CN111393462A - 一种基于双机理的用于检测onoo-的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种基于双机理的用于检测ONOO‑的荧光探针及其制备方法和应用，属于荧光探针检测技术领域，目的在于提供一种基于双机理测定ONOO‑的荧光探针及其制备方法和应用。称取2‑氨基苯硫醇和4‑（二乙胺基）水杨醛溶解在10mL无水乙醇溶液中，然后加入浓盐酸和过氧化氢溶液。在室温下搅拌，加入10mL二次水进行淬灭，过滤得到粗产物，然后将粗产物在乙醇溶液中重结晶，得到黄色固体；将得到的固体、碳酸钾和4‑溴甲基苯硼酸频哪酯加入到DMF溶液中，反应5小时后，用旋转蒸发仪旋干，柱层析分离纯化后即得到目标产物。所得到的探针在水溶液中具有良好的溶解度和分散性，并且可以用来检测ONOO‑和内源性细胞成像。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针检测技术领域，具体涉及一种基于双机理的用于检测ONOO-的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
ONOO-是生物体内重要的活性氧分子，是由超氧阴离子(O2 ·-)和一氧化氮(NO)通过自由基反应生成的产物。ONOO-作为较强的氧化剂和亲核试剂，参与了生物体内广泛的生理和病理活动过程，过量的ONOO-将导致各种疾病的产生，如癌症，阿尔兹海默症和炎症等。因此，发展更多的荧光探针检测ONOO-是极其重要的。但是目前的荧光探针大多是基于单机理测定，很少是通过双机理测定ONOO-。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于双机理测定ONOO-的荧光探针及其制备方法和应用，本发明的制备方法简单，通过该方法制备的荧光探针能够避免多种离子的干扰。
本发明采用如下技术方案：
一种基于双机理的用于检测ONOO-的荧光探针，其结构式如下：
一种基于双机理的用于检测ONOO-的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
第一步，分别称取2-氨基苯硫醇和4-（二乙胺基）水杨醛，溶解在10mL无水乙醇溶液中，然后加入浓盐酸和过氧化氢溶液，在室温下搅拌1-2h后，加入10mL二次水进行淬灭，过滤得到粗产物，然后将粗产物在乙醇溶液中重结晶，得到黄色固体；
第二步，将第一步得到的黄色固体、碳酸钾和4-溴甲基苯硼酸频哪酯加入到DMF溶液中，60-80℃条件下反应5h，反应完毕后，旋转蒸发仪旋干，柱层析分离纯化后得到目标产物。
第一步中所述2-氨基苯硫醇和4-（二乙胺基）水杨醛的摩尔比为1-1.5:1，优选1.3:1，浓盐酸和过氧化氢溶液的体积比为1:2.5。第一步中所述搅拌时间优选90min。
第二步中所述黄色固体、碳酸钾和4-溴甲基苯硼酸频哪酯的摩尔比为0.5-1:2:1，优选0.8:2:1，所述反应温度优选60℃，柱层析用的洗脱剂体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇。
一种荧光探针应用于ONOO-的检测，包括如下步骤：
第一步，用DMSO配制1 mM的荧光探针的储备液，用二次水配置pH=7.4、浓度为0.02 M的磷酸缓冲溶液；
第二步，ONOO-溶液的配置：将5 mL浓度0.6 M的亚硝酸钠溶液加入到5 mL浓度0.6 M的过氧化氢溶液中，用磁力搅拌器高速搅拌混合，然后迅速加入0.6 g氢氧化钠，反应2 min后，加入0.1 g的二氧化锰除去未反应完全的过氧化氢，冷冻保存；通过0.1 M的氢氧化钠溶液作为参比，测得ONOO-溶液的浓度为0.2 mM；
第三步，取20 μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH=7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2 mL，在荧光光度计上检测，随着ONOO-溶液的增加，在荧光光度计上测定436 nm处的荧光强度逐渐增强，体系在436 nm的荧光强度和ONOO-浓度在0.2-7.68 µM的范围内呈现良好的线性关系，以ONOO-浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，得到ONOO-浓度与荧光强度的线性方程F=21.96+36.74 [ONOO-]，R2=0.9952。
本发明的有益效果如下
1. 本发明首次提出通过分子内电荷转移（ICT）和激发态分子内质子转移（ESIPT）双机理来测定ONOO-，双机理的研究设计旨在激发研究者探索更多的研究机理，增加检测方法的多样性。本发明制备的荧光探针能够避免多种离子的干扰。
2. 本发明制备的荧光探针具有良好的溶解性和分散性。
3. 本发明制备的荧光探针经济环保，所用试剂便宜易得，无污染物产生。
4. 本发明制备的荧光探针可以在RAW 264.7 细胞中检测内源性的ONOO-。
附图说明
图1为本发明制备的荧光探针检测ONOO-的荧光光谱图。
图2为本发明制备的荧光探针通过荧光光谱法测定ONOO-的线性关系图。
图3为本发明测定共存离子对ONOO-的干扰性图。
图4为本发明荧光探针与ONOO-的时间响应图。
图5为本发明荧光探针与ONOO-的光稳定性图。
图6为本发明pH3-7对反应体系的影响图。
图7为本发明pH8-12对反应体系的影响图。
图8为本发明的荧光探针在RAW 264.7细胞中对ONOO-的成像能力图，其中，a-d为荧光探针在RAW 264.7细胞中对ONOO-的成像能力，e-h为加入ONOO-内源性供体脂质体LPS和干扰素IFN-γ处理之后的成像能力图，i-l为加入ONOO-内源性供体脂质体LPS、干扰素IFN-γ和ONOO-清除剂ebselen之后的成像能力图。
具体实施方式
实施例1 荧光探针的合成和表征
称取0.52 g 2-氨基苯硫醇和0.6 g 4-（二乙胺基）水杨醛溶解在10mL无水乙醇溶液中，然后加入0.79 mL浓盐酸和1.93 mL过氧化氢溶液。在室温下搅拌90分钟之后，加入10mL水进行淬灭，过滤得到粗产物，然后将粗产物在乙醇溶液中重结晶，得到黄色固体；FT-IR(/cm-1): (O-H): 3438; (C-H): 2973; (C=N): 1632; (C=C): 1560, 1469, 1429. 1HNMR (600 MHz, DMSO) δ 11.73 (s, 1H), 8.03 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.90 (d, J =7.9 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 6.38 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 6.21 (s, 1H), 3.46–3.36 (m, 4H), 1.13 (s, 6H). 13C NMR (151MHz, DMSO) δ 167.89, 159.04, 152.16, 151.45, 132.82, 130.34, 126.83, 124.61,122.23, 121.24, 106.09, 104.98, 97.59, 44.38, 13.02. HRMS (ESI): Calcd forC17H18N2OS[M+H]+299.1218, found 299.12155。
（2）将得到的0.11 g黄色固体、0.12 g碳酸钾和0.127 g 4-溴甲基苯硼酸频哪酯加入到DMF溶液中，在60℃下反应5小时，反应完毕后，用旋转蒸发仪旋干，柱层析（洗脱剂二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1）分离纯化后即得到目标产物。FT-IR (/cm-1): (C-H):2974; (C=N): 1608; (C=C): 1554, 1521, 1461. 1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 8.66 (s,1H), 8.22 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 9.0 Hz,1H), 7.49 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.27 – 7.20 (m, 1H), 5.75 (s,2H), 5.29 (s, 1H), 3.69 (s, 2H), 3.32 (s, 2H), 3.18 (d, J = 28.5 Hz, 1H),3.04 (s, 1H), 1.27 (d, J = 22.6 Hz, 13H), 1.06 (s, 5H). 13C NMR (151 MHz,DMSO) δ 168.82, 168.26, 163.26, 160.33, 150.36, 144.73, 139.96, 139.82,132.31, 132.19, 125.66, 124.49, 123.09, 88.96, 78.73, 74.90, 60.15, 50.57,29.90, 17.66. HRMS (ESI): Calcd for C17H18N2OS[M+H]+515.2540, found 515.25382。
实施例2 荧光探针通过荧光光谱法检测ONOO-
取20 μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH=7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2 mL，在荧光光度计上检测，随着ONOO-溶液浓度的增加，在荧光光度计上测定436 nm处的荧光强度逐渐增强见图1。
实施例3荧光探针通过荧光光谱法测定ONOO-的线性关系
取20 μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH=7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2 mL，在荧光光度计上检测，逐渐加入不同浓度的ONOO-，在荧光光度计上测定436 nm处的荧光强度逐渐增强，而且体系在436 nm的荧光强度和ONOO-溶液浓度在0.2-7.68 µM的范围内呈现良好的线性关系，以[ONOO-]为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，得到[ONOO-]与荧光强度的线性方程F=21.96+36.74 [ONOO-], R2=0.9952，见图2。
实施例4测定共存离子对ONOO-的干扰性
取20 μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH=7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2 mL，再分别加入10 uM的ONOO-以及100 uM的其它各种离子，在荧光光度计上检测，离子的干扰性实验分别见图3。实验证明，其它常见离子不干扰体系对ONOO-的测定。
实施例5探针与ONOO-的时间响应研究
取20 μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH=7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2 mL，然后加入10 uM的ONOO-，在荧光光度计上检测，结果见图4。实验证明，响应时间约为20秒，探针可以较快地检测ONOO-。
实施例6探针与ONOO-的光稳定性研究
取20 μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH=7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2 mL，然后加入10 uM的ONOO-，在荧光光度计上检测，结果见图5。实验证明，荧光强度没有发生明显的改变，说明探针与ONOO-体系是相对稳定的。
实施例7 pH对反应体系的影响
取20 μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH分别为2，3，4，5，6，7.4，8，9，10，11的磷酸缓冲溶液稀释至2 mL，在荧光光度计上检测各个pH下的荧光强度。接着分别加入10uM的ONOO-，在荧光光度计上检测荧光强度的变化，结果见图6和图7。实验证明，探针本身荧光强度在不同pH下没有发生明显的改变，但是加入ONOO-之后，在pH为3.0-7.0范围内荧光强度逐渐增强，在pH为8.0-12.0范围内荧光强度逐渐下降，说明探针适合在生理条件下检测ONOO-。
实施例8探针在RAW 264.7细胞中对ONOO-的成像能力图
将探针在RAW 264.7细胞中培养10分钟，在激光共聚焦下显示较弱的黄色荧光（见图8a-d），加入ONOO-内源性供体脂质体LPS和干扰素IFN-γ处理之后，蓝色荧光明显增强，黄色荧光没有发生明显的变化（见图8e-h），再加入ONOO-清除剂ebselen之后，蓝色荧光减弱（见图8i-l）。实验证明，探针可以在RAW 264.7细胞中检测内源性的ONOO-。
Claims (5)
1.一种基于双机理的用于检测ONOO-的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的结构式如下：
2.一种如权利要求1所述的基于双机理的用于检测ONOO-的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
第一步，分别称取2-氨基苯硫醇和4-（二乙胺基）水杨醛，溶解在10mL无水乙醇溶液中，然后加入浓盐酸和过氧化氢溶液，在室温下搅拌1-2h后，加入10mL二次水进行淬灭，过滤得到粗产物，然后将粗产物在乙醇溶液中重结晶，得到黄色固体；
第二步，将第一步得到的黄色固体、碳酸钾和4-溴甲基苯硼酸频哪酯加入到DMF溶液中，60-80℃条件下反应5h，反应完毕后，旋转蒸发仪旋干，柱层析分离纯化后得到目标产物。
3.根据权利要求2所述的一种基于双机理的用于检测ONOO-的荧光探针的制备方法，其特征在于：第一步中所述2-氨基苯硫醇和4-（二乙胺基）水杨醛的摩尔比为1-1.5:1，浓盐酸和过氧化氢溶液的体积比为1:2.5。
4.根据权利要求2所述的一种基于双机理的用于检测ONOO-的荧光探针的制备方法，其特征在于：第二步中所述黄色固体、碳酸钾和4-溴甲基苯硼酸频哪酯的摩尔比为0.5-1:2:1，柱层析用的洗脱剂体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇。
5.一种如权利要求1所述的荧光探针应用于ONOO-的检测，其特征在于：包括如下步骤：
第一步，用DMSO配制1 mM的荧光探针的储备液，用二次水配置pH=7.4、浓度为0.02 M的磷酸缓冲溶液；
第二步，ONOO-溶液的配置：将5 mL浓度0.6 M的亚硝酸钠溶液加入到5 mL浓度0.6 M的过氧化氢溶液中，用磁力搅拌器高速搅拌混合，然后迅速加入0.6 g氢氧化钠，反应2 min后，加入0.1 g的二氧化锰除去未反应完全的过氧化氢，冷冻保存；通过0.1 M的氢氧化钠溶液作为参比，测得ONOO-溶液的浓度为0.2 mM；
第三步，取20 μL荧光探针的储存液于干净的比色管中，用pH=7.4的磷酸缓冲溶液稀释至2 mL，在荧光光度计上检测，随着ONOO-溶液的增加，在荧光光度计上测定436 nm处的荧光强度逐渐增强，体系在436 nm的荧光强度和ONOO-浓度在0.2-7.68 µM的范围内呈现良好的线性关系，以ONOO-浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，得到ONOO-浓度与荧光强度的线性方程F=21.96+36.74 [ONOO-]，R2=0.9952。
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