CN115697352A - 作为蛋白聚糖模拟物的硫酸化糖胺聚糖生物材料 - Google Patents

Abstract

提供了能够模拟结缔组织的细胞外基质中发现的天然蛋白聚糖的功能的聚合物缀合物。本发明的聚合物缀合物可用于治疗患有软组织退行性病况的受试者。还提供了制备本发明聚合物缀合物的简单且可拓展的化学方法。

Description

作为蛋白聚糖模拟物的硫酸化糖胺聚糖生物材料

技术领域

本申请要求2020年3月19日提交的第62/991804号美国临时申请的权益。上述申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

细胞外基质(ECM)形成软组织和结缔组织的非细胞支架。它提供了常驻细胞所需的生化和结构支持，它在维持组织形状和抵抗机械应力方面发挥着关键作用。蛋白聚糖是ECM的天然大分子，维持组织健康并防止ECM降解。通过其强大的渗透水合作用以及结合和调节关键生长因子的能力，蛋白聚糖是健康ECM的保护剂。作为对老化、疾病或损伤的反应，ECM失去功能。蛋白聚糖含量减少，导致胶原纤维和其他基质成分也开始降解。此种降解是许多软组织疾病、病症和/或病况(包括皮肤、椎间盘、软骨和尿道组织等的那些)的潜在因素。蛋白聚糖功能的恢复是解决ECM功能丧失的一种治疗选项。

Thomas Jozefiak的WO2018/053276(指定美国并公布于2018年3月22日)描述了新型蛋白聚糖模拟生物聚合物，其通过引用整体并入本文。优选材料来源于包括用双官能连接剂活化核聚合物、然后加入过量的硫酸化糖胺聚糖(GAG)与活化的核聚合物反应的方法。还描述了一种方法，其中包括其他修饰剂以赋予其他期望性质(例如靶向特定生物靶标)。现在已经发现，改进的蛋白聚糖模拟组合物可以通过允许更好地控制后续步骤中修饰剂添加的方法来更有效地生产。

发明内容

本公开描述了中至高分子量的聚合物缀合物，它们可溶于水溶液和生物溶液且由硫酸化糖胺聚糖(GAG)链和修饰剂组成。所提供的聚合物缀合物是生物相容的、易于使用小口径针头注射、能够模拟软组织ECM中的某些蛋白聚糖功能且具有改进的靶向性和/或局部反应性。本公开还提供了治疗患有软组织退行性病况的受试者的方法。

本发明部分地基于如下出乎意料的发现：现有技术方法通常导致衍生自接头试剂的不完全反应的侧链反应性基团的保留。考虑到侧链接头基团的反应性和聚合物结合羟基(其在反应的高pH环境中具有反应性)以及氢氧根离子本身的可得性，此种观察结果是出乎意料的。发明人已经发现，这些侧链反应性基团的存在可以通过选择反应条件来控制。本发明方法基于如下认识：此种反应性化合物在制备修饰的组合物中具有作为中间体的用途。本发明的新方法选择了在中间体生物聚合物中产生可控水平的侧链反应性基团的条件，然后引入过量的反应性修饰基团以完全淬灭剩余反应性接头基团。所得三阶段工艺与其中修饰基团与GAG生物聚合物同时引入的现有技术方法相比具有很强的优势。在这些条件下，由于更高反应性的猝灭剂清除了乙烯基砜基，所需的高分子量积累被严重约束。

附图说明

如附图所示，本发明的前述和其他目的、特征和优点将从以下对本发明优选实施方式的更具体描述中显而易见，其中相同的附图标记在不同视图中表示相同的部分。附图不一定按比例绘制，而是强调说明本发明的原理。

图1描述了用双官能连接剂活化线性聚合物、然后将活化的聚合物与硫酸化的GAG链连接以形成瓶刷状聚合物缀合物，其特征在于活性侧链接头基团剩余。可选地进行稀释后，侧链接头基团与修饰剂或猝灭剂反应。

图2描述了用双官能连接剂活化线性聚合物、然后将活化的聚合物与硫酸化的GAG链连接以形成瓶刷状聚合物缀合物，其特征在于活性侧链接头基团剩余；可选地进行稀释，加入相同或不同的双官能剂(例如二乙烯基砜)，可选地加入修饰剂或猝灭剂，以及可选地加入超过一种猝灭剂。

具体实施方式

为了解决长期以来在治疗软组织疾病、病症和病况方面的需求，需要生产能够模拟天然蛋白聚糖的形态和物理性质的蛋白聚糖模拟物。天然蛋白聚糖由GAG链组成，由于存在硫酸盐基团和羧酸盐基团，GAG链在生理条件下带高负电。

本发明涉及以受控方式使硫酸化GAG和其他反应性部分反应，以制备仍可溶于水溶液的高分子量、支化、硫酸化的GAG组合物。

定义

如本文所用，标题和小节副标题出于组织目的而提供，并不意在具有限制性。因此，除非另有说明，否则小节中描述的实施方式适用于整个申请。

适用于一个以上感兴趣值的术语“近似”或“约”指与所述参考值相近的值。在某些实施方式中，术语“近似”或“约”指在所述参考值的任一方向(大于或小于)上落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％以下以内的值范围，除非另有说明或除非从上下文中明显可见(除非该数字将超过可能值的100％)。

如本文所用，术语“施用”通常指给受试者或系统施用组合物。本领域普通技术人员将了解在适当情况下可用于给受试者(例如人类)施用的多种途径。例如，在一些实施方式中，施用可以为眼部施用、口服施用、肠胃外施用、局部施用等。在一些具体实施方式中，施用可以为支气管施用(例如通过支气管滴注)、颊施用、皮肤施用(其可以为或包括例如局部到真皮、皮内、皮间、透皮等中的一种以上)、肠内施用、动脉内施用、皮内施用、胃内施用、髓内施用、肌肉内施用、鼻内施用、腹膜内施用、鞘内施用、膀胱内施用、静脉内施用、心室内施用、特定器官内(例如肝内)施用、粘膜施用、鼻施用、口服施用、直肠施用、皮下施用、舌下施用、局部施用、气管施用(例如气管内滴注)、阴道施用、玻璃体施用等。在一些实施方式中，施用可包括间歇给药(例如在时间上分开的多个剂量)和/或周期性给药(例如由共同时间段分开的单个剂量)。在一些实施方式中，施用可包括连续施用(例如灌注)持续至少一段选定时间。如本文所用，“生物相容”意在描述在与体液或活细胞或组织接触时产生最小破坏性或宿主反应效应的材料。该术语也被认为表示与识别蛋白(例如天然抗体、细胞蛋白、细胞和生物系统的其他成分)的相互作用最小，除非此种相互作用是特意需要的。因此，特意用于引起上述效应以及体内施用引起最小且医学上可接受的炎症、异物反应、免疫毒性、化学毒性或其他此类不良效应的材料和官能基团被认为是生物相容的。如本文所用，术语“生物分子”指通常存在于细胞和组织中的属于化合物类别的分子(例如蛋白质、氨基酸、肽、多核苷酸、核苷酸、碳水化合物、糖类、脂类、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、类固醇等)，无论是天然的还是人工产生的(例如通过合成或重组方法)。生物分子的示例性类型包括但不限于肽、酶、受体、神经递质、激素、细胞因子、细胞反应调节剂(例如生长因子和趋化因子)、抗体、疫苗、干扰素、核酶、反义剂、质粒、DNA和RNA。

如本文所使用的术语“治疗”(也称为“处理”或“医治”)指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、延迟特定疾病、病症和/或病况的一种以上症状、特征和/或原因的发作、降低特定疾病、病症和/或病况的一种以上症状、特征和/或原因的严重程度和/或减少特定疾病、病症和/或病况的一种以上症状、特征和/或原因的发生的物质(例如药物组合物)的任何施用。此种治疗可针对未表现出相关疾病、病症和/或病况的体征的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病况的早期体征的患者。作为替代或补充，此种治疗可针对表现出相关疾病、病症和/或病况的一个以上既定体征的受试者。在一些实施方式中，治疗可针对已被诊断为患有相关疾病、病症和/或病况的受试者。在一些实施方式中，治疗可针对已知具有一种以上易感因素(与相关疾病、病症和/或病况的发展的风险增加在统计学上相关)的受试者。

如本文所用，“受试者”指生物体，通常是哺乳动物(例如人类)。在一些实施方式中，受试者患有相关疾病、病症或病况。在一些实施方式中，受试者对疾病、病症或病况具有易感性。在一些实施方式中，受试者显示疾病、病症或状况的一个以上症状或特征。在一些实施方式中，受试者不显示疾病、病症或病况的任何症状或特征。在一些实施方式中，受试者为对疾病、病症或病况具有易感性或风险的一个以上特征的人类。在一些实施方式中，受试者为患者。在一些实施方式中，受试者为接受诊断和/或治疗和/或已经被施用的个体。在一些实施方式中，对于本文所述的任何方法，受试者为哺乳动物。在一些实施方式中，对于本文所述的任何方法，受试者为人类。

如本文中，术语“糖胺聚糖”和“GAG”可互换使用，指由包含氨基糖(例如N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)和糖醛糖(例如葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸)或半乳糖的重复二糖单元组成的多糖。用于本发明的GAG可以在尺寸上变化，可以为硫酸化的或非硫酸化的。可用于本发明方法中的GAG包括但不限于透明质酸、软骨素、硫酸软骨素(例如硫酸软骨素6和硫酸软骨素4)、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、肝素、皮肤素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等。

如本文所用，术语“改善”、“增加”或“减少”或它们的语法等价物表示与基线测量相关的值，例如在开始本文所述治疗之前在同一个体中的测量或在没有进行本文所述治疗的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量。

如本文所用，术语“修饰剂”指共价连接至聚合物缀合物的有机部分、无机部分或生物有机部分。修饰剂可以为小分子或大分子，并且可以属于任何化学或药物类别，例如，核苷酸、化疗剂、抗菌剂、抗病毒剂、免疫调节剂、激素或其类似物、酶、抑制剂、生物碱和治疗性放射性核素(例如α、β或正电子发射体)。在某些实施方式中，根据本发明的修饰剂包括但不限于生物分子、小分子、治疗剂、药学上有用的基团或实体、大分子、诊断标记、螯合剂、亲水性部分、分散剂、电荷修饰剂、粘度修饰剂、表面活性剂、凝血剂和絮凝剂等。在一些实施方式中，修饰剂为对特定生物分子或组织具有亲和力的靶肽或碳水化合物，并且可增强聚合物缀合物的递送和/或功效。修饰剂可以具有一种以上药物功能，例如生物活性和药物动力学修饰。药物动力学修饰剂可包括例如抗体、抗原、受体配体、亲水性基团、疏水性基团或带电基团。生物活性修饰剂包括例如治疗药物和前药、抗原、免疫调节剂。可检测的修饰剂包括诊断标记，例如放射性标记、荧光标记、顺磁性标记、超顺磁性标记、铁磁性标记、X射线调制标记、X射线不透明标记、超声反射标记以及其他可通过可得临床或实验室方法之一(例如闪烁照相术、核磁共振波谱、MRI、X射线断层摄影术、超声层析成像、光成像、放射免疫分析)检测的物质。

优选的修饰剂的特征在于反应性部分，该反应性部分能够与由双官能接头和聚合物核反应产生的侧链反应性基团反应。例如，二乙烯基砜(DVS)和硫酸软骨素的反应产生以侧链乙烯基为特征的聚合物核。亲核基团(优选胺基和/或巯基)与此类侧链乙烯基反应。因此，在侧链反应性基团为乙烯基的情况下，优选的修饰剂的特征在于胺。

术语“疏水性”指有机分子或自由基在水或水溶液中不具有或预期不具有显著溶解度的性质。疏水部分表示降低母体分子或聚合物的水溶性的有机分子或聚合物上的取代基。疏水部分可包含C4-C36烷基，例如可以为饱和或不饱和的脂肪酸或者甾醇。在一些实施方式中，可使用C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、C30、C32和C34脂肪酸。疏水基团可具有16个以上的碳原子。合适的示例性疏水基团可选自：甾醇、胆固醇、棕榈酰、十六烷-8-烯酰基、油烯基、(9E,12E)-十八烷-9,12-二烯酰、二辛基、鞘氨醇(sphingoid)和C16-C20酰基。例如，疏水性修饰剂可以为或可以包含脂质、磷脂或亲脂性醇，例如阳离子脂质、中性脂质、鞘脂和脂肪酸，例如硬脂酸、油酸、反油酸、亚油酸、反亚油酸(linoleaidic)、亚麻酸和肉豆蔻酸。在一些实施方式中，脂肪酸包括C4-C30饱和或不饱和烷基链。烷基链可以为直链或支链的。

术语“接头”、“连接剂”、“交联剂”等包括具有一种以上可与两种以上分子反应从而“连接”它们的反应性官能团的试剂。例如，连接剂可以将聚合物连接到GAG、两种GAG以及GAG和修饰剂。连接剂通常是本领域已知的。特别优选的连接剂为二乙烯基砜。

如本文所用，与疾病、病症和/或病况的发生结合使用时，术语“预防”或“防止”指降低疾病、病症和/或病况的风险和/或延迟疾病、病症或病况一个以上特征或症状的发作。当疾病、病症或病况的发作被延迟了预定时间段时，可认为已完成预防。

如本文所用，术语“参考”描述了与之进行比较的标准或对照。例如，在一些实施方式中，将感兴趣的试剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照试剂、动物或个体、人群、样品、序列或值进行比较。在一些实施方式中，参考或对照与感兴趣的测试或测定基本上同时进行测试和/或测定。在一些实施方式中，参考或对照是历史参考或对照，可选地体现在有形介质中。通常，如本领域技术人员所理解的，参考或对照在与被评估物类似的条件或环境下测定或表征。当存在足够的相似性以证明依赖和/或与特定的可能参考或对照进行比较时，本领域技术人员将理解。在一些实施方式中，参考是聚集蛋白聚糖(aggrecan)。在一些实施方式中，参考是聚合起始材料。在一些实施方式中，参考是无效缀合反应。在一些实施方式中，参考是除省略接头剂之外在所有方面与所提供的聚合物缀合物的形成相同的无效缀合反应。

术语“凝胶”指粘弹性材料，其流变特性将其与溶液或固体区分开来。如果组合物在稳定状态或低剪切条件下不流动、但在搅拌时显示出一些流动性或流动，则被认为是凝胶。凝胶由构成连续固相的三维延伸网络组成，流体相分散在其中(在水凝胶的情况下为水)。通常，存在的液相的量远大于固相。延伸的交联网络可以通过化学共价键或溶液中的物理缔合形成。

除非另有说明，否则术语“分子量”指重均分子量或“M_w”(本文中可与“M_w”互换使用)。

术语“可溶”指分子(溶质)在分子水平上完全分散在另一种物质(溶剂)中的化学条件，其中溶质分子之间没有强相互作用。

蛋白聚糖

蛋白聚糖是在身体的所有结缔组织的细胞外基质(ECM)中发现的糖蛋白。大量蛋白聚糖及其组织特异性表达已被鉴定。尽管存在相当多的结构多样性，但所有蛋白聚糖的共同结构元件是用一个以上硫酸化糖胺聚糖(GAG)链糖基化的蛋白核。蛋白核可包含对生物功能重要的几个模块化结构元件(例如IgG样、EGF样、HA结合基序、富含亮氨酸的基序等)。最典型地，共价结合的硫酸化GAG链是硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素或硫酸乙酰肝素。它们通常作为与核蛋白链上丝氨酸部分结合的O-连接聚糖而附着在蛋白核上。

水合作用对ECM稳态至关重要。水分含量决定组织体积和抗压性。水合作用还为细胞迁移、ECM结构成分(例如胶原蛋白和弹性蛋白)的组织和生物分子的运输创造所需的空间。ECM中蛋白聚糖的主要结构功能是维持水合作用。这与携带大量硫酸化GAG链的大的聚集蛋白聚糖特别相关。透凝蛋白聚糖(hyalectan)家族中的蛋白聚糖(例如聚集蛋白聚糖和多能蛋白聚糖(versican))包含集中在核蛋白的特定亚单位内的多个(例如约10至100个)GAG链。这些独特的生物聚合物结构具有瓶刷状聚合物结构和非常高密度的阴离子电荷，这些阴离子电荷来源于GAG链上以小体积集中的大量硫酸盐和羧酸盐部分。除在ECM中提供关键的水合作用和结构支持之外，已知蛋白聚糖在细胞外信号传导中发挥重要作用。已知它们与多种生长因子、趋化因子和细胞因子强烈结合，并影响凋亡、细胞发育、细胞运动和粘附的信号通路。

越来越多的科学证据支持蛋白聚糖在维持结缔组织完整性方面发挥重要作用：防止组织退化、促进损伤后愈合和抵抗疾病。由于蛋白聚糖在决定结缔组织的物理性质方面发挥着重要作用，并且已知结缔组织(例如真皮)与年龄相关的变化与蛋白聚糖降解相关，基于蛋白聚糖的治疗方法(例如蛋白聚糖替代疗法)是一种治疗与年龄相关变化和伤口愈合以及解决皮肤科、泌尿科、心血管科和骨科领域未满足的医疗需求的有前景的方法。

尽管蛋白聚糖被认为是软骨和软组织的ECM中至关重要的生物分子，但它们在大多数组织中仅少量存在。蛋白聚糖难以从天然来源中分离并大规模纯化。因此，生物分子(例如聚集蛋白聚糖)目前只能少量地作为研究工具使用。使用组织分离的蛋白聚糖作为治疗剂的成本高昂且不切实际。此外，由于免疫宿主反应，从异种组织(牛、猪、海洋)中提取的蛋白聚糖可能不适合直接用于人类医药。

蛋白聚糖模拟材料

已有几项研究寻求设计能够模拟结缔组织中天然存在的蛋白聚糖(PG)的重要结构和/或生物学功能的组合物。这些方法分为若干类别：

a.合成聚合物或天然多糖的硫酸化。例如，合成PG模拟物的最简单方法之一是碳水化合物(例如右旋糖酐)的硫酸化[D Papy Garcia等，Macromolecules 2005，38：4647-4654]。合成聚合物(例如芳香多酚)的硫酸化也被报道产生具有GAG或PG生物活性的分子[UR Desai，Future Med.Chem.2013，5：1363-1366]。

b.硫酸化GAG附着在表面或颗粒上。例如，硫酸软骨素被缀合至碳纳米管表面，以提供GAG功能性纳米颗粒，作为用于软骨置换的水凝胶构建物中的PG模拟物[J Wei等，Materials Chemistry and Physics 2015，166：66-72]。在用能够与硫酸软骨素还原端上的丝氨酸部分反应的反应性氰酸酯活化这些凝胶后，将硫酸软骨素附着到琼脂糖凝胶的表面[KJ Mattern等，Carbohydrate Research 2007，342：2192-2201]。硫酸软骨素附着在聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维表面和壳聚糖包覆的PET纤维表面[C-H Jou等，Polym.Adv.Technol.2005，16：821-826]。

c.通过阴离子硫酸化GAG与阳离子聚合物络合产生不溶性颗粒。高阴离子GAG和聚阳离子(例如壳聚糖)之间形成复合物已被描述为产生能够结合FGF-2的纳米颗粒的方法[SBoddohi等，Biomacromolecules 2009，10：1402-1409][LW Place等，Biomacromolecules2014，15：3772-3780]。将乙酰肝素与各种反应性聚合物络合，形成应用于医疗器械表面的不溶性涂层[US 2005/0281857]。

d.某些生物活性肽与硫酸化GAG缀合以提供成分明确的可溶性肽聚糖衍生物。例如，硫酸皮肤素与能够结合II型胶原蛋白或透明质酸的肽的缀合已被广泛研究和描述[SSharma等，Acta Biomaterialia 2013，9：4618-4625][JC Bernhard等，ActaBiomaterialia2012，8：1543-1550][US 9200039]。

e.含有硫酸化双糖或低聚糖的单体聚合。例如，通过合成被简单硫酸软骨素二糖单元取代的ROMP可聚合单体，可制备硫酸软骨素的聚合物模拟物[S-G Lee等，Chem.Sci.，2010，1：322-325]。

f.多价寡糖聚糖的合成。已经制备了代表单个整体硫酸乙酰肝素(HS)结构基序的特定二糖和四糖，并将其与4臂树枝状连接分子结合。这些硫酸乙酰肝素模拟物被发现能够模拟长链天然HS与某些治疗蛋白相互作用的性能[PC Tyler等，Angew.Chem.Int.Ed.2015，54：2718-2723]。

g.GAG与其他聚合物的缀合。例如，几种小糖和低聚糖通过其还原末端与合成聚合物核上的互补官能团反应来缀合至合成聚合物[K Godula等，J.Am.Chem.Soc.2010，132：9963-9965]。在相关方法中，已经报道了聚集蛋白聚糖样瓶刷组合物使用透明质酸衍生物作为聚合物核，该聚合物核能够与作为刷毛的全长天然乙酰肝素或硫酸软骨素链的还原端反应[LW Place等，Biomacromolecules 2014，15：3772-3780]。在形成瓶刷结构的另一种方法中，在几种反应场景(包括以聚丙烯酸作为核的酰胺形成反应)中，在链的还原端具有O-连接丝氨酸聚糖的硫酸软骨素已被用作单螯胺[US 20130052155 A1]。

与蛋白聚糖模拟物的领域相关的一个独特研究领域关注交联GAG水凝胶。在这些情况下，获得了延伸的交联网络，而不是可溶性聚合物化合物。交联网络的性质最根本来源于它们的交联密度和粒度。相比之下，可溶性聚合物的特征在于它们的分子量和支化程度。通常，交联凝胶具有高模量，难以通过注射来施用。

通过GAG材料交联制备的水溶胀水凝胶颗粒在生物环境中呈现富含GAG的表面。然而，注射到组织中后，这些交联凝胶在ECM中表现为离散颗粒，因此不能作为蛋白聚糖模拟材料发挥作用。它们不具备如同已知蛋白聚糖(例如多能蛋白聚糖)在真皮中所做的那样整合到软组织中并与ECM的其他成分相互作用的能力。

对交联GAG网络的研究可以集中于透明质酸(HA)，因为它可由细菌培养物以及天然来源和商业可用来源大规模生产。此外，HA通常以非常高分子量的形式存在，通常超过500,000Da，高至数百万Da。高分子量有利于形成延伸的水凝胶结构。由于此原因，在基于HA的交联水凝胶的合成和使用方面进行了大量工作，透明质酸是生物制药和医疗器械产品开发中广泛使用的GAG。HA凝胶是众所周知的真皮填充剂、粘性补充剂和美容剂。

与HA不同的是，硫酸化GAG(例如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和硫酸角质素)目前可从天然来源获得，且通常数量要少得多。高质量GMP材料的商业来源有限。此外，由于提取自天然组织，这些硫酸化GAG的分子量比HA低得多。例如，高质量的牛源硫酸软骨素的分子量普遍低于50,000Da，通常低于25,000Da。这些生物聚合物的低分子量以及高纯度材料的采购困难限制了它们在生物制药和医疗器械产品开发中的应用。

关于交联HA水凝胶的研究报告和专利文献指出，可以使用其他GAG代替HA。然而，鉴于硫酸化GAG和HA之间的显著差异，最显著的是分子量差异非常大，因此不能假定现有用HA形成凝胶的合成方法适用于硫酸化GAG。此外，不能假定来自硫酸化GAG的交联水凝胶的性质与HA交联水凝胶相似。

对于交联GAG水凝胶的形成，几种1步直接连接剂已被描述于文献中，并发现可提供生物相容性水凝胶。这些交联HA水凝胶已用于多种商业产品，例如真皮填充剂(例如

)、粘性补充剂(例如

和

)和粘附屏障(例如

)。直接连接剂的非限制性实例为二乙烯基砜(DVS)、表氯醇(epi)、丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、二环氧辛烷、乙二醇二缩水甘油醚、亚苯基-双(乙基碳化二亚胺)和1,1’羰基二咪唑(CDI)。

已知各种直接交联剂与硫酸化GAG的反应可形成强水凝胶。然而，申请人已观察到，此种凝胶形成对反应条件敏感，可以获得意想不到的结果。例如，DVS与硫酸软骨素的反应可能导致多种结果。在某些情况下，获得强效且透明的凝胶。在某些情况下，可获得粘性透明流体。在某些情况下，获得不溶性的修饰硫酸软骨素的浑浊悬液。在某些情况下，获得浑浊凝胶。在本文中，申请人公开了用于控制和指导这些不同结果以产生可溶性聚合物缀合物的方法。当然，这里的表述“可溶性”指水溶性，其中溶液可以自由流动和注射。

尽管在开发蛋白聚糖模拟材料方面进行了多次尝试，但目前还没有已知聚合物缀合物可有效地提供天然蛋白聚糖的有益物理功能和生物功能、已知或预期具有生物相容性、可溶并能够通过扩散整合到软组织中、易于注射或施用、在软组织中保留较长时间，并且可以使用可扩展到商业量的有效且简单的化学工艺来制造。

聚合物缀合物

本发明涉及蛋白聚糖模拟物。本发明包括如下认识：硫酸化GAG(和其他聚合物)包含许多功能性部分，这些功能性部分能够与适当的连接剂反应以形成可溶性的高阶聚合物缀合物，包括具有支化和瓶刷状结构的那些。这些功能性部分可与连接剂反应以“活化”聚合物链以与一个以上其他聚合物链缀合。虽然在这方面的先前努力已经产生了作为凝胶的GAG组合物，但本发明提供了不属于凝胶且仍可溶于水溶液的聚合物缀合物。在一些实施方式中，通过控制连接剂和硫酸化GAG的化学计量、硫酸化GAG的浓度、硫酸化GAG的分子量和/或反应时间来制备本发明的可溶性聚合物缀合物。

同样，这里的表述“可溶性”指水溶性，其中溶液可以自由流动和注射。“自由流动”优选指在20℃下的粘度小于约500cp，优选小于约100cp，例如小于约50cp。“可注射”通常指通过用于静脉注射、肌肉注射或皮下注射的医用针递送。例如，可以使用15至30号针，优选18至25号针。对于更高号的针和/或粘度，可能需要更多的时间和压力来递送特定溶液。在粘度太大且针头太小的情况下，很可能会注射失败。注射失败是注射针在递送过程中堵塞的情况。因此，蛋白聚糖模拟物的水溶性可以至少在一个方面通过水溶液的粘度来表征。此种水溶液可以在饱和点测量。然而，应理解，施用的溶液不需要在饱和状态下递送。作为替代或补充，溶液可以为可微过滤的。例如，溶液可通过过滤器(例如0.2微米过滤器)，从而使溶液无菌、优选适合注射。

GAG或其他聚合物上可用于本文所述连接化学的官能部分包括但不限于羟基、胺、硫醇和羧基。在一些实施方式中，官能部分为或包含沿着GAG聚合物主链的一个以上羟基。在一些实施方式中，官能部分为或包含沿着GAG聚合物主链的一个以上羧基。

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物包含或由通过连接剂连接的多个硫酸化GAG聚合物链组成。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物包含或由通过连接剂连接的多个硫酸化GAG聚合物链和至少一种其他聚合物组成。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物包含或由通过连接剂连接的多个硫酸化GAG聚合物链和至少两种其他聚合物组成。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物包含或由通过连接剂连接的多个硫酸化GAG聚合物链和至少三种其他聚合物组成。在一些实施方式中，包括本段中描述的实施方式，硫酸化GAG是硫酸软骨素。在一些实施方式中，包括本段中描述的实施方式，其他聚合物是除硫酸软骨素之外的硫酸化GAG。在一些实施方式中，包括本段中描述的实施方式，其他聚合物是非硫酸化GAG。在一些实施方式中，包括本段中描述的实施方式，其他聚合物是透明质酸(HA)或羧甲基纤维素(CMC)。

应理解，本发明的聚合物缀合物与单个GAG聚合物链相比通常具有更高(例如增加)的分子量，但不会形成具有延伸交联网络的凝胶。在一些实施方式中，与用作起始材料的未连接的硫酸化GAG相比，本发明的聚合物缀合物的分子量在特定范围内(例如，聚合物缀合物的分子量为单个未连接的硫酸化GAG起始材料的分子量的3倍至100倍以上)。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物是分子量在特定范围内(例如，单个未连接的硫酸化GAG起始材料的分子量的3倍至100倍以上)的支化多链缀合物。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物是分子量在特定范围内(例如，单个未连接的硫酸化GAG起始材料的分子量的3倍至100倍以上)的瓶刷状多链缀合物。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物的分子量为单个未连接的硫酸化GAG起始材料的约3倍至100倍、3倍至75倍、3倍至50倍、3倍至25倍、5倍至100倍、5倍至75倍、5倍至50倍和5倍至25倍的范围内。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物的分子量为单个未连接的硫酸化GAG起始材料的分子量的5倍至25倍。已实现了具有非常高分子量的水溶性聚合物。例如，已实现了分子量大于500千、600千、700千、800千、900千、100万、150万、200万、250万以上的交联硫酸化GAG。

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物可溶于水溶液或盐水。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物包含多个硫酸化糖胺聚糖(GAG)聚合物链，其中每个硫酸化GAG通过接头剂连接到一个或多个硫酸化GAG聚合物链，所述聚合物缀合物可溶于水溶液且分子量为单个未连接的硫酸化GAG分子量的3倍至100倍。

不希望受任何特定理论的约束，聚合物缀合物变型包括但不限于变化的长度、硫酸化模式、分子量、化学组成等。可使用本文提供的方法控制的这些变化可影响聚合物缀合物的构象、分子量、水合功能、机械功能和细胞信号传导功能。

接头剂

本领域技术人员将熟悉适合于连接GAG聚合物和根据本发明使用的其他聚合物的直接接头剂的类型。应理解，术语“连接剂”、“接头剂”、“交联剂”和“接头”是可互换的，其中应理解接头是由与接头剂反应衍生的缀合物的一部分。

在一些实施方式中，接头剂为双官能的。在一些实施方式中，接头剂是非聚合的。例如，聚合接头的特征在于重复单元。在一些实施方式中，接头剂仅是聚合的，其中单体单元重复10次以下。在一些实施方式中，接头剂仅是聚合的，其中单体单元重复5次以下。在一些实施方式中，接头剂的分子量小于约150Da、200Da、250Da、300Da、350Da、400Da、450Da、500Da、600Da、700Da、800Da、900Da或1,000Da。在一些实施方式中，接头剂是非聚合的且小于约150Da、200Da、250Da、300Da、350Da、400Da、450Da、500Da、600Da、700Da、800Da、900Da或1,000Da。在一些实施方式中，接头剂是非聚合的且小于约1,000Da。在一些实施方式中，接头剂是非聚合的且小于约500Da。在一些实施方式中，接头剂是非聚合的且小于约250Da。在一些实施方式中，接头剂是非聚合的且小于约200Da。在一些实施方式中，接头剂是非聚合的且小于约150Da。在一些实施方式中，接头剂是非聚合的且小于150Da、200Da、250Da、300Da、350Da、400Da、450Da、500Da、600Da、700Da、800Da、900Da或1,000Da。

在一些实施方式中，接头剂选自二乙烯基砜(DVS)、二环氧化物、表氯醇(Epi)、丁二醛缩水甘油醚(BDDE)及它们的组合。在一些实施方式中，接头剂为表氯醇(Epi)。在一些实施方式中，接头剂为丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。在一些实施方式中，接头剂为双碳化二亚胺。在一些实施方式中，接头剂为亚苯基-双(乙基碳化二亚胺)。在一些实施方式中，接头剂为1,1'-羰基二咪唑。在一些实施方式中，接头剂为二乙烯基砜(DVS)。

在一些实施方式中，接头剂为溴乙酸NHS酯、6-(碘乙酰氨基)己酸NHS酯、马来酰亚胺乙酸NHS酯、马来酰亚胺基苯甲酸NHS酯或MMCCH(4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基酰肼)。

在一些实施方式中，接头是包含2至约20个氨基酰基残基的肽片段，直链或支链烷基或芳基羧酸酯，或饱和或不饱和、直链或支链的C_1-20烃链，其中，接头的一个以上亚甲基单元可选且独立地被环丙基、-CHOH-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO₂-、SO₂N(R)-、-O-、C(O)-、-OC(O)--C(O)O-、-S-、-SO-、-SO₂-、-C(＝S)-或-C(＝NR)-取代。

在一些实施方式中，接头或接头剂包含短的聚(亚烷基氧化物)链。在一些实施方式中，接头或接头剂为两端具有环氧基的短的聚(亚乙基氧化物)链，例如聚(乙二醇)二缩水甘油醚。

优选的接头是水溶性的且其特征在于与亲核基团(例如GAG上的羟基侧链和修饰剂上存在的胺)反应的部分。

硫酸化GAG

在一些实施方式中，根据本发明使用的硫酸化GAG选自硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素及它们的组合。在一些实施方式中，硫酸化GAG是硫酸软骨素。硫酸软骨素由N-乙酰半乳糖胺(GalN)和葡萄糖醛酸(GlcN)的重复二糖单元组成。在一些实施方式中，硫酸软骨素可具有超过100种糖类，它们可以各自独立地在不同位置和以不同数量被硫酸化(例如硫酸软骨素A、C、D和E)。在一些实施方式中，硫酸化GAG的分子量可大于约1,000Da、5,000Da、10,000Da、15,000Da、20,000Da、30,000Da，40,000Da、50,000Da和100,000Da或可以在包括这些数中任两个的范围内。在一些实施方式中，硫酸软骨素的分子量可大于约1,000Da、5,000Da、10,000Da、15,000Da、20,000Da、30,000Da，40,000Da、50,000Da和100,000Da或可以在包括这些数中任两个的范围内。硫酸化GAG通常从天然来源获得，但可以由非动物来源或合成来源提供。

修饰GAG

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物可通过使用修饰GAG来制备，其中至少一种修饰剂已被引入至少一种聚合物GAG链。如上所述，GAG具有沿着链的许多羟基和羧基官能团。此外，GAG的还原端提供了单一且独特的化学官能团。为了延伸和增强本发明中所述的新型组合物的治疗益处，本发明包括如下认识：可以在与连接剂反应之前(或之后)将修饰剂引入GAG链。用化学修饰的GAG或GAG糖缀合物来实施本发明方法将提供具有修饰剂赋予的额外益处的高分子量蛋白聚糖模拟物。例如，含有对胶原蛋白I、胶原蛋白II、其他胶原蛋白异构体、弹性蛋白、整合素受体或其他ECM成分或细胞表面蛋白(包括但不限于半乳凝素)具有亲和力的肽的硫酸化GAG将使蛋白聚糖模拟物能够更特异地结合到目标生物分子。文献描述了GAG的共价修饰的几个实例，本领域技术人员知晓用于此种修饰的合适化学物。

在一些实施方式中，硫酸化GAG可沿着GAG聚合物链进行修饰。在一些实施方式中，在将GAG链骨架与连接剂连接之前，可通过本领域技术人员已知的各种方法将修饰剂引入到硫酸化GAG上。在一些实施方式中，可使用本领域技术员熟悉的还原端化学(例如还原胺化)将修饰剂引入硫酸化GAG的还原端。

在一些实施方式中，沿着GAG聚合物链通过羧基来修饰硫酸化GAG。在一些实施方式中，羧基经受肽偶联条件以形成酰胺键，从而引入修饰剂。合适的肽偶联条件在本领域中是众所周知的，包括在Han等，Tetrahedron 2004，60：2447-67和VR Pattabiraman等，Nature 2011，480：471-479中详细描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，合适的肽偶联条件包括选自碳化二亚胺或三唑活化试剂的肽偶联试剂，在碱(例如DIEA或本领域技术人员熟悉的其他碱)存在下。在某些实施方式中，肽偶联条件包含添加HOBt、HOAt、DMAP、BOP、HBTU、HATU、BOMI、DCC、EDC、IBCF或它们的组合。在一些实施方式中，肽偶联剂选自三嗪活化剂，例如4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)。

在一些实施方式中，可溶高分子量硫酸化GAG组合物可用聚合物制备，所述聚合物已被基团化学取代以增强其在预期应用中的性能。在一些实施方式中，此类修饰剂沿着GAG多糖链无规地被取代或仅在该链的还原端被取代。在一些实施方式中，所提供的聚合物缀合物包含被已知对ECM组分(例如胶原蛋白、弹性蛋白)具有强亲和力的肽修饰剂取代的硫酸化GAG，例如硫酸软骨素(ChS)。在其他实施方式中，所提供的聚合物缀合物包含被抗氧化剂修饰剂或其他分子取代以增强其治疗益处的硫酸化GAG。肽缀合是本领域中众所周知的向合成聚合物和生物材料添加生物识别和功能的手段。许多短肽基序已被识别并用于生物材料应用，其可用于形成本发明的GAG缀合物。这些肽中的许多来源于对给定目标生物分子具有所需亲和力的天然蛋白质。

在一些实施方式中，所提供的聚合物缀合物包含被整合素结合修饰剂取代的硫酸化GAG。最熟知的用于结合细胞表面整合素的肽基序源自纤维连接蛋白：GRGDS(SEQ ID NO：1)、PHSRN(SEQ ID NO：2)、REDV(SEQ ID NO：3)和LVD。这些肽及其衍生物对细胞表面整合素具有亲和力，并与生物材料基质共价结合以固定细胞。源自层粘连蛋白的整合素结合肽也被用于将细胞吸引到生物材料中：YIGSR(SEQ ID NO：4)、GIIFFL(SEQ ID NO：5)、IKVAV(SEQID NO：6)、它们的衍生物等。

在一些实施方式中，所提供的聚合物缀合物包含被胶原蛋白结合剂取代的硫酸化GA G。已知有几种肽可结合至胶原蛋白表面。一些衍生自饰胶蛋白聚糖(Decorin)：SYIRIADTNITGC(SEQ ID NO：7)(称为dc-13)、LRELHLNNN(SEQ ID NO：8)(IS-6)和LHERHLNNN(SEQID NO：9)。另一种众所周知的胶原蛋白结合肽是[GPO]7，一种甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸胶原蛋白基序的7聚体重复序列，对原纤维胶原蛋白具有螺旋亲和力。肽GLRSKSKKFRRPDIQYPDA(SEQ ID NO：10)被描述于US 9133246 B2，其中它被用作靶向胶原蛋白的融合蛋白的一部分。US 9200039 B2描述了胶原蛋白结合肽RRRANAALKAGELYKSILYGG(SEQ ID NO：11)(称为SILY)和WYRGRLGC(SEQ ID NO：12)以及若干其它实例。此外，US8846003 B2描述了在胶原蛋白III表面结合具有特异性的肽，例如：KELNLVYTGC(SEQ IDNO：13)和GSITTIDVPWNVGC(SEQ ID NO：14)。US 8034898 B2中描述了几种对胶原蛋白具有亲和力的环状肽，包括：WHCYTYFPHHYCVYG(SEQ ID NO：15)；GWHCYTYFPHHYCTYG(SEQ ID NO：16)；AWHCYTYPHHYCVYG(SEQ ID NO：17)；LWHCYTYFPHHYCVYG(SEQ ID NO：18)和YWHCYTYFPHHYCVYG(SEQ ID NO：19)。

在一些实施方式中，所提供的聚合物缀合物包含被透明质酸结合修饰剂取代的硫酸化GAG。US 9200039 B2中描述了对ECM中的透明质酸具有亲和力的肽。这些肽包括GAHWQFNALTVRGGGC(SEQ ID NO：20)(称为GAH)和其他实例。

优选地，根据本发明的聚合物缀合物包含被至少一个半乳凝素的聚糖配体取代的至少一个硫酸化GAG聚合物链，例如，包含至少一个β-半乳糖残基(例如β-半乳糖苷)的硫酸化GAG-聚合物链。

在一些实施方式中，所提供的聚合物缀合物包含任何上述肽或聚糖作为修饰剂。

通常，在使GAG交联后，将修饰剂加入可溶性聚合物缀合物中。出乎意料地发现，在交联基本上完成后添加修饰剂可得到改进的聚合物缀合物。

其他聚合物

在所提供的聚合物缀合物的一些实施方式中，硫酸化GAG与其他聚合物和生物分子直接缀合。在一些实施方式中，加入透明质酸(HA)或羧甲基纤维素(CMC)以形成可溶性高分子量杂合聚合物组合物。在一些实施方式中，硫酸化GAG可与分子量大于约250kDa、300kDa、350kDa、400kDa、450kDa、500kDa、1,000kDa或在包括这些数中任两个的范围内的其他聚合物和生物聚合物直接缀合在一起。

制备GAG聚合物缀合物的方法

如上所述，通过适当选择合成试剂和方法来合成本发明的聚合物缀合物。下文讨论是为了说明可用于组装本发明聚合物缀合物的各种方法中的某些方法。然而，本讨论并不意在限制可用于制备本发明化合物的反应或反应顺序的范围。

如下所示的方案A描述了硫酸化GAG(例如硫酸软骨素)和接头剂(例如DVS)可连接的各种位置：

方案A

如下所示的方案B描述了硫酸化GAG与第二种硫酸化GAG和结合接头剂(DVS)反应以形成聚合物缀合物的实例：

方案B

申请人观察到，在硫酸化GAG以高浓度存在的条件下，可以快速形成强透明凝胶。例如，当硫酸软骨素的浓度大于8wt％(100g溶液中含有8g聚合物)且使用足够DVS时，使用M_w＝14,000Da的市售牛源硫酸软骨素材料，添加DVS(在0.1N NaOH溶液中)后1至2小时内可形成水凝胶。

可将DVS/OH比率和聚合物浓度的各种组合表示为溶液中聚合物的重量％。在某些组合中形成凝胶，而在其他组合中不形成凝胶。此外，可以在凝胶形成之前淬灭反应。可以选择反应条件以使反应混合物保持澄清，以及由于形成不溶性、高度修饰的聚合物衍生物，反应变得浑浊或不透明的条件。

本发明提供了制备聚合物缀合物的方法，其中主要产物是可溶于水溶液的硫酸化GAG聚合物缀合物。根据本发明的一个方面，本文提供的方法中使用的硫酸化GAG浓度被选择为避免形成凝胶。

在一些实施方式中，硫酸化GAG的浓度大于约1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％或在包括这些数中任两个的范围内。在一些实施方式中，硫酸化GAG的浓度小于约20wt％、15wt％、12wt％、10wt％、9wt％、8wt％、7wt％、6wt％、5wt％、4wt％、3wt％、2wt％或1wt％。在一些实施方式中，硫酸化GAG的浓度为2wt％至7wt％，例如2wt％至5wt％。

在一些实施方式中，在约8wt％至16wt％ChS范围内进行的实验表明，凝胶形成速度随ChS浓度和所用DVS量的增加而增加。例如，当生物聚合物上可用的DVS/羟基当量的摩尔比小于0.1时，即使较高浓度的ChS溶液(10至12wt％)在90分钟后也不会形成凝胶。因此，DVS/羟基摩尔比可以小于约1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01或在包括这些数中任两个的范围内。通常，较高的摩尔比可与较低的硫酸化GAG浓度一起使用。

在一些实施方式中，当这些反应在DVS/羟基比系统地增加的条件下进行时，观察到凝胶形成速度加快。此外，发现当DVS/羟基水平较高(接近或高于1.0)时，一些反应变得浑浊，甚至形成白色固体沉淀。通过NMR光谱对该不溶性产物进行表征，发现它是一种被乙烯基砜基团高度取代的硫酸软骨素衍生物。本发明的方法通常在避免凝胶形成并保持水溶性聚合物缀合物的条件下进行。

“支化”聚合物缀合物

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物具有支化结构。在一些实施方式中，硫酸化GAG与连接剂在如下条件下反应：GAG浓度以及连接剂与GAG的摩尔比被选择为提供可溶性支化聚合物而非延伸交联网络。在一些实施方式中，接头剂为DVS，DVS/羟基比为约0.01至0.6。在一些实施方式中，DVS/羟基比为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或在包括这些数中任两个的范围内。

在某些实施方式中，本发明提供了制备聚合物缀合物的方法，其包括如下步骤：i)提供浓度为约2wt％至20wt％的硫酸化GAG的水溶液；以及ii)使硫酸化GAG与连接剂接触，其中GAG羟基与连接剂的摩尔比小于凝胶形成所需的摩尔比以形成可溶性支化聚合物。在一些实施方式中，步骤i中的硫酸化GAG的分子量为10,000Da至100,000Da。在一些实施方式中，GAG羟基与连接剂的摩尔比(例如DVS/羟基比)为0.01至0.6。在一些实施方式中，步骤i中的硫酸化GAG的分子量为5,000Da至200,000Da(例如10,000Da至100,000Da)，GAG羟基与连接剂的摩尔比(例如DVS/羟基比)为0.01至0.6。

在一些实施方式中，硫酸化GAG与直接连接剂在如下条件下反应：可在形成延伸交联网络(例如凝胶)之前终止反应。在这些情况下，通过添加酸(例如HCl)使pH值降至中性值，可以容易地使交联反应终止。同样，获得了可溶性支化聚合物，而不是延伸的交联网络。在一些实施方式中，在反应终止之前，反应发生一定量的时间。在一些实施方式中，反应发生约1至120分钟。在一些实施方式中，反应发生约25至40分钟。在一些实施方式中，反应发生约40分钟。在一些实施方式中，反应发生约90分钟。

在一些实施方式中，支化聚合物缀合物的分子量大于约15,000Da、20,000Da，30,000Da、40,000Da、50,000Da、100,000Da、200,000Da、300,000Da、400,000Da、500,000Da、1000,000Da以上或在包括这些数中任两个的范围内。

“瓶刷状”聚合物缀合物

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物具有瓶刷状结构。在一些实施方式中，硫酸化GAG在顺序引入反应物的条件下与连接剂反应。在一些实施方式中，反应物的此种分阶段添加可显著影响产物的分子结构和性质。例如，在一锅法(1-pot procedure)中，小部分硫酸化GAG可在稀溶液中用连接剂活化，以形成中间体多价反应性核聚合物。随后添加过量的相同或不同的硫酸化GAG导致形成具有瓶刷状结构的可溶性高分子量硫酸化GAG组合物。

因此，在一些实施方式中，本发明提供了通过在单一反应中连续引入硫酸化GAG来制备聚合物缀合物的方法，其包括如下步骤：i)提供硫酸化GAG；以及ii)在小部分硫酸化GAG与全部连接剂反应的条件下，使硫酸化GAG与连接剂反应；以及iii)加入剩余部分的硫酸化GAG以形成具有瓶刷状结构的可溶性缀合物。

在一些实施方式中，能够与连接剂(例如CMC、HA)直接反应的高分子量的核聚合物在两阶段合成程序的初始步骤中反应。然后可以引入硫酸化GAG以与修饰的核聚合物反应，在一锅法中形成瓶刷状聚合物组合物。

在一些实施方式中，本发明提供了制备聚合物缀合物的方法，其包括如下步骤：i)在稀溶液中用连接剂活化核聚合物，以形成中间体多价反应性核聚合物；以及ii)加入过量的硫酸化GAG，以形成可溶性瓶刷状聚合物。在某些实施方式中，步骤i包括在小部分核聚合物与全部连接剂反应的条件下用连接剂活化核聚合物。在某些实施方式中，步骤i包括在稀溶液中用连接剂活化亚化学计量量的核聚合物(即，超过聚合物羟基的过量连接剂)，以形成中间体多价反应性核聚合物。在一些实施方式中，步骤i的核聚合物是与步骤ii中添加的硫酸化GAG相同的硫酸化GAG。在一些实施方式中，步骤i的核聚合物是不同于步骤ii中添加的硫酸化GAG的硫酸化GAG。在一些实施方式中，步骤i的核聚合物不是硫酸化GAG。在某些实施方式中，步骤i中的核聚合物是羧甲基纤维素。在某些实施方式中，步骤i中的核聚合物是透明质酸。

在一些实施方式中，所提供的聚合物缀合物在两步反应中制备，其中，先在稀溶液中用连接剂官能化核聚合物、然后通过沉淀或其他方法分离。可以对用连接剂修饰的中间体核聚合物进行表征和/或纯化。该中间体核聚合物在第二反应中与浓溶液中的硫酸化GAG的后续反应提供了可溶性瓶刷状聚合物组合物。

因此，在一些实施方式中，本发明提供了制备聚合物缀合物的方法，其包括如下步骤：i)在稀溶液中用连接剂官能化核聚合物以形成中间体核聚合物；ii)分离中间体核聚合物；以及iii)使中间体核聚合物与浓溶液中的硫酸化GAG反应以形成可溶性瓶刷状聚合物。

在一些实施方式中，瓶刷状聚合物缀合物的分子量大于约15,000Da、20,000Da、30,000Da、40,000Da、50,000Da、100,000Da、200,000Da、300,000Da、400,000Da、500,000Da、1000,000Da、2000,000Da以上或在包括这些数中任两个的范围内。

在根据本发明的方法中，聚合物缀合物(例如瓶刷状和/或支化聚合物缀合物)的特征在于由接头的不完全反应产生的反应性基团或部分。例如，当使用二乙烯基砜(DVS)作为连接剂时，聚合物缀合物的特征在于未反应的乙烯基部分。考虑到GAG倾向于与DVS反应例如形成硬凝胶，因此与未反应的乙烯基形成水溶性聚合物缀合物是出乎意料的。

可以利用未反应的乙烯基的存在。该方法包括随后添加能够与反应性基团反应以形成共价键的修饰剂。随后添加修饰剂具有至少两个益处。首先，它导致剩余反应性基团的淬灭，以避免在储存期间的无意凝胶化或使用时发生共价反应。第二，它可以赋予聚合物缀合物期望的生物活性，如上文所述的靶向性。

表征技术

如上所述，在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物可溶于水溶液。与已知的GAG聚合物缀合物不同，此类缀合物是具有延伸交联网络的凝胶。虽然本领域技术人员可以区分凝胶材料和非凝胶材料，但为避免疑义，应注意，对于均相溶液中的聚合，延伸交联网络的形成将以溶液特性的损失为特征。例如，反应混合物将不再流动，并且当将凝胶加入大量水中时可能会膨胀但不会溶解。此类凝胶具有固体或粘弹性材料的性质。此外，此类凝胶具有可以使用流变学来量化的粘弹性性质。例如，许多强凝胶的储存模量(G')大于其损失模量(G”)。

在一些实施方式中，所提供的聚合物缀合物在溶解于水中时将保持溶液流动特性。在一些实施方式中，所提供的聚合物缀合物将具有分子量分布和支化度(将是合成方法的特征)，并且在批次之间将是可重复的。在一些实施方式中，所提供的聚合物缀合物的特征在于，在制造所提供的高分子缀合物期间，观察到透明粘性流体而不是凝胶。在一些实施方式中，聚合物缀合物是水溶液中的透明粘性流体。

所提供的聚合物缀合物的表征可通过凝胶渗透色谱(GPC)和动态光散射(DLS)来提供。在一些实施方式中，与流动相关的参数(例如粘度或模量)可通过粘度和流变学确定。

流体动力学半径(Rh)由DLS确定，并与分子量和结构(支化类型/程度)直接相关。在一些实施方式中，将实现与起始材料相比的Rh增强或增加。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物与参考相比具有增大的流体动力学半径。在一些实施方式中，聚集蛋白聚糖可以为用于分子量和Rh的上限的参考模型。在一些实施方式中，起始材料(例如未连接的硫酸化GAG)可用作参考。

DLS是一种直接测定溶液中聚合物尺寸(Rh)的简便方法，但它不能直接测量分子量。知道流体动力学半径允许估算分子量。

软件(Wyatt技术)使用形状模型由Rh估算M_w。该计算可以在输入通用聚合物结构模型(球状、螺旋状、支化)后进行。

聚合物缀合物的纯化

在一些实施方式中，聚合物缀合物可通过本领域技术人员已知的方法来纯化。在一些实施方式中，聚合物缀合物可通过透析来纯化。在一些实施方式中，聚合物缀合物可通过切向流动过滤来纯化。在一些实施方式中，聚合物缀合物可从粗反应产物中沉淀。在某些情况下，聚合物缀合物可从反应混合物中沉淀、收集、再溶解于水中并再次沉淀。可进行多次再溶解/沉淀循环。在实施方式中，聚合物溶液可进行微滤，例如通过0.2微米过滤器。

使用方法

软组织(例如血管、皮肤或肌肉骨骼组织)损伤相当常见。纠正身体软组织缺陷和/或损伤的外科方法通常包括植入由生物相容性惰性材料制成的结构，以试图替代或取代有缺陷功能。植入非生物降解材料会导致永久性结构作为异物留在体内。建议将由可吸收材料制成的植入物用作临时替代物，目的是允许愈合过程来替代可吸收材料。然而，这些方法在长期矫正身体结构方面取得的成功有限。

因此，本发明包括治疗软组织的方法，其包括使软组织与本文所述的聚合物缀合物接触。

随着人年龄增长，随着面部脂肪的减少和皮肤弹性的降低，面部皱缩(皱纹)和皱褶会逐渐形成。皮肤会变形，急性伤口需要更长时间才能愈合，更容易留下疤痕。多年来，医生们尝试了各种方法和材料来对抗面部软组织的体积损失。科学家和医生一直在寻找理想的真皮填充剂。

例如，软组织病况进一步包括：皮肤病况(例如，疤痕修复或治疗创伤性伤口、严重烧伤、皮肤溃疡(例如，褥疮(压力)溃疡、静脉溃疡和糖尿病溃疡)以及外科伤口，例如与皮肤癌切除相关的伤口)；血管病况(例如，血管疾病，例如外周动脉疾病、腹主动脉瘤、颈动脉疾病和静脉疾病；血管损伤；血管发育不良)；影响声带的病况；美容病况(例如，涉及修复、增强或美化的病况)；肌肉疾病；结缔组织(例如肌腱和韧带，包括但不限于牙周韧带和前交叉韧带)病况；以及器官和/或筋膜(例如膀胱、肠、骨盆底)病况。

肌肉骨骼系统的退化和受损软组织导致并增加导致剧烈疼痛和运动受限的医疗并发症的风险。例如，退化和受损的脊柱软组织是全世界数百万人背痛的主要来源。韧带和椎间盘的软组织变性也增加了局部脊柱关节损伤和背痛的风险，包括：关节突关节(小关节)、肋椎关节、骶髂关节、骶椎关节和寰枢关节。

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物用于医药。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物用于治疗与哺乳动物软组织相关的疾病、病症或病况。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物用于治疗与软组织缺陷和/或病症相关的疾病、病症或病况，其中向软组织部位施用本发明的缀合物导致软组织的全部或部分功能恢复。

在一些实施方式中，根据本发明治疗的软组织选自椎间盘、皮肤、心脏瓣膜、关节软骨、软骨、半月板、脂肪组织、颅面、眼、肌腱、韧带、筋膜、纤维组织、滑膜、肌肉、神经、血管及它们的任意组合。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物用于皮肤、矫形、泌尿、伤口修复和局部美容。

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物用于治疗哺乳动物中与ECM降解相关的疾病、病症或病况。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物用于治疗与ECM缺陷和/或病症相关的疾病、病症或病况，向ECM施用本发明的缀合物导致ECM的全部或部分功能恢复。

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物提供了延迟(例如预防)软组织丧失的发作的方法。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物提供了增强软组织的方法。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物提供了用于美容增强的方法。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物提供了治疗患有结缔组织年龄相关变性或结缔组织变性相关疾病的受试者的方法。

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物用于急性伤口愈合。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物用于再生医药。

间质性膀胱炎(IC)或膀胱疼痛综合征(BPS)是一种慢性疾病，在美国影响400万至1200万人，主要是女性。IC/BPS的特点是尿频、尿急和膀胱充盈相关的疼痛。因此，本发明的聚合物缀合物优选用于治疗在患有膀胱疼痛综合征或间质性膀胱炎的患者中发现的受损膀胱尿路上皮。在一些实施方式中，聚合物优选通过膀胱内滴注施用至膀胱。本发明还考虑治疗辐射诱发的膀胱炎、细菌性膀胱炎、化疗相关膀胱炎或氯胺酮诱发的膀胱炎患者。

尽管病因未知且不受任何特定理论限制，但一种主流理论认为：膀胱疼痛症状源于膀胱腔表面紧密不渗透屏障的丧失，导致支配尿路上皮的内脏传入纤维的激活。构成负责膀胱不渗透性的管腔细胞层的“伞形细胞”可能缺失或不完全分化，表面的正常糖胺聚糖(GAG)层受损，紧密连接蛋白表达改变。Parsons证明，IC患者对注入膀胱的尿素的吸收明显高于对照组；Hurst通过MRI明确显示，IC/BPS患者的尿路上皮渗透性明显高于正常对照组。尚不清楚膀胱如何失去其不渗透性。有证据表明，它可以通过神经连接(可能由炎性细胞调节)，也可以通过尿液中的物质或阳离子清除剂的流失而内源性发生。

尽管已尝试了多种药剂，但IC/BPS的治疗选择有限。通过GAG补充治疗恢复尿路上皮不渗透性，取得了一些成功。GAG补充包括囊内施用硫酸软骨素和透明质酸(单独或组合)、肝素或聚硫酸戊聚糖

不幸地，反应率很少超过50％至60％。目前GAG替代疗法的有限疗效可通过这些药物不能复制尿路上皮的天然GAG层来解释。尿路上皮GAG层由蛋白聚糖(PG)组成，主要是二聚糖和珍珠聚糖。PG是糖蛋白，通常被硫酸化GAG链的簇取代，从而增加这些硫酸化GAG与其他生物分子的相互作用，产生非常高的阴离子电荷区。由此产生的渗透压确保了富含PG的组织和界面具有非常有效的水合作用。目前IC/BPS中的GAG补充方法仅提供线性单链GAG(例如透明质酸)，其为低分子量(<50kDa)的非硫酸化或硫酸化的GAG，例如硫酸软骨素。这些单链GAG不能模拟天然尿路上皮表面上的PG提供的聚集硫酸化GAG环境。PG本身不是实用治疗剂，因为它们是难以从组织中分离和纯化的复杂生物分子。

然而，本发明的蛋白聚糖模拟缀合聚合物通过呈现硫酸化GAG链的多价阵列来模拟PG结构，用于以对单一线性GAG链而言不可能的方式结合生物表面。对于恢复IC/BPS中的膀胱不渗透性，与膀胱内皮的结合至关重要。因此，本发明的蛋白聚糖模拟缀合聚合物呈现出的硫酸化GAG链的此种多价显示是一项重大创新。优选地，本发明的蛋白聚糖模拟物通过用例如半乳凝素的聚糖配体(例如包含β-半乳糖苷的配体)进一步官能化来提供IC/BPS的靶向治疗。例如，此种用β-半乳糖苷“修饰”的聚合物缀合物将靶向膀胱上皮中存在的半乳凝素。因此，本发明提供了治疗患者的间质性膀胱炎(IC)的方法，其包括向患者施用本发明聚合物缀合物的步骤，优选施用至少一个硫酸化GAG聚合物链包含至少一个半乳凝素的聚糖配体(例如β-半乳糖苷)的本发明聚合物缀合物。

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物或任何其他GAG生物聚合物与膀胱的MRI诊断成像相结合使用来治疗IC/BPS，包括灌注适当的MRI造影剂，例如Gd(DTPA)、Gd(DOTA)或其他Gd系MRI造影试剂，并观察病理性膀胱渗透性，如文献[Towner,R.A.,Wisniewski,A.B.,Wu,D.H.,Van Gordon,S.B.,Smith,N.,North,J.C.,…Hurst,R.E.，AFeasibility Study to Determine Whether Clinical Contrast Enhanced MagneticResonance Imaging can Detect Increased Bladder Permeability in Patients withInterstitia l Cystitis，Journal of Urology，195(3)：631-638；https://doi.org/10.1016/j.juro.2015.08.077]中所描述的。本发明提出了将此种诊断性Gd系MRI造影剂与本发明的聚合物缀合物或其他GAG组合使用来治疗IC/BPS，特别是治疗膀胱渗透性可测量的患者。

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物用于治疗退化椎间盘。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物用于将聚合物缀合物施用到退化椎间盘核中的方法中，以增加椎间盘的渗透势。将聚合物缀合物材料施用到退化椎间盘核中可以恢复正常的椎间盘高度和功能。优选地，本发明的聚合物缀合物通过直接注射施用到椎间盘中。此种施用可导致有缺陷椎间盘的承载和粘弹性特性的全部或部分恢复。

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物用于膝关节和其他关节的骨关节炎OA。OA，也称为退行性关节病，是最常见的关节炎形式，由伴随衰老的软骨逐渐分解而导致。通常，OA发生在由于其他类型的关节炎(例如类风湿性关节炎)造成的创伤或慢性关节损伤之后。或者，OA可能由过度使用特定关节而造成。OA最常涉及肘部、手指、臀部、膝盖、肩部、手腕、脊柱和脚趾的关节。临床上，OA的特征在于关节疼痛、压痛、运动受限、捻发音(crepitus)和不可逆转的渐进性残疾。它可以存在于这些关节之一或所有关节中。尽管大多数身体组织可以在受伤后进行修复，但据认为软骨修复受到有限的血液供应和缺乏有效的软骨再生机制的阻碍。优选地，本发明提供了向患有OA的患者施用本发明的聚合物缀合物的方法。优选地，本发明的聚合物缀合物可通过直接注射到受累关节来施用给患者。优选地，本发明的聚合物缀合物可通过与其他粘性补充剂(包括但不限于含透明质酸(HA)的粘性补充剂，例如

和

)一起直接注射到受累关节来施用给患者。

聚合物缀合物可用于组织修复，例如用于修复受损组织的方法和材料。可以根据本文提供的方法修复任何合适的组织。例如，组织可以为在手术修复后组织粘附出现问题的任何组织。在某些情况下，组织可以为肌腱、韧带、肌肉、子宫或腹部组织。例如，组织可以为肩袖的肌肉和肌腱，受损组织可以为撕裂的肩袖。例如，可通过本文所述方法修复或替换的肌腱可包括岗上肌腱、岗下肌腱、跟腱、胫骨前肌腱、腓骨长肌腱、胫中肌腱、指长伸肌腱、拇长伸肌腱、指长屈肌腱或髌肌腱。例如，可通过本文所述方法修复或替换的韧带可包括尺骨副韧带、桡骨副韧带、医学副韧带、外侧副韧带、前交叉韧带、后交叉韧带、前或后距腓韧带、跟腓韧带或距骨后韧带。例如，聚合物缀合物可与组织损伤部位接触。例如，聚合物缀合物可以与肌腱或韧带的撕裂端接触。接触可能发生在撕裂组织的外科修复(例如缝合)之前、期间或之后。为了防止组织粘连和抗粘结剂在组织撕裂端之间的渗透，聚合物缀合物可以在植入之前、植入之后或植入之前和之后提供防粘结剂涂层。当聚合物缀合物与组织接触时，可以将抗粘附涂层施用到周围组织。该方法的益处提供了被动屏障以防止抗粘结剂泄漏到伤口部位，和/或可主动促进伤口愈合，和/或在伤口愈合期间防止伤口组织粘附到周围软组织。

组织修复或愈合的其他实例包括膜修复，例如与耳朵、鼻子和喉咙或真皮相关的粘膜。例如，本发明包括治疗酸反流、粘膜炎、牙周炎、鼻窦炎、慢性鼻窦炎、链球菌性咽炎、疱疹、中耳炎、特应性皮炎、酒渣鼻、牛皮癣、湿疹、痤疮、面部红斑、脓疱、烧伤、体癣、念珠菌病、带状疱疹等。本发明还包括眼部递送。眼部疾病包括眼部感染、眼睑炎、干眼症、包涵体结膜炎、青光眼、炎性眼病病况等。

本发明的聚合物缀合物可与治疗哺乳动物椎间盘疾病或病况的任何已知或迄今未知方法结合使用。优选地，受试者为人类。

施用

在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物可与一种以上赋形剂、缓冲剂、载体、稳定剂、防腐剂和/或疏松剂一起配制。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物可使用完全生物相容(即无毒)的赋形剂配制。在一些实施方式中，本发明的聚合物缀合物可使用赋形剂配制，并通过盐(例如磷酸钠盐)在生理pH下缓冲。

本发明的聚合物缀合物可以使用本领域已知的各种方法和各种制剂施用到受试者的软组织部位，以进行其功能恢复。施用方法根据所治疗的病况和药物组合物进行选择。本发明聚合物缀合物的施用可以多种方式进行，包括但不限于皮肤施用、皮下施用、静脉施用、口服施用、局部施用、经皮施用、腹腔内施用、肌肉内施用和膀胱内施用。例如，微粒、微球和微胶囊制剂可用于口服施用、肌肉内施用或皮下施用。脂质体和纳米颗粒还适用于静脉施用。本发明聚合物缀合物的施用可以通过单一途径或通过几种途径同时进行。例如，口服施用可以伴随静脉注射或肠外注射。

优选地，通过膀胱内滴注施用受试组合物。该过程通常包括将导管插入尿道并用含有受试组合物的合适稀释剂填充膀胱。可通过手动灌输或肾泵来进行填充。电动药物施用可进一步协助膀胱内药物递送(参见例如Riedl,C.R.等，J.Endourol.1998，12：269-72；通过引用并入)。

优选地，本发明的缀合物通过使用小规格针头或微针或微针阵列直接注射到真皮中来施用。作为支链生物聚合物的本发明聚合物缀合物在溶液中具有低粘度的优点，这有助于通过小规格针注射。

在一些实施方式中，优选本发明的聚合物缀合物在施用后不会明显降解。在一些实施方式中，优选本发明的组合物在组织中快速或缓慢降解。因此，当在体内施用时，聚合物缀合物可以为永久性的、可以通过酶降解或可以在溶剂(例如水)存在下降解。

本发明的方法包括确定用于治疗IC症状的化合物和药物组合物的最佳剂量，其可考虑动物实验的结果来确定。更具体的剂量明显取决于施用方法、受试者状况(例如年龄、体重、性别、敏感度、所吃食物)、给药间隔、联合施用的药物以及IC的严重性和程度。给定条件下的最佳剂量和施用频率必须由医学专家基于这些指南进行适当剂量测试来确定，并且不构成本领域技术人员的过度实验。

本发明的聚合物缀合物也可使用本领域技术人员众所周知的缓释或长期递送方法来施用。本文所用的“缓释”或“长期释放”意指递送体系将药物治疗量的聚合物缀合物施用超过一天、优选超过一周、最优选至少约30天至60天以上。长期释放体系可包含含有聚合物缀合物(例如生物可降解聚合物)的可植入固体或凝胶。

本发明的聚合物缀合物可与一种以上其他药物(或其任意组合)组合施用。本发明的聚合物缀合物可与另一种药理活性化合物或两种以上其他药理活性化合物有效组合，用于治疗与IC相关的疼痛和/或下尿路症状(LUTS)和/或疼痛膀胱综合征和/或膀胱疼痛综合征。例如，本发明的聚合物缀合物可与选自如下的一种以上试剂同时、顺序或单独施用：

阿片类镇痛剂，例如吗啡、海洛因、氢吗啡酮、氧吗啡酮、羟甲左吗南、烯丙左吗喃、美沙酮、哌替啶、芬太尼、可卡因、可待因、二氢可待因、氧可酮、氢可酮、丙氧芬、纳美芬、纳洛芬、纳洛酮、纳曲酮、丁丙诺啡、布托啡诺、纳布啡或镇痛新；

非甾体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林、双氯芬酸、二氟尼柳(diflusinal)、依托度酸、芬布芬、非诺洛芬、氟苯柳、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯灭酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、尼美舒利、硝基氟比洛芬(nitroflurbiprofen)、奥沙拉嗪、奥沙普嗪、苯基丁氮酮、吡罗昔康、柳氮磺胺吡啶、舒林酸、托美汀或佐美酸；

巴比妥酸盐镇静剂，例如异戊巴比妥、阿普比妥、仲丁巴比妥、异丁巴比妥、甲基苯巴比妥、美沙比妥、美索比妥、戊巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥、他布比妥、硫戊巴比妥(theamylal)或硫喷妥钠；

具有镇静作用的苯二氮卓，例如利眠宁、氯拉卓酸(clorazepate)、地西泮、氟拉西泮、劳拉西泮、氧西泮、替马西泮或三唑仑；

具有镇静作用的H₁拮抗剂，例如苯海拉明、吡拉明、异丙嗪、氯苯那敏或氯环利嗪；

镇静剂，例如苯乙哌啶酮(glutethimide)、甲丙氨酯(meprobamate)、甲喹酮(methaqualone)或氯醛比林(dichloralphenazone)；

骨骼肌松弛剂，例如巴氯芬、卡立普多(carisoprodol)、氯唑沙宗、环苯扎林、美索巴莫或邻甲苯海拉明(orphrenadine)；

NMDA受体拮抗剂，例如右美沙芬((+)-3-羟基-N-甲基吗啡喃)或其代谢物右啡烷((+)-3-羟基-N-甲基吗啡喃)、氯胺酮、美金刚、吡咯喹啉醌、顺式-4-(磷酰甲基)-2-哌啶羧酸、布地平、EN-3231(

吗啡和右美沙酮的组合制剂)、托吡酯、1,3,3,5,5-五甲基环己胺(neramexane)或perzinfotel，包括NR2B拮抗剂，例如艾芬地尔、曲索罗地或(-)-(R)-6-{2-[4-(3-氟苯基)-4-羟基-1-哌啶基]-1-羟基乙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮；

α-肾上腺素能药物，例如多沙唑嗪、坦索罗辛、可乐定、胍法辛、右美托咪定(dexmetatomidine)、莫达非尼、特拉唑嗪、吲哚拉明、阿夫唑嗪、西洛多辛或4-氨基-6,7-二甲氧基-2-(5-甲烷-磺胺基-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-基)-5-(2-吡啶基)喹唑啉、哌唑嗪；

三环抗抑郁剂，例如地昔帕明、丙咪嗪、阿米替林或去甲替林；

抗惊厥剂，例如卡马西平、拉莫三嗪、托吡酯或丙戊酯；

速激肽(NK)拮抗剂，特别是NK-3、NK-2或NK-1拮抗剂，例如(αR,9R)-7-[3,5-双(三氟甲基)苄基]-8,9,10,11-四氢-9-甲基-5-(4-甲基苯基)-7H-[1,4]重氮杂[2,1-g][1,7]-萘吡啶-6-13-二酮(TAK-637)、5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙氧基-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基]-甲基]-1,2-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮(MK-869)、阿瑞匹坦、拉奈匹坦、达匹坦或3-[[2-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]-甲氨基]-2-苯基哌啶(2S,3S)；

毒蕈碱类拮抗剂，例如奥昔布宁、托特罗定、弗斯特罗定、5-羟甲基托特罗定、丙哌维林、曲司氯铵、达非那新、索利那新、替米维林(temiverine)和异丙托铵；

COX-2选择性抑制剂，例如塞来昔布、罗非昔布、帕瑞昔布、伐地昔布、德拉昔布、依托昔布或罗美昔布；

煤焦油镇痛剂，特别是醋氨酚/对乙酰氨基酚；

神经抑制剂，例如氟哌利多、氯丙嗪、氟哌啶醇、奋乃静、硫利达嗪、美索达嗪、三氟拉嗪、氟奋乃静、氯氮平、奥氮平、利培酮、齐拉西酮、奎硫平、舍吲哚、阿立哌唑、索奈哌唑(sonepiprazole)、布南色林、伊潘立酮、哌罗匹隆、雷氯必利、佐替平、联苯芦诺、阿塞那平、鲁拉西酮、氨磺必利、巴洛哌酮(balaperidone)、帕林多(palindore)、依利色林、奥沙奈坦、利莫那班、美兰纳坦(meclinertant)、

或沙利佐坦；

辣椒素受体激动剂(例如树脂毒素)或拮抗剂(例如辣椒平)；

β肾上腺素能药物，例如普萘洛尔；

局部麻醉剂，例如美西律；

皮质类固醇，例如地塞米松；

5-HT受体激动剂或拮抗剂(例如苯噻啶)，特别是5-HT_1B/1D激动剂，例如依来曲普坦、舒马曲普坦、那拉曲普坦、佐米曲普坦或利扎曲普坦；

5-HT_2A受体拮抗剂，例如R(+)-α-(2,3-二甲氧基-苯基)-1-[2-(4-氟苯基乙基)]-4-哌啶甲醇(MDL-100907)；

胆碱能(烟碱)镇痛剂，例如异丙克兰(TC-1734)、(E)-N-甲基-4-(3-吡啶基)-3-丁烯-1-胺(RJR-2403)、(R)-5-(2-氮杂环丁烷甲氧基)-2-氯吡啶(ABT-594)或尼古丁；

TRAMADOL^TM；

PDE-5抑制剂，例如5-[2-乙氧基-5-(4-甲基-1-哌嗪基-磺酰基)苯基]-1-甲基-3-正丙基-1,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(西地那非)、(6R,12aR)-2,3,6,7,12,12a-六氢-2-甲基-6-(3,4-亚甲基二氧苯基)-吡嗪并[2′1′,1:6,1]-吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(IC-351或他达拉非)、2-[2-乙氧基-5-(4-乙基-哌嗪-1-基-1-磺酰基)-苯基]-5-甲基-7-丙基-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(伐地那非)、5-(5-乙酰基-2-丁氧基-3-吡啶基)-3-乙基-2-(1-乙基-3-氮杂环丁基)-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮、5-(5-乙酰基-2-丙氧基-3-吡啶基)-3-乙基-2-(1-异丙基-3-氮杂环丁基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮、5-[2-乙氧基-5-(4-乙基哌嗪-1-基磺酰基)吡啶-3-基]-3-乙基-2-[2-甲氧基乙基]-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮、4-[(3-氯-4-甲氧苄基)氨基]-2-[(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基]-N-(嘧啶-2-基甲基)嘧啶-5-甲酰胺、3-(1-甲基-7-氧-3-丙基-6,7-二氢-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)-N-[2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基]-4-丙氧基苯磺酰胺；

α-2-δ配体，例如加巴喷丁、普瑞巴林、3-甲基加巴喷丁、(1α,3α,5α)(3-氨基-甲基-二环[3.2.0]庚-3-基)-乙酸、(3S,5R)-3-氨基甲基-5-甲基-庚酸、(3S,5R)-3-氨基-5-甲基-庚酸、(3S,5R)-3-氨基-5-甲基-辛酸、(2S,4S)-4-(3-氯苯氧基)-脯氨酸、(2S,4S)-4-(3-氟苄基)-脯氨酸、[(1R,5R,6S)-6-(氨基甲基)二环[3.2.0]庚-6-基]乙酸、3-(1-氨基甲基-环己基甲基)-4H-[1,2,4]恶二唑基-5-酮、C-[1-(1H-四唑-5-基甲基)-环庚基]-甲胺、(3S,4S)-(1-氨基甲基-3,4-二甲基-环戊基)-乙酸、(3S,5R)-3-氨基-5-甲基-壬酸、(3R,4R,5R)-3-氨基-4,5-二甲基-辛酸、(3R,4R,5R)-3-氨基-4,5-二甲基-辛酸、(3S,5R)-3-氨基甲基-5-甲基-辛酸；

大麻素(cannabinoid)；

代谢型谷氨酸亚型1受体(mGluR1)拮抗剂；

血清素再摄取抑制剂，例如舍曲林、舍曲林代谢物去甲基舍曲林、氟西汀、去甲氟西汀(氟西汀去甲基代谢物)、氟伏沙明、帕罗西汀、西酞普兰、西酞普兰代谢物去甲基西酞普兰、依地普仑、d,l-苯氟拉明、氟西汀(femoxetine)、伊福西汀、氰基度硫平(cyanodothiepin)、利托西汀、达泊西汀、奈法唑酮、西文氯胺和曲唑酮；

去甲肾上腺素(降肾上腺素)再摄取抑制剂，例如马普替林、洛非帕明、米氮平、羟丙替林、非唑拉明(fezolamine)、托莫西汀、米安色林、安非他酮(buproprion)、安非他酮代谢物羟基安非他酮、诺米芬辛和维洛沙秦

特别是选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂，例如瑞波西汀，特别是(S,S)-瑞波西丁；

双重血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂，例如文拉法辛、文拉法辛代谢物O-去甲基文拉法辛、氯米帕明、氯米帕明代谢物去甲基氯米帕明、度洛西汀、米那普仑和丙咪嗪；

诱导型氮氧合酶(iNOS)抑制剂，例如S-[2-[(1-亚氨基乙基)氨基]乙基]-L-同型半胱氨酸、S-[2-[(1-亚氨基乙基)-氨基]乙基]-4,4-二氧基-L-半胱氨酸、S-[2-[(1-亚氨基乙基)氨基]乙基]-2-甲基-L-半胱氨酸、(2S,5Z)-2-氨基-2-甲基-7-[(1-亚氨基乙基]氨基]-5-庚酸、2-[[(1R,3S)-3-氨基-4-羟基-1-(5-噻唑基)-丁基]硫代]-5-氯-3-吡啶甲腈、2-[[(1R,3S)-3-氨基-4-羟基-1-(5-噻唑基)丁基]硫代]-4-氯苯腈、(2S,4R)-2-氨基-4-[[2-氯-5-(三氟甲基)苯基]硫代]-5-噻唑丁醇、2-[[(1R,3S)-3-氨基-4-羟基-1-(5-噻唑基)丁基]硫代]-6-(三氟甲基)-3-吡啶甲腈、2-[[[(1R,3S)-3氨基-4-羟基-1-(5-噻唑基)丁基]硫代]-5-氯苯腈、N-[4-[2-(3-氯苄基氨基)乙基]苯基]噻吩-2-甲脒或胍乙基二硫化物；

乙酰胆碱酯酶抑制剂，例如多奈哌齐；

前列腺素E₂亚型4(EP4)拮抗剂，例如N-[({2-[4-(2-乙基-4,6-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)苯基]乙基}氨基)-羰基]-4-甲基苯磺酰胺或4-[(1S)-1-({[5-氯-2-(3-氟苯氧基)吡啶-3-基]羰基}氨基]苯甲酸；

白三烯B₄拮抗剂，例如1-(3-联苯-4-基甲基-4-羟基-色满-7-基)-环戊烷羧酸(CP-105696)、5-[2-(2-羧基乙基)-3-[6-(4-甲氧基苯基)-5E-己烯基]氧基苯氧基]-戊酸(ONO-4057)或DPC-11870；

5-脂氧合酶抑制剂，例如齐留通、6-[(3-氟-5-[4-甲氧基-3,4,5,6-四氢-2H-吡喃-4-基)苯氧基-甲基]-1-甲基-2-喹啉酮(ZD-2138)或2,3,5-三甲基-6-(3-吡啶甲基)、1,4-苯醌(CV-6504)；

钠通道阻滞剂，例如利多卡因或布比卡因；

5-HT3拮抗剂，例如昂丹司琼；

糖胺聚糖层替代物和抗炎剂，例如戊聚糖多硫酸酯(ELMIRON^TM)；

β-3激动剂，例如YM-178(米拉贝隆或2-氨基-N-[4-[2-[[(2R)-2-羟基-2-苯基乙基]氨基]乙基]苯基]-4-噻唑乙酰胺)、索拉勃隆(solabegron)、KUC-7483(利托贝隆(ritobegron)或2-[4-[2[[(1S,2R)-2-羟基-2-(4-羟基苯基)-1-甲基乙基]氨基]-乙基]-2,5-二甲基苯氧基]-乙酸)或AK-134；

抗组胺剂，例如羟嗪；

H₂拮抗剂，例如西咪替丁或雷尼替丁；

硝酸银；

类固醇；

多柔比星；

硫酸软骨素；

色甘酸二钠；

奥昔氯生(Clorpactin^TM)；以及

免疫抑制剂，例如环孢霉素。

实施例

下文实施例意在对本发明的某些实施方式进行说明，而不是限制本发明的范围。

材料和方法

硫酸软骨素(EP注射级)从Bioiberica获得(来自供应商的GPC数据：Mn＝11,400，M_w＝13,700Da，PDI＝1.21)。硫酸软骨素二钠-A结构重复单元的当量重量为503.35g/当量(C₁₄H₁₉O₁₄SNa₂)，羟基当量重量为503.35/3＝167.78g/OH当量。99％二乙烯基砜从ACROSOrganics购买。羧甲基纤维素(M_w＝250kDa和90kDa，取代度＝0.80、226.16g/当量、113.08g/OH当量)从Sigma Aldrich购买。

DLS方案

在DynaPro Nanostar仪器(Wyatt Technology)上使用Wyatt的环状烯烃共聚物一次性微型试管进行动态光散射分析。数据在25℃下采集，采集时间为10s，流体动力学半径在20次采集中取平均。使用DYNAMICS软件7.5版(Wyatt Technology)拟合数据，以获得流体动力学半径和估算摩尔质量。

实施例1：通过在氯化钠存在下在一锅中分阶段添加反应物来合成具有瓶刷状结 构的可溶性高M_w硫酸软骨素组合物(在阶段1和2中)。使用优化的切向流过滤方案来纯化产 物。

1A：通过分阶段添加进行反应

将硫酸软骨素钠(0.306g，1.823mmol当量羟基)和氯化钠(85.2mg，1.46mmol)溶解在20mL反应容器中的9.746g DI水中。得到澄清无色溶液。用微升移液器按体积添加DVS(0.254g，216μL，2.15mmol)。轻轻混合后，溶液澄清无色。通过使用微升移液器加入1.03mL的1.0N NaOH来引发反应。加入NaOH后，溶液立即变成淡黄色并保持澄清。反应物在硫酸软骨素中为3.04wt％，在NaOH(pH 13)中为0.1M。将反应物在旋转器上轻轻混合。15分钟后，添加额外的硫酸软骨素钠(0.909g，5.42mmol当量羟基)，在旋转器上搅拌反应混合物。反应溶液变得更加粘稠，但仍保持透明和流动。用NaOH引发两小时后，通过使用微升移液器加入1.03mL的1.0N HCl来淬灭反应。将澄清的流体反应混合物加入到含有50g PBS的小瓶中，加入PBS使总重量达到80g。稀释的反应混合物很容易地通过0.45μm PVDF针筒式过滤器进行过滤。

1B：使用切向流过滤进行纯化

将Spectrμm Lab KR2i TFF系统与250mL进料储存器和20cm中空纤维过滤组件一起使用，该中空纤维过滤组件包含改性聚醚砜过滤纤维(1mm直径，100kDa MWCO，75cm²总表面积，零件号D02-E100-10-N)。将全部80g的实施例11A的稀释产物装入进料储存器。切向流过滤以200mL/min流速开始，流速增加至300mL/min，入口压力保持低于25psig。TFF在透析模式下运行，用另外的PBS连续地补充损失到渗透物的溶液体积。以此种方式，随着五体积(400mL)的渗透物(permeate)的产生，过滤期间渗余物(retentate)溶液体积保持不变。然后通过用DI水(而不是PBS)补充进料储存器以脱盐模式继续TFF，并继续过滤直至获得另外五体积的渗透物(400mL)。然后暂停DI水补充，以浓缩模式运行过滤，将渗余物体积降至约50mL。然后停止TFF并冲洗系统(10ml DI水)以回收滞留(hold-up)体积。然后通过冻干将纯化的渗余物干燥72小时，得到纯化产物(0.538g，相对于起始硫酸软骨素重量为45％产率)，为白色蓬松固体。

本实施例表明，在0.15M氯化钠存在下分阶段添加的反应方案提供了可溶性聚合物，其可通过0.45μm膜过滤，并通过使用100kDa MWCO过滤器的切向流过滤进行纯化。TFF纯化后，以良好的产率获得了可溶性聚合物。预期它的分子量显著大于起始材料且具有支化构象。

实施例2：改变阶段1和阶段2的硫酸软骨素比率以控制具有瓶刷结构的所得高M_w 硫酸软骨素组合物的尺寸

泛化并重复实施例1的程序以得到几个反应，其中硫酸软骨素和DVS的总量保持恒定，但阶段1和阶段2之间的硫酸软骨素分配不同。将所有反应进行120分钟，然后用HCl淬灭，稀释，通过0.45μm mPES针筒式过滤器过滤，然后通过TFF用100kDa MWCO过滤器纯化，正如实施例1所述。然后在冻干后获得干燥产物。

使用Wyatt DynaPro Nanostar进行静态和动态光散射测量来表征这些反应的产物。使用Nanostar的静态光散射功能对这些高度支化材料进行的M_W测定是定性的，因为它们具有不寻常的树枝状结构。不过，使用相同的实验条件和仪器设置获得M_w结果和半径测定，从而可以对聚合物尺寸进行相对评级。这些材料的准确M_w测量必须通过更严格的方法(例如SEC-MALLS)来获得。

实验结果如下表所示。数据表明，当硫酸软骨素和DVS的总量保持恒定时，所得聚合物缀合物的分子量受到阶段1和阶段2之间硫酸软骨素的相对分配的强烈影响。当阶段1中加入反应的硫酸软骨素比例增加时，获得更大分子量聚合物。此观察结果与如下机制一致：大量的分子量生长发生在阶段1中，产生乙烯基砜官能的支化硫酸软骨素组合物。阶段1中延伸网络(凝胶)的形成被避免，因为在该反应阶段CS的总浓度保持相对较低。阶段2中添加的另外CS用于淬灭生长的支化硫酸软骨素组合物上的反应性基团并构造另外的分子量。由于大多数反应性乙烯基砜基团现在都在生长的支化聚合物侧链上，因此避免了阶段2中延伸网络(凝胶)的形成，预期该反应阶段的游离DVS浓度相对较低。

阶段1中增加CS的百分比可获得更高M_w的产物

*由累积量测量的流体动力半径

由静态光散射数据估算M_w

实施例3：通过SEC-MALLS表征具有瓶刷状结构的可溶性高M_w硫酸软骨素组合物

SEC表征通过独立的ISO 17025认证分析实验室进行验证。SEC-MALLS的实验条件概述如下。

SEC-MALLS的条件

对于本评估，使用实施例1中描述的一般两阶段程序制备材料，但改变几个关键反应参数以观察这些参数对分子量的影响。显示的结果是两个可重复色谱图的平均值。使用光散射测量分子量的一个关键参数是比折射率增量(dn/dc)，其被定义为溶质浓度改变时溶液折射率的变化。本项目中使用的dn/dc值为0.1427mL/g，如文献[Li,L.、Li,Y.、Feng,D.等，Preparation of Low Molecular Weight Chondroitin sulfates,Screening of aHigh Anti-Complement Capacity of Low Molecular Weight Chondroitin sulfate andIts Biologic Activity Studies in Attenuating Osteoarthritis，Int.Journal ofMol.Science s2016,17(10),1685]所示。下表概述了此结果。提供了硫酸软骨素钠起始材料的分析以供比较。

SEC-MALLS结果

*CS＝硫酸软骨素起始材料

结果表明，在分阶段添加程序中制备的本发明实施例的重均分子量(M_w)的摩尔质量比制备它们的硫酸软骨素大很多倍。尽管这些材料有些多分散，但折射率和光散射色谱图显示出合理的峰形状。

实施例4：通过¹H-NMR表征具有瓶刷状结构的可溶性高M_w硫酸软骨素组合物：侧链 乙烯基砜基团的定量

使用¹H-NMR对使用上述方法制备的支化硫酸软骨素组合物进行表征。在每种情况下，将支化的高M_w硫酸软骨素组合物溶解在D₂O(15mg/mL)中，并置于标准5mm硼硅酸盐NMR管中。在带有5mm宽带探头的JEOL ECZ 400核磁共振光谱仪上采集质子核磁共振谱，使用自动调谐和匹配，Delta 5.3软件用于数据采集和处理，以及MNova软件用于处理。

结果发现，CS的¹H-NMR光谱与公布的牛气管来源硫酸软骨素的光谱完全匹配[Mucci,A.,Schenetti,L.和Volpi,N.，¹H and ¹³C nuclear magnetic resonanceidentification and characterization of components of chondroitin sulfates ofvarious origin，Carbohydrate Polymers 2000,41(1),37-45.https://doi.org/10.1016/S0144-8617(99)00075-2]。在1.5至5.0ppm区域，除支化高M_w硫酸软骨素组合物光谱中存在3.6和4.1ppm的两个新的强峰之外，CS和支化高M_w硫酸软骨素组合物的¹H-NMR光谱非常相似。这些新的共振预期来自桥接的接头基团的支化高M_w组合物中存在的二乙基磺酰基团的亚甲基质子。注意，该化学结构在反应方案B中示出。4.1ppm处的亚甲基信号归因于与砜基结合的亚甲基，3.60ppm处的亚甲基归因于与连接反应中形成的醚基结合的亚甲基。

发明人发现，随着掺入支化高M_w硫酸软骨素组合物中的DVS的相对量增加，¹H-NMR光谱显示4.1ppm和3.6ppm处二乙基磺酰基峰的强度成比例增加。其余CS峰保持不变。

出乎意料地，发明人还发现，除在4.1ppm和3.6ppm处的二乙基磺酰基峰之外，在某些情况下，支链高M_w硫酸软骨素组合物的¹H-NMR光谱也在光谱的乙烯基区域显示出共振，这表明存在以侧链方式结合到支化高M_w聚合物产物上的残留乙烯基砜基团。观察到这些侧链反应性乙烯基砜基团在6.4ppm、6.5ppm和6.9ppm处为三个明确的多重信号。注意，侧链乙烯基砜基团的化学结构如反应方案A所示。

发明人随后证明乙烯基砜峰的强度受到反应条件的影响。使用上述标准程序进行一组反应。然而，在本实验中，在不同时间用HCl淬灭反应。在标准处理、TFF纯化和冻干后，用¹H-NMR分析支化高M_w生物聚合物产物。在得到的一组光谱中，乙烯基砜官能度的相对含量通过比较2.0至2.1ppm(代表3个氢原子)的乙酰胺信号的积分面积与三个乙烯基信号的积分总面积(也代表3个氢原子)来确定。由于每个硫酸软骨素二糖重复单元都含有单个乙酰胺基，这些信号的积分面积比提供了支化高M_w生物聚合物上侧链乙烯基砜含量的测量结果。例如，如果乙酰胺共振和乙烯基共振的强度相同(100：100)，则支化高M_w生物聚合物产物中的每个CS二糖重复单元也将包含一个侧链乙烯基砜基团。这组实验中使用的反应条件和通过¹H-NMR测定的侧链乙烯基砜与乙酰胺的积分峰面积比如下所述。

¹H-NMR积分结果

从该方法得到的支化高M_w生物聚合物产物上残留乙烯基砜基团的存在是事先没有预料到的。最初预期所有反应性乙烯基砜将被硫酸软骨素上的羟基(如预期)或高碱性(pH＝13)反应混合物中存在的氢氧化物离子消耗。事实上数据表明，对于给定的一组反应条件，乙烯基砜信号的相对强度随着反应时间的增加而减小。随着反应时间的延长，这些侧链乙烯基被来自阶段2添加的可用硫酸软骨素消耗以增加产物的M_w，或被氢氧化物离子消耗以生成侧链羟乙基磺酰基部分。据报道，此种侧链羟乙基砜基团在使用DVS作为交联剂制备生物聚合物水凝胶时为非反应性副产物[Chang,G.,Boney,J.,Konowicz,P.,Skrabut,E.,Yu,L.P.,Coury,A.和Jarrett,P.(2007年4月)，Assay development and applicationfor the determination of percent modification of divinyl sulfone modifiedhyaluronan hydrogel.Poster，Society for Biomaterials 2007年年会，伊利诺伊州芝加哥]。出乎意料地，本发明方法能够可控地提供具有反应性乙烯基砜基团的支化高M_w生物聚合物。根据本发明方法的条件，可控制所得支化高M_w生物聚合物上的反应性乙烯基部分的相对量，以有意提供反应性生物聚合物材料或替代地提供几乎没有反应性官能团的生物聚合物组合物。发明人还提出，具有侧链反应性乙烯基砜基团的支化高M_w GAG生物聚合物非常有用。此种生物聚合物能够有效地修饰含有活性亲核基团的表面或生物表面。例如，哺乳动物组织表面通常由多种蛋白质材料组成，其中含有来自富含赖氨酸和半胱氨酸的蛋白质的胺基和硫醚基。众所周知，组织和细胞表面上的此种反应性基团可作为亲核试剂与适当的反应性亲电试剂(包括乙烯基砜)一起发挥作用。乙烯基砜官能化支化高M_w生物聚合物包含一类高活性表面修饰生物聚合物，其能够对组织和细胞表面进行持久的表面修饰，以提供作为医疗设备和治疗材料的有用的治疗可能性。支化高M_w GAG生物聚合物具有独特的创新性。这些材料还具有在适当功能化表面或生物表面(例如组织表面)上产生共价结合的支化硫酸化GAG生物聚合物材料涂层的能力。

实施例5：在三阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的两性、正己基官能化、高M_w硫酸 软骨素组合物

发明人进一步证明，支化高M_w GAG生物聚合物侧链上的残留乙烯基砜基团可以在合成过程结束时用适当的亲核剂有效地淬灭。因此，设计并实施了一种新型三阶段工艺；阶段1和阶段2如先前实施例中所述进行，以提供可溶性高M_w支化GAG生物聚合物，不过不是通过添加酸、而是添加过量亲核淬灭剂化合物来淬灭反应，以与所有剩余乙烯基砜基团完全反应。在短反应时间后，用HCl中和反应物，如前所述进行处理和纯化。此新型三阶段工艺产生了含有来自猝灭剂化合物的附加结构元素或官能团的可溶性高M_w支化GAG生物聚合物。许多结构元素或官能团可以引入聚合物结构中。本实施例说明了在三阶段工艺(阶段3中使用正己基胺作为猝灭剂)中制备的正己基官能化的两性支化高M_w GAG生物聚合物的合成。

阶段1：将硫酸软骨素钠(0.500g，2.783mmol当量羟基)和氯化钠(101mg)溶解在20mL反应容器中的10.375g DI水中。得到澄清无色溶液。用微升移液器按体积添加DVS(0.329g，279μL，2.78mmol)。轻轻混合后，溶液澄清无色。通过使用微升移液器加入1.153mL的1.0N NaOH开始反应。加入NaOH后，溶液立即变成淡黄色并保持澄清。11.5mL反应物在硫酸软骨素中为4.2wt％，在NaOH(pH 13)中为0.1M。将反应物在旋转器上轻轻混合。

阶段2：15分钟后，添加另外部分的硫酸软骨素钠(0.500g，2.783mmol当量羟基)，在旋转器上搅拌反应混合物。反应溶液的硫酸软骨素为8wt％，变得稍微更加粘稠，但保持清澈和流体。

阶段3：通过引入NaOH引发反应100分钟后，除去25％的反应混合物，用HCl淬灭以提供对照材料。向剩余反应混合物中加入正己基胺(0.282mL，2.09mmol)，摇晃澄清的反应混合物，将其置于旋转混合器上。加入反应物中的胺猝灭剂的量与初始DVS加入的摩尔量相同。选择此量是因为它被认为代表了与生长聚合物上残留的侧链乙烯基砜基团的浓度相比是大量过量的。混合30分钟后，通过使用微升移液器加入2.965mL的1.0N HCl将反应物完全中和。溶液的pH约为6.5。用PBS将澄清的流体反应混合物稀释至60mL，通过0.45μm针筒式过滤器进行过滤。

纯化：将Spectrum Lab KR2i TFF系统与250mL进料储存器和20cm中空纤维过滤组件一起使用，该中空纤维过滤组件包含改性聚醚砜过滤纤维(1mm直径，100kDa MWCO，75cm²总表面积，零件号D02-E100-10-N)。将全部60mL体积的稀释产物装入进料储存器中。切向流过滤以200mL/min流速开始，流速增加至300mL/min，入口压力保持低于25psig。TFF在透析模式下运行，用另外的PBS连续地补充损失到渗透物的溶液体积。以此种方式，随着五体积(300mL)的渗透物的产生，过滤期间渗余物溶液体积保持不变。然后通过用DI水(而不是PBS)补充进料储存器以脱盐模式继续TFF，并继续过滤直至获得另外五体积的渗透物(300mL)。然后暂停DI水补充，以浓缩模式运行过滤，将渗余物体积降至约40mL。然后停止TFF并冲洗系统(10mL DI水)以回收滞留体积。然后通过冻干将纯化的渗余物干燥72小时，得到纯化产物(0.468g)，为白色蓬松固体。

通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为25nm，静态光散射的M_w估计值为203kDa。通过质子NMR对产物进行的分析显示，完全没有乙烯基共振，并且有几个代表正己基的新峰。硫酸软骨素乙酰胺峰和己基的甲基峰之间的积分峰面积比为100：17，这表明产物在17％的硫酸软骨素二糖单元上含有正己基取代基。稀水溶液的低表面张力(摇动时形成一些泡沫)的出现表明了产物为两性。

实施例6：在三阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的两性、正辛基官能化、高M_w硫酸 软骨素组合物

完全如上所述地重复实施例5所述的程序，区别在于：阶段3中加入正辛基胺(0.345mL，2.09mmol)作为猝灭剂。与实施例20不同，正辛基胺的加入导致反应混合物变稠和浑浊。因此，在阶段3反应中加入额外体积(12mL)的DI水以恢复透明度和流动性。然后按实施例20中所述地处理并纯化该溶液，得到纯化产物(0.512g)，为白色蓬松固体。通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为36nm，静态光散射的M_w估计值为320kDa。通过质子NMR对产物进行的分析显示，完全没有乙烯基共振，并且有几个代表正己基的新峰。硫酸软骨素乙酰胺峰和己基的甲基峰之间的积分峰面积比为100：12，这表明产物在13％的硫酸软骨素二糖单元上含有正己基取代基。稀水溶液的低表面张力(摇动时形成强烈泡沫)的出现表明了产物为两性。

实施例7：在三阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的吡咯烷官能化、高M_w硫酸软骨 素组合物

完全如上所述地重复实施例5所述的三阶段程序，区别在于：阶段3中添加吡咯烷(0.174mL，2.09mmol)作为猝灭剂。加入吡咯烷后，反应混合物保持澄清且可流动。然后按实施例20中所述地处理并纯化该溶液，得到纯化产物(0.373g)，为白色蓬松固体。通过WyattDynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为27nm，静态光散射的M_w估计值为253kDa。通过质子NMR对产物进行的分析显示，完全不存在乙烯基共振。在此种情况下，添加的吡咯烷基的亚甲基共振被硫酸软骨素峰掩盖。

实施例8：在三阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的谷胱甘肽官能化、高M_w硫酸软 骨素组合物

重复实施例5所述的三阶段程序，区别在于：阶段3中添加谷胱甘肽(0.642g，2.09mmol)作为猝灭剂。固体谷胱甘肽很快溶解在反应混合物中，得到澄清溶液。如实施例20所示，添加谷胱甘肽后，反应混合物保持透明且可流动。然后处理并纯化该溶液，得到纯化产物(0.369g)，为白色蓬松固体。通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为21nm，静态光散射的M_w估计值为143kDa。通过质子NMR对产物进行的分析显示，完全不存在乙烯基共振。在此种情况下，添加的谷胱甘肽基的共振的一部分被硫酸软骨素峰所掩盖。

实施例9：在三阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的乳糖胺(lactosylamine)官能 化、高M_w硫酸软骨素组合物

重复实施例5所述的三阶段程序(按0.500g硫酸软骨素钠的比例)，区别在于：阶段3中添加乳糖胺作为猝灭剂。加入乳糖胺后，反应混合物保持澄清且可流动。然后处理该溶液并纯化，得到纯化产物(0.373g)，为白色蓬松固体。通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为27nm，静态光散射的M_w估计值为253kDa。通过质子NMR对产物进行的分析显示，完全不存在乙烯基共振。在此种情况下，添加的乳糖基团的亚甲基共振被硫酸软骨素峰掩盖。

实施例10：在三阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的2-乙氧基乙胺官能化、高M_w硫 酸软骨素组合物

阶段1：将硫酸软骨素钠(0.1730g，2.783mmol当量羟基)和氯化钠(0.0465mg)溶解在20mL反应容器中的4.7790g DI水中。得到澄清无色溶液。用微升移液器按体积添加DVS(0.091g，77.1μL，0.786mmol)。轻轻混合后，溶液澄清无色。通过使用微升移液器加入0.531mL的1.0N NaOH来引发反应。加入NaOH后，溶液立即变成淡黄色并保持澄清。反应物在硫酸软骨素中为3.2wt％，在NaOH(pH 13)中为0.1M。将反应物在旋转器上轻轻混合。

阶段2：15分钟后，添加另外部分的硫酸软骨素钠(0.5180g，2.783mmol当量羟基)，在旋转器上搅拌反应混合物。反应溶液的硫酸软骨素的含量为11.5wt％，变得稍微更加粘稠。

阶段3：通过引入NaOH引发反应120分钟后，使用2mL DI水稀释反应溶液。轻轻混合后，溶液保持澄清无色。反应溶液的硫酸软骨素的含量为8.1wt％，变得不那么粘稠。30分钟后，向反应溶液中加入0.0805mL 2-乙氧基乙胺。加入反应物中的胺猝灭剂的量与初始DVS加入量的摩尔量相同。选择此量是因为它被认为代表了与生长聚合物上残留的侧链乙烯基砜基团的浓度相比是大量过量的。混合15分钟后，通过使用微升移液器加入0.981mL的1.0NHCl将反应完全中和。溶液的pH约为6.5。用PBS将澄清的流体反应混合物稀释至40mL，通过0.45μm的针筒式过滤器进行过滤。

纯化：将Spectrum Lab KR2i TFF系统与50mL进料储存器和20cm中空纤维过滤组件一起使用，该中空纤维过滤组件包含改性聚醚砜过滤纤维(直径0.5mm，100kDa MWCO，总表面积115cm²，零件号D02-E100-05-N)。将全部40mL体积的稀释产物装入进料储存器中。切向流过滤以150mL/min流速开始，将跨膜压力设为15，增至18，保持入口压力低于25psig。TFF在自动透析模式下运行，用另外的PBS连续地补充损失到渗透物的溶液体积。以此种方式，随着五体积(200mL)的渗透物的产生，过滤期间渗余物溶液体积保持不变。然后通过用DI水(而不是PBS)补充进料储存器以脱盐模式继续TFF，并继续过滤直至获得另外五体积的渗透物(200mL)。然后暂停DI水补充，以浓缩模式运行过滤，以将渗余物体积降至约40mL。然后停止TFF并冲洗系统(5mL DI水)以回收滞留体积。通过0.2μm针筒式过滤器过滤纯化的渗余物，然后通过冻干将纯化的渗余物干燥72小时，得到纯化产物(0.3567g)，为白色蓬松固体。

通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为43.5nm，静态光散射的M_w估计值为1902kDa。通过SEC-MALLS对产物进行的分析显示Mn＝268000且M_w＝2470000。通过质子NMR对产物进行的分析显示，完全没有乙烯基共振，并且有几个代表2-乙氧基乙胺的甲基的新峰。硫酸软骨素乙酰胺峰和2-乙氧基乙胺基的甲基峰之间的积分峰面积比为100：4，这表明产物在4％的硫酸软骨素二糖单元上含有2-乙氧基乙胺取代基。

实施例18：在三阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的高度乙烯基官能化(1/4)、高 M_w硫酸软骨素组合物

发明人证明了，可以将额外的乙烯基砜基团加入到支化的高M_w GAG生物聚合物中，同时保持溶解度。在阶段3中，进行关键的稀释步骤，允许在阶段4中与额外的交联剂反应。

本实施例的阶段1和阶段2在与实施例10相同的条件下运行。

阶段3：通过引入NaOH引发反应120分钟后，使用2mL DI水稀释反应溶液。轻轻混合后，溶液保持澄清无色。反应溶液的硫酸软骨素的含量为8.1wt％，变得不那么粘稠。5分钟后，向反应溶液中加入0.0771mL DVS。加入反应物中的DVS的量与初始DVS加入量的摩尔量相同。混合15分钟后，通过使用微升移液器加入0.531mL的1.0N HCl将反应完全中和。溶液的pH约为6.5。用PBS将澄清的流体反应混合物稀释至40mL，通过0.45μm的针筒式过滤器进行过滤。

纯化：将Spectrum Lab KR2i TFF系统与50mL进料储存器和含有改性聚醚砜过滤纤维(直径0.5mm，100kDa MWCO，总表面积115cm²，零件号D02-E100-05-N)的20cm中空纤维过滤组件一起使用。将全部40mL体积的稀释产物装入进料储存器中。以150mL/min流速启动切向流过滤，将跨膜压力设为15，增至18，保持入口压力低于25psig。TFF在自动透析模式下运行，用另外的PBS连续地补充损失到渗透物的溶液体积。以此种方式，随着五体积(200mL)的渗透物的产生，过滤期间渗余物溶液体积保持不变。然后通过用DI水(而不是PBS)补充进料储存器以脱盐模式继续TFF，并继续过滤直至获得另外五体积的渗透物(200mL)。然后暂停DI水补充，以浓缩模式运行过滤，以将渗余物体积降至约40mL。然后停止TFF并冲洗系统(5mL DI水)以回收滞留体积。通过0.2μm针筒式过滤器过滤纯化的渗余物，然后通过冻干将纯化的渗余物干燥72小时，得到纯化产物(0.3772g)，为白色蓬松固体。

通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为44nm，静态光散射的M_w估计值为393kDa。通过SEC-MALLS对产物进行的分析显示，Mn＝167000且M_w＝677000。通过质子NMR对产物进行的分析显示出更高值的乙烯基共振信号。硫酸软骨素乙酰胺峰和乙烯基峰之间的积分峰面积比为100：24，这表明产物在24％的硫酸软骨素二糖单元上含有乙烯基。

实施例19：在三阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的中高度乙烯基官能化(2/4)、 高M_w硫酸软骨素组合物

本实施例的阶段1和阶段2在与实施例10相同的条件下运行，区别在于：使用搅拌板代替旋转器搅拌作为混合方法。

阶段3：在通过引入NaOH引发反应105分钟后，使用4mL DI水稀释反应溶液。轻轻混合后，溶液保持澄清无色。反应溶液的硫酸软骨素的含量为6.3wt％，粘度稍微降低。15分钟后，向反应溶液中加入0.0578mL DVS。加入反应物中的DVS的量等于初始DVS加入量的75％。混合15分钟后，通过使用微升移液器加入0.581mL的1.0N HCl将反应完全中和。溶液的pH约为6.5。用PBS将澄清的流体反应混合物稀释至40mL，通过0.45μm的针筒式过滤器进行过滤。

纯化：将Spectrum Lab KR2i TFF系统与50mL进料储存器和含有改性聚醚砜过滤纤维(直径0.5mm，100kDa MWCO，总表面积115cm²，零件号D02-E100-05-N)的20cm中空纤维过滤组件一起使用。将全部40mL体积的稀释产物装入进料储存器中。以150mL/min流速启动切向流过滤，将跨膜压力设为15，增至18，保持入口压力低于25psig。TFF在自动透析模式下运行，用另外的PBS连续地补充损失到渗透物的溶液体积。以此种方式，随着五体积(200mL)的渗透物的产生，过滤期间渗余物溶液体积保持不变。然后通过用DI水(而不是PBS)补充进料储存器以脱盐模式继续TFF，并继续过滤直至获得另外五体积的渗透物(200mL)。然后暂停DI水补充，以浓缩模式运行过滤，以将渗余物体积降至约40mL。然后停止TFF并冲洗系统(5mL DI水)以回收滞留体积。通过0.2μm针筒式过滤器过滤纯化的渗余物，然后通过冻干将纯化的渗余物干燥72小时，得到纯化产物(0.3800g)，为白色蓬松固体。

通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为46.4nm，静态光散射的M_w估计值为375kDa。通过质子NMR对产物进行的分析显示出更高值的乙烯基共振信号。硫酸软骨素乙酰胺峰和乙烯基峰之间的积分峰面积比为100：16，这表明产物在16％的硫酸软骨素二糖单元上含有残留乙烯基。

实施例20：在三阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的中度乙烯基官能化(3/4)、高 M_w硫酸软骨素组合物

本实施例的阶段1和阶段2在与实施例10相同的条件下运行，区别在于：使用搅拌板代替旋转器搅拌作为混合方法。

阶段3：在通过引入NaOH引发反应105分钟后，使用4mL DI水稀释反应溶液。轻轻混合后，溶液保持澄清无色。反应溶液的硫酸软骨素为6.3wt％，变得不那么粘稠。15分钟后，向反应溶液中加入0.0386mL DVS。加入反应物中的DVS的量等于初始DVS加入量的50％。混合15分钟后，通过使用微升移液器加入0.581mL的1.0N HCl将反应完全中和。溶液的pH约为6.5。用PBS将澄清的流体反应混合物稀释至40mL，通过0.45μm的针筒式过滤器进行过滤。

纯化：将Spectrum Lab KR2i TFF系统与50mL进料储存器和含有改性聚醚砜过滤纤维(直径0.5mm，100kDa MWCO，总表面积115cm²，零件号D02-E100-05-N)的20cm中空纤维过滤组件一起使用。将全部40mL体积的稀释产物装入进料储存器中。以150mL/min流速启动切向流过滤，将跨膜压力设为15，增至18，保持入口压力低于25psig。TFF在自动透析模式下运行，用另外的PBS连续地补充损失到渗透物的溶液体积。以此种方式，随着五体积(200mL)的渗透物的产生，过滤期间渗余物溶液体积保持不变。然后通过用DI水(而不是PBS)补充进料储存器以脱盐模式继续TFF，并继续过滤直至获得另外五体积的渗透物(200mL)。然后暂停DI水补充，以浓缩模式运行过滤，以将渗余物体积降至约40mL。然后停止TFF并冲洗系统(5mL DI水)以回收滞留体积。通过0.2μm针筒式过滤器过滤纯化的渗余物，然后通过冻干将纯化的渗余物干燥72小时，得到纯化产物(0.3350g)，为白色蓬松固体。

通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为38.1nm，静态光散射的M_w估计值为340kDa。通过质子NMR对产物进行的分析显示出更高值的乙烯基共振信号。硫酸软骨素乙酰胺峰和乙烯基峰之间的积分峰面积比为100：12，这表明产物在12％的硫酸软骨素二糖单元上含有残留乙烯基。

实施例21：在三阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的低度乙烯基官能化(3/3)、高 M_w硫酸软骨素组合物

本实施例的阶段1和阶段2在与实施例10相同的条件下运行，区别在于：使用搅拌板代替旋转器搅拌作为混合方法。

阶段3：在通过引入NaOH引发反应105分钟后，使用4mL DI水稀释反应溶液。轻轻混合后，溶液保持澄清无色。反应溶液的硫酸软骨素为6.3wt％，变得不那么粘稠。45分钟后，向反应溶液中加入0.0193mL DVS。加入反应物中的DVS的量等于初始DVS加入量的25％。混合15分钟后，通过使用微升移液器加入0.581mL的1.0N HCl将反应完全中和。溶液的pH约为6.5。用PBS将澄清的流体反应混合物稀释至40mL，通过0.45μm的针筒式过滤器进行过滤。

纯化：将Spectrum Lab KR2i TFF系统与50mL进料储存器和含有改性聚醚砜过滤纤维(直径0.5mm，100kDa MWCO，总表面积115cm²，零件号D02-E100-05-N)的20cm中空纤维过滤组件一起使用。将全部40mL体积的稀释产物装入进料储存器中。以150mL/min流速启动切向流过滤，将跨膜压力设为15，增至18，保持入口压力低于25psig。TFF在自动透析模式下运行，用另外的PBS连续地补充损失到渗透物的溶液体积。以此种方式，随着五体积(200mL)的渗透物的产生，过滤期间渗余物溶液体积保持不变。然后通过用DI水(而不是PBS)补充进料储存器以脱盐模式继续TFF，并继续过滤直至获得另外五体积的渗透物(200mL)。然后暂停DI水补充，以浓缩模式运行过滤，以将渗余物体积降至约40mL。然后停止TFF并冲洗系统(5mL DI水)以回收滞留体积。通过0.2μm针筒式过滤器过滤纯化的渗余物，然后通过冻干将纯化的渗余物干燥72小时，得到纯化产物(0.2818g)，为白色蓬松固体。

通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为28.25nm，静态光散射的M_w估计值为217kDa。通过质子NMR对产物进行的分析显示出更高值的乙烯基共振信号。硫酸软骨素乙酰胺峰和乙烯基峰之间的积分峰面积比为100：8，这表明产物在8％的硫酸软骨素二糖单元上含有残留乙烯基。

实施例22：在四阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的两性、正己基官能化、高M_w硫 酸软骨素组合物

发明人进一步证明，高度取代的乙烯基砜支化的高M_w GAG生物聚合物可以有效地淬灭正己基胺，从而产生高度取代的两性聚合物。

本实施例的阶段1和阶段2在与实施例10相同的条件下运行，区别在于：使用搅拌板代替旋转器搅拌作为混合方法。

阶段3：在通过引入NaOH引发反应105分钟后，使用4mL DI水稀释反应溶液。轻轻混合后，溶液保持澄清无色。反应溶液的硫酸软骨素为6.3wt％，变得不那么粘稠。15分钟后，向反应溶液中加入0.0578mL DVS。加入反应物中的DVS的量等于初始DVS加入量的75％。

阶段4：混合15分钟后，向反应溶液中加入0.1009mL己胺。加入反应物中的胺猝灭剂的量与初始DVS加入量的摩尔量相同。选择此量是因为它被认为代表了与生长聚合物上残留的侧链乙烯基砜基团的浓度相比是大量过量的。加入己胺后，溶液立即变得浑浊。混合15分钟后，通过使用微升移液器加入1.181mL的1.0N HCl将反应完全中和。溶液的pH约为6.5。用PBS将澄清的流体反应混合物稀释至40mL，通过0.45μm的针筒式过滤器进行过滤。

纯化：将Spectrum Lab KR2i TFF系统与50mL进料储存器和含有改性聚醚砜过滤纤维(直径0.5mm，100kDa MWCO，总表面积115cm²，零件号D02-E100-05-N)的20cm中空纤维过滤组件一起使用。将全部40mL体积的稀释产物装入进料储存器中。以150mL/min流速启动切向流过滤，将跨膜压力设为15，增至18，保持入口压力低于25psig。TFF在自动透析模式下运行，用另外的PBS连续地补充损失到渗透物的溶液体积。以此种方式，随着五体积(200mL)的渗透物的产生，过滤期间渗余物溶液体积保持不变。然后通过用DI水(而不是PBS)补充进料储存器以脱盐模式继续TFF，并继续过滤直至获得另外五体积的渗透物(200mL)。然后暂停DI水补充，以浓缩模式运行过滤，以将渗余物体积降至约40mL。然后停止TFF并冲洗系统(5mL DI水)以回收滞留体积。通过0.2μm针筒式过滤器过滤纯化的渗余物，然后通过冻干将纯化的渗余物干燥72小时，得到纯化产物(0.4102g)，为白色蓬松固体。

通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为34.5nm，静态光散射的M_w估计值为284kDa。通过质子NMR对产物进行的分析显示，完全没有乙烯基共振，并且有几个代表正己基的新峰。硫酸软骨素乙酰胺峰和己基的甲基峰之间的积分峰面积比为100：18，这表明产物在18％的硫酸软骨素二糖单元上含有正己基取代基。稀水溶液的低表面张力(摇动时形成一些泡沫)的出现表明产物为两性。

实施例23：在五阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的硼酸和2-乙氧基乙胺官能化、 高M_w硫酸软骨素组合物

发明人进一步证明，支化高M_w GAG生物聚合物侧链上的残留乙烯基砜基团可以在合成过程结束时用适当的亲核剂有效地淬灭。因此，设计并实施了一种新型六阶段工艺；阶段1和阶段2如前面实施例中所述进行，以提供可溶性高M_w支化GAG生物聚合物，不过阶段3中用DI水稀释溶液，并且阶段4中添加额外的DVS，而不是用酸淬灭反应。在阶段5中，添加过量的亲核淬灭剂化合物，以与一些剩余乙烯基砜基团反应。发现该特定亲核剂不能淬灭所有残留乙烯基信号，因此阶段6中添加了其他亲核淬灭剂，以确保乙烯基信号完全淬灭。在短反应时间后，用HCl中和反应物，如前所述进行处理和纯化。此新型六阶段工艺生产了含有来自猝灭剂化合物的额外结构元素或官能团的可溶性高M_w支化GAG生物聚合物。许多结构元素或官能团可以引入聚合物结构中。本实施例说明了在六阶段工艺(阶段3中使用DI水、阶段4中使用DVS、阶段5中使用正己基胺作为猝灭剂、阶段6中使用2-乙氧基乙胺作为猝灭剂)中制备的正己基官能化的两性支化高M_w GAG生物聚合物的合成。

本实施例的阶段1和阶段2在与实施例10相同的条件下运行，区别在于：使用搅拌板代替旋转器搅拌作为混合方法。

阶段3：在通过引入NaOH引发反应105分钟后，使用4mL DI水稀释反应溶液。轻轻混合后，溶液保持澄清无色。反应溶液的硫酸软骨素的含量为6.3wt％，粘度稍微降低。15分钟后，向反应溶液中加入0.0193mL DVS。加入反应物中的DVS的量等于初始DVS加入量的25％。

阶段4：15分钟后，将江阴迈康升华医药科技有限公司生产的0.2017g杂环化合物((4-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-3-氟苯基)硼酸盐酸盐，C₉H₁₃BClFN₂O₃)加入反应溶液中。添加后，反应溶液的pH降低，因此添加HCl直至pH＝13。轻轻混合后，溶液变得略微混浊。15分钟后，向反应溶液中加入0.0805mL 2-乙氧基乙胺。加入反应物中的胺猝灭剂的量与初始DVS加入量的摩尔量相同。选择此量是因为它被认为代表了与生长聚合物上残留的侧链乙烯基砜基团的浓度相比是大量过量的。混合15分钟后，通过使用微升移液器加入0.981mL的1.0N HCl将反应完全中和。溶液的pH约为6.5。用PBS将澄清的流体反应混合物稀释至40mL，通过0.45μm的针筒式过滤器进行过滤。

纯化：将Spectrum Lab KR2i TFF系统与50mL进料储存器和含有改性聚醚砜过滤纤维(直径0.5mm，100kDa MWCO，总表面积115cm²，零件号D02-E100-05-N)的20cm中空纤维过滤组件一起使用。将全部40mL体积的稀释产物装入进料储存器中。以150mL/min流速启动切向流过滤，将跨膜压力设为15，增至18，保持入口压力低于25psig。TFF在自动透析模式下运行，用另外的PBS连续地补充损失到渗透物的溶液体积。以此种方式，随着五体积(200mL)的渗透物的产生，过滤期间渗余物溶液体积保持不变。然后通过用DI水(而不是PBS)补充进料储存器以脱盐模式继续TFF，并继续过滤直至获得另外五体积的渗透物(200mL)。然后暂停DI水补充，以浓缩模式运行过滤，以将渗余物体积降至约40mL。然后停止TFF并冲洗系统(5mL DI水)以回收滞留体积。通过0.2μm针筒式过滤器过滤纯化的渗余物，然后通过冻干将纯化的渗余物干燥72小时，得到纯化产物(0.3846g)，为白色蓬松固体。

通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为25.1nm，静态光散射的M_w估计值为701.4kDa。通过质子NMR对产物进行的分析显示完全没有乙烯基共振，以及显示预期的芳基和2-乙氧基乙胺共振。硫酸软骨素乙酰胺峰与芳基和2-乙氧基乙胺峰之间的积分峰面积比分别为100：6.9和100：1.5，这表明产物在6.9％和1.5％的硫酸软骨素二糖单元上含有芳基和-2-乙氧基乙胺取代基。

实施例24：在两阶段、一锅法中制备具有瓶刷结构的乳糖胺官能化、高M_w硫酸软骨 素组合物

发明人进一步证明，支化高M_w GAG生物聚合物侧链上的残留乙烯基砜基团可以在合成过程结束时用适当的亲核剂有效地淬灭。因此，设计并实施了一种新型两阶段工艺；将高度乙烯基SuperGAG和乳糖胺溶于pH 13的盐水中，用乳糖胺淬灭残留乙烯基。观察到乳糖胺没有淬灭所有残留乙烯基，因此在阶段2中添加其他亲核剂以确保所有残留乙烯基信号均淬灭。在短反应时间后，用HCl中和反应物，如前所述进行处理和纯化。此新型两阶段工艺产生了含有来自猝灭剂化合物的额外结构元素或官能团的可溶性高M_w支化GAG生物聚合物。许多结构元素或官能团可以引入聚合物结构中。本实施例说明了两阶段工艺(阶段1中使用乳糖胺作为猝灭剂、阶段2中使用2-乙氧基乙胺作为猝灭剂)中制备的乳糖胺和2-乙氧基乙胺官能化支链高M_w GAG生物聚合物的合成。

阶段1：将SuperGAG 007-033-2(0.100g)和乳糖胺(0.500mg)溶解在20mL反应容器中的3.0g 0.9％盐水中。得到澄清无色溶液。通过使用微升移液器加入0.600mL的1.0NNaOH开始反应。加入氢氧化钠后，溶液保持澄清无色。用搅拌棒在搅拌板上轻轻混合反应物。

阶段2：45分钟后，向反应瓶中加入0.0805mL 2-乙氧基乙胺。加入反应物中的胺猝灭剂的量与上述SuperGAG合成过程中的初始DVS加入量的摩尔量相同。选择此量是因为它被认为代表了与生长聚合物上残留的侧链乙烯基砜基团的浓度相比是大量过量的。轻轻混合后，溶液保持澄清无色。混合15分钟后，通过使用微升移液器加入0.981mL的1.0N HCl将反应完全中和。溶液的pH约为6.5。用PBS将澄清的流体反应混合物稀释至40mL，通过0.45μm的针筒式过滤器进行过滤。

纯化：将Spectrμm Lab KR2i TFF系统与50mL进料储存器和含有改性聚醚砜过滤纤维(直径0.5mm，100kDa MWCO，总表面积115cm²，零件号D02-E100-05-N)的20cm中空纤维过滤组件一起使用。将全部40mL体积的稀释产物装入进料储存器中。以150mL/min流速启动切向流过滤，将跨膜压力设为15，增至18，保持入口压力低于25psig。TFF在自动透析模式下运行，用另外的PBS连续地补充损失到渗透物的溶液体积。以此种方式，随着五体积(200mL)的渗透物的产生，过滤期间渗余物溶液体积保持不变。然后通过用DI水(而不是PBS)补充进料储存器以脱盐模式继续TFF，并继续过滤直至获得另外五体积的渗透物(200mL)。然后暂停DI水补充，以浓缩模式运行过滤，以将渗余物体积降至约40mL。然后停止TFF并冲洗系统(5mL DI水)以回收滞留体积。通过0.2μm针筒式过滤器过滤纯化的渗余物，然后通过冻干将纯化的渗余物干燥72小时，得到纯化产物(0.0.069g)，为白色蓬松固体。

通过Wyatt DynaPro Nanostar DLS对产物进行的分析显示，流体动力学半径为48.3nm，静态光散射的M_w估计值为2307kDa。通过质子NMR对产物进行的分析显示，完全没有乙烯基共振，并且有几个代表2-乙氧基乙胺的甲基的新峰。在本实施例中，添加的乳糖胺基团的共振被硫酸软骨素峰遮蔽；无法进行定量，但观察到光谱以与添加乳糖胺相符的方式发生了变化。硫酸软骨素乙酰胺峰和甲基峰之间的积分峰面积比为100：12，这表明产物在12％的硫酸软骨素二糖单元上含有2-乙氧基乙胺取代基。

实施例25：组合物用于治疗大鼠间质性膀胱炎的评估(联合MRI定量膀胱渗透性)

大鼠模型用于复现漏膀胱病理学，其被认为是间质性膀胱炎(IC)发展的主要因素。雌性卵巢切除(OVX)Sprague-Dawley大鼠(250-300g)购自Charles RiverLaboratories。在控制温度和湿度的条件下，每个笼子饲养两只大鼠。OVX大鼠用于避免激素循环的任何影响，因为雄性大鼠不能通过尿道插管。所有动物都可以自由获取食物和水，在实验前至少1周适应设施的环境。实验方案由相关机构动物护理和使用委员会批准。

经尿道治疗

用硫酸鱼精蛋白(PS)处理7周龄体重250g至300g的OVX雌性SAS Sprague

大鼠，以诱导膀胱泄漏，如文献[Towner等，Journal of Urology 2015，193：1394-1400]中所述。大鼠在稳定供氧的情况下用异氟烷(3％)麻醉约10分钟，在使用润滑的18号静脉导管(Surflo，Terumo公司，马里兰州埃尔克顿)和定制导丝导尿后排空膀胱。注意不要在导管通过耻骨后立即停止导管，不要让它“触底”，以免对膀胱造成伤害。监测动物是否有血尿，作为膀胱创伤的指标，不使用任何尿液或溶液中有血的动物。PS(1mg/mL，在400μL盐水中)通过导管缓慢注入膀胱。15分钟后，通过施加下腹部压力排空膀胱。然后用盐水(400μL×3)冲洗膀胱，然后取出经尿道导管，将动物送回居住笼子。

膀胱和结肠的MRI成像

通过磁共振成像(MRI)评估膀胱渗透性。用异氟醚(1.5％至3.0％)和800至1000mLO₂麻醉大鼠进行MRI实验。MRI在7-Tesla 30cm孔径

MRI系统上进行。对于膀胱图像，体内诊断CE-MRI特别使用Gd-DTPA(0.2mmol Gd/kg稀释至800mL盐水)，通过膀胱内导管施用，在膀胱对比图像上显示膀胱尿路上皮渗透性丧失。每3分43秒获得膀胱对比图像，总共20分钟。对于结肠造影图像，Gd DTPA(0.2mmol Gd/kg，在盐水中稀释至200mL)通过24号0.75英寸BD INSYTE静脉施用^TM自动防护装置^TM屏蔽尾静脉导管。获取图像30分钟。所有MRI图像均使用特定参数的T1加权RARE(快速采集，松弛增强)MRI脉冲序列采集，参数包括重复时间1200毫秒、回波时间9毫秒、RARE因子4,4平均值、1mm图像切片厚度、256×256矩阵和6.5×6.5cm²视场(带运动和脂肪抑制)。

生物聚合物处理

在PS处理后24小时，将本发明的生物聚合物滴注到泄漏的膀胱中。PS暴露后24小时，通过经尿道导尿施用生物聚合物。在施用之前，将生物聚合物溶解在盐水(20mg/mL)中，无菌过滤(0.2μm PVDF针筒式过滤器)。生物聚合物施用在MRI成像所述的麻醉方案下进行。

在PS暴露后24小时、聚合物处理后立即进行MRI。在PS暴露后5天、生物聚合物处理后4天再次进行MRI。

数据分析和统计

测量图像中感兴趣区域(ROI)的MRI信号强度。膀胱周边、结肠粘膜、膀胱周围脂肪体、周围结肠组织和大腿内侧肌肉的高强度区域以及对照数据集的相应区域可使用4或5个ROI。可以使用ParaVision^TM(版本5.0)显示这些数据。使用ANOVA和后Tukey多重比较测试进行统计分析，使用InStat

评估治疗组之间的差异。组之间p<0.05、<0.01或<0.001的信号强度差异被认为具有统计学意义。

实施例26：用于治疗间质性膀胱炎的组合物的评估

使用两种动物模型。之前详细描述的大鼠模型用于确认：使用TEER“黄金标准”，SuperGAG可恢复不渗透性。相同模型用于确认恢复膀胱不渗透性可消除腹痛后果。在转基因小鼠模型中也证实了不渗透性的恢复，该模型作为我们实验室开发的使用MRI的IC/BPS模型，得到了越来越多的认可。小鼠膀胱太小，无法进行可靠的TEER测量。

从上午9点开始(第0天)，用异氟醚氧麻醉OVX雌性Sprague-Dawley大鼠，用24号静脉导管(Terumo Medical)插管，将400μL 1mg/mL鱼精蛋白硫酸盐注入膀胱。该剂量的鱼精蛋白硫酸盐是通常使用的1/10，产生最小的可见尿路上皮损伤。10分钟后去除鱼精蛋白硫酸盐，将动物送回笼子。从第二天(第1天)上午9点开始，再次用异氟醚氧麻醉动物，将400μL的20mg/mL SuperGAG盐水或单独盐水作为对照。为了进行比较，由于CS是临床使用的，向一组动物灌输400μL的20mg/mL CS。由于与膀胱壁的相互作用可能是通过GAG链上的负电荷而产生的静电，因此对等重量的SuperGAG和CS进行了比较。从下午12点开始，对大鼠实施安乐死，分离出膀胱。膀胱被打开、整个安装，尿路上皮面朝上，使用夹在尿路上的小腔室。如前所述，测量电位差(PD)和短路电流(Isc)的电生理变量以评估膀胱和结肠中的TEER。用盐水代替鱼精蛋白硫酸盐或SuperGAG/CS来灌注假处理动物，以解释导管损伤的任何伪影。

在大鼠模型中，使用应用于耻骨上区域的von Frey长丝评估膀胱敏感性。雌性OVX大鼠膀胱内注射硫酸鱼精蛋白(1mg/mL)，24小时后用i)载体、ii)CS(20mg/mL)或iii)SuperGAG(20mg/mL)处理。对照组包括接受假滴注代替鱼精蛋白硫酸盐或任何治疗的动物。3小时后评估膀胱敏感性。每根von Frey长丝施加1至2秒，共10次。用从最低到最高的力来测试长丝。腹部急剧收缩、立即舔或梳理或跳跃被认为是积极的反应。

URO-MCP-1转基因模型如前所述。通过在100μL盐水中以1μg LPS的亚毒性剂量(第0天，上午9点)膀胱内注射LPS诱发伴有渗透性的膀胱炎。对照组仅施用生理盐水(100μL)(生理盐水URO-MCP-1)。另一个由野生型(WT)小鼠组成的对照组也仅施用盐水(盐水WT)。在LPS注射后1小时，用盐水冲洗膀胱3次以去除任何过量的LPS。第二天(第1天，上午9点)用CS或SuperGAG(20mg/mL盐水；100μL)或盐水处理动物，在3小时后(第1日，下午12点)评估初始渗透性。

对于渗透性的MRI评估，如上所述对小鼠进行麻醉和治疗，但在第1天、第3天和第5天，将小鼠麻醉、灌注造影剂Gd-DTPA并放入MRI仪器中，而不是对小鼠进行安乐死。MRI实验在7特斯拉30厘米孔径Bruker Biospec MRI系统(美国德克萨斯州伍德兰市Bruker-Biospin公司)上进行。在LPS滴注后1、3和5天进行MRI扫描。对于膀胱图像，通过膀胱内导管施用Gd-DTPA(0.034mM Gd DTPA，在盐水中稀释至100μL)以显示膀胱尿路上皮的渗透性损失。造影后7分钟测定膀胱CE-MRI信号强度变化。对于所有MR图像，使用T1加权RARE(快速采集，松弛增强)MRI脉冲序列，参数如下：重复时间(TR)为1200ms，回波时间(TE)为9ms，RARE因子为4，平均值为4，图像切片厚度为1mm，矩阵为256×256，视场(FOV)为3.5×3.5cm²，同时具有运动和脂肪抑制。将动物安乐死，将膀胱置于福尔马林中进行组织病理学检查。

MRI信号强度由Paravision(5.0版本，Bruker Biospin)上显示的图像中的感兴趣区域(ROI)(在膀胱周边的高强度区域以及盐水对照动物数据集的相应区域拍摄4至5个ROI)来测量。

在硫酸鱼精蛋白大鼠模型中，SuperGAG滴注液在恢复膀胱不渗透性方面比载体对照更有效。用生物聚合物处理3小时后，对来自硫酸鱼精蛋白大鼠模型的切除膀胱膜进行TEER测量。(括号中每组大鼠的数量)。假处理对照显示TEER＝2500±249Ωcm。恢复不渗透性可减少疼痛反应。OVX雌性大鼠膀胱内注射1mg/mL硫酸鱼精蛋白，24小时后用载体CS(20mg/mL)或SuperGAG-1(20mg/mL)处理。对照组包括接受假滴注代替鱼精蛋白硫酸盐或任何治疗或鱼精蛋白硫酸后再加入载体的动物。3小时后使用应用于耻骨上区域的von Frey长丝评估膀胱敏感性。每根长丝施加1-2秒，共10次。从最低到最高的力测试长丝。腹部急剧收缩、立即舔或梳理或跳跃被认为是积极的反应。在中等压力(2至4g)下，SuperGAG将疼痛反应减少一半以上，在缓解疼痛方面比CS更有效。在更高压力(15g)下，压力可能会影响膀胱之外的器官，并超过任何缓解作用。

与对照组相比，SuperGAG改善了URO-MCP-1IC小鼠模型的膀胱渗透性。与盐水处理的URO-MCP-1小鼠相比，LPS处理的URO-MCP-1小鼠的MRI信号强度的％变化显著增加(****p<0.0001)；或与盐水处理过的WT小鼠相比，LPS处理过的URO-MCP-1小鼠的MRI信号强度的％变化显著增加(****p<0.0001)。在UROMCP-1间质性膀胱炎模型中，SuperGAG将增加的膀胱渗透性恢复到接近正常水平。将相同重量的CS与SuperGAG和CS单体(20mg/mL)一起滴注，这也是临床使用的剂量。与经LPS处理的URO-MCP-1小鼠相比，经SuperGAG或CS处理的经LPS治疗的UROMCP-1小鼠的MRI信号强度(SI)的％变化显著降低(第1天，两者均为*p<0.05；第3天，两者均为***p<0.0001)。与LPS URO-MCP-1小鼠相比，仅SuperGAG LPS URO-MCP-1小鼠在第5天的MRI SI的％变化显著降低(**p<0.01)。

数据表明，使用URO-MCP1转基因小鼠模型，并使用CE-MRI评估渗透性，SuperGAG可将膀胱渗透性恢复到正常值。对于盐水处理的URO-MCP1或野生型小鼠，亚毒性剂量的LPS会诱导膀胱渗透性，而滴注盐水则不会。膀胱、对照、盐水处理的URO-MCP1、硫酸鱼精蛋白处理且盐水处理的野生型小鼠的代表性图像。注意，在大鼠鱼精蛋白硫酸盐模型中，正常对照值较高(2500Ω·cm²)；而在小鼠LPS模型中，通过CE-MRI直接评估渗透性，正常值较低。在小鼠模型的情况下，对照表示通过诱导渗透性的处理获得的值，然后施用溶剂(vehicle)而不是恢复渗透性的试剂。通过在第1天、第3天和第5天对同一只小鼠进行重复测定来确定随时间的变化，这些小鼠只接受LPS(对照PPS)、SuperGAG(S-GAG)或CS处理。比较SuperGAG制剂和CS时的小效应量需要更大的样本量来测试统计显著性。尽管如此，数据表明SuperGAG比CS更有效，特别是在治疗后第5天，因为它显著低于对照，而CS与对照组没有显著差异。

等价物

应理解，虽然已结合详细描述描述了本公开，但前述描述旨在说明而非限制本发明的范围(由所附权利要求的范围限定)。其他方面、优点和变型落入以下权利要求的范围内。

本文引用的专利文献和科研文献建立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和已公布或未公布的美国专利申请均通过引用并入本文。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。本文引用的所有其他出版参考文献、文件、手稿和科研文献均通过引用并入本文。

Claims (23)

1.一种制备水溶性硫酸化GAG缀合物的方法，其包括如下步骤：

i)在足以使连接剂与硫酸化GAG反应以形成包含可溶性聚合物的溶液的条件下，使在水溶液中浓度为2wt％至20wt％的硫酸化GAG与有效量的连接剂、例如双官能接头接触，其中，GAG羟基与连接剂的摩尔比小于凝胶形成所需的摩尔比，所述可溶性聚合物的特征在于侧链连接基团；

ii)向步骤i)的溶液中加入额外的硫酸化GAG，所述额外的硫酸化GAG的量足以与一部分的侧链连接基团反应，形成具有瓶刷结构的可溶性聚合物缀合物，所述可溶性聚合物缀合物的特征在于残留侧链连接基团；以及

iii)在足以使残留侧链连接基团与反应性修饰剂反应的条件下，加入修饰剂，形成带有所述修饰剂的水溶性硫酸化GAG瓶刷缀合物，所述修饰剂的特征在于反应性部分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤i)的产物具有基本上线性的结构。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤iii)的硫酸化GAG缀合物产物的分子量为100,000Da至5,000,000Da。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤i)的硫酸化GAG的分子量为约1,000Da、5,000Da、10,000Da、15,000Da、20,000Da、30,000Da、40,000Da、50,000Da、100,000Da或在包括这些数中任两个的范围内，优选为5,000Da至30,000Da。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤i)的溶液中存在的GAG羟基当量与连接剂的摩尔数之比为0.8至4.0。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤i)的硫酸化GAG与步骤ii)中添加的硫酸化GAG相同。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述侧链反应性基团为乙烯基。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述连接剂为二乙烯基砜。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过质子NMR测定，步骤ii)中形成的可溶性聚合物的2％至30％的二糖重复单元上存在侧链反应性基团。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，以15/85至80/20、优选20/80至40/60的比率分配步骤i)和ii)中添加的硫酸化GAG的总量。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤iii)中引入的修饰剂的反应性部分为胺。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述修饰剂包含靶向部分。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述修饰剂为乳糖胺。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述修饰剂包含与哺乳动物组织原位形成共价键的部分。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述修饰剂包含疏水部分。

16.由前述权利要求中任一项所述的方法生产的聚合物缀合物，其包含多个硫酸化糖胺聚糖(GAG)聚合物链，其中，每个硫酸化GAG聚合物链通过源自连接剂的接头与一个以上硫酸化GAG聚合物链连接，所述聚合物缀合物可溶于水溶液，所述聚合物缀合物的分子量为单个未连接的硫酸化GAG的分子量的3倍至300倍。

17.一种治疗软组织的方法，其包括向软组织施用权利要求16所述的聚合物缀合物。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述软组织和/或其病况选自：皮肤、面部皱缩(皱纹)、疤痕、伤口、烧伤、皮肤溃疡、皮肤癌切除、血管病况、外周动脉疾病、腹主动脉瘤、颈动脉疾病、静脉疾病、血管损伤、血管发育不良、声带、肌肉、结缔组织、肌腱、韧带、牙周韧带、前交叉韧带、器官、筋膜、膀胱、肠、骨盆底、肌肉骨骼系统的软组织、脊柱的软组织、椎间盘、脊柱关节、关节突关节(小关节)、肋椎关节、骶髂关节、骶椎关节和寰枢关节。

19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述软组织选自：椎间盘、皮肤、心脏瓣膜、关节软骨、软骨、半月板、脂肪组织、颅面、眼、肌腱、韧带、筋膜、纤维组织、滑膜、肌肉、神经、血管及它们的任意组合。

20.根据权利要求17所述的方法，其中，针对与哺乳动物中细胞外基质(ECM)降解相关的疾病、病症或病况对所述软组织进行治疗。

21.一种治疗间质性膀胱炎的方法，其包括向患者的膀胱施用权利要求16所述的聚合物缀合物。

22.一种治疗伤口的方法，其包括向患者的伤口施用权利要求16所述的聚合物缀合物。

23.一种再生软组织的方法，其包括向患者的软组织施用权利要求16所述的聚合物缀合物。

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