CN115747089A - 一种生产谷胱甘肽的重组酿酒酵母菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产谷胱甘肽的重组酿酒酵母菌及其构建方法，该重组酿酒酵母菌过表达γ‑谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因和/或谷胱甘肽合成酶的基因。利用该重组酿酒酵母菌生产谷胱甘肽，具有产量高、得率高、生物安全、使用无毒副作用等优点。该菌属于食品安全微生物范畴，其表达产物不需要经过大量宿主安全性实验，即可用于生产符合食品级要求的谷胱甘肽，符合节约资源、环境友好的理念。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产谷胱甘肽的重组酿酒酵母菌及其构建方法。
背景技术
谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，化学名为γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成，同时具有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽。谷胱甘肽在自然界中广泛存在，在所有的动植物细胞中都有发现，其中在动物的肾脏、肝脏、红细胞中含量较为丰富。谷胱甘肽具有保护细胞、抗氧化、解毒、清除自由基和提高免疫力等作用，其已经是人类治疗白内障、肝损伤等疾病的临床常用药，也广泛应用于食品、保健和医疗美容等领域，只是目前在动物上的应用还比较少见。
目前获得谷胱甘肽的方法很多，主要的制备方法包括溶剂提取、化学合成、微生物发酵法和酶合成法。目前国内外广泛采用微生物发酵法和酶法生产谷胱甘肽。微生物发酵法主要是将编码谷胱甘肽合成酶系(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶，GSH I和GSH II)或者双功能合成酶GshF的基因克隆到大肠杆菌或者酵母表达系统，发酵培养获得谷胱甘肽。然而，大肠杆菌是一种条件致病菌，产生的内毒素等物质极易引起动物产生免疫反应；大肠杆菌极易遭受到噬菌体的感染，是噬菌体的良好的宿主菌；大肠杆菌不属于食品安全微生物范畴，目前的发酵方法不足以生产出符合食品级谷胱甘肽，且不符合节约资源、环境友好的生产理念。
由于酵母菌株自身谷胱甘肽的含量远高于其他种类微生物，且酿酒酵母已被美国FDA认定为安全性生物，其表达产物不需经过大量宿主安全性实验,且发酵简单，产量高，具有良好的潜力作为谷胱甘肽生产的菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产谷胱甘肽的重组酿酒酵母菌及其构建方法，该重组酿酒酵母菌可用于生产谷胱甘肽，具有产量高、得率高、生物安全、使用无毒副作用等优点。
为此，第一方面，本发明提供一种重组酿酒酵母菌，所述重组酿酒酵母菌过表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因和/或谷胱甘肽合成酶的基因。
如本领域技术人员所知晓的一般定义，所述过表达指目标蛋白的产生量大于相同条件下培养的野生型菌种的目标蛋白表达量
在一些实施方式中，所述重组酿酒酵母菌过表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因。
在一些实施方式中，所述重组酿酒酵母菌过表达谷胱甘肽合成酶的基因。
在一些实施方式中，所述重组酿酒酵母菌过表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因和谷胱甘肽合成酶的基因。
进一步，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因来源于酿酒酵母菌Saccharomycescerevisiae S288C。
进一步，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因为gsh I。
进一步，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步，所述谷胱甘肽合成酶的基因来源于酿酒酵母菌Saccharomycescerevisiae S288C。
进一步，所述谷胱甘肽合成酶的基因为gsh II。
进一步，所述谷胱甘肽合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步，所述重组酿酒酵母菌具有Kanr抗性基因和/或Hygr抗性基因。
进一步，所述Kanr抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步，所述Hygr抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的第二方面，提供所述重组酿酒酵母菌的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备谷胱甘肽合成酶的表达质粒，制备γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达质粒；
S2、将所述谷胱甘肽合成酶的表达质粒和/或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达质粒转化至酿酒酵母菌种，得到所述重组酿酒酵母菌。
进一步，所述谷胱甘肽合成酶的表达质粒具有Hygr抗性基因。
进一步，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达质粒具有Kanr抗性基因。
进一步，所述酿酒酵母菌种本身不具备Hygr抗性或遗传霉素抗性。
进一步，所述酿酒酵母菌种为Saccharomyces cerevisiae INVSc1(BNCC354598)。
进一步，所述谷胱甘肽合成酶的表达质粒的制备方法包括：将Hygr抗性基因和谷胱甘肽合成酶的基因克隆至pYES6-CT质粒。
进一步，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达质粒的制备方法包括：将Kanr抗性基因和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因克隆至pYES6-CT质粒。
进一步，所述克隆包括酶切连接。
进一步，所述质粒转化之后，还包括以下步骤：根据所述谷胱甘肽合成酶的表达质粒和/或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达质粒的抗性进行筛选，从而筛选得到所述重组酿酒酵母菌。
根据本发明的技术方案，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因和谷胱甘肽合成酶的基因可以通过常规基因工程手段获得，例如可以以微生物DNA为模板通过PCR扩增得到，也可以通过查询其序列ID通过人工合成方式得到。
在一些实施方式中，所述重组酿酒酵母菌的制备方法，包括如下步骤：
(1)将Kanr抗性基因的基因克隆到pYES6-CT质粒上，得到重组质粒pYES6-CT(Kanr)；将γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因克隆到pYES6-CT(Kanr)质粒上，得到重组质粒pYES6-CT-gsh I(Kanr)；
(2)将Hygr抗性基因的基因克隆到pYES6-CT质粒上，得到重组质粒pYES6-CT(Hygr)；将谷胱甘肽合成酶的基因克隆到pYES6-CT(Hygr)质粒上，得到重组质粒pYES6-CT-gsh II(Hygr)；
(3)将所述的重组质粒pYES6-CT-gsh I(Kanr)和/或重组质粒pYES6-CT-gsh II(Hygr)转化酿酒酵母菌，得到所述重组酿酒酵母菌。
进一步，所述步骤(1)包括：以pET-28a为模板进行Kanr抗性基因的扩增，并使Kanr抗性基因扩增产物的两端分别具有BamH I和Xbal I酶切位点；通过酶切链接将Kanr抗性基因克隆至pYES6-CT质粒，得到重组质粒pYES6-CT(Kanr)；以人工合成的gsh I基因序列为模板进行gsh I基因的扩增，并使gsh I基因扩增产物的两端分别具有BamH I和Xbal I酶切位点；通过酶切链接将gsh I基因克隆至pYES6-CT(Kanr)质粒，得到重组质粒pYES6-CT-gsh I(Kanr)。
进一步，所述步骤(2)包括：以pLVX-IRES-Hyg为模板进行Hygr抗性基因的扩增，并使Hygr抗性基因扩增产物的两端分别具有BamH I和Xbal I酶切位点；通过酶切链接将Hygr抗性基因克隆至pYES6-CT质粒，得到重组质粒pYES6-CT(Hygr)；以人工合成的gsh II基因序列为模板进行gsh II基因的扩增，并使gsh II基因扩增产物的两端分别具有BamH I和Xbal I酶切位点；通过酶切链接将gsh II基因克隆至pYES6-CT(Hygr)质粒，得到重组质粒pYES6-CT-gsh II(Hygr)。
进一步，步骤(3)包括：测定所述酿酒酵母菌对G418的敏感浓度，用含G418抗性平板筛选成功转化pYES6-CT-gsh I(Kanr)的重组酿酒酵母菌；和/或，测定所述酿酒酵母菌对Hygr的敏感浓度，用含Hygr抗性平板筛选成功转化pYES6-CT-gsh II(Hygr)的重组酿酒酵母菌。
本发明的第三方面，提供一种谷胱甘肽的制备方法，包括在适于表达谷胱甘肽的培养条件下培养所述重组酿酒酵母菌，和从培养产物中分离纯化谷胱甘肽。
进一步，所述培养条件包括：液体培养基发酵培养，并且在发酵过程中补加甘油，所述补加甘油的量为发酵液总体积的1-2％，例如1％、1.5％、2％等。
进一步，所述补加甘油的时间为发酵培养开始的第18h、42h、66h和90h。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下进步：
本发明提供了一种重组酿酒酵母菌，利用其生产谷胱甘肽，具有产量高、得率高、生物安全、使用无毒副作用等优点。该菌属于食品安全微生物范畴，其表达产物不需要经过大量宿主安全性实验，即可用于生产符合食品级要求的谷胱甘肽，符合节约资源、环境友好的理念。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1：本发明提供的重组酿酒酵母菌在不同时间段的摇瓶发酵GSH产量。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
酵母和质粒DNA的提取、纯化，PCR反应，DNA酶切、连接等分子生物学实验步骤均参考《分子克隆实验技术指南》、《酵母遗传学方法实验指南》以及试剂盒产品说明书。
菌种Saccharomyces cerevisiae INVSc1(BNCC354598)、Saccharomycescerevisiae S288C、E.coli TOP 10来自本实验室，质粒pYES6-CT、pET-28a、pLVX-IRES-Hyg，所用的酶(限制性内切酶、Taq/Ex Taq、Pyrobest以及T4 DNA连接酶)购自Takara和NEB公司。
实施例1
重组质粒pYES6-CT(Kanr)和重组质粒pYES6-CT(Hygr)的构建
(一)pYES6-CT(Kanr)的构建：
1、G418(Kanr)基因的克隆：pET-28a带有Kanr抗性基因(SEQ ID NO：1)，根据pET-28a载体序列，设计上下游引物，Kanr-F：CGCGGATCCTGAGCCATATTCAACGGGAAAC(BamH I)；Kanr-R：CTAGTCTAGAGAAAAACTCATCGAGCATC(Xbal I)。
2、以pET-28a载体为模板，上述引物为引物，用Pyrobest聚合酶扩增Kanr基因片段。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。扩增得到的产物经核酸电泳跑胶验证后通过PCR Purification Kit试剂盒纯化。将扩增得到的Kanr基因片段和载体pYES6-CT均用酶Xbal I和Bam H I进行双酶切。
酶切体系为：pYES6-CT或者Kanr基因片段60μL，Xbal I和BamH I各2μL，缓冲液10μL，ddH2O 26μL，总体积100μL。
3、T4 DNA连接酶连接：将Xbal I和BamH I双酶切后的Kanr基因片段和载体pYES6-CT用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组载体重组质粒pYES6-CT(Kanr)。连接体系为：双酶切后的pYES6-CT 3μL，双酶切后的Kanr基因片段5μL，T4 DNA连接酶1μL，缓冲液1μL，连接得到重组质粒pYES6-CT(Kanr)。
(二)pYES6-CT(Hygr)的构建：
1、Hygr基因的扩增：pLVX-IRES-Hyg带有Hygr抗性基因(SEQ ID NO：2)，根据pLVX-IRES-Hyg载体序列，设计引物。Hygr-F：CGCGGATCCAAGCCTGAACTCACCGCGACGTC(BamH I)；Hygr-R：CTAGTCTAGACTATTCCTTTGCCCTCGGACGAG(Xbal I)。
2、以pLVX-IRES-Hyg载体为模板，上述引物为引物，用Pyrobest聚合酶扩增Hygr基因片段。用Pyrobest聚合酶扩增Hygr基因片段。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸7min。扩增得到的产物经核酸电泳跑胶验证后通过PCR Purification Kit试剂盒纯化。将扩增得到的Hygr基因片段和载体pYES6-CT均用酶BamH I和Xbal I进行双酶切。
酶切体系为：pYES6-CT或者Hygr基因片段60μL，BamH I和Xbal I各2μL，缓冲液10μL，ddH2O 26μL，总体积100μL。
3、T4 DNA连接酶连接：将扩增得到的Hygr基因片段和载体pYES6-CT均用酶BamH I和Xbal I进行双酶切，并用T4 DNA连接酶进行连接得到重组载体重组质粒pYES6-CT(Hygr)。连接体系为：双酶切后的pYES6-CT 3μL，双酶切后的Hygr基因片段5μL，T4 DNA连接酶1μL，缓冲液1μL，连接得到重组质粒pYES6-CT(Hygr)。
实施例2
重组质粒pYES6-CT-gsh I(Kanr)和重组质粒pYES6-CT-gsh II(Hygr)的构建
gsh I基因来源于酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae S288C)，查找GeneBank序列号为Gene ID:853344，送上海生工合成，得到pMD18-gsh I。
gsh II基因来源于酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae S288C)，查找GeneBank序列号为Gene ID:854108，送上海生工合成，得到pMD18-gsh II。
(一)pYES6-CT-gsh I(Kanr)的构建
1、gsh I基因的克隆：根据gsh I基因序列，设计上下游引物，gsh I-F：CCCAAGCTTATGGGACTCTTAGCTTTGGGC(HindⅢ)；gsh I-R：CGCGGATCCTTAACATTTGCTTTCTATTG(BamH I)。
2、以pMD18-gsh I载体为模板，上述引物为引物，用Pyrobest聚合酶扩增gsh I基因片段。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸4.5min，共30个循环；72℃延伸10min。扩增得到的产物经核酸电泳跑胶验证后通过PCR PurificationKit试剂盒纯化。将扩增得到的gsh I基因片段和载体pYES6-CT(Kanr)均用酶HindⅢ和BamHI进行双酶切。
酶切体系为：pYES6-CT(Kanr)或者gsh I基因片段60μL，HindⅢ和BamH I各2μL，缓冲液10μL，ddH2O 26μL，总体积100μL。
3、T4 DNA连接酶连接：将HindⅢ和BamH I双酶切后的gsh I基因片段和载体pYES6-CT(Kanr)用T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物转入E.coli TOP 10，经酶切及测序验证正确，得到重组载体重组质粒pYES6-CT-gsh I(Kanr)。连接体系为：双酶切后的pYES6-CT(Kanr)3μL，双酶切后的gsh I基因片段5μL，T4 DNA连接酶1μL，缓冲液1μL，连接得到重组质粒pYES6-CT-gsh I(Kanr)。
(二)pYES6-CT-gsh II(Hygr)的构建
1、gsh II基因的克隆：根据gsh II基因序列，设计上下游引物，gshII-F：CCCAAGCTTATGGCACACTATCCACCTTC(HindⅢ)；gshII-R：CCAGGGATCCCTAGTAAAGAATAATACTGTC(BamH I)。
2、以pMD18-gsh II载体为模板，上述引物为引物，用Pyrobest聚合酶扩增gsh II基因片段。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min。扩增得到的产物经核酸电泳跑胶验证后通过PCR Purification Kit试剂盒纯化。将扩增得到的gsh II基因片段和载体pYES6-CT(Hygr)均用酶HindⅢ和Bam HI进行双酶切。
酶切体系为：pYES6-CT(Hygr)或者扩增得到的gsh II基因片段60μL，Hind Ⅲ和Bam H I各2μL，缓冲液10μL，ddH2O 26μL，总体积100μL。
3、T4 DNA连接酶连接：将HindⅢ和BamH I双酶切后的gsh II基因片段和载体pYES6-CT(Hygr)用T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物转入E.coli TOP 10，经酶切及测序验证正确，即得到重组载体重组质粒pYES6-CT-gsh II(Hygr)。连接体系为：双酶切后的pYES6-CT(Hygr)3μL，双酶切后的gsh II基因片段5μL，T4 DNA连接酶1μL，缓冲液1μL。
实施例3
重组酿酒酵母菌株的筛选
1、电转重组质粒
分别过夜培养带有质粒pYES6-CT-gsh I(Kanr)的E.coli TOP 10、带有质粒pYES6-CT-gsh II(Hygr)的E.coli TOP 10；醇提质粒pYES6-CT-gsh I(Kanr)和pYES6-CT-gsh II(Hygr)并线性化之后，分别电转和混合电转入宿主细胞INVSC1，电转后的溶液30℃，50rpm摇床复苏2h，然后分别涂布于含G418抗性的YPD平板、含Hygr抗性的YPD平板和含G418+Hygr抗性的YPD平板，于30℃培养至转化子长出。
2、重组酿酒酵母菌株抗性平板的筛选
由于INVSC1没有G418和Hygr抗性，因此只有转化了质粒pYES6-CT-gsh I(Kanr)的转化子(INVSC1/pYES6-CT-gsh I)才可以在含G418抗性的YPD平板生长；转化了质粒pYES6-CT-gsh II(Hygr)的转化子(INVSC1/pYES6-CT-gsh II)才可以在含有Hygr抗性的YPD平板生长；同时转化了质粒pYES6-CT-gsh I(Kanr)+pYES6-CT-gsh II(Hygr)的转化子(INVSC1/pYES6-CT-gsh I+pYES6-CT-gsh II)才可以在含有G418+Hygr抗性的YPD平板生长。
最初的转化子在125μg/mL G418、100μg/mL Hygr和125μg/mL G418+100μg/mLHygr的YPD平板上生长。转化子能够适应更高浓度的抗性，代表整合到基因组上的重组质粒的拷贝数更多。初次筛出的转化子在更高浓度的抗性平板上复筛。复筛菌株最终选择在1.0mg/mL G418、800μg/mL Hygr和1.0mg/mL G418+800μg/mL Hygr的YPD平板上生长速度较快的菌株。将经复筛得到的菌株用于后续实验。
实施例4
产谷胱甘肽重组酿酒酵母菌株的摇瓶发酵
从在1.0mg/mL G418、800μg/mL Hygr和1.0mg/mL G418+800μg/mL Hygr的YPD平板上生长速度较快的复筛菌株INVSC1/pYES6-CT-gsh I、INVSC1/pYES6-CT-gsh II和INVSC1/pYES6-CT-gsh I+pYES6-CT-gsh II中随机挑选，进行摇瓶发酵培养。分为以下几个步骤：
1、取在1.0mg/mL G418、800μg/mL Hygr和1.0mg/mL G418+800μg/mL Hygr的YPD平板上生长速度较快的复筛菌株INVSC1/pYES6-CT-gsh I、INVSC1/pYES6-CT-gsh II和INVSC1/pYES6-CT-gsh I+pYES6-CT-gsh II，在同浓度抗性平板上划线纯化单克隆两到三次。
2、将上述平板分别于30℃恒温培养三天，挑取单克隆分别接入5mL的YPD液体培养基中，于30℃，200rpm培养过夜。
3、取步骤(2)培养得到的3mL菌液转接种于30mL YPD液体培养基，200rpm摇床培养96h，并在发酵培养的第18h、42h、66h、90h补加甘油，补加甘油的量为发酵液总体积的1.5％。并于发酵的第48h、72h、96h取样检测GSH的含量。
4、对于导入了gsh I、gsh II和gsh I+gsh II基因的三组重组酿酒酵母菌株，每组选GSH产量最高的两株，进行以下编号：两株导入了gsh I的重组酵母菌分别编号A-105、A-283，两株导入了gsh II的重组酵母菌分别编号B-083、B-351，两株导入了gsh I+gsh II的重组酵母菌分别编号C-057、C-171。将上述菌株用甘油管保藏于-80℃冰箱。
实施例5
导入gsh I、gsh II和gsh I+gsh II基因对重组酿酒酵母菌株合成谷胱甘肽的影响探讨
1、取A-105、A-283、B-083、B-351、C-057、C-171和未转质粒的INVSC1的甘油冻存管室温融化后，分别按照1％的接种量被接入10mL的YPD液体培养基中，于30℃，200rpm培养18-24h。
2、取3mL菌液转接30mL YPD液体培养基，200rpm摇床培养96h，并在发酵培养的第18h、42h、66h、90h补加甘油，补加甘油的量为发酵液总体积的1.5％。并于发酵的第48h、72h、96h取样检测GSH的含量，分别计算A-105和A-283的产量平均值、B-083和B-351的产量平均值、C-057和C-171的产量平均值，检测结果如表1和图1所示。
表1不同时间段摇瓶发酵GSH的产量
根据表1的数据和图1的结果显示，A-105/A-283、B-083/B-351、C-057/C-171组的发酵产量显著高于同发酵周期的对照组未转质粒的INVSC1的发酵产量，这表明，重组酿酒酵母中导入gsh I和gsh II基因，对于发酵产量的提高具有积极地意义。
其中实验组中发酵产量较高的菌株依次为：C-057/C-171(导入gsh I+gsh II的重组酿酒酵母菌株)＞A-105/A-283(导入gsh I的重组酿酒酵母菌株)＞B-083/B-351(导入gsh II基因的重组酿酒酵母菌株)。这表明，在谷胱甘肽合成中，gsh I指导的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和gsh II指导的谷胱甘肽合成酶作为谷胱甘肽合成中的重要的酶类，它们含量的增加，进而指导更多的谷胱甘肽合成。而gsh I指导的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，作为谷胱甘肽合成中的重要的限速酶，它的作用比谷胱甘肽合成酶更为重要。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶含量协同提高对发酵产物谷胱甘肽含量的提高效率优于单独提高γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶或谷胱甘肽合成酶的含量。
实施例6
摇瓶发酵高产菌株的遗传稳定性考察
本实施例选取摇瓶产量最高的菌株C-057进行遗传稳定性考察。具体步骤如下：
取C-057甘油管室温融化后，蘸取菌液在无抗YPD平板上划线，生长菌落作为1代菌株。取YPD平板上1代生长菌落随机挑选50个，点板YPD平板。先点板YPD无抗平板，后点板125g/mL G418+100μg/mL Hygr的抗性平板，统计1代质粒丢失率。1代菌株继续在YPD平板上传代，每转接一次算一代，连续传代10次，与1代菌株质粒丢失率统计方法相同，取YPD平板上10代生长菌落随机挑选50个，点板YPD平板。先点板YPD无抗平板，后点板125g/mL G418+100μg/mL Hygr的抗性平板，统计10代质粒丢失率。发酵产量采用实施例5中所述方法，每个代次选择5株，最终统计摇瓶96h发酵产量。综合对比10代与1代菌株，考察质粒稳定性和产量稳定性。检测结果如表2所示。
表2 10代菌的质粒稳定性和产量稳定性
根据表2的结果可知，与1代相比，10代菌株的质粒丢失率较低，且发酵产量占比较高，可满足实际生产的需求，具有良好的应用前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种重组酿酒酵母菌，其特征在于，所述重组酿酒酵母菌过表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因和/或谷胱甘肽合成酶的基因。
2.如权利要求1所述的重组酿酒酵母菌，其特征在于，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因来源于酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae S288C；
优选地，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因为gsh I；
优选地，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.如权利要求1所述的重组酿酒酵母菌，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶的基因来源于酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae S288C；
优选地，所述谷胱甘肽合成酶的基因为gsh II；
优选地，所述谷胱甘肽合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.如权利要求1所述的重组酿酒酵母菌，其特征在于，所述重组酿酒酵母菌具有Kanr抗性基因和/或Hygr抗性基因；
优选地，所述Kanr抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
优选地，所述Hygr抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.权利要求1-4任一项所述的重组酿酒酵母菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备谷胱甘肽合成酶的表达质粒，制备γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达质粒；
S2、将所述谷胱甘肽合成酶的表达质粒和/或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达质粒转化至酿酒酵母菌种，得到所述重组酿酒酵母菌。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶的表达质粒具有Hygr抗性基因；
优选地，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达质粒具有Kanr抗性基因。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶的表达质粒的制备方法包括：将Hygr抗性基因和谷胱甘肽合成酶的基因克隆至pYES6-CT质粒；
优选地，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达质粒的制备方法包括：将Kanr抗性基因和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因克隆至pYES6-CT质粒；
优选地，所述克隆的方法包括酶切连接。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述质粒转化之后，还包括以下步骤：根据所述谷胱甘肽合成酶的表达质粒和/或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达质粒的抗性进行筛选，从而筛选得到所述重组酿酒酵母菌。
9.一种谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，包括在适于表达谷胱甘肽的培养条件下培养权利要求1-4任一项所述的重组酿酒酵母菌，和从培养产物中分离纯化谷胱甘肽。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述培养条件包括：液体培养基发酵培养，并且在发酵过程中补加甘油，所述补加甘油的量为发酵液总体积的1-2％；
优选地，所述补加甘油的时间为从发酵培养开始的第18h、42h、66h和90h。
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