CN112358475A - 一种苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种苯并吡喃鎓‑吩噻嗪衍生物及其制备方法和应用。本发明提供的用于实时定量检测HClO的苯并吡喃鎓‑吩噻嗪衍生物，合成简便、原料廉价易得、水溶性好，且对HClO的检测表现出灵敏度高、选择性好和瞬时响应的优势，能够实现在水相体系和活细胞中实时定量检测次氯酸，并首次实现了活细胞和斑马鱼体内铁死亡过程中HClO的检测和定量，具有临床应用价值。

Description

一种苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学合成领域和生物传感技术领域，具体涉及一种苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物及其制备方法和应用；本发明还涉及苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物在水相体系中检测次氯酸的应用；本发明另外还涉及苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物在检测活细胞以及铁死亡过程中次氯酸的应用。
背景技术
次氯酸（HClO）在体内主要是通过免疫细胞发生炎症反应时分泌的髓过氧化物酶（MPO）催化氯离子的过氧化反应产生，也可在外源性刺激物（如脂多糖和佛波酯）诱导下产生。HClO作为胞内重要的活性氧，它在抵御病原体和细菌的入侵、激活转录因子和维持胞内的氧化还原稳态等方面发挥着重要作用，一旦HClO过量产生时，将引发机体的氧化损伤，并导致动脉粥样硬化、关节炎、类风湿性关节炎、心血管疾病和癌症等疾病的发生。因此，发展高效的检测工具实现HClO的实时和定量检测对探究炎症等疾病的变化及其病理过程具有重要意义。
铁死亡是一种铁离子依赖型的细胞死亡，是区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式，它在细胞代谢、氧化还原状态以及退行性疾病、癌症等方面发挥着重要作用（Nature 2019, 575, 688–692; Nature 2019, 575, 693–698; Mol.Cell 2019, 73, 354-363; Cell Death Dis., 2020, 11, 1-13）。因此，监测铁死亡过程中次氯酸水平的变化对癌预防和治疗意义重大，但目前为止还没有研究报道关于监测铁死亡过程中次氯酸水平的变化。
考虑到荧光探针具有高灵敏度和选择性、易操作性、无创性以及对活细胞、组织和小动物的生物兼容性等优势，它已经成为目前最具吸引力的分子成像技术之一。近年来，已经发展了很多用于检测细胞内HClO水平变化的荧光探针（Chem 2020, 6,832–866; Chem.Rev. 2019, 119, 10403-10519; Chem. Soc. Rev. 2016,45, 2976-3016），但它们存在对HClO的响应时间较长、检测限高、水溶性差等缺陷，而且它们都无法实现铁死亡过程中对HClO的实时定量检测。因此，发展可在纯水相体系中实时并定量检测HClO的荧光探针，实现癌细胞内、炎症模型和铁死亡过程中次氯酸的检测和定量意义重大。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物及其制备方法；
本发明的另一个目的是提供该苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物在水相体系中检测次氯酸的应用；
本发明的还有一个目的是提供该苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物在检测活细胞中次氯酸的应用；
本发明的更一个目的是提供该苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物在检测铁死亡过程中次氯酸的应用。
一、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物及其制备
本发明提供的一种苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物，中文名为2-(1-丁基-2-甲氧基-吩噻嗪-3-基)-7-(二乙氨基)苯并吡喃高氯酸盐，英文名为2-(10-butyl-2-methoxy-10H-phenothiazin-3-yl)-7-(diethylamino)chromenylium perchlorate，命名为PTC，结构式如下：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明提供的次氯酸苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）氩气氛围下，将2-甲氧基吩噻嗪、溴丁烷、氢氧化钠溶于二甲基亚砜中，加入碘化钾，于90~100℃下加热反应4~6h，反应结束后将其冷却至室温，加水淬灭，用二氯甲烷萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋干并柱层析分离提纯得10-正丁基-2-甲氧基吩噻嗪。其中，2-甲氧基吩噻嗪、溴丁烷和氢氧化钠的摩尔比为1:1.5:1.5~1:2.5:2.5；碘化钾的加入量为2-甲氧基吩噻嗪摩尔量的1~2%；柱层析分离是以石油醚为洗脱剂过硅胶柱。
（2）冰浴条件下，将10-正丁基-2-甲氧基吩噻嗪和醋酸酐混合，在混合体系中加入催化剂磷酸，于45~55℃下反应1.5~2.5h，反应结束后加水淬灭，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋干并柱层析分离提纯得1-(10-正丁基-2-甲氧基-吩噻嗪-3-基)乙酮。其中，10-正丁基-2-甲氧基吩噻嗪与醋酸酐的摩尔比为1:7~1:9；10-正丁基-2-甲氧基吩噻嗪与磷酸的摩尔比为1:2~1:4；柱层析分离是以石油醚:乙酸乙酯 =100:1为洗脱剂过硅胶柱。
（3）将1-(10-正丁基-2-甲氧基-吩噻嗪-3-基)乙酮和N,N-二乙基水杨醛加入浓硫酸中，于85~95℃下反应4~6h，反应结束并冷却至室温后，在冰水浴条件下，加入高氯酸并混合均匀，随后用二氯甲烷萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋干并柱层析分离提纯即得苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物。其中，1-(10-正丁基-2-甲氧基-吩噻嗪-3-基)乙酮与N,N-二乙基水杨醛的摩尔比为1:1.5~1:2.5；1-(10-正丁基-2-甲氧基-吩噻嗪-3-基)乙酮与高氯酸的摩尔比为1:20 ~1:25；柱层析分离是以二氯甲烷:乙醇= 50:1为洗脱剂过硅胶柱。
二、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC在水相体系中对HClO的检测
1、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC对HClO的选择性检测
配置初浓度为3 mM的PTC，初浓度为30 mM的各种活性氧、氨基酸、阴离子和阳离子。向一系列荧光比色皿中依次加入2.98mL PBS（10 mM, pH = 7.4）缓冲液和10 μL PTC，再分别加入10 μL HClO, ONOO-, HO•, H2O2, O2 −•,t-BuOOH, NO, Cys, Hcy, GSH, L-Ser, DL-Met, L-Phe, L-Lys, L-Leu, L-Pro, L-His, S2-,NO3 -, NO2 -, HSO3 -, OAc-, SO4 2-, PO4 3-,K+, Zn2+, Cu2+, Na+，混合均匀后立即测定不同组的荧光光谱变化，得到627nm处荧光强度与不同离子间的柱状图，结果如图4所示，其中1-28号分别代表：HClO, ONOO-, HO•, H2O2,O2 −•,t-BuOOH, NO, Cys, Hcy, GSH, L-Ser, DL-Met, L-Phe, L-Lys, L-Leu, L-Pro, L-His, S2-,NO3 -, NO2 -, HSO3 -, OAc-, SO4 2-, PO4 3-, K+, Zn2+, Cu2+, Na+。由图4可以看出，只有HClO加入可以使PTC在627nm处的荧光信号显著增强，其它各种活性氧、氨基酸、阴离子和阳离子均不会引起PTC荧光信号的明显变化，这说明本发明所提供的PTC能够实现对HClO的选择性检测。
2、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC在对不同浓度次氯酸的响应性
配置初浓度为3 mM的PTC，分别向荧光比色皿中加入2.99 mL PBS（10 mM, pH = 7.4）缓冲液和10 μL PTC（PTC终浓度为10 μM），再将预先配置好的不同浓度的次氯酸依次加入PTC的PBS缓冲体系中（次氯酸的终浓度为0-50 μM），混合均匀后，立即用荧光分光光度计测定波长为550-800 nm范围内荧光光谱变化（λex= 520 nm，λem = 627 nm），得到荧光强度随次氯酸浓度变化关系图，结果如图5A所示，以及627nm处荧光强度随次氯酸浓度变化的散点图，结果如图5B所示。从图5可以看出随着次氯酸浓度的依次增加，627 nm处的荧光强度逐渐增强至最大并保持不变，这说明本发明所提供的PTC能够高效地响应HClO，并表现出很好的浓度依赖性。同时627 nm处的荧光强度与HClO浓度（0-5μM）之间存在很好的线性关系（图5C），其线性回归方程为Y = 592.75x + 30.718，线性相关系数R2 = 0.9953，这说明PTC在HClO浓度为0-5μM范围内能够实现对HClO的定量检测。
3、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC对不同浓度次氯酸的响应时间
配置初浓度为3 mM的PTC，依次加入向荧光比色皿中2.98 mL PBS（10 mM, pH = 7.4）缓冲液、10 μL PTC和10 μL HClO（0μM，10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50 μM），混合均匀后在不同时间梯度下测定其荧光光谱的变化，得到627nm处荧光强度随时间变化的折线图，结果如图6所示。由图6可以看出，PTC与HClO一经混合，则立即反应，且5s后627nm处的荧光强度不再发生变化，说明本发明所提供的PTC能够实现在纯水相体系中对HClO的超灵敏、瞬时响应。
4、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物检测次氯酸的机理分析
Figure DEST_PATH_IMAGE002
苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物由吩噻嗪和苯并吡喃嗡骨架组成，由于光诱导的电子转移过程使得PTC本身没有荧光，当其与HClO反应后，吩噻嗪结构中的硫原子被氧化为亚砜单元，使得光诱导电子转移过程被抑制，并在627 nm处出现强的荧光发射信号，实现了对HClO的超灵敏响应。
三、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC检测细胞内的次氯酸
1、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC实时检测细胞内外源性次氯酸
将处于对数期生长的HeLa细胞接种于六孔板内，于37℃培养箱（含5% CO2）培养过夜后更换新鲜培养基，分别用不同浓度HClO（100 μM，200 μM和300 μM）孵育细胞30 min，再加入苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC（10 μM）孵育细胞30 min，随后弃除培养基，用PBS清洗细胞3次后，用荧光显微镜监测外源性HClO作用下胞内荧光信号的变化，实验结果如图7所示。由图7可以看出PTC单独孵育HeLa后，仅仅表现出微弱的荧光信号（图7A），当外加HClO的浓度依次增大时，红色荧光依次增强（图7B-D），这说明本发明所提供的PTC能够实现对细胞中外源性HClO的荧光成像。
2、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC实时检测细胞内内源性次氯酸
将处于对数期生长的巨噬细胞RAW264.7接种于六孔板中，于37℃培养箱（含5% CO2）培养过夜后更换新鲜培养基，分别进行以下实验：（A）PTC（10μM）孵育细胞30 min；（B）LPS（2μg/mL）孵育RAW264.7细胞2h，PTC（10μM）孵育细胞30min；（C）PMA（2μg/mL）孵育RAW264.7细胞2h，PTC孵育细胞30min；（D）LPS和PMA孵育RAW264.7细胞2h，再用PTC孵育细胞30min。随后弃除培养基，用PBS清洗细胞3次后，用荧光显微镜监测胞内荧光信号的变化，实验结果如图8所示。由图8可以看出，PTC单独孵育RAW264.7后，红色通道表现出弱的荧光信号（图8A），当用LPS和PMA预孵育细胞后红色荧光明显增强（图8B-D），这说明本发明所提供的PTC能够检测内源性HClO水平的变化。
3、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC定量检测细胞内外源性和内源性次氯酸
HeLa和RAW264.7细胞的接种和孵育方式同上，将孵育好的细胞用胰酶消化，收集细胞，用离心机（500g）离心细胞，PBS洗涤3次，用流式细胞仪检测不同处理组细胞内荧光强度的变化，实验结果如图9所示。由图9可以看出，用不同浓度的HClO孵育HeLa细胞后，其荧光强度随HClO浓度的增大依次增强（图9A）；用LPS和PMA孵育RAW264.7后，荧光强度显著增强（图9B）。这说明本发明所提供的PTC能够定量检测细胞内外源性以及内源性HClO。
四、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC对铁死亡过程中细胞和斑马鱼体内HClO的检测
1、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC实时定量检测铁死亡过程中细胞内的HClO
实时检测是将实验分为三组，对照组中只加苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC孵育细胞；实验组中一组加入铁死亡的诱导剂Erastin预孵育细胞，再加入苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC孵育细胞；另一组中首先加入Erastin孵育细胞相应时间后，加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）孵育细胞，再加入苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物孵育细胞；PBS洗涤后，用荧光显微镜检测不同组荧光信号的变化。同样地，定量检测实验中，将用Erastin，Fer-1和PTC孵育好的三组细胞，首先用PBS洗涤，胰酶消化收集细胞，500g转速离心细胞，PBS洗涤，最后用流式细胞仪定量监测不同实验组作用下胞内荧光强度的变化。具体步骤及结论如下：
将HeLa细胞分别接种于六孔板内，分别将其分为3组：（A）PTC（10 μM）单独孵育HeLa细胞30min；（B）首先用铁死亡诱导剂Erastin（10 μM）分别孵育HeLa细胞12 h，再用PTC（10 μM）孵育细胞30min；（C）首先用铁死亡诱导剂Erastin（10 μM）孵育HeLa细胞12 h后，用铁死亡抑制剂Fer-1（5μM）孵育细胞6h，再用PTC（10 μM）孵育细胞30min。将孵育好的细胞用PBS清洗细胞3次，再用荧光显微镜监测不同实验组荧光信号的变化，实验结果如图10所示。将孵育好的细胞用PBS洗涤，胰酶消化后，收集细胞，500 g转速离心细胞，再用流式细胞仪定量不同实验组荧光强度的变化，实验结果如图11所示。由图10和11可以看出，当用PTC处理细胞后，仅仅表现出微弱的荧光信号（10A），当用Erastin预孵育细胞后，红色荧光显著增强（10B和11B），当用Erastin预孵育细胞，再用Fer-1孵育细胞后，其荧光强度相比于10B和11B明显减弱（10C和11C），这说明本发明所提供的PTC能够实时定量检测铁死亡过程中活细胞内HClO水平。
2、苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC检测铁死亡过程中斑马鱼体内的HClO
将脱卵培养5天的斑马鱼分为三组，分别放入六孔板中。（A）PTC（5 μM）孵育斑马鱼30min；（B）Erastin（10 μM）孵育斑马鱼6 h，再用PTC（5 μM）孵育30 min；（C）Erastin（10 μM）孵育斑马鱼6 h后，用Fer-1（5 μM）孵育6 h，再用PTC（5 μM）孵育30 min；然后用培养液清洗斑马鱼3次，麻醉剂将其麻醉后，荧光显微镜下成像，结果如图12所示。由图12可以看出，PTC处理斑马鱼后，表现出微弱的红色荧光（图12A），Erastin处理斑马鱼后，红色荧光明显增强（图12B），Erastin和Fer-1处理斑马鱼后，其红色荧光相比于图12B明显减弱（图12C），这说明本发明所提供的PTC能够检测铁死亡过程中斑马鱼体内的HClO水平的变化，同时也说明本发明所提供的PTC具有临床应用价值。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
本发明提供的苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物，原料廉价易得，合成简便、水溶性好。该苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物对HClO的检测具有灵敏度高、选择性好和瞬时响应的优势，能够实现在活细胞中对次氯酸实时定量检测，并首次实现了活细胞和斑马鱼体内铁死亡过程中HClO的检测和定量，具有临床应用价值。
附图说明
图1是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的1H NMR图谱；
图2是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的13C NMR图谱；
图3是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的高分辨质谱图；
图4是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物对不同物质的选择性柱状图；
图5是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的荧光强度随次氯酸浓度变化关系图；
图6是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的荧光强度随时间变化的折线图；
图7是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物实时检测细胞内外源性HClO的荧光成像；
图8是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物实时检测细胞内内源性HClO的荧光成像；
图9是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物定量检测细胞内外源性和内源性HClO的荧光强度变化；
图10是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物实时检测铁死亡过程中胞内HClO的荧光成像；
图11是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物定量检测铁死亡过程中胞内HClO的荧光强度变化；
图12是苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物检测铁死亡过程中斑马鱼体内HClO的荧光成像。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的合成
（1）10-正丁基-2-甲氧基吩噻嗪的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE003
氩气氛围下，将2-甲氧基吩噻嗪（5 mmol，1.145g）、溴丁烷（10 mmol，1.36 g）、氢氧化钠（10 mmol，0.4 g）和碘化钾（0.072 mmol，12 mg）加入二甲基亚砜（10 mL）中，反应体系于95℃反应6 h后将其冷却至室温，加入100 mL水淬灭反应，随后用二氯甲烷萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂，所得样品经柱层析分离（石油醚为洗脱剂）得无色油状液体10-正丁基-2-甲氧基吩噻嗪（化合物1），产率89%。
（2）1-(10-正丁基-2-甲氧基-吩噻嗪-3-基)乙酮的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE004
冰浴下，将化合物1（5mmol，1.3g）和醋酸酐（40mmol，3.8mL）混合，在混合体系中慢慢滴加磷酸（15mmol，0.8mL），滴加完后将该反应体系置于50℃油浴锅反应2h，反应结束后，将其冷却至室温并加水淬灭，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋干，所得样品经柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯=100:1）得黄色固体1-(10-正丁基-2-甲氧基-吩噻嗪-3-基)乙酮（化合物2），产率76%。
（3）PTC的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE005
将化合物2（1mmol，297mg）和N,N-二乙氨基水杨醛（2mmol，386mg）慢慢加入浓硫酸（10mL）中，将反应体系于90℃反应5h，薄层析色谱监测反应完成后将其冷却至室温，慢慢倒入100mL冰水中，再加入质量浓度为70%的高氯酸（1mL）混合均匀，将得到的混合物用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋干，所得样品经柱层析分离（二氯甲烷：乙醇 =50:1）得深蓝色固体的目标产物PTC，收率81%。
其氢谱谱图如图1：1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.60 (d, J = 8.4 Hz, 1H),8.05 – 8.02 (m, 2H), 7.92 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 9.6, 2.4 Hz,1H), 7.36 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.27 (td, J = 8.4, 1.2 Hz,1H), 7.21 (dd, J =7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.06 (td, J = 7.2, 0.6 Hz, 1H),6.74 (s, 1H), 4.10 – 4.07 (m, 5H), 3.69 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.77 – 1.72 (m,2H), 1.48 – 1.41 (m, 2H), 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 0.92 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
其碳谱谱图如图2：13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 162.41, 160.67, 158.07,154.96, 151.15, 147.50, 141.01, 131.29, 127.41, 126.61, 126.15, 123.54,121.82, 116.81, 116.78, 116.44, 114.51, 111.63, 110.81, 99.27, 95.32, 56.06,46.52, 44.81, 27.67, 18.76, 13.05.
其高分辨质谱谱图如图3：HRMS (ESI) m/z calcd for C30H33N2O2S (M): 485.2257.Found: 485.2259, error: 0.4 ppm.
实施例2 苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC在水相体系中对HClO的检测
向一系列荧光比色皿中依次加入2.98mL PBS（10 mM, pH = 7.4）缓冲液和10 μL苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC（3 mM），再分别加入HClO, ONOO-, HO•, H2O2, O2 −•,t-BuOOH,NO, Cys, Hcy, GSH, L-Ser, DL-Met, L-Phe, L-Lys, L-Leu, L-Pro, L-His,S2-, NO3 -,NO2 -, HSO3 -, OAc-, SO4 2-, PO4 3-, K+, Zn2+, Cu2+, Na+（30 mM），若苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC的PBS缓冲液在627nm处的荧光强度显著增强，说明加入的是HClO；若苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物PTC的PBS缓冲液在627nm处的荧光强度没有发生明显变化，说明加入的不是HClO。

Claims (10)

1.一种苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物，其化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.如权利要求1所述的一种苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）氩气氛围下，将2-甲氧基吩噻嗪、溴丁烷、氢氧化钠溶于二甲基亚砜中，加入碘化钾，于90~100℃下加热反应4~6h，反应结束后将其冷却至室温，加水淬灭，用二氯甲烷萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋干并柱层析分离提纯得10-正丁基-2-甲氧基吩噻嗪；
（2）冰浴条件下，将10-正丁基-2-甲氧基吩噻嗪和醋酸酐混合，在混合体系中加入催化剂磷酸，于45~55℃下反应1.5~2.5h，反应结束后加水淬灭，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋干并柱层析分离提纯得1-(10-正丁基-2-甲氧基-吩噻嗪-3-基)乙酮；
（3）将1-(10-正丁基-2-甲氧基-吩噻嗪-3-基)乙酮和N,N-二乙基水杨醛加入浓硫酸中，于85~95℃下反应4~6h，反应结束并冷却至室温后，在冰水浴条件下，加入高氯酸并混合均匀，随后用二氯甲烷萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋干并柱层析分离提纯即得苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物。
3.如权利要求2所述的一种苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，2-甲氧基吩噻嗪、溴丁烷和氢氧化钠的摩尔比为1:1.5:1.5~1:2.5:2.5。
4.如权利要求2所述的一种苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，碘化钾的加入量为2-甲氧基吩噻嗪摩尔量的1~2%。
5.如权利要求2所述的一种可苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，10-正丁基-2-甲氧基吩噻嗪与醋酸酐的摩尔比为1:7~1:9；10-正丁基-2-甲氧基吩噻嗪与磷酸的摩尔比为1:2~1:4。
6.如权利要求2所述的一种苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，1-(10-正丁基-2-甲氧基-吩噻嗪-3-基)乙酮与N,N-二乙基水杨醛的摩尔比为1:1.5~1:2.5；1-(10-正丁基-2-甲氧基-吩噻嗪-3-基)乙酮与高氯酸的摩尔比为1:20~1:25。
7.如权利要求1所述的苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物在水相体系中检测次氯酸的应用。
8. 如权利要求7所述的苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物在水相体系中检测次氯酸的应用，其特征在于：在苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的PBS缓冲液中，分别加入HClO, ONOO-, HO•,H2O2, O2 −•,t-BuOOH, NO,Cys, Hcy, GSH, L-Ser, DL-Met, L-Phe, L-Lys, L-Leu, L-Pro, L-His, S2-,NO3 -, NO2 -, HSO3 -, OAc-, SO4 2-, PO4 3-, K+, Zn2+, Cu2+, Na+，只有HClO的加入可以使苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物的PBS缓冲液在627nm处的荧光强度显著增强。
9.如权利要求1所述的苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物在检测活细胞中次氯酸的应用。
10.如权利要求1所述的苯并吡喃鎓-吩噻嗪衍生物在检测铁死亡过程中次氯酸的应用。
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