氢成像的近红外荧光探针。
本发明还提供了一种上述近红外荧光探针的制备方法。
本发明的另一目的为提供了上述近红外荧光探针在活体或细胞成像中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种用于过氧化氢成像的近红外荧光探针，所述近红外荧光探针的结构式为：
本发明还提供了一种上述用于过氧化氢成像的近红外荧光探针的制备方法，具体合成路线为：
本发明所提供的制备方法具体包括以下步骤：
（1）将4-（二乙氨基）水杨醛在浓硫酸中浓缩并冷却至0℃，在剧烈搅拌下加入6-羟基-1-四氢萘酮，得混合物，将混合物进行升温反应；反应结束后将反应液冷却至室温，然后在冰浴条件下，二氯甲烷萃取，合并有机相，分离纯化得到深紫色固体DHX-OH；
（2）将4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯、DHX-OH和K2CO3混合后加入溶剂进行反应，TLC追踪反应进程；反应结束后向反应液中加入去离子水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，分离纯化得到棕黄色固体DHX-1。
进一步的，步骤（1）中，所述4-（二乙氨基）水杨醛在浓硫酸中的摩尔浓度为0.24mol/L；所述4-（二乙氨基）水杨醛和6-羟基-1-四氢萘酮的摩尔比为1.1-1.5：1。
进一步的，步骤（1）中，所述升温反应为将混合物在N2保护下升温至60-110℃搅拌反应6 h；所述分离用的洗脱剂为V石油醚：V乙酸乙酯=3:1-1:1。
进一步的，步骤（2）中，所述4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯、DHX-OH和K2CO3的摩尔比为1.0-1.5：1：0.3-1；所述DHX-OH在溶剂中的浓度为0.05mol/L；所述溶剂和去离子水的体积比为2:1。
进一步的，步骤（2）中，所述溶剂选自四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、吡啶、二氯甲烷、氯仿和甲苯中的任一种；所述反应为在20-50℃下反应5h。
本发明还提供了上述用于过氧化氢成像的近红外荧光探针在生物活体或细胞中过氧化氢成像的应用；优选的为在HK-2细胞中过氧化氢成像的应用。
本发明的有益效果为：
（1）本发明制备得到的近红外荧光探针对过氧化氢选择性和灵敏度高，具有抵抗其他物质干扰的能力，能够满足生物学检验；
（2）本发明提供的荧光探针具有近红外荧光（NIR）发射能力，可以穿透更深的组织并有效抵消自身背景荧光的干扰，荧光稳定性好，且能够获得更加准确及稳定的成像效果，具有广阔的应用前景；
（3）本发明提供的合成方法简单，易操作。
附图说明
图1为探针DHX-1与不同浓度的过氧化氢孵育后的荧光光谱；
图2为探针DHX-1与过氧化氢、其他活性氧和活性离子、部分金属离子，氨基酸孵育后的荧光光谱；
图3为探针DHX-1和 过氧化氢在不同 pH条件下的荧光光谱；
图4为探针DHX-1对 过氧化氢不同时间点的荧光光谱；
图5为探针DHX-1与不同浓度的尿酸孵育的HK-2细胞的荧光成像图；
图6为探针DHX-1与不同浓度的尿酸孵育的HK-2细胞的荧光强度图；其中，A为尿酸浓度0μM、B为尿酸浓度300μM、C为尿酸浓度500μM、D为尿酸浓度700 μM。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
（1）4-（二乙氨基）水杨醛（0.374 g, 1.2mmol）在浓硫酸（5 mL）中浓缩并且冷却至0℃，在剧烈搅拌下加入6-羟基-1-四氢萘酮（0.392g，1.0 mmol），得到混合物，然后混合物在N2保护下升温至90℃搅拌反应6 h；反应结束后将反应液冷却至25℃，然后倒在冰水上，冰浴条件下用二氯甲烷萃取15mL×3次，合并有机相，通过硅胶柱分离（洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=3/1），得到深紫色固体，即为DHX-OH，收率为84.8%；
DHX-OH的核磁表征如下：
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ9.29 (s, 1H), 7.52(s, 1H), 7.16 (d,J= 9.6 Hz,1H), 6.77-6.71 (d,J= 5.1 Hz, 2H), 6.61-6.60 (t,J= 8.2 Hz, 2H), 3.40 (d,J=10.4 Hz, 2H), 3.34 (d,J= 13.4 Hz, 2H), 3.11 (d,J= 14.2 Hz, 1H), 2.84 (t,J=4.8 Hz, 1H), 1.25 (t,J= 9.7 Hz, 3H), 1.18 (t,J= 4.6 Hz, 3H).13C NMR (100 Hz,CDCl3)δ162.52, 156.99, 154.75, 149.28, 144.07, 132.99, 130.74, 127.33,124.77, 122.69, 117.54, 116.60, 113.80,112.12, 55.10, 51.23, 40.93, 28.49,11.69, 10.59。
（2）4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯（0.328g，1.1mmol）、DHX-OH（0.323g， 1.0mmol）和K2CO3（0.065g，0.5mmol）加入到单口烧瓶中，然后加入20mL的DMF做溶剂，30℃反应5h，TLC追踪反应进程 (二氯甲烷/甲醇=5/1)；反应结束后向反应液中加入去离子水(10mL)，然后用乙酸乙酯萃取15mL×3次，合并有机相，通过硅胶柱分离（洗脱剂：二氯甲烷/甲醇=10/1），得到棕黄色固体，即为DHX-1，收率为77.8%；
DHX-1的核磁表征如下：
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.81 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.52 (d,J= 11.5Hz, 1H), 7.31 (t,J= 8.4 Hz, 1H), 7.29 (s, 1H), 7.18 (d,J= 3.5 Hz, 1H), 6.96(s, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.77 (t,J= 13.3 Hz, 1H), 6.66 (d,J= 6.7 Hz, 1H), 5.25(d,J= 10.4 Hz, 1H), 3.42 (t,J= 9.3 Hz, 2H), 3.36 (t,J= 8.1 Hz, 2H), 3.05 (m,1H), 2.84 (d,J= 2.9 Hz, 1H), 1.27 (t,J= 4.4 Hz, 4H), 1.18-1.16 (m, 12H).13CNMR (100 MHz, CDCl3)δ169.79, 161.66, 169.16, 159.12, 148.65, 141.94, 136.37,135.26, 133.39, 130.33, 129.35, 127.21, 123.86,120.28, 115.35, 114.49,114.21, 93.30, 89.09, 72.12, 70.07, 45.97, 44.83, 33.47, 20.67, 19.76, 19.74,19.69, 12.63, 12.58。
效果实施例
（一）探针DHX-1荧光性质的检测
所有荧光光谱都在λex = 461 nm下收集溶液在500 nm~800 nm 的荧光发射。激发和发射狭缝宽度 2 nm/2 nm。将探针DHX-1与不同浓度的过氧化氢（0-200 μM）在37 ℃下孵育40 min，然后在荧光光谱仪上记录它们的荧光光谱（图1）。
如图1所示，DHX-1与不同浓度的过氧化氢进行反应，随着过氧化氢的浓度逐渐增加，探针在792nm处的荧光发射强度逐渐增强，说明探针与过氧化氢发生了反应生成了DHX-OH，并且荧光发射强度随着DHX-OH浓度的增加而增强。
在探针DHX-1对过氧化氢的选择性研究中，将DHX-1（20 μM）与过氧化氢（50 μM）、活性氧和活性离子（50 μM，包括HSO3 -、ClO-、·OH、O2 -）、金属阳离子和阴离子（1 mM，包括Cu2 +、Na+、K+、Fe2+、Mg2+和Cl-），氨基酸（1 mM，包括半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽）在DMSO-PBS（1:9 v/v，10 mM，pH=7.4）中37 ℃孵育40 min，然后记录它们的荧光光谱（图2）。
如图2所示，在同样条件下，与空白组（1）的荧光强度相比，探针DHX-1 加入其它检测物（2-14）时，荧光强度基本无变化，但是加入过氧化氢（15）的时候，荧光强度急剧增加，说明探针通过荧光强度增强的方式特异性单一的选择识别过氧化氢，也就是说，探针DHX-1对识别过氧化氢具有非常好的选择性。
在探针DHX-1的pH响应研究中，DHX-1（20 μM）和 过氧化氢（50 μM）在不同 pH（3、4、5、6、7、8、9、10）的 DMSO-PBS（1：9 v/v, 10 mM）中 37 ℃孵育40 min，记录其荧光光谱（图3）。
如图3所示，当加入过氧化氢的时候，在溶液pH≤6时，探针DHX-1的荧光强度增强很少，但是当溶液pH在7-9范围时，探针DHX-1的荧光强度急剧增加。这说明探针DHX-1适用于中性或弱碱性测试环境，可以适用于体内生理环境中检测过氧化氢。
在探针DHX-1 对 过氧化氢的时间响应研究中，分别记录DHX-1（20 μM）与 过氧化氢（50 μM）孵育的不同时间点（0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 h）的荧光光谱（图4）。
如图4所示，当加入过氧化氢的时候，在3小时内，探针DHX-1的荧光强度达到最大，探针DHX-1的最大荧光强度稳定存在2小时，这说明探针DHX-1可以适用在体内生理环境中稳定存在。
（二）探针DHX-1在尿酸诱导的HK-2细胞模型中的成像
将HK-2细胞与不同浓度的尿酸（0、300、500 和 700 μM）一起孵育24 h，然后与DHX-1（10 μM）一起孵育2 h, 然后再荧光显微镜下进行拍照，记录探针的荧光成像（图5）及显示的荧光强度（图6）。
如图5和图6所示：HK-2细胞中加入不同浓度的尿酸（0、300、500 和 700 μM）和探针DHX-1（10 μM）孵育，在荧光共聚焦显微镜下成像显示出不同的红色荧光强度，并且随着尿酸浓度的增加，荧光强度也逐渐的增加，说明尿酸可以引起HK-2细胞中过氧化氢浓度的增加，从而引发细胞的氧化应激反应，造成细胞损伤。
Claims (1)
1.一种近红外荧光探针非疾病诊断和治疗目的的在HK-2细胞中过氧化氢成像的应用，其特征在于，所述近红外荧光探针的结构式为：
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