CN109897627A

CN109897627A - 一种快速检测onoo-的近红外荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109897627A
Application number: CN201910214093.0A
Authority: CN
Inventors: 李明璐; 宋胜梅; 梁帆; 李甘; 董川; 双少敏
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2019-06-18

Abstract

本发明提供一种快速检测过氧亚硝酸根离子(ONOO^‑)的近红外荧光探针及其制备方法和应用。制备步骤：(1)称取一定质量的6‑羟基‑1‑四氢萘酮和4‑(二乙氨基)水杨醛溶解在冰醋酸和浓硫酸的混合溶液中，超声混匀，然后在室温下过夜搅拌，反应完毕后，将产物快速加入到乙酸乙酯中，红色沉淀逐渐被析出，过滤并用乙醚洗涤3次，之后真空干燥得到固体；(2)将得到的固体、碳酸钾和4‑溴甲基苯硼酸频哪酯加入到DMF溶液中，在60‑80℃下反应5小时，反应完毕后，将混合溶液加入到冰水中，并用氯仿萃取，随后用旋转蒸发仪旋干，柱层析分离纯化后即得到目标产物。所得到的探针在水溶液中具有良好的溶解度和分散性，并且可以用来快速检测ONOO^‑和细胞成像。

Description

一种快速检测ONOO-的近红外荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及过氧亚硝酸根离子(ONOO^-)的制备方法和应用，具体属于一种快速检测ONOO^-的制备方法和应用。

背景技术

ONOO^-是一种高活性的氧化剂和高效硝化剂，是通过NO和O₂ ^·-反应生成的。ONOO^-及其次级产物HO.,CO3^·-和NO₂ ^-可以和蛋白质、脂类和核酸等多种生物分子发生反应，导致线粒体功能障碍和细胞凋亡。有人合成了一种可以迅速检测ONOO^-的荧光探针(CN106905235A)，但其发射波长相对较短，不能很好地避免生物基质的背景干扰，大大限制了其在生物医学的应用。所以，合成一种操作简单、选择性好、灵敏度高、检测速度快且近红外的荧光探针是极其迫切的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速检测ONOO^-的近红外荧光探针及其制备方法，所述探针不仅制备简单且易操作，而且能够避免多种离子的干扰。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种快速检测ONOO^-的近红外荧光探针，其结构式为：

一种快速检测ONOO^-的近红外荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取一定质量的6-羟基-1-四氢萘酮和4-(二乙氨基)水杨醛溶解在一定比例的冰醋酸和浓硫酸的混合溶液中，超声得到均匀混合溶液，然后在室温下过夜搅拌；反应完毕后，将产物快速加入到乙酸乙酯中，待红色沉淀逐渐全部被析出，然后过滤并用乙醚洗涤3次，将固体真空干燥得到产物；

(2)将上述得到的产物、碳酸钾和4-溴甲基苯硼酸频哪酯加入到DMF溶液中，在60-80℃下反应5小时，反应完毕后，将混合溶液加入到冰水中，并用氯仿萃取，随后用旋转蒸发仪旋干，得到固体，经柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚，即得到纯净的目标产物。

步骤(1)中所述的6-羟基-1-四氢萘酮和4-(二乙氨基)水杨醛的摩尔比优选为0.5-1.5:1，更优选1:1。

步骤(1)中所述的冰醋酸和浓硫酸的体积比为4:1。

步骤(2)中所述的得到的产物、碳酸钾和4-溴甲基苯硼酸频哪酯的摩尔比优选为1-2:2:1，更优选1:2:1。

步骤(2)中所述的反应温度为60℃。

步骤(2)中所述的洗脱剂乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:10。

一种荧光光谱测定ONOO^-的方法，其特征在于，包括如下步骤：

用DMSO配置1mM的如上所述的近红外荧光探针的储备液，用二次水配置pH＝7.4、浓度为0.02M的磷酸缓冲溶液；

ONOO^-溶液的配置：将5mL浓度0.6M的亚硝酸钠溶液加入到5mL浓度0.6M的过氧化氢溶液中，用磁力搅拌器高速搅拌混合，然后迅速加入0.6g氢氧化钠，反应2min后，加入0.1g的二氧化锰除去未反应完全的过氧化氢，冷冻保存；通过0.1M的氢氧化钠溶液作为参比，测得ONOO^-溶液的浓度为0.2mM；

取2μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH＝7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2mL，在荧光光度计上检测，随着ONOO^-溶液的增加，在荧光光度计上测定625nm处的荧光强度逐渐增强，体系在625nm的荧光强度和ONOO^-浓度在0-8×10^-6M的范围内呈现良好的线性关系，以[ONOO^-]为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，得到[ONOO^-]与荧光强度的线性方程F＝98.26+72.15ONOO^-(R²＝0.9967)。

与现有技术相比，本发明的检测具有以下优点：

(1)溶解性好：本探针在水溶液中具有良好的溶解性和分散性；

(2)经济环保：本探针所需试剂便宜易得，无污染物产生；

(3)特异性高：可以高选择性地检测ONOO^-，并不受其它离子的干扰；

(4)本探针可以快速检测ONOO^-，而且是一种近红外荧光探针。

附图说明

图1为本发明荧光探针检测ONOO^-的荧光光谱图；

图2为本发明荧光探针通过荧光光谱法测定ONOO^-的线性关系图；

图3为本发明共存阳离子对ONOO^-测定干扰性的荧光光谱图；

图4为本发明共存阴离子对ONOO^-测定干扰性的荧光光谱图；

图5为本发明荧光探针与ONOO^-的时间响应图；

图6为本发明荧光探针在SMMCS-7721细胞中对ONOO^-的成像能力图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做出进一步详细说明，具体实施例并不限制本发明保护的范围。

实施例1荧光探针的合成和表征

(1)称取0.32g 6-羟基-1-四氢萘酮和0.4g 4-(二乙氨基)水杨醛溶解在体积比为4:1的冰醋酸和浓硫酸的混合溶液中，超声得到均匀混合溶液，然后在室温下过夜搅拌。反应完毕后，将产物快速加入到乙酸乙酯中，待红色沉淀逐渐全部被析出，然后过滤并用乙醚洗涤3次，将得到的固体真空干燥得到产物；¹H NMR(600MHz,DMSO)δ8.63(s,1H),8.16(d,J＝8.7Hz,1H),7.93(t,J＝14.5Hz,1H),7.41(dd,J＝9.3,2.4Hz,1H),7.26(t,J＝10.0Hz,1H),6.95(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),6.87(d,J＝2.3Hz,1H),3.74–3.63(m,4H),3.08–2.96(m,4H),1.24(t,J＝7.1Hz,6H).¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ164.76,164.32,158.25,155.24,148.39,146.22,132.06,129.43,120.71,117.67,116.18,96.14,45.71,26.99,25.11,12.88.ESI-MS:320.16420(M⁺),cald for C₂₁H₂₂NO₂ ⁺320.16451.

(2)将上述得到的产物称取0.14g、碳酸钾0.12g和4-溴甲基苯硼酸频哪酯0.13g加入到DMF溶液中60℃反应5小时，反应完毕后将混合溶液加入到300mL冰水中，并加入300mL氯仿萃取，通过分液漏斗分离出有机相，然后真空干燥，得到固体，经柱层析分离(洗脱剂为体积比1:10的乙酸乙酯和石油醚)，即得到纯净的产物。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.19(d,J＝9.0Hz,1H),7.97(t,J＝7.4Hz,1H),7.88(d,J＝8.1Hz,1H),7.71(d,J＝7.1Hz,1H),7.60(d,J＝12.4Hz,1H),7.43(t,J＝7.6Hz,1H),7.28(d,J＝7.2Hz,1H),6.43(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),6.33(d,J＝1.7Hz,1H),5.75(s,1H),5.45(d,J＝11.7Hz,1H),4.11(d,J＝34.2Hz,1H),3.44–3.34(m,5H),3.32(s,3H),3.16(s,1H),1.27(d,J＝16.4Hz,13H),1.13–0.97(m,5H).¹³C NMR(151MHz,CDCl₃)δ168.20,162.65,157.16,155.81,145.31,139.94,139.84,131.54,131.09,130.99,130.72,128.81,126.63,126.51,126.43,114.21,110.03,100.57,88.92,74.86,60.14,53.82,49.14,29.90,17.71.ESI-MS:536.2969(M⁺),cald forC₃₄H₃₉BNO₄ ⁺536.2967.

实施例2荧光探针通过荧光光谱法检测ONOO^-

取2μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH＝7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2mL，在荧光光度计上检测，随着ONOO^-溶液浓度的增加，在荧光光度计上测定625nm处的荧光强度逐渐增强见图1。

实施例3荧光探针通过荧光光谱法测定ONOO^-的线性关系

取2μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH＝7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2mL，在荧光光度计上检测，逐渐加入ONOO^-溶液的体积为0、1、2、3、4、5、6、7、8，在荧光光度计上测定625nm处的荧光强度逐渐增强，而且体系在625nm的荧光强度和ONOO^-溶液浓度在0-8×10^-6M的范围内呈现良好的线性关系，以[ONOO^-]为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，得到[ONOO^-]与荧光强度的线性方程F＝98.26+72.15ONOO^-(R²＝0.9967)，见图2。

实施例4共存离子对ONOO^-的荧光光谱干扰性的测定

取2μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH＝7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2mL，再分别加入8uM的ONOO^-以及100uM的其它各种阴离子和阳离子，在荧光光度计上检测，阳离子和阴离子的干扰性实验分别见图3和图4。实验证明，其它常见离子不干扰体系对ONOO^-的测定。

实施例5探针与ONOO^-的时间响应研究

取2μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH＝7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2mL，再分别加入8uM的ONOO^-，在荧光光度计上检测，结果见图5。实验证明，响应时间为4.2秒，探针可以较快地检测ONOO^-。

实施例6探针在SMMCS-7721细胞中对ONOO^-的成像能力图将探针在SMMCS-7721细胞中培养10分钟，在激光共聚焦下显示较弱的红色荧光(见图6a)，加入ONOO^-供体SIN-1处理，红色荧光明显增强(见图6b)，加入ONOO^-清除剂ebselen红色荧光减弱(见图6c)。实验证明，探针可以在细胞中检测ONOO^-。

Claims

1.一种快速检测ONOO^-的近红外荧光探针，其特征在于结构式为：

2.如权利要求1所述的一种快速检测ONOO^-的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的一种快速检测ONOO^-的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的6-羟基-1-四氢萘酮和4-(二乙氨基)水杨醛的摩尔比为0.5-1.5:1。

4.如权利要求2所述的一种快速检测ONOO^-的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的冰醋酸和浓硫酸的体积比为4:1。

5.如权利要求2所述的一种快速检测ONOO^-的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的得到的产物、碳酸钾和4-溴甲基苯硼酸频哪酯的摩尔比为1-2:2:1。

6.如权利要求2所述的一种快速检测ONOO^-的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的反应温度为60℃。

7.如权利要求2所述的一种快速检测ONOO^-的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的洗脱剂乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:10。

8.一种荧光光谱测定ONOO^-的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用DMSO配置1mM的如权利要求1所述的荧光探针的储备液，用二次水配置pH＝7.4、浓度为0.02M的磷酸缓冲溶液；

(2)ONOO^-溶液的配置：将5mL浓度0.6M的亚硝酸钠溶液加入到5mL浓度0.6M的过氧化氢溶液中，用磁力搅拌器高速搅拌混合，然后迅速加入0.6g氢氧化钠，反应2min后，加入0.1g的二氧化锰除去未反应完全的过氧化氢，冷冻保存；通过0.1M的氢氧化钠溶液作为参比，测得ONOO^-溶液的浓度为0.2mM；

(3)取2μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH＝7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2mL，在荧光光度计上检测，随着ONOO^-溶液的增加，在荧光光度计上测定625nm处的荧光强度逐渐增强，体系在625nm的荧光强度和ONOO^-浓度在0-8×10^-6M的范围内呈现良好的线性关系，以ONOO^-浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，得到ONOO^-浓度与荧光强度的线性方程F＝98.26+72.15ONOO^-(R²＝0.9967)。