JP2023518382A - タンパク質模倣物としての硫酸化グリコサミノグリカン生体材料 - Google Patents

Abstract

結合組織の細胞外マトリックスに見られる天然プロテオグリカンの機能を模倣することができるポリマーコンジュゲートが提供される。本発明のポリマーコンジュゲートは、軟組織変性状態に罹患している対象の治療において有用性を有する。本発明のポリマーコンジュゲートを調製するための単純でスケーラブルな化学プロセスも提供される。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年３月１９日に出願された米国仮出願第６２／９９１，８０４号の利益を主張する。上記出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、軟部組織及び結合組織の非細胞足場を形成する。これは、常在細胞に必要とされる生化学的及び構造的支持の両方を提供し、組織形状の維持及び機械的ストレスへの耐性において重要な役割を果たす。プロテオグリカンは、組織の健康を維持し、ＥＣＭ分解を防止するＥＣＭの天然高分子である。プロテオグリカンは、その強力な浸透水和及び重要な成長因子に結合して調節する能力により、健康なＥＣＭの保護因子である。加齢、疾患又は損傷に対する応答として、ＥＣＭは機能性を失う。プロテオグリカン含量は減少し、それによってコラーゲン繊維及び他のマトリックス成分も分解し始める。そのような分解は、いくつか例を挙げると、皮膚、椎間板、軟骨、及び尿道組織のものを含む多くの軟部組織疾患、障害、及び／又は状態の根底にある因子である。プロテオグリカン機能の回復は、ＥＣＭ機能の喪失に対処するための１つの治療選択肢である。

参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍａｓ Ｊｏｚｅｆｉａｋによる国際公開第２０１８／０５３２７６号は、米国を指定し、２０１８年３月２２日に公開され、新規プロテオグリカン模倣バイオポリマーを記載している。好ましい材料は、コアポリマーを二官能性連結剤で活性化し、続いて過多の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を添加して活性化コアポリマーと反応させることを含むプロセスから誘導される。特定の生物学的標的への標的化などの追加の望ましい特性を付与するために、追加の修飾因子が含まれるプロセスも記載される。改善されたプロテオグリカン模倣組成物は、その後の工程における修飾因子の添加に対するより良好な制御を可能にするプロセスによって、より効果的に製造され得ることが今回発見された。

本開示は、水溶液及び生物学的溶液に可溶性であり、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖及び修飾因子から構成される中～高分子量のポリマーコンジュゲートを記載する。提供されるポリマーコンジュゲートは、生体適合性であり、小さなゲージの針を使用して注射することが容易であり、軟部組織ＥＣＭにおける特定のプロテオグリカン機能を模倣することができ、改善された標的化及び／又は局所反応性を有する。本開示はまた、軟部組織変性状態に罹患している対象を治療する方法を提供する。

本発明は、部分的には、先行技術のプロセスによって、しばしばリンカー試薬の不完全な反応に由来するペンダント反応性基が保持されるという予想外の発見に基づく。この所見は、ペンダントリンカー基の反応性、及び反応の高ｐＨ環境で反応性であるポリマー結合ヒドロキシル基の利用可能性、ならびに水酸化物イオン自体の観点から予想外であった。本発明者らは、これらのペンダント反応性基の存在が反応条件の選択によって制御され得ることを見出した。本発明の方法は、この反応性化合物が修飾組成物の調製における中間体としての有用性を有するという認識に基づいている。新規な本発明の方法は、中間体バイオポリマー中に制御可能なレベルのペンダント反応性基を生成する条件を選択し、次いで、反応性修飾基を過剰に導入して、残りの反応性リンカー基を完全に反応停止させる。得られた３段階プロセスは、ＧＡＧバイオポリマーと同時に修飾基が導入された従来技術のプロセスを超える強力な利点を有する。これらの条件下では、より反応性の高いクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）によるビニルスルホン基の捕捉により、所望の高分子量の蓄積が大幅に抑制された。

本発明の前述及び他の目的、特徴及び利点は、添付の図面に示されているように、本発明の好ましい実施形態の以下のより具体的な説明から明らかになるであろう。添付の図面では、種々の図全体を通して、同様の参照符号は同じ部分を指す。図面は必ずしも縮尺通りではなく、その代わり、本発明の原理を説明することに重点が置かれている。

二官能性連結剤による直鎖ポリマーの活性化、その後の活性化ポリマーの硫酸化ＧＡＧ鎖との連結による、反応性ペンダントリンカー基が残存することを特徴とするボトルブラシ（ｂｏｔｔｌｅｂｒｕｓｈ）様ポリマーコンジュゲートの形成を示す。必要に応じて希釈した後、ペンダントリンカー基を修飾因子又は反応停止（クエンチング）剤と反応させる。 二官能性連結剤による直鎖ポリマーの活性化、それに続く活性化ポリマーの硫酸化ＧＡＧ鎖との連結による、反応性ペンダントリンカー基が残存することを特徴とするボトルブラシ様ポリマーコンジュゲートの形成を示す。任意の希釈、同じ又は異なる二官能性剤（ジビニルスルホンなど）の添加、任意の修飾因子又は反応停止剤の添加及び任意の２つ以上の反応停止剤の添加。

軟部組織の疾患、障害及び状態の治療における長年の要求に対処するために、天然プロテオグリカンの形態及び物理的特性を模倣することができるプロテオグリカン模倣物を製造することが望ましい。天然プロテオグリカンは、サルフェート基及びカルボキシレート基の存在に起因して生理学的条件下で高度に負に帯電したＧＡＧ鎖から構成される。

本発明は、硫酸化ＧＡＧ及び他の反応性部分を制御された方法で反応させて、水溶液に可溶性のままである高分子量の分岐した硫酸化ＧＡＧ組成物を生成することに関する。

定義
本明細書で使用される場合、ヘッダ及びセクションのサブタイトルは、編成目的で提供されており、限定することを意味するものではない。したがって、１つのセクションに記載された実施形態は、特に明記しない限り、本出願の全体に適用される。

「およそ」又は「約」という用語は、１つ又は複数の目的の値に適用される場合、記載された基準値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、特に明記しない限り、さもなければ文脈から明らかでない限り、記載された基準値のいずれかの方向（より大きい又はより小さい）に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満に入る値の範囲を指す（そのような数が可能性ある値の１００％を超える場合を除く）。

本明細書で使用される「投与」という用語は、典型的には、対象又は系への組成物の投与を指す。当業者は、適切な状況で、対象、例えばヒトへの投与に利用され得る様々な経路を認識するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、眼、経口、非経口、局所などであり得る。いくつかの特定の実施形態では、投与は、気管支（例えば、気管支点滴注入によって）、頬側、皮膚（例えば、真皮への局所、皮内、皮間、経皮などの１つ以上であり得るか、又はそれらの１つ以上を含み得る）、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、膀胱内、静脈内、脳室内、特定の臓器内（例えば、肝内）、粘膜、鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（例えば、気管内点滴注入によって）、膣、硝子体などであり得る。いくつかの実施形態では、投与は、間欠的（例えば、時間的に分けられた複数の用量）及び／又は周期的（例えば、一般的な期間によって分けられた個々の用量）投与である投与を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間の連続投与（例えば、灌流）を含み得る。本明細書で使用される場合、「生体適合性」は、体液又は生細胞もしくは組織と接触している間に最小限の有害又は宿主応答効果を及ぼす材料を説明することを意図している。この用語はまた、認識タンパク質、例えば、天然に存在する抗体、細胞タンパク質、細胞及び生物系の他の成分との相互作用が、そのような相互作用が特に望ましい場合を除き、最小限であることを意味すると解釈される。したがって、上記の効果を引き起こすことを特に意図された材料及び官能基であって、そのインビボ投与が誘発する炎症、異物反応、免疫毒性、化学的毒性又は他のそのような有害作用が最小限かつ医学的に許容されるものは、生体適合性であると考えられる。本明細書で使用される「生体分子」という用語は、天然に存在するか人工的に作製された（例えば、合成又は組換え方法によって）かにかかわらず、細胞及び組織に一般的に見られる化学化合物のクラスに属する分子（例えば、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、炭水化物、糖、脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイドなど）を指す。生体分子の例示的な種類には、ペプチド、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、細胞応答修飾因子、例えば成長因子及び走化性因子、抗体、ワクチン、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス剤、プラスミド、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とも）という用語は、特定の疾患、障害、及び／又は状態を部分的もしくは完全に緩和し、改善し、リライブし（ｒｅｌｉｖｅ）、阻害し、発症を遅延させ、重症度を低下し、及び／又は１つ以上の症状、特徴、及び／もしくは原因の出現率を低下させる物質（例えば、医薬組成物）の任意の投与を指す。そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／もしくは状態の徴候を示さない対象、ならびに／又は疾患、障害、及び／もしくは状態の初期徴候のみを示す対象の治療であり得る。代替的又は追加的に、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／又は状態の１つ又は複数の確立された徴候を示す対象の治療であり得る。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／又は状態に罹患していると診断された対象の治療であり得る。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／又は状態の発症のリスク増加と統計的に相関する１つ以上の感受性因子を有することが知られている対象の治療であり得る。

本明細書で使用される場合、「対象」は生物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト）を意味する。いくつかの実施形態では、対象は、関連する疾患、障害又は状態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、又は状態にかかりやすい。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害又は状態の１つ以上の症状又は特徴を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害又は状態のいかなる症状又は特徴も示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害又は状態に対する感受性又はそのリスクに特徴的な１つ以上の特徴を有する者である。いくつかの実施形態では、対象は患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／又は治療が施され、かつ／又は施されたことがある個体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかについて、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかについて、対象はヒトである。

「グリコサミノグリカン」及び「ＧＡＧ」という用語は、本明細書で互換的に使用される場合、アミノ糖（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミンなど）及びウロン糖（グルクロン酸又はイズロン酸など）又はガラクトースを含む反復二糖単位で構成される多糖を指す。本発明で使用するためのＧＡＧは、サイズは様々であり得、硫酸化又は非硫酸化のいずれかであり得る。本発明の方法で使用され得るＧＡＧには、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（例えば、コンドロイチン６－硫酸及びコンドロイチン４－硫酸）、ヘパラン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、デルマタン、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸などが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「改善する」、「増加させる」もしくは「減少させる」という用語又はその文法的等価物は、ベースライン測定、例えば、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体における測定、又は本明細書に記載の治療を受けない対照個体（又は複数の対照個体）における測定と比較した値を示す。

本明細書で使用される場合、「修飾因子」という用語は、ポリマーコンジュゲートに共有結合している有機、無機又は生物有機部分を指す。修飾因子は、小分子又は高分子であり得、任意の化学的又は医薬クラス、例えばヌクレオチド、化学療法剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、免疫調節剤、ホルモン又はその類似体、酵素、阻害剤、アルカロイド及び治療用放射性核種、治療用放射性核種（例えば、アルファ、ベータ又は陽電子エミッタ）に属し得る。特定の実施形態では、本発明による修飾因子には、いくつか例を挙げると、生体分子、小分子、治療剤、薬学的に有用な基又は実体、高分子、診断標識、キレート剤、親水性部分、分散剤、電荷改質剤、粘度改質剤、界面活性剤、凝固剤及び凝集剤が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、修飾因子は、特定の生体分子又は組織に対する親和性を有する標的ペプチド又は炭水化物であり、ポリマーコンジュゲートの送達及び／又は有効性を増強し得る。修飾因子は、１つ以上の薬学的機能、例えば、生物学的活性及び薬物動態学的修飾を有することができる。薬物動態学修飾因子としては、例えば、抗体、抗原、受容体リガンド、親水性基、疎水性基又は荷電基が挙げられ得る。生物学的に活性な修飾因子としては、例えば、治療薬及びプロドラッグ、抗原、免疫調節剤が挙げられる。検出可能な修飾因子には、診断標識、例えば放射性、蛍光性、常磁性、超常磁性、強磁性、Ｘ線調節、Ｘ線不透明、超音波反射性、及び利用可能な臨床又は研究室方法、例えば、シンチグラフィー、ＮＭＲ分光法、ＭＲＩ、Ｘ線断層撮影、ソノトモグラフィ、光イメージング、ラジオイムノアッセイの１つによって検出可能な他の物質が含まれる。

好ましい修飾因子は、二官能リンカーとポリマーコアとの反応から生じるペンダント反応性基と反応することができる反応性部分を特徴とする。例えば、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）とコンドロイチン硫酸との反応は、ペンダントビニル基を特徴とするポリマーコアをもたらす。求核基、好ましくはアミン及び／又はスルフヒドリル基は、このようなペンダントビニル基と反応性である。したがって、ペンダント反応性基がビニル基である場合、好ましい修飾因子はアミンを特徴とする。

「疎水性」という用語は、水又は水溶液中での有意な溶解度を有しない、又は有しないと予想される有機分子又はラジカルの特性を指す。疎水性部分は、親分子又はポリマーの水溶解度を低下させる有機分子又はポリマー上の置換基を示すと解釈される。疎水性部分は、飽和であっても不飽和であってもよいＣ４－Ｃ３６アルキル基、例えば脂肪酸、又はステロールを含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２２、Ｃ２４、Ｃ２６、Ｃ２８、Ｃ３０、Ｃ３２及びＣ３４脂肪酸を使用することができる。疎水性基は、炭素数１６以上であってもよい。例示的な適切な疎水性基は、ステロール、コレステロール、パルミトイル、ヘキサデカ－８－エノイル、オレイル、（９Ｅ，１２Ｅ）－オクタデカ－９、１２－ジエノイル、ジオクタノイル、スフィンゴイド、及びＣ１６－Ｃ２０アシルを含む群から選択され得る。例えば、疎水性修飾因子は、脂質、リン脂質又は親油性アルコール、例えばカチオン性脂質、中性脂質、スフィンゴ脂質、ならびに脂肪酸、例えばステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレイド（ｌｉｎｏｌｅａｉｄｉｃ）酸、リノレン酸、及びミリスチン酸であり得るか、又はそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、Ｃ４－Ｃ３０飽和又は不飽和アルキル鎖を含む。アルキル鎖は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。

「リンカー」、「連結剤（ｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」、「架橋剤」などの用語は、２つ以上の分子と反応し、それによってそれらを「連結」することができる１つ以上の反応性官能基を有する薬剤を含む。連結剤は、例えば、ポリマーをＧＡＧ、２つのＧＡＧ、ならびにＧＡＧ及び修飾因子に連結することができる。連結剤は、当技術分野において一般に知られている。特に好ましいリンカーは、ジビニルスルホンである。

「予防する」又は「予防」という用語は、疾患、障害及び／又は状態の発生に関連して使用される場合、本明細書で使用される場合、疾患、障害及び／もしくは状態を発症するリスクを低下させること、ならびに／又は疾患、障害もしくは状態の１つ以上の特徴又は症状の発症を遅延させることを指す。疾患、障害、又は状態の発症が所定の期間遅延した場合、予防は完了したとみなすことができる。

本明細書で使用される「参照」という用語は、比較される基準又は対照を表す。例えば、いくつかの実施形態では、目的の薬剤、動物、個体、集団、試料、配列又は値を、参照又は対照の薬剤、動物、個体、集団、試料、配列又は値と比較する。いくつかの実施形態では、参照又は対照は、目的物の試験又は判定と実質的に同時に試験及び／又は判定される。いくつかの実施形態では、参照又は対照は、任意選択的に有形媒体で具体化された過去の参照又は対照である。典型的には、当業者によって理解されるように、基準又は対照は、評価中のものと同等の条件又は状況下で判定又は特徴付けられる。当業者は、特定の可能な参照又は対照への信頼性及び／又はそれらとの比較を正当化するのに十分な類似性が存在する場合を理解するであろう。いくつかの実施形態では、参照はアグリカンである。いくつかの実施形態では、参照はポリマー出発物質である。いくつかの実施形態では、参照は、無コンジュゲート反応である。いくつかの実施形態では、参照は、リンカー剤の省略を除いて、提供されるポリマーコンジュゲートの形成とすべての状況で一致する無コンジュゲート反応である。

「ゲル」という用語は、そのレオロジー特性で溶液又は固体と区別される粘弾性材料を指す。組成物は、定常状態又は低剪断条件下では流れないが、撹拌されるといくらかの流動性又は流れを示す場合、ゲルであると考えられる。ゲルは、中に流体相（ヒドロゲルの場合、水）が分散された連続固相を構成する３次元拡張ネットワークからなる。一般に、流体相は、固相よりもはるかに多くの量で存在する。拡張架橋ネットワークは、化学的共有結合又は溶液中での物理的会合のいずれかによって形成することができる。

「分子量」という用語は、特に明記しない限り、重量平均分子量又は「Ｍ_ｗ」（本明細書では「Ｍｗ」と互換的に使用される）を指す。

「可溶性」という用語は、分子（溶質）が別の物質（溶媒）中に分子レベルで完全に分散しており、溶質分子間に強い相互作用がない化学的状態を指す。

プロテオグリカン
プロテオグリカンは、身体のすべての結合組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見出される糖タンパク質である。多数のプロテオグリカン及びそれらの組織特異的発現が同定されている。構造にはかなりの多様性があるが、すべてのプロテオグリカンの共通の構造要素は、１つ又は多くの硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖でグリコシル化されたタンパク質コアである。タンパク質コアは、生物学的機能に重要ないくつかのモジュラー構造要素（例えば、ＩｇＧ様、ＥＧＦ様、ＨＡ結合モチーフ、ロイシンリッチモチーフなど）を含むことができる。共有結合した硫酸化ＧＡＧ鎖は、最も典型的には、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸又はヘパラン硫酸である。これらは、コアタンパク質鎖上のセリン部分に結合したＯ－結合型グリカンとしてタンパク質コアに結合していることが多い。

水和は、ＥＣＭ恒常性にとって極めて重要である。含水量は、組織体積及び圧迫に対する抵抗性を決定する。水和はまた、細胞移動、コラーゲン及びエラスチンなどのＥＣＭ構造成分の組織化、ならびに生体分子の輸送に必要な空間を作り出す。ＥＣＭにおけるプロテオグリカンの主要な構造的機能は、水和の維持である。これは、多数の硫酸化ＧＡＧ鎖を有する大きな凝集性プロテオグリカンに特に関連する。ヒアレクタン（ｈｙａｌｅｃｔａｎ）ファミリーのプロテオグリカン、例えばアグリカン及びバーシカンは、コアタンパク質の特定のサブユニット内に濃縮された複数の（例えば、約１０～１００）ＧＡＧ鎖を含む。これらの独特のバイオポリマー構造は、ボトルブラシ様ポリマー構造と、少量に濃縮されたＧＡＧ鎖上の多数のサルフェート部分及びカルボキシレート部分に由来する非常に高密度のアニオン電荷とを有する。ＥＣＭにおける重要な水和及び構造的支持を提供することに加えて、プロテオグリカンは、細胞外シグナル伝達において重要な役割を果たすことが知られている。それらは、いくつかの成長因子、ケモカイン及びサイトカインと強く結合し、アポトーシス、細胞発生、細胞運動性及び接着のためのシグナル伝達経路に影響を及ぼすことが知られている。

増々多くの科学的証拠が、結合組織の完全性の維持におけるプロテオグリカンの重要な役割、すなわち組織分解からの保護、傷害後の治癒の促進、及び疾患への抵抗を裏付けている。プロテオグリカンが結合組織の物理的特性の決定において果たす重要な役割、及び結合組織、例えば、真皮における加齢に伴う変化がプロテオグリカン分解と相関するという理解によって、プロテオグリカンに基づく治療法、例えば、プロテオグリカン補充療法は、加齢に伴う変化の治療及び創傷治癒のための、かつ皮膚科、泌尿器科、心臓血管及び整形外科の領域における満たされていない医学的需要に対処するための有望なアプローチである。

プロテオグリカンは、軟骨及び軟部組織のＥＣＭにおいて極めて重要な生体分子であると理解されているが、ほとんどの組織において少量しか存在しない。プロテオグリカンは、天然の供給源から単離し、大規模に精製することが困難である。したがって、アグリカンなどの生体分子は、現在、少量の研究ツールとしてのみ入手可能である。治療薬としての組織単離プロテオグリカンの使用は、法外な費用がかかり、実用的ではない。さらに、生体異物組織（ウシ、ブタ、海産）から抽出されたプロテオグリカンは、免疫学的宿主応答のためにヒト医薬における直接使用には不適切であり得る。

プロテオグリカン模倣物材料
天然に存在するプロテオグリカン（ＰＧ）の結合組織における重要な構造的及び／又は生物学的機能を模倣することができる組成物の設計を探究する、いくつかの研究が行われてきた。これらのアプローチは、いくつかのカテゴリに分類される。
ａ．合成ポリマー又は天然多糖類の硫酸化。例えば、ＰＧ模倣物の合成のための最も単純なアプローチの１つは、デキストランなどの炭水化物の硫酸化である［Ｄ Ｐａｐｙ－Ｇａｒｃｉａ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００５、３８：４６４７～４６５４］。芳香族ポリフェノールなどの合成ポリマーの硫酸化は、ＧＡＧ又はＰＧの生物活性を有する分子を生成することも報告されている［ＵＲ Ｄｅｓａｉ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１３，５：１３６３－１３６６］。
ｂ．表面又は粒子への硫酸化ＧＡＧの付着。例えば、コンドロイチン硫酸をカーボンナノチューブの表面にコンジュゲートして、軟骨補充のためのヒドロゲル構造物中のＰＧ模倣物としてＧＡＧ機能性ナノ粒子を提供した［Ｊ Ｗｅｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ２０１５，１６６：６６－７２］。コンドロイチン硫酸をアガロースゲルの表面に、それらのゲルをコンドロイチン硫酸還元末端のセリン部分と反応することができる反応性シアネートエステルで活性化した後、結合させた［ＫＪ Ｍａｔｔｅｒｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００７，３４２：２１９２－２２０１］。コンドロイチン硫酸を、ポリ（エチレンテレフタレート）繊維表面及びキトサン被覆ＰＥＴ繊維表面に付着させた［Ｃ－Ｈ Ｊｏｕ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｏｌｙｍ．Ａｄｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，１６：８２１－８２６］。
ｃ．アニオン性硫酸化ＧＡＧとカチオン性ポリマーとの複合体形成による不溶性粒子の生成。高度にアニオン性のＧＡＧと、キトサンなどのポリカチオンとの複合体の形成は、ＦＧＦ－２を結合することができるナノ粒子を生成する方法として記載されている［Ｓ Ｂｏｄｄｏｈｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００９，１０：１４０２－１４０９］［ＬＷ Ｐｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４，１５：３７７２－３７８０］。ヘパランを様々な反応性ポリマーと複合体形成させて、医療デバイス表面に適用される不溶性コーティングを形成する［米国特許第２００５／０２８１８５７号］。
ｄ．特定の生物活性ペプチドを硫酸化ＧＡＧとコンジュゲートさせて、十分に定義された、可溶性ペプチドグリカン誘導体を提供する。例えば、デルマタン硫酸と、コラーゲン－ＩＩ又はヒアルロン酸のいずれかを結合することができるペプチドとのコンジュゲートは、広く研究され、記載されている［Ｓ Ｓｈａｒｍａ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ ２０１３，９：４６１８－４６２５］［ＪＣ Ｂｅｒｎｈａｒｄ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ ２０１２，８：１５４３－１５５０］［米国特許第９，２００，０３９号］。
ｅ．硫酸化二糖又はオリゴ糖を有するモノマーの重合。例えば、コンドロイチン硫酸のポリマー模倣物は、単純なコンドロイチン硫酸二糖単位で置換されたＲＯＭＰ重合性モノマーの合成によって作製されている［Ｓ－Ｇ Ｌｅｅ，ｅｔ，ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１０，１：３２２－３２５］。
ｆ．多価オリゴ糖グリカンの合成。単一実体ヘパラン硫酸（ＨＳ）構造モチーフを表す特定の二糖類及び四糖類が調製され、４アーム樹枝状連結分子に結合している。これらのヘパラン硫酸模倣物は、特定の治療用タンパク質との相互作用において長鎖天然ＨＳの性能を模倣する能力を有することが分かった［ＰＣ Ｔｙｌｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４：２７１８－２７２３］。
ｇ．ＧＡＧと他のポリマーとのコンジュゲート。例えば、いくつかの小さな糖及びオリゴ糖は、それらの還元末端と合成ポリマーコア上の相補的官能基との反応によって合成ポリマーにコンジュゲートされている［Ｋ Ｇｏｄｕｌａ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２：９９６３－９９６５］。関連するアプローチでは、アグリカン様ボトルブラシ組成物は、剛毛としての全長天然ヘパラン又はコンドロイチン硫酸鎖の還元末端と反応することができるポリマーコアとしてヒアルロン酸誘導体を使用することが報告されている［ＬＷ Ｐｌａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４，１５：３７７２－３７８０］。ボトルブラシ様構造を形成するための別のアプローチでは、Ｏ－結合型セリングリカンを鎖の還元末端に有するコンドロイチン硫酸が、コアとしてのポリ（アクリル酸）とのアミド形成反応を含むいくつかの反応シナリオにおいて、モノテレケリックアミンとして使用されている［米国特許第２０１３００５２１５５Ａ１号］。

プロテオグリカン模倣物の分野にある程度関連する別の研究分野は、架橋ＧＡＧヒドロゲルに焦点を当てている。これらの場合、可溶性ポリマー化合物ではなく、拡張した架橋ネットワークが得られる。架橋ネットワークの特性は、最も根本的にはそれらの架橋密度及び粒径に由来する。対照的に、可溶性ポリマーは、それらの分子量及び分岐度によって特徴付けられる。一般に、架橋ゲルは高い弾性率を有し、注射による投与が困難であり得る。

ＧＡＧ材料の架橋を介して調製された水膨潤ヒドロゲル粒子は、生物学的環境においてＧＡＧに富む表面を呈する。しかしながら、組織への注射後、これらの架橋ゲルはＥＣＭ内で別個の粒子として挙動するので、プロテオグリカン模倣材料として機能することができない。それらは、例えばベルシカンなどのプロテオグリカンが真皮で行うことが知られているように、軟部組織に組み込まれ、ＥＣＭの他の成分と相互作用する能力を有さない。

架橋ＧＡＧネットワークに関する研究がヒアルロン酸（ＨＡ）に集中することができるのは、それが天然源だけでなく細菌培養から大規模に産生され、商業的に入手可能であるためである。さらに、ＨＡは、通常５００，０００Ｄａ超で数百万Ｄａに及ぶ非常に高い分子量の形態で一般に入手可能である。高分子量は、拡張ヒドロゲル構造の形成に有利である。このため、ＨＡベースの架橋ヒドロゲルの合成及び使用に関する重要な研究が行われ、ヒアルロン酸は、バイオ医薬品及び医療デバイス製品開発において広く使用されているＧＡＧである。ＨＡゲルは、皮膚フィラー、増粘剤及び化粧品として周知である。

ＨＡとは対照的に、硫酸化ＧＡＧ（例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸及びケラタン硫酸）は、現在天然源から入手可能であり、一般にはるかに少量である。高品質ＧＭＰ材料の商業的供給源は限られている。また、天然組織から抽出される場合、これらの硫酸化ＧＡＧはＨＡよりもはるかに低い分子量を有することが見出されている。例えば、高品質ウシ由来コンドロイチン硫酸は、一般に、５０，０００Ｄａ未満、典型的には２５，０００Ｄａ未満の分子量を有することが分かっている。これらのバイオポリマーの低分子量、ならびに高純度材料を供給することの困難さは、バイオ医薬品及び医療デバイス製品開発におけるそれらの使用を制限している。

架橋ＨＡヒドロゲルに関する研究報告及び特許は、他のＧＡＧがＨＡの代わりに利用され得ることに言及している。しかしながら、硫酸化ＧＡＧとＨＡとの間の有意な相違、最も顕著には分子量の非常に大きな差を考慮すると、ＨＡを用いてゲルを形成するための既存の合成方法が、硫酸化ＧＡＧに応用できると仮定することはできない。また、硫酸化ＧＡＧ由来の架橋ヒドロゲルの特性は、ＨＡ架橋ヒドロゲルの特性に類似すると仮定することはできない。

架橋ＧＡＧヒドロゲルの形成のための、いくつかの１ステップ直接連結剤が文献に記載されており、生体適合性ヒドロゲルを提供することが見出されている。これらの架橋ＨＡヒドロゲルは、皮膚フィラー（例えば、ＨＹＬＡＦＯＲＭ（登録商標）、ＰＲＥＶＥＬＬＥ（登録商標）、ＲＥＳＴＹＬＡＮＥ（登録商標）、ＪＵＶＥＤＥＲＭ（登録商標））及び増粘剤（例えば、ＳＹＮＶＩＳＣ（登録商標）、ＳＹＮＶＩＳＣ－ＯＮＥ（登録商標）、ＳＵＰＡＲＴＺ（登録商標）、ＥＵＦＬＥＸＸＡ（登録商標）、ＪＯＮＥＸＡ（登録商標）、ＭＯＮＯＶＩＳＣ（登録商標）、ＯＲＴＨＯＶＩＳＣ（登録商標））及び接着バリア（例えば、ＩＮＣＥＲＴ（登録商標）、ＩＮＣＥＲＴ－Ｓ（登録商標）、ＨＹＡＬＯＢＡＲＲＩＥＲ（登録商標））などの様々な市販製品で利用されている。直接連結剤の非限定的な例は、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、エピクロロヒドリン（ｅｐｉ）、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、ジエポキシオクタン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、フェニレン－ビス（エチルカルボジイミド）、１，１’カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）である。

種々の直接架橋剤と硫酸化ＧＡＧとの反応は、強固なヒドロゲルを形成することが知られている。しかしながら、出願人らは、そのようなゲル形成が反応条件に敏感であり、予想外の結果が得られ得ることを観察した。例えば、ＤＶＳとコンドロイチン硫酸との反応は、いくつかの結果をもたらし得る。場合によっては、強固な透明なゲルが得られる。場合によっては、粘性の透明な流体が得られる。場合によっては、不溶性修飾コンドロイチン硫酸の濁った懸濁液が得られる。場合によっては、濁ったゲルが得られる。本出願人は、これらの様々な結果を制御及び指導して、可溶性ポリマーコンジュゲートを生成するための方法を本明細書で開示する。もちろん、この文脈における「可溶性」という言葉は、溶液が自由に流動し、注射可能である水溶性を指す。

プロテオグリカン模倣物材料を開発するためのいくつかの試みにもかかわらず、生体適合性であり、可溶性であり、拡散によって軟部組織中に組み込まれることができ、注射又は投与が容易であり、軟部組織中に長期間保持され、市販量にスケーラブルな効率的かつ単純な化学プロセスを使用して作製することができることが知られているか又は予想される、天然プロテオグリカンの有益な物理的及び生物学的機能を効果的に提供する既知のポリマーコンジュゲートは、現在のところ存在しない。

ポリマーコンジュゲート
本発明は、プロテオグリカン模倣物に関する。本発明は、硫酸化ＧＡＧ（及び他のポリマー）が、適切な連結剤と反応して、分岐したボトルブラシ様構造を有するものを含む、可溶性の高次ポリマーコンジュゲートを形成することができるいくつかの官能性部分を含むという認識を包含する。そのような官能性部分を連結剤と反応させて、ポリマー鎖を、１つ以上の他のポリマー鎖とコンジュゲートするために「活性化」することができる。この領域での以前の努力により、ゲルであるＧＡＧ組成物が生成されたが、本発明は、ゲルではなく、水溶液に可溶性のままであるポリマーコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、本発明の可溶性ポリマーコンジュゲートは、連結剤及び硫酸化ＧＡＧの化学量論、硫酸化ＧＡＧの濃度、硫酸化ＧＡＧの分子量及び／又は反応時間を制御することによって生成される。

再度、この文脈における「可溶性」という言葉は、溶液が自由に流動し、注射可能である水溶性を指す。「自由に流動する」とは、好ましくは、２０Ｃで約５００ｃｐ未満、好ましくは約１００ｃｐ未満、例えば約５０ｃｐ未満の粘度を意味する。「注射可能」とは、典型的には、静脈内、筋肉内又は皮下注射に使用される医療用針を介した送達を指す。例えば、１５～３０ゲージの針、好ましくは１８～２５ゲージの針を使用することができる。針のゲージ及び／又は粘度が高くなると、特定の溶液を送達するために必要な時間及び圧力が増加する可能性がある。小さすぎる針と組み合わせて粘度が高すぎる場合、注射失敗が起こりやすい。注射失敗は、送達中に針が目詰まりする場合である。したがって、プロテオグリカン模倣物の水溶性は、少なくとも一態様では、水溶液の粘度によって特徴付けることができる。このような水溶液は、飽和点で測定することができる。しかしながら、投与される溶液は、飽和状態で送達される必要はないことが理解されよう。代替的又は追加的に、溶液は、精密濾過することができる。例えば、溶液をフィルター（例えば、０．２ミクロンフィルター）に通し、それによって溶液を滅菌し、好ましくは注射に適したものにすることができる。

本明細書に記載の連結化学作用において利用され得るＧＡＧ又は他のポリマー上の官能性部分には、ヒドロキシル基、アミン、チオール及びカルボキシル基が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、官能性部分は、ＧＡＧポリマー骨格鎖に沿った１つ以上のヒドロキシル基であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、官能性部分は、ＧＡＧポリマー骨格鎖に沿った１つ以上のカルボキシル基であるか、又はそれを含む。

いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、連結剤を介して連結された複数の硫酸化ＧＡＧポリマー鎖を含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、連結剤を介して連結された複数の硫酸化ＧＡＧポリマー鎖及び少なくとも１つのさらなるポリマーを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、連結剤を介して連結された複数の硫酸化ＧＡＧポリマー鎖及び少なくとも２つのさらなるポリマーを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、連結剤を介して連結された複数の硫酸化ＧＡＧポリマー鎖及び少なくとも３つのさらなるポリマーを含むか、又はそれらからなる。この段落に記載される実施形態を含むいくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧはコンドロイチン硫酸である。この段落に記載される実施形態を含むいくつかの実施形態では、さらなるポリマーは、コンドロイチン硫酸以外の硫酸化ＧＡＧである。この段落に記載される実施形態を含むいくつかの実施形態では、さらなるポリマーは、非硫酸化ＧＡＧである。この段落に記載される実施形態を含むいくつかの実施形態では、さらなるポリマーは、ヒアルロン酸（ＨＡ）又はカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ある。

本発明のポリマーコンジュゲートは、一般に、個々のＧＡＧポリマー鎖と比較してより高い（例えば、増加した）分子量を有するが、拡張された架橋ネットワークを有するゲルを形成しないことが理解されるであろう。いくつかの実施形態において、本発明のポリマーコンジュゲートは、出発物質として使用される非連結硫酸化ＧＡＧと比較して特定の範囲の分子量を有する（例えば、ポリマーコンジュゲートは個々の非連結硫酸化ＧＡＧ出発物質の３倍～１００倍以上の分子量を有する）。いくつかの実施形態において、本発明のポリマーコンジュゲートは、特定の範囲（例えば、個々の非連結硫酸化ＧＡＧ出発物質の３倍～１００倍以上）の分子量を有する分岐多鎖コンジュゲートである。いくつかの実施形態において、本発明のポリマーコンジュゲートは、特定の範囲（例えば、個々の非連結硫酸化ＧＡＧ出発物質の３倍～１００倍以上）の分子量を有するボトルブラシ様多鎖コンジュゲートである。いくつかの実施形態において、本発明のポリマーコンジュゲートは、個々の非連結硫酸化ＧＡＧ出発物質の分子量の約３倍～１００倍、３倍～７５倍、３倍～５０倍、３倍～２５倍、５倍～１００倍、５倍～７５倍、５倍～５０倍及び５倍～２５倍の範囲内の分子量を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリマーコンジュゲートは、個々の非連結硫酸化ＧＡＧ出発物質の分子量の５倍～２５倍の範囲の分子量を有する。非常に高分子量の水溶性ポリマーが達成されている。例えば、５００Ｋ、６００Ｋ、７００Ｋ、８００Ｋ、９００Ｋ、１００万、１５０万、２００万、２５０万又はそれを超える分子量を有する架橋硫酸化ＧＡＧが達成されている。

いくつかの実施形態において、本発明のポリマーコンジュゲートは、水溶液又は生理食塩水に可溶性である。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、複数の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ポリマー鎖を含み、各硫酸化ＧＡＧは、リンカー剤を介して１つ又は複数の硫酸化ＧＡＧポリマー鎖に連結されており、ポリマーコンジュゲートは水溶液に可溶性であり、個々の非連結硫酸化ＧＡＧの３倍～１００倍の分子量を有する。

いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ポリマーコンジュゲートの変形には、様々な長さ、硫酸化パターン、分子量、化学組成などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で提供される方法を使用して制御され得るこれらの変形は、ポリマーコンジュゲートの立体配座、分子量、水和、機械的及び細胞シグナル伝達機能に影響を及ぼし得る。

リンカー剤
当業者は、本発明に従って使用されるＧＡＧポリマー及び他のポリマーを連結するのに適した種類の直接リンカー剤に精通しているであろう。「連結剤」、「リンカー剤」、「架橋剤」及び「リンカー」という用語は交換可能であり、リンカーはリンカー剤との反応に由来するコンジュゲートの一部であると理解される。

いくつかの実施形態では、リンカー剤は二官能性である。いくつかの実施形態では、リンカー剤はポリマーではない。例えば、ポリマーリンカーは、反復単位を特徴とする。いくつかの実施形態では、リンカー剤は、モノマー単位が１０回以下繰り返すポリマーのみである。いくつかの実施形態では、リンカー剤は、モノマー単位が５回以下繰り返すポリマーのみである。いくつかの実施形態では、リンカー剤は、約１５０Ｄａ、２００Ｄａ、２５０Ｄａ、３００Ｄａ、３５０Ｄａ、４００Ｄａ、４５０Ｄａ、５００Ｄａ、６００Ｄａ、７００Ｄａ、８００Ｄａ、９００Ｄａ又は１０００Ｄａ未満の分子量を有する。いくつかの実施形態では、リンカー剤はポリマーではなく、約１５０Ｄａ、２００Ｄａ、２５０Ｄａ、３００Ｄａ、３５０Ｄａ、４００Ｄａ、４５０Ｄａ、５００Ｄａ、６００Ｄａ、７００Ｄａ、８００Ｄａ、９００Ｄａ又は１０００Ｄａ未満である。いくつかの実施形態において、リンカー剤はポリマーではなく、約１０００Ｄａ未満である。いくつかの実施形態において、リンカー剤はポリマーではなく、約５００Ｄａ未満である。いくつかの実施形態において、リンカー剤はポリマーではなく、約２５０Ｄａ未満である。いくつかの実施形態において、リンカー剤はポリマーではなく、約２００Ｄａ未満である。いくつかの実施形態において、リンカー剤はポリマーではなく、約１５０Ｄａ未満である。いくつかの実施形態では、リンカー剤はポリマーではなく、１５０Ｄａ、２００Ｄａ、２５０Ｄａ、３００Ｄａ、３５０Ｄａ、４００Ｄａ、４５０Ｄａ、５００Ｄａ、６００Ｄａ、７００Ｄａ、８００Ｄａ、９００Ｄａ又は１０００Ｄａ未満である。

いくつかの実施形態では、リンカー剤は、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ジエポキシド、エピクロロヒドリン（Ｅｐｉ）、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカー剤はエピクロロヒドリン（Ｅｐｉ）である。いくつかの実施形態では、リンカー剤はブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である。いくつかの実施形態では、リンカー剤はビスカルボジイミドである。いくつかの実施形態では、リンカー剤はフェニレン－ビス（エチルカルボジイミド）である。いくつかの実施形態では、リンカー剤は、１，１’－カルボニルジイミダゾールである。いくつかの実施形態では、リンカー剤はジビニルスルホン（ＤＶＳ）である。

いくつかの実施形態では、リンカー剤は、ブロモ酢酸ＮＨＳエステル、６－（ヨードアセトアミド）カプロン酸ＮＨＳエステル、マレイミド酢酸ＮＨＳエステル、マレイミド安息香酸ＮＨＳエステル、又はＭＭＣＣＨ（４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシルヒドラジド）である。

いくつかの実施形態では、リンカーは、２個～約２０個のアミノアシル残基、直鎖もしくは分岐鎖のアルキルもしくはアリールカルボン酸エステル、又はＣ_１－２０の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素鎖を含むペプチド性フラグメントであり、ここで、リンカーの１つ以上のメチレン単位は、独立して、シクロプロピレン、－ＣＨＯＨ－、－ＮＲ－、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）－、－Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２－、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、
－ＳＯ_２－、－Ｃ（＝Ｓ）－又はＣ（＝ＮＲ）－
で置き換えられてもよい。

いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカー剤は、短いポリ（アルキレンオキシド）鎖を含有する。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカー剤は、両末端にエポキシド基を有する短いポリ（エチレンオキシド）鎖、例えばポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルである。

好ましいリンカーは水溶性であり、求核基、例えばＧＡＧ上のヒドロキシ基ペンダント及び修飾因子上に提示されたアミンと反応する部分を特徴とする。

硫酸化ＧＡＧ
いくつかの実施形態では、本発明に従って使用するための硫酸化ＧＡＧは、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧはコンドロイチン硫酸である。コンドロイチン硫酸は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮ）とグルクロン酸（ＧｌｃＮ）との反復二糖単位からなる。いくつかの実施形態では、コンドロイチン硫酸は、１００を超える糖類を有することができ、それらの各々は、可変の位置及び量で独立して硫酸化され得る（例えば、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ、Ｄ及びＥ）。いくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧの分子量は、約１，０００Ｄａ超、５，０００Ｄａ超、１０，０００Ｄａ超、１５，０００Ｄａ超、２０，０００Ｄａ超、３０，０００Ｄａ超、４０，０００Ｄａ超、５０，０００Ｄａ超、１００，０００Ｄａ超、又はこれらの数字のいずれか２つを含む範囲であり得る。いくつかの実施形態では、コンドロイチン硫酸の分子量は、約１，０００Ｄａ超、５，０００Ｄａ超、１０，０００Ｄａ超、１５，０００Ｄａ超、２０，０００Ｄａ超、３０，０００Ｄａ超、４０，０００Ｄａ超、５０，０００Ｄａ超、１００，０００Ｄａ超、２００，０００Ｄａ超、又はこれらの数字のいずれか２つを含む範囲であり得る。硫酸化ＧＡＧは、一般に天然源から得られるが、非動物性又は合成源によって提供されてもよい。

修飾ＧＡＧ
いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、修飾ＧＡＧを使用することによって調製することができ、ここで少なくとも１つの修飾因子は、少なくとも１つのポリマーＧＡＧ鎖に導入されている。上記のように、ＧＡＧは、鎖に沿って多数のヒドロキシル及びカルボキシル官能基を有する。さらに、ＧＡＧの還元末端は、単一かつ独特の化学官能性を提供する。本発明に記載される新規な組成物の治療上の利益を拡大及び増強するために、本発明は、連結剤との反応の前（又は後）にＧＡＧ鎖に修飾因子を導入し得るという認識を包含する。化学修飾されたＧＡＧ又はＧＡＧ糖コンジュゲートを用いて本発明の方法を実施することにより、修飾因子によってもたらされるさらなる利点を有する高分子量プロテオグリカン模倣物が提供されるであろう。例えば、コラーゲン－Ｉ、コラーゲン－ＩＩ、他のコラーゲンアイソフォーム、エラスチン、インテグリン受容体、又は他のＥＣＭ成分もしくは細胞表面タンパク質、例えば、限定されないが、ガレクチンに対する親和性を有するペプチドを有する硫酸化ＧＡＧは、標的生体分子に対するプロテオグリカン模倣物のより特異的な結合を可能にする。文献は、ＧＡＧの共有結合修飾のいくつかの例を記載しており、そのような修飾のための適切な化学は当業者に公知である。

いくつかの実施形態において、硫酸化ＧＡＧは、ＧＡＧポリマー鎖に沿って修飾され得る。いくつかの実施形態において、修飾因子は、ＧＡＧ鎖骨格を連結剤と連結させる前に、当業者に公知の種々の方法によって硫酸化ＧＡＧに導入され得る。いくつかの実施形態において、修飾因子は、当業者によく知られている還元末端化学を使用して（例えば、還元的アミノ化）、その還元末端において硫酸化ＧＡＧ上に導入され得る。

いくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧが、ＧＡＧポリマー鎖に沿ったカルボキシル基を介して修飾される。いくつかの実施形態では、カルボキシル基をペプチドカップリング条件に供してアミド結合を形成し、それによって修飾因子を導入する。適切なペプチドカップリング条件は当技術分野で周知であり、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６０，２４４７－６７（２００４）及びＶＲ Ｐａｔｔａｂｉｒａｍａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８０，４７１－４７９（２０１１）に詳細に記載されているものが含まれ、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、適切なペプチドカップリング条件は、ＤＩＥＡなどの塩基又は当業者によく知られている他の塩基の存在下で、カルボジイミド又はトリアゾール活性化試薬から選択されるペプチドカップリング試薬を含む。特定の実施形態では、ペプチドカップリング条件は、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、ＤＭＡＰ、ＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＢＯＭＩ、ＤＣＣ、ＥＤＣ、ＩＢＣＦ、又はそれらの組み合わせの添加を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドカップリング剤は、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）などのトリアジン活性化剤から選択される。

いくつかの実施形態では、可溶性高分子量硫酸化ＧＡＧ組成物は、意図される用途におけるそれらの性能を高めるための基で化学的に置換されたポリマーを用いて調製され得る。いくつかの実施形態では、そのような修飾因子は、ＧＡＧ多糖鎖に沿ってランダムに、又は鎖の還元末端でのみ置換される。いくつかの実施形態では、提供されるポリマーコンジュゲートは、硫酸化ＧＡＧ、例えばＥＣＭ（例えば、コラーゲン、エラスチン）の成分に強い親和性を有することが知られているペプチド修飾因子で置換されたコンドロイチン硫酸（ＣｈＳ）を含む。他の実施形態では、提供されるポリマーコンジュゲートは、その治療上の利益を強化するために酸化防止修飾因子又はその他の分子で置換された硫酸化ＧＡＧを含む。ペプチドコンジュゲートは、合成ポリマー及び生体材料に生物学的認識及び機能を付加する手段として当技術分野で周知である。多くの短いペプチドモチーフが同定され、本発明のＧＡＧコンジュゲートの形成に有用であり得る生体材料用途で利用されている。これらのペプチドの多くは、所与の標的生体分子に対して所望の親和性を有する天然タンパク質に由来する。

いくつかの実施形態において、提供されるポリマーコンジュゲートは、インテグリン結合性修飾因子で置換された硫酸化ＧＡＧを含む。最もよく知られているのは、細胞表面インテグリンに結合するためのペプチドモチーフがフィブロネクチンに由来する：ＧＲＧＤＳ（配列番号１）、ＰＨＳＲＮ（配列番号２）、ＲＥＤＶ（配列番号３）及びＬＶＤ。これらのペプチド及びそれらの誘導体は、細胞表面インテグリンに対する親和性を有し、生体材料マトリックスに共有結合して細胞を固定化している。ラミニンに由来するインテグリン結合性ペプチドもまた、細胞を生体材料に引き付けるために使用されてきた：ＹＩＧＳＲ（配列番号４）、ＧＩＩＦＦＬ（配列番号５）、ＩＫＶＡＶ（配列番号６）、それらの誘導体、他多数。

いくつかの実施形態において、提供されるポリマーコンジュゲートは、コラーゲン結合剤で置換された硫酸化ＧＡＧを含む。コラーゲン表面に結合することが知られているいくつかのペプチドが存在する。いくつかは、デコリンに由来する：ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ（配列番号７）（ｄｃ－１３として知られている）、ＬＲＥＬＨＬＮＮＮ（配列番号８）（ＩＳ－６）及びＬＨＥＲＨＬＮＮＮ（配列番号９）。別の周知のコラーゲン結合性ペプチドは［ＧＰＯ］７であり、グリシン－プロリン－ヒドロキシプロリンコラーゲンモチーフの７－ｍｅｒ反復は、原線維コラーゲンに対してヘリコジェニック（ｈｅｌｉｃｏｇｅｎｉｃ）親和性を有する。ペプチドＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡ（配列番号１０）は、米国特許第９，１３３，２４６ Ｂ２号に記載されており、そこではコラーゲンを標的とする融合タンパク質の一部として使用された。米国特許第９，２００，０３９ Ｂ２号には、コラーゲン結合性ペプチドＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ（配列番号１１）（ＳＩＬＹとして知られている）及びＷＹＲＧＲＬＧＣ（配列番号１２）、ならびにいくつかの他の例が記載されている。さらに、米国特許第８，８４６，００３ Ｂ２号明細書には、コラーゲン－ＩＩＩ表面での結合に特異性を有するペプチド、例えば：ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ（配列番号１３）及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ（配列番号１４）が記載されている。米国特許第８０３４８９８ Ｂ２号には、ＷＨＣＹＴＹＦＰＨＨＹＣＶＹＧ（配列番号１５）；ＧＷＨＣＹＴＹＦＰＨＨＹＣＴＹＧ（配列番号１６）；ＡＷＨＣＹＴＹＦＰＨＨＹＣＶＹＧ（配列番号１７）；ＬＷＨＣＹＴＹＦＰＨＨＹＣＶＹＧ（配列番号１８）；ＹＷＨＣＹＴＹＦＰＨＨＹＣＶＹＧ（配列番号１９）を含む、コラーゲンに対する親和性を有するいくつかの環状ペプチドが記載されている。

いくつかの実施形態において、提供されるポリマーコンジュゲートは、ヒアルロナン結合性修飾因子で置換された硫酸化ＧＡＧを含む。ＥＣＭ中のヒアルロナンへの結合に対する親和性を有するペプチドは、米国特許第９，２００，０３９ Ｂ２号に記載されている。これらには、ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧＧＣ（配列番号２０）（ＧＡＨとして知られている）及び他の例が含まれる。

好ましくは、本発明によるポリマーコンジュゲートは、ガレクチンについて少なくとも１つのグリカンリガンドで置換された少なくとも１つの硫酸化ＧＡＧポリマー鎖、例えば少なくとも１つのβ－ガラクトース残基（例えば、β－ガラクトシド）を含む硫酸化ＧＡＧポリマー鎖を含む。

いくつかの実施形態では、提供されるポリマーコンジュゲートは、修飾因子として上記のペプチド又はグリカンのいずれかを含む。

典型的には、ＧＡＧを架橋した後に、修飾因子を可溶性ポリマーコンジュゲートに添加する。驚くべきことに、架橋後に修飾因子を添加すると、実質的にすべてのポリマーコンジュゲートが改善されることが発見された。

追加のポリマー
提供されるポリマーコンジュゲートのいくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧは、他のポリマー及び生体分子と直接コンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ヒアルロン酸（ＨＡ）又はカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を組み込んで、ハイブリッド高分子量可溶性ポリマー組成物を形成する。いくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧは、約２５０ｋＤａ超、３００ｋＤａ超、３５０ｋＤａ超、４００ｋＤａ超、４５０ｋＤａ超、５００ｋＤａ超、１，０００ｋＤａ超、又はこれらの数字のいずれか２つを含む範囲の分子量を有する他のポリマー及びバイオポリマーと直接コンジュゲートされ得る。

ＧＡＧポリマーコンジュゲートを調製する方法
上記のように、本発明のポリマーコンジュゲートは、合成試薬及び方法の適切な選択によって合成される。以下の議論は、本発明のポリマーコンジュゲートの組み立てに使用するための、利用可能な多様な方法のいくつかを例示するために提供される。しかしながら、議論は、本発明の化合物を調製するのに有用な反応又は反応シーケンスの範囲を限定することを意図するものではない。

以下に示すスキームＡは、硫酸化ＧＡＧ（例えば、コンドロイチン硫酸）及びリンカー剤（例えば、ＤＶＳ）が結合され得る様々な位置を示す：
スキームＡ

以下に示されるスキームＢは、ポリマーコンジュゲートを形成するために、結合リンカー剤（ＤＶＳ）を含む第２の硫酸化ＧＡＧと反応させた硫酸化ＧＡＧの例を示す：
スキームＢ

出願人は、硫酸化ＧＡＧが高濃度で存在する条件下で、強固な透明ゲルが迅速に形成され得ることを観察した。例えば、Ｍｗ＝１４，０００Ｄａの市販のウシ由来コンドロイチン硫酸材料を使用して、コンドロイチン硫酸が８ｗｔ％を超える濃度であり（１００ｇの溶液に８ｇのポリマーが含まれる）、十分なＤＶＳが使用される場合、ヒドロゲルは、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液中にＤＶＳを添加した後１～２時間以内に形成され得る。

ＤＶＳ／ＯＨ比とポリマー濃度の様々な組み合わせは、溶液中のポリマーの重量％として表すことができる。いくつかの組み合わせでは、ゲルが形成され、他の組み合わせでは、ゲルが形成されない。さらに、ゲルの形成前に反応をクエンチ（停止）することが可能である。反応混合物が透明なままであるようにする反応条件、及び不溶性の高度に修飾されたポリマー誘導体の形成により反応物が濁るか、又は不透明になる条件を選択することができる。

本発明は、とりわけ、主要な生成物が水溶液に可溶性の硫酸化ＧＡＧポリマーコンジュゲートであるポリマーコンジュゲートを調製する方法を提供する。本発明の一態様によれば、硫酸化ＧＡＧが、ゲルの形成を回避するように選択された濃度で本明細書中に提供される方法において使用される。

いくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧの濃度は、約１ｗｔ％超、２ｗｔ％超、３ｗｔ％超、４ｗｔ％超、５ｗｔ％超、６ｗｔ％超、７ｗｔ％超、又はこれらの数字のいずれか２つを含む範囲である。いくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧの濃度は、約２０ｗｔ％未満、１５ｗｔ％未満、１２ｔ％未満、１０ｗｔ％未満、９ｗｔ％未満、８ｗｔ％未満、７ｗｔ％未満、６ｗｔ％未満、５ｗｔ％未満、４ｗｔ％未満、３ｗｔ％未満、２ｗｔ％未満又は１ｗｔ％未満である。いくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧの濃度は、２ｗｔ％～７ｗｔ％、例えば２ｗｔ％～５ｗｔ％の範囲である。

いくつかの実施形態では、約８ｗｔ％～１６ｗｔ％の範囲のＣｈＳで行われる実験で、ゲル形成の速度が、ＣｈＳの濃度及び使用されるＤＶＳの量の両方とともに増加することが明らかになる。例えば、バイオポリマー上で利用可能なＤＶＳ／ヒドロキシル基当量のモル比が０．１未満である場合、ＣｈＳのより高濃度の溶液（１０～１２ｗｔ％）でさえ、９０分後にゲルは形成されない。したがって、ＤＶＳ／ヒドロキシルモル比は、約１．０未満、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１未満、０．０５未満、０．０１未満、又はこれらの数字のいずれか２つを含む範囲であり得る。典型的には、より低い硫酸化ＧＡＧ濃度でより高いモル比を使用することができる。

いくつかの実施形態では、ＤＶＳ／ヒドロキシル比が体系的に増加する条件下でこれらの反応を実施した場合、ゲル形成の速度が加速されることが観察された。さらに、ＤＶＳ／ヒドロキシルレベルが高い場合（１．０付近又はそれを超える）、一部の反応物が濁るか、又は白色固体沈殿物さえも形成することがわかった。ＮＭＲ分光法によるこの不溶性生成物の特性評価により、それがビニルスルホン基で高度に置換されたコンドロイチン硫酸誘導体であることが分かった。本発明の方法は、典型的には、ゲル形成を回避し、水溶性ポリマーコンジュゲートを維持する条件下で実施される。

「分岐」ポリマーコンジュゲート
いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、分岐構造を有する。いくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧを、ＧＡＧ濃度及びＧＡＧに対する連結剤のモル比が、拡張した架橋ネットワークではなく可溶性分岐ポリマーを提供するように選択されている条件下で連結剤と反応させる。いくつかの実施形態では、リンカー剤はＤＶＳであり、ＤＶＳ／ヒドロキシル比は約０．０１～０．６の範囲である。いくつかの実施形態では、ＤＶＳ／ヒドロキシル比は、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、又はこれらの数字のいずれか２つを含む範囲である。

特定の実施形態では、本発明は、ポリマーコンジュゲートを調製する方法であって、ｉ）水溶液中約２ｗｔ％～２０ｗｔ％の濃度の硫酸化ＧＡＧを提供する工程；及びｉｉ）硫酸化ＧＡＧを連結剤と接触させる工程を含む方法を提供し、ここでＧＡＧヒドロキシル基対連結剤のモル比は、ゲル形成が可溶性分岐ポリマーを形成するのに必要なモル比よりも小さい。いくつかの実施形態では、工程ｉにおける硫酸化ＧＡＧは、１０，０００Ｄａ～１００，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＧＡＧヒドロキシル基対連結剤（例えば、ＤＶＳ／ヒドロキシル比）のモル比は、０．０１～０．６である。いくつかの実施形態では、工程Ｉにおける硫酸化ＧＡＧは、５，０００Ｄａ～２００，０００Ｄａ、例えば１０，０００Ｄａ～１００，０００Ｄａの分子量及び０．０１～０．６のＧＡＧヒドロキシル基対連結剤（例えば、ＤＶＳ／ヒドロキシル比）のモル比を有する。

いくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧを、拡張した架橋ネットワーク（例えば、ゲル）が形成される前に反応を終結させることができる条件下で、直接連結剤と反応させる。これらのケースでは、酸（ＨＣｌなど）を添加してｐＨを中性値に下げることによって、連結反応を容易に終了させる。ここでも、拡張した架橋ネットワークではなく、可溶性分岐ポリマーが得られる。いくつかの実施形態では、反応は、反応が終結するまで一定時間行われる。いくつかの実施形態では、反応は、約１～１２０分間行われる。いくつかの実施形態では、反応は、約２５～４０分間行われる。いくつかの実施形態では、反応は、約４０分間行われる。いくつかの実施形態では、反応は、約９０分間行われる。

いくつかの実施形態では、分岐ポリマーコンジュゲートの分子量は、約１５，０００Ｄａ超、２０，０００Ｄａ超、３０，０００Ｄａ超、４０，０００Ｄａ超、５０，０００Ｄａ超、１００，０００Ｄａ超、２００，０００Ｄａ超、３００，０００Ｄａ超、４００，０００Ｄａ超、５００，０００Ｄａ超、１，０００，０００Ｄａ超、又はこれらの数字のいずれか２つを含む範囲である。

「ボトルブラシ様」ポリマーコンジュゲート
いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、ボトルブラシ様構造を有する。いくつかの実施形態では、硫酸化ＧＡＧを、反応物が連続的に導入される条件下で連結剤と反応させる。いくつかの実施形態では、反応物のこの段階的添加は、生成物の分子構造及び特性に有意に影響を及ぼし得る。例えば、１ポット手順では、硫酸化ＧＡＧの少量部分を希釈溶液中の連結剤で活性化して、中間の多価反応性コアポリマーを形成することができる。過剰な、同じ又は異なる硫酸化ＧＡＧを続いて添加すると、ボトルブラシ様構造を有する可溶性の高分子量硫酸化ＧＡＧ組成物が形成される。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、硫酸化ＧＡＧの連続的導入を介して単一の反応においてポリマーコンジュゲートを調製する方法であって、ｉ）硫酸化ＧＡＧを提供する工程；ｉｉ）硫酸化ＧＡＧの少量部分が連結剤の全部と反応する条件下で、硫酸化ＧＡＧを連結剤と反応させる工程；及びｉｉｉ）硫酸化ＧＡＧの残りの部分を添加して、ボトルブラシ様構造を有する可溶性コンジュゲートを形成する工程を含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、連結剤（例えば、ＣＭＣ、ＨＡ）と直接反応することができる高分子量コアポリマーを、２段階合成手順の最初の工程で反応させる。次いで、硫酸化ＧＡＧを導入して、１ポット手順でボトルブラシ様ポリマー組成物を形成する修飾コアポリマーと反応させることができる。

いくつかの実施形態では、本発明は、ポリマーコンジュゲートを調製する方法であって、ｉ）コアポリマーを希釈溶液中の連結剤で活性化して、中間の多価反応性コアポリマーを形成する工程；及びｉｉ）過剰の硫酸化ＧＡＧを添加して、可溶性ボトルブラシ様ポリマーを形成する工程を含む方法を提供する。特定の実施形態では、工程ｉは、コアポリマーの少量部分が連結剤の全量と反応する条件下で、コアポリマーを連結剤で活性化することを含む。特定の実施形態では、工程ｉは、準化学量論量のコアポリマー（すなわち、ポリマーのヒドロキシル基に対する過剰な連結剤）を希釈溶液中の連結剤で活性化して、中間の多価反応性コアポリマーを形成することを含む。いくつかの実施形態では、工程ｉのコアポリマーは、工程ｉｉで添加されるものと同一の硫酸化ＧＡＧである。いくつかの実施形態では、工程ｉのコアポリマーは、工程ｉｉで添加されるものとは異なる硫酸化ＧＡＧである。いくつかの実施形態では、工程ｉのコアポリマーは、硫酸化ＧＡＧではない。特定の実施形態では、工程ｉのコアポリマーはカルボキシメチルセルロースである。特定の実施形態では、工程ｉのコアポリマーはヒアルロン酸である。

いくつかの実施形態では、提供されるポリマーコンジュゲートは、２段階反応で調製され、最初にコアポリマーが希釈溶液中の連結剤で官能化され、次いで沈殿又は他の手段によって単離される。連結剤で修飾された中間コアポリマーは、特性評価及び／又は精製することができる。濃縮溶液中の硫酸化ＧＡＧとの第２の反応におけるこの中間コアポリマーのその後の反応は、可溶性ボトルブラシ様ポリマー組成物を提供する。

したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、ポリマーコンジュゲートを調製する方法であって、ｉ）コアポリマーを希釈溶液中の連結剤で官能化して、中間コアポリマーを形成する工程；ｉｉ）中間コアポリマーを単離する工程；及びｉｉｉ）中間コアポリマーを濃縮溶液中の硫酸化ＧＡＧと反応させて、可溶性ボトルブラシ様ポリマーを形成する工程を含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ボトルブラシ様ポリマーコンジュゲートの分子量は、約１５，０００Ｄａ超、２０，０００Ｄａ超、３０，０００Ｄａ超、４０，０００Ｄａ超、５０，０００Ｄａ超、１００，０００Ｄａ超、２００，０００Ｄａ超、３００，０００Ｄａ超、４００，０００Ｄａ超、５００，０００Ｄａ超、１，０００，０００Ｄａ超、２，０００，０００Ｄａ超、又はこれらの数字のいずれか２つを含む範囲である。

本発明によるプロセスでは、ポリマーコンジュゲート、例えばボトルブラシ様及び／又は分岐ポリマーコンジュゲートは、リンカーの不完全な反応から生じる反応性基又は反応性部分を特徴とする。例えば、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）が連結剤として使用される場合、ポリマーコンジュゲートは未反応のビニル部分を特徴とする。ＧＡＧがＤＶＳと反応し、例えば堅いゲルを形成する性向があることを考えると、未反応のビニル基を有する水溶性ポリマーコンジュゲートの形成は驚くべきことであった。

未反応ビニル基の提示を利用することができる。プロセスは、反応性基と反応して共有結合を形成することができる修飾因子を、その後添加することを含む。修飾因子のその後の添加は、少なくとも２つの利点を有する。第１に、残りの反応基をクエンチ（反応停止）して、貯蔵中の意図しないゲル化又は使用時の共有結合反応を回避する。第２に、ポリマーコンジュゲートに望ましい生物学的活性、例えば上記のような標的化を付与することができる。

特性評価技術
上記の通り、いくつかの実施形態において、本発明のポリマーコンジュゲートは水溶液に可溶性である。そのようなコンジュゲートは、拡張した架橋ネットワークを有するゲルである公知のＧＡＧポリマーコンジュゲートとは対照的である。当業者は、ゲルである材料とゲルでない材料とを区別することができるが、誤解を避けるために、均一溶液中での重合の場合、拡張した架橋ネットワークの形成は、溶液特性の喪失によって特徴付けられることを注記する。例えば、反応混合物はもはや流れず、ゲルが大量の水に添加されると膨潤し得るが、溶解しないだろう。このようなゲルは、固体又は粘弾性材料の特性を呈する。さらに、そのようなゲルは、レオメトリーを使用して定量化することができる粘弾性特性を有する。例えば、多くの強固なゲルは、その損失弾性率（Ｇ’’）よりも大きい貯蔵弾性率（Ｇ’）を有する。

いくつかの実施形態では、提供されるポリマーコンジュゲートは、水に溶解された場合に溶液流動特性を維持するであろう。いくつかの実施形態では、提供されるポリマーコンジュゲートは、合成方法に特有の分子量分布及び分岐度を有し、バッチごとに再現可能である。いくつかの実施形態では、提供されるポリマーコンジュゲートは、提供されるポリマーコンジュゲートの製造中にゲルではなく透明な粘性流体が観察されることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、水溶液中の透明な粘性流体である。

提供されるポリマーコンジュゲートの特性評価は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）によって提供され得る。いくつかの実施形態では、粘度又は弾性率などの流動に関するパラメータは、粘度測定及びレオロジーによって決定することができる。

流体力学的半径（Ｒｈ）はＤＬＳによって決定され、分子量及び構造（タイプ／分岐度）に直接関連する。いくつかの実施形態では、出発物質のＲｈを上回るＲｈの増強又は増加が達成される。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、参照の流体力学的半径と比較して増加した流体力学的半径を有する。いくつかの実施形態では、アグリカンは、分子量及びＲｈの両方の上限をモデル化するために使用される参照であり得る。いくつかの実施形態では、出発物質（例えば、非連結硫酸化ＧＡＧ）を参照として使用することができる。

ＤＬＳは、溶液中のポリマーのサイズ（Ｒｈ）を直接決定するための便利な方法であるが、分子量を直接測定するものではない。流体力学的半径を知ることにより、分子量の推定が可能になる。ＤＹＭＡＮＩＣＳ（登録商標）ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、形状モデルを使用してＲｈからＭｗを推定する。一般的なポリマー構造、すなわち球状、コイル状、分岐状を入力した後に、この計算を行うことができる。

ポリマーコンジュゲートの精製
いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、当業者に公知の方法によって精製され得る。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、透析によって精製され得る。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、タンジェンシャルフロー濾過によって精製され得る。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、粗反応生成物から沈殿され得る。いくつかのケースでは、ポリマーコンジュゲートは反応混合物から沈殿され、回収され、水に再溶解され、再度沈殿され得る。いくつかの再溶解／沈殿サイクルを行うことができる。いくつかの実施形態では、ポリマー溶液は、精密濾過することができ、例えば、０．２ミクロンフィルターに通すことができる。

使用方法
軟部組織、例えば血管、皮膚また筋骨格組織の損傷は、極めて一般的である。軟部組織の欠陥及び、又は損傷を体内で補正するための外科的アプローチは、一般に、欠損した機能を交換又は代用しようとする生体適合性の不活性材料で作られた構造物の埋め込みを含む。非生分解性材料の埋め込みは、異物として体内に残る恒久的な構造物をもたらす。吸収可能な材料で作られた埋没物は、一時的な代替品として使用するために提案され、その目的は、治癒プロセスが吸収された材料を置き換えられるようにすることである。しかしながら、これらのアプローチは、体内の構造物の長期的な補正について限られた成功しか収めていない。

したがって、本発明は、軟部組織を本明細書中に記載されるポリマーコンジュゲートと接触させることを含む、軟部組織を治療する方法を含む。

人は年をとると、顔の脂肪の喪失及び皮膚の弾力性の低下に応答して、顔面しわ（ｒｈｙｔｉｄ）（しわ）及びヒダが発生する。皮膚は形状を失い、急性創傷治癒の時間がかかり、瘢痕化しやすくなる。医師は、顔の軟部組織の顔の量損失に対抗するために、長年にわたって様々な方法及び材料を試みてきた。科学者及び医師は、理想的な皮膚フィラーを絶えず探している。

軟部組織状態は、例えば、皮膚の状態（例えば、瘢痕の修正又は外傷性創傷、重症熱傷（ｓｅｖｅｒｅ ｂｕｍｓ）、皮膚潰瘍（例えば、褥瘡（圧迫）潰瘍、静脈性潰瘍及び糖尿病性潰瘍）、及び皮膚がんの切除に関連するものなどの外科的創傷の治療）；血管状態（例えば、末梢性動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、及び静脈疾患などの血管疾患；血管損傷；不適切な血管発生）；声帯に影響を及ぼす状態；美容的状態（例えば、修復、増強、又は美化を伴うもの）；筋疾患；腱及び靭帯などの結合組織、例えば、これらに限定されないが、歯周靭帯及び前十字靭帯の状態；臓器及び／又は筋膜（例えば、膀胱、腸、骨盤底）の状態をさらに含む。

筋骨格系の変性及び損傷した軟部組織は、激しい痛み及び運動の制限をもたらす医学的合併症を引き起こし、そのリスクを高める。例えば、脊椎の軟部組織の変性及び損傷は、世界中の数百万人もの人々の背部痛の主な原因である。靭帯及び椎間板の軟部組織変性はまた、椎間（ｚｙｇａｐｏｐｈｙｓｉｃａｌ）関節（ファセット）、肋椎関節、仙腸関節、仙椎関節及び環軸関節を含む局所脊椎関節への損傷、及びそれらに由来する背部痛のリスクを増加させる。

いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、医薬において使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、哺乳動物の軟部組織に関連する疾患、障害、又は状態の治療に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、軟部組織欠損及び／又は障害に関連する疾患、障害、又は状態を治療するのに使用するためのものであり、本発明のコンジュゲートを軟部組織部位に投与すると、全体的又は部分的に軟部組織の機能的回復がもたらされる。

いくつかの実施形態では、本発明に従って治療される軟部組織は、椎間板、皮膚、心臓弁、関節軟骨、軟骨、半月板、脂肪組織、頭蓋顔面、眼、腱、靭帯、筋膜、線維組織、滑膜、筋肉、神経、血管、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、皮膚、整形外科、泌尿器科、創傷修復及び局所化粧品に使用するためのものである。

いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、哺乳動物におけるＥＣＭの分解に関連する疾患、障害、又は状態の治療に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、ＥＣＭ欠損及び／又は障害に関連する疾患、障害、又は状態を治療するのに使用するためのものであり、本発明のコンジュゲートをＥＣＭに投与すると、全体的又は部分的にＥＣＭの機能的回復がもたらされる。

いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、軟部組織喪失の開始を遅延させる（例えば、防止する）方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、軟部組織を増強する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、美容的な増強方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、結合組織の加齢性変性又は結合組織の変性に関連する疾患に罹患している対象を治療する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、急性創傷治癒において使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、再生医療において使用するためのものである。

間質性膀胱炎（ＩＣ）又は膀胱痛症候群（ＢＰＳ）は、米国で４００万～１２００万人、主に女性が罹患する慢性疾患である。ＩＣ／ＢＰＳは、頻尿、尿意切迫感の増大、及び膀胱充満感に関連する疼痛を特徴とする。したがって、本発明のポリマーコンジュゲートは、好ましくは、膀胱痛症候群又は間質性膀胱炎に罹患している患者に見られる膀胱の尿路上皮の損傷の治療に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、好ましくは膀胱内点滴注入によって膀胱に投与される。本発明はまた、放射線誘発膀胱炎、細菌性膀胱炎、化学療法に関連する膀胱炎又はケタミンによって誘発される膀胱炎を有する患者を治療することを企図する。

病因は不明であり、特定の理論に限定されるものではないが、１つの有力な理論は、膀胱痛症状が、尿路上皮に神経を分配する内臓求心性線維の活性化をもたらす管腔膀胱表面での、緊密な不透過性バリアの喪失に起因することを提案している。膀胱不透過性を担う管腔細胞層を含む「アンブレラ細胞」が、非存在又は完全に分化していない可能性があり、表面上のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の正常な層が損なわれ、タイトジャンクションタンパク質発現が変化する。Ｐａｒｓｏｎｓは、ＩＣ患者が膀胱に注入された尿素を対照よりも有意に高く吸収を示すことを実証し、Ｈｕｒｓｔは、ＭＲＩを使用して、ＩＣ／ＢＰＳ患者の尿路上皮が正常対照よりも有意に高い透過性を有することを明確に示した。どのようにして膀胱がその不透過性を失うかは、不明である。証明は、おそらく炎症細胞によって調節される神経接続を介して内因的起こり得ること、及び尿中の物質、又は陽イオンスカベンジャーの喪失から起こり得ることを示唆している。

ＩＣ／ＢＰＳの治療選択肢は、多種多様な薬剤が試みられているにもかかわらず限られている。いくつかの成功は、ＧＡＧ補充療法による尿路上皮不透過性の回復によってもたらされた。ＧＡＧ補充は、コンドロイチン硫酸及びヒアルロナン（単独で又は一緒に）、ヘパリン又はペントサンポリ硫酸（ＥＬＭＩＲＯＮ（登録商標））の膀胱内投与を含む。残念ながら、奏効率が５０％～６０％を超えることはまれである。現在のＧＡＧ補充療法の限られた有効性は、これらの薬剤が尿路上皮の天然ＧＡＧ層を複製することができないことによって説明され得る。尿路上皮ＧＡＧ層は、プロテオグリカン（ＰＧ）、主にビグリカン及びパールカンから構成される。ＰＧは、通常、硫酸化ＧＡＧ鎖のクラスターで置換された糖タンパク質であり、それによって、これらの硫酸化ＧＡＧと他の生体分子との相互作用を増加させ、非常に高いアニオン電荷のゾーンを作り出す。結果として生じる浸透圧は、ＰＧに富む組織及び界面に対して非常に効果的な水和を保証する。ＩＣ／ＢＰＳ中のＧＡＧ補充のための現在のアプローチは、非硫酸化のヒアルロン酸などの直鎖一本鎖ＧＡＧ、又はコンドロイチン硫酸などの低ＭＷ（＜５０ｋＤａ）の硫酸化ＧＡＧのみを提供する。これらの一本鎖ＧＡＧは、天然の尿路上皮の表面上のＰＧによってもたらされるクラスター化硫酸化ＧＡＧ環境を模倣することができない。ＰＧ自体は、組織からの単離及び精製が困難な複雑な生体分子であるため、実用的な治療薬ではない。

しかしながら、本発明のプロテオグリカン模倣コンジュゲートポリマーは、単一の直鎖ＧＡＧ鎖では不可能な方法で生物学的表面に結合するための硫酸化ＧＡＧ鎖の多価アレイを表現することによってＰＧ構造を模倣する。ＩＣ／ＢＰＳにおける膀胱不透過性を回復させるためには、膀胱内皮への結合が重要であり、したがって、本発明のプロテオグリカン模倣コンジュゲートポリマーによって提示される硫酸化ＧＡＧ鎖のこの多価表示は、重要な革新を表す。好ましくは、本発明のプロテオグリカン模倣物は、例えばガレクチンのためのグリカンリガンド、例えばβ－ガラクトシドを含むリガンドでのさらなる官能化による、標的化されたＩＣ／ＢＰＳの治療を提供する。例えばβ－ガラクトシドで「修飾された」そのようなポリマーコンジュゲートは、膀胱上皮に存在するガレクチンを標的とする。したがって、本発明は、患者の間質性膀胱炎（ＩＣ）を治療する方法であって、本発明のポリマーコンジュゲート、好ましくは、少なくとも１つの硫酸化ＧＡＧポリマー鎖がガレクチン（例えば、β－ガラクトシド）に対する少なくとも１つのグリカンリガンドを含む本発明のポリマーコンジュゲートを、患者に投与する工程を含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲート又は任意の他のＧＡＧバイオポリマーを使用するＩＣ／ＢＰＳの治療は、膀胱の診断用ＭＲＩ撮像と組み合わされ、それには、Ｇｄ（ＤＴＰＡ）、Ｇｄ（ＤＯＴＡ）又は他のＧｄ系ＭＲＩ造影剤などの適切なＭＲＩ造影色素の滴下注入、及び文献［Ｔｏｗｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ａ．Ｂ．，Ｗｕ，Ｄ．Ｈ．，Ｖａｎ Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．，Ｎｏｒｔｈ，Ｊ．Ｃ．，… Ｈｕｒｓｔ，Ｒ．Ｅ．（２０１６）．Ａ Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ Ｓｔｕｄｙ ｔｏ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ Ｗｈｅｔｈｅｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ｃａｎ Ｄｅｔｅｃｔ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｙｓｔｉｔｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ，１９５（３），６３１－６３８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｕｒｏ．２０１５．０８．０７７］に記載されている病理学的膀胱透過性の観察が含まれる。本発明は、この診断用Ｇｄ系ＭＲＩ造影剤を、本発明のポリマーコンジュゲート、又は他のＧＡＧと組み合わせてＩＣ／ＢＰＳ、特に測定可能な膀胱透過性を有する患者の治療のために使用することを想定している。

いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、変性椎間板の治療において使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、椎間板の浸透ポテンシャルを増大させるために変性椎間板の核内にポリマーコンジュゲートを投与する方法において使用するためのものである。変性椎間板の核内へポリマーコンジュゲートの材料を投与すると、正常な椎間板の高さ及び機能を回復させることができる。好ましくは、本発明のポリマーコンジュゲートは、椎間板への直接注射によって投与される。そのような投与によって、欠陥のある椎間板の耐荷重特性及び粘弾性特性を全体的又は部分的に回復させることができる。

いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、膝及び他の関節の変形性関節症ＯＡに使用するためのものである。ＯＡは、変性関節疾患としても知られており、関節炎の最も一般的な形態であり、加齢に伴う軟骨の漸進的な破壊に起因する。典型的には、ＯＡは、外傷、又は関節リウマチなどの他の何らかのタイプの関節炎に起因する慢性関節傷害の後に起こる。あるいは、ＯＡは、特定の関節の過剰な使用によって生じる。ＯＡは、最も一般的には、肘、指、腰、膝、肩、手首、脊椎、及びつま先の関節に関与する。臨床的には、ＯＡは、関節痛、圧痛、運動制限、捻髪音、及び容赦ない進行性の障害を特徴とする。これは、これらの関節のうちの１つのみ、又はそれらのすべてに存在することができる。ほとんどの身体組織は損傷後に修復することができるが、軟骨の修復は、血液供給の制限、及び軟骨再増殖のための有効な機構の欠如によって妨げられると考えられている。好ましくは、本発明は、ＯＡに罹患している患者に本発明のポリマーコンジュゲートを投与する方法を提供する。好ましくは、本発明のポリマーコンジュゲートは、罹患した関節への直接注射によって患者に投与され得る。好ましくは、本発明のポリマーコンジュゲートは、限定されないが、ヒアルロン酸（ＨＡ）含有増粘剤、例えばＥＵＦＬＥＸＸＡ（登録商標）、ＨＹＡＬＧＡＮ（登録商標）、ＯＲＴＨＯＶＩＳＣ（登録商標）、ＳＵＰＡＲＴＺ（登録商標）及びＳＹＮＶＩＳＣ（登録商標）を含む追加の増粘剤と組み合わせて、罹患関節に直接注射することによって患者に投与され得る。

ポリマーコンジュゲートは、組織修復、例えば損傷組織を修復するための方法及び材料に使用することができる。任意の適切な組織を、本明細書で提供される方法に従って修復することができる。例えば、組織は、外科的修復後に組織接着が問題を呈する任意の組織であり得る。いくつかのケースでは、組織は、腱、靭帯、筋肉、子宮、又は腹部組織であり得る。例えば、組織は、回旋腱板の筋肉及び腱であり得、損傷した組織は、断裂した回旋腱板であり得る。本明細書中に記載される方法によって修復又は交換され得る腱には、例えば、棘上筋腱、棘下筋腱、アキレス腱、前脛骨筋腱、長腓骨筋腱、中腓骨筋腱、長指伸筋腱、長母指伸筋腱、長指屈筋腱又は膝蓋骨腱が含まれ得る。本明細書に記載の方法によって修復又は交換され得る靭帯は、例えば、尺骨側副靭帯、外側側副靭帯、内側側副靭帯、外側側副靭帯、前十字靭帯、後十字靭帯、前もしくは後距腓靭帯、踵腓靭帯、距踵靭帯、又は後距踵靭帯を含むことができる。例えば、ポリマーコンジュゲートを組織損傷部位に接触させることができる。例えば、ポリマーコンジュゲートを、腱又は靭帯の断裂端に接触させることができる。接触は、断裂組織の外科的修復（例えば、縫合）の前、最中、又は後に起こり得る。組織の断裂端の間の組織接着及び抗接着剤の漏出を防止するために、ポリマーコンジュゲートは、埋め込み前もしくは埋め込み後のいずれか、又はその両方に塗布される抗接着性コーティングを提供することができる。ポリマーコンジュゲートが組織に接触することにより、周囲の組織に抗接着性コーティングを塗布することができる。この方法の利点は、創傷部位への抗接着剤漏出を防止するための受動的バリアを提供し、かつ／又は創傷治癒を積極的に促進することができ、かつ／又は創傷治癒中に創傷組織が周囲の軟部組織へ接着するのを防止することができる。

組織修復又は治癒のさらなる例としては、例えば耳、鼻及び喉又は真皮に関連する粘膜などの膜の修復が挙げられる。例えば、本発明は、酸逆流、粘膜炎、歯周炎、副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、連鎖球菌咽頭炎、ヘルペス、耳炎、アトピー性皮膚炎、酒さ、乾癬、湿疹、座瘡、顔面紅斑、膿痂疹、熱傷、体部白癬、カンジダ症、帯状疱疹などを治療することを含む。本発明はまた、眼科的送達を含む。眼疾患には、眼感染症、眼瞼炎、ドライアイ、封入体結膜炎、緑内障、炎症性眼症状などが含まれる。

本発明のポリマーコンジュゲートは、哺乳動物における椎間板疾患又は状態を治療する任意の公知の、又は今まで未知であった方法と組み合わせて使用することができる。好ましくは、対象はヒトである。

投与
いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、１つ以上の賦形剤、緩衝剤、担体、安定剤、保存剤及び／又は増量剤と共に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、完全に生体適合性である（すなわち、非毒性）賦形剤を使用して製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、賦形剤を使用して製剤化され得、塩（例えば、リン酸ナトリウム塩）によって生理学的ｐＨで緩衝される。

本発明のポリマーコンジュゲートは対象の軟部組織部位に、その機能性回復のために、様々な方法を使用して、当技術分野で公知の様々な製剤で投与され得る。投与方法は、治療される状態及び医薬組成物に応じて選択される。本発明のポリマーコンジュゲートの投与は、限定されないが、皮膚、皮下、静脈内、経口、局所、経皮、腹腔内、筋肉内、及び膀胱内を含む様々な方法で行うことができる。例えば、微粒子、ミクロスフェア及びマイクロカプセル製剤は、経口投与、筋肉内投与又は皮下投与に有用である。リポソーム及びナノ粒子はさらに、静脈内投与に適している。本発明のポリマーコンジュゲートの投与は、単一の経路、又は同時にいくつかの経路によって行われてもよい。例えば、経口投与は、静脈内又は非経口注射と同時に行うことができる。

好ましくは、対象組成物は、膀胱内点滴注入によって投与される。この手順は、一般に、カテーテルを尿路に挿入し、膀胱に対象組成物を含有する適切な希釈剤を充填することを含む。充填は、手動注入又は腎ポンプによって行うことができる。電動薬物投与は、膀胱内薬物送達をさらに補助することができる（例えば、参照により組み込まれているＲｉｅｄｌ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｕｒｏｌ．１２：２６９－７２（１９９８）を参照されたい）。

好ましくは、本発明のコンジュゲートを、小ゲージ針又は微細針又は微細針アレイを使用して真皮に直接注射することによって投与する。分岐バイオポリマーとしての本発明のポリマーコンジュゲートは、小ゲージ針による注入を容易にする溶液中にある場合、低粘度であるという利点を有する。

いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、投与後に目に見えて分解しないことが好ましい。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、急速に又はゆっくりと、組織中で分解することが好ましい。したがって、体内に投与された場合、ポリマーコンジュゲートは、持続性であってもよく、酵素的に分解されてもよく、又は溶媒、例えば水の存在下で分解されてもよい。

本発明の方法は、動物実験の結果を考慮して決定され得る、ＩＣ症状を治療するための化合物及び医薬組成物の最適用量の決定を含む。より具体的な用量は、投与方法、対象の状態、例えば年齢、体重、性別、感受性、食事、投与間隔、組み合わせて投与される医薬、ならびにＩＣの重症度及び程度などに応じて明らかに異なる。所与の条件下での最適な用量及び投与頻度は、これらのガイドラインに基づいて医療専門家の適切な用量試験によって決定されなければならず、当業者にとって不当な実験を構成するものではない。

本発明のポリマーコンジュゲートはまた、持続放出又は長期送達方法を使用して投与され得、それらは当業者に周知である。本明細書で使用される「持続放出」又は「長期放出」とは、送達システムが１日超、好ましくは１週間超、最も好ましくは少なくとも約３０日間～６０日間又はそれ以上にわたって薬学的治療量のポリマーコンジュゲートを出すことを意味する。長期放出システムは、生分解性ポリマーなど、ポリマーコンジュゲートを含有する埋め込み可能な固体又はゲルを含み得る。

本発明のポリマーコンジュゲートは、１つ以上の他の薬物（又はそれらの任意の組み合わせとして）と組み合わせて投与され得る。本発明のポリマーコンジュゲートは、ＩＣに関連する下部尿路症状（ＬＵＴＳ）及び／又は有痛性膀胱痛症候群及び／又は膀胱痛症候群を治療するために、別の薬理学的に活性な化合物と、又は２つ以上の他の薬理学的に活性な化合物と有用に組み合わせることができる。例えば、本発明のポリマーコンジュゲートは、以下から選択される１つ以上の薬剤と組み合わせて、同時に、連続的に、又は別々に投与され得る：
オピオイド鎮痛薬、例えばモルヒネ、ヘロイン、ヒドロモルホン、オキシモルホン、レボルファノール、レバロルファン、メタドン、メペリジン、フェンタニル、コカイン、コデイン、ジヒドロコデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、プロポキシフェン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、ナルブフィン又はペンタゾシン；
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、アスピリン、ジクロフェナク、ジフルシナール、エトドラク、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルフェニサル、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、ニメスリド、ニトロフルルビプロフェン、オルサラジン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スルファサラジン、スリンダク、トルメチン又はゾミラック；
バルビツレート鎮静薬、例えば、アモバルビタール、アプロバルビタール、ブタバルビタール、ブタビタール、メホバルビタール、メタビタール、メトヘキシタール、ペントバルビタール、フェノバルビタール、セコバルビタール、タルブタール、テアミラール又はチオペンタール；
鎮静作用を有するベンゾジアゼピン、例えば、クロルジアゼポキシド、クロラゼペート、ジアゼパム、フルラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパム又はトリアゾラム；
鎮静作用を有するＨ_１アンタゴニスト、例えば、ジフェンヒドラミン、ピリラミン、プロメタジン、クロルフェニラミン又はクロルシクリジン；
鎮静薬、例えばグルテチミド、メプロバメート、メタカロン又はジクロルフェナゾン；
骨格筋弛緩薬、例えば、バクロフェン、カリソプロドール、クロルゾキサゾン、シクロベンザプリン、メトカルバモール又はオルプレナジン；
ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、例えばデキストロメトルファン（（＋）－３－ヒドロキシ－Ｎ－メチルモルフィナン）又はその代謝産物デキストロルファン（（＋）－３－ヒドロキシ－Ｎ－メチルモルフィナン）、ケタミン、メマンチン、ピロロキノリンキニン、シス－４－（ホスホノメチル）－２－ピペリジンカルボン酸、ブジピン、ＥＮ－３２３１（モルヒネとデキストロメトルファンの組み合わせ製剤であるＭｏｒｐｈｉＤｅｘ（登録商標））、トピラマート、ネラメキサン、又はＮＲ２Ｂアンタゴニストを含むペルジンフォテル、例えばイフェンプロジル、トラキソプロジル又は（－）－（Ｒ）－６－｛２－［４－（３－フルオロフェニル）－４－ヒドロキシ－１－ピペリジニル］－１－ヒドロキシエチル－３、４－ジヒドロ－２（１Ｈ）－キノリノン；
α－アドレナリン作動性、例えば、ドキサゾシン、タムスロシン、クロニジン、グアンファシン、デクスメデトミジン、モダフィニル、テラゾシン、インドラミン、アルフゾシン、シロドシン又は４－アミノ－６，７－ジメトキシ－２－（５－メタンスルホンアミド－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノル－２－イル）－５－（２－ピリジル）キナゾリン；プラゾシン；
三環系抗うつ薬、例えばデシプラミン、イミプラミン、アミトリプチリン又はノルトリプチリン；
抗痙攣薬、例えばカルバマゼピン、ラモトリギン、トピラマート又はバルプロアート；
タキキニン（ＮＫ）アンタゴニスト、特にＮＫ－３、ＮＫ－２又はＮＫ－１アンタゴニスト、例えば（αＲ，９Ｒ）－７－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）ベンジル］－８，９，１０，１１テトラヒドロ－９－メチル－５－（４－メチルフェニル）－７Ｈ－［１，４］ジアゾシノ［２，１－ｇ］［１，７］－ナフチリジン－６－１３－ジオン（ＴＡＫ－６３７）、５－［（２Ｒ，３Ｓ）－２－［（１Ｒ）－１－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エトキシ－３－（４－フルオロフェニル）－４－モルホリニル］－メチル］－１，２－ジヒドロ－３Ｈ－１，２，４トリアゾール－３－オン（ＭＫ－８６９）、アプレピタント、ランピタント、ダピタント又は３－［［２－メトキシ－５－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－メチルアミノ］－２－フェニルピペリジン（２Ｓ，３Ｓ）；
ムスカリンアンタゴニスト、例えば、オキシブチニン、トルテロジン、フェソテロジン、５－ヒドロキシメチルトルテロジン、プロピベリン、塩化トロスピウム、ダリフェナシン、ソリフェナシン、テミベリン及びイプラトロピウム；
ＣＯＸ－２選択的阻害剤、例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、パレコキシブ、バルデコキシブ、デラコキシブ、エトリコキシブ又はルミラコキシブ；
コールタール鎮痛薬、特にアセトアミノフェン／パラセタモール；
神経弛緩薬、例えばドロペリドール、クロルプロマジン、ハロペリドール、ペルフェナジン、チオリダジン、メソリダジン、トリフルオロペラジン、フルフェナジン、クロザピン、オランザピン、リスペリドン、ジプラシドン、ケチアピン、セルチンドール、アリピプラゾール、ソネピプラゾール、ブロナンセリン、イロペリドン、ペロスピロン、ラクロプリド、ゾテピン、ビフェプルノックス、アセナピン、ルラシドン、アミスルプリド、バラペリドン（ｂａｌａｐｅｒｉｄｏｎｅ）、パリンドーレ（ｐａｌｉｎｄｏｒｅ）、エプリバンセリン、オサネタント、リモナバント、メクリネルタント、ＭＩＲＡＸＩＯＮ（登録商標）又はサリゾタン；
バニロイド受容体アゴニスト（例えば、レシニフェラトキシン）又はアンタゴニスト（例えば、カプサゼピン）；
β－アドレナリン作動性、例えばプロプラノロール；
局所麻酔薬、例えばメキシレチン；
コルチコステロイド、例えばデキサメタゾン；
５－ＨＴ受容体アゴニスト又はアンタゴニスト（例えば、ピゾチフェン）、特に５－ＨＴ_{１Ｂ／１Ｄ}アゴニスト、例えばエレトリプタン、スマトリプタン、ナラトリプタン、ゾルミトリプタン又はリザトリプタン；
５－ＨＴ_２Ａ受容体アンタゴニスト、例えばＲ（＋）－α－（２，３－ジメトキシフェニル）－１－［２－（４－フルオロフェニルエチル）］－４－ピペリジンメタノール（ＭＤＬ－１００９０７）；
コリン作動性（ニコチン性）鎮痛薬、例えばイソプロニクリン（ＴＣ－１７３４）、（Ｅ）－Ｎ－メチル－４－（３－ピリジニル）－３－ブテン－１－アミン（ＲＪＲ－２４０３）、（Ｒ）－５－（２－アゼチジニルメトキシ）－２－クロロピリジン（ＡＢＴ－５９４）又はニコチン；
ＴＲＡＭＡＤＯＬ（商標）；
ＰＤＥ－５阻害剤、例えば５－［２－エトキシ－５－（４－メチル－１－ピペラジニル－スルホニル）フェニル］－１－メチル－３－ｎ－プロピル－１，６－ジヒドロ－７Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｄ］ピリミジン－７－オン（シルデナフィル）、（６Ｒ，１２ａＲ）－２，３，６，７，１２，１２ａ－ヘキサヒドロ－２－メチル－６－（３，４－メチレンジオキシフェニル）－ピラジノ［２’１’，１：６，１］－ピリド［３，４－ｂ］インドール－１，４－ジオン（ＩＣ－３５１又はタダラフィル）、２－［２－エトキシ－５－（４－エチル－ピペラジン－１－イル－１－スルホニル）－フェニル］－５－メチル－７－プロピル－３Ｈ－イミダゾ［５，１－ｆ］［１，２，４］トリアジン－４－オン（バルデナフィル）、５－（５－アセチル－２－ブトキシ－３－ピリジニル）－３－エチル－２－（１－エチル－３－アゼチジニル）－２，６－ジヒドロ－７Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｄ］ピリミジン－７－オン、５－（５－アセチル－２－プロポキシ－３－ピリジニル）－３－エチル－２－（１－イソプロピル－３－アゼチジニル－２，６－ジヒドロ－７Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｄ］ピリミジン－７－オン、５－［２－エトキシ－５－（４－エチルピペラジン－１－イルスルホニル）ピリジン－３－イル］－３－エチル－２－［２－メトキシエチル］－２，６－ジヒドロ－７Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｄ］ピリミジン－７－オン、４－［（３－クロロ－４－メトキシベンジル）アミノ］－２－［（２Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）ピロリジン－１－イル］－Ｎ－（ピリミジン－２－イルメチル）ピリミジン－５－カルボキサミド、３－（１－メチル－７－オキソ－３－プロピル－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）－Ｎ－［２－（１－メチルピロリジン－２－イル］エチル］－４－プロポキシベンゼンスルホンアミド；
α－２－δリガンド、例えば、ガバペンチン、プレガバリン、３－メチルガバペンチン、（１α、３α、５α）（３－アミノ－メチル－ビシクロ［３．２．０］ヘプタ－３－イル）－酢酸、（３Ｓ，５Ｒ）－３－アミノメチル－５－メチル－ヘプタン酸、（３Ｓ，５Ｒ）－３－アミノ－５－メチル－ヘプタン酸、（３Ｓ，５Ｒ）－３－アミノ－５－メチル－オクタン酸、（２Ｓ，４Ｓ）－４－（３－クロロフェノキシ）プロリン、（２Ｓ，４Ｓ）－４－（３－フルオロベンジル）－プロリン、［（１Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）－６－（アミノメチル）ビシクロ［３．２．０］ヘプタ－６－イル］酢酸、３－（１－アミノメチル－シクロヘキシルメチル）－４Ｈ－［１，２，４］オキサジアゾール－５－オン、Ｃ－［１－（１Ｈ－テトラゾール－５－イルメチル）－シクロヘプチル］－メチルアミン、（３Ｓ，４Ｓ）－（１－アミノメチル－３，４－ジメチル－シクロペンチル）－酢酸、（３Ｓ，５Ｒ）－３－アミノ－５－メチル－ノナン酸、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－アミノ－４，５－ジメチル－ヘプタン酸及び（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－アミノ－４，５－ジメチル－オクタン酸；（３Ｓ，５Ｒ）－３－アミノメチル－５－メチルオクタン酸；
カンナビノイド；
代謝型グルタミン酸サブタイプ１受容体（ｍＧｌｕＲ１）アンタゴニスト；
セロトニン再取り込み阻害剤、例えばセルトラリン、セルトラリン代謝産物デスメチルセルトラリン、フルオキセチン、ノルフルオキセチン（フルオキセチンデスメチル代謝産物）、フルボキサミン、パロキセチン、シタロプラム、シタロプラム代謝産物デスメチルシタロプラム、エスシタロプラム、ｄ，ｌ－フェンフルラミン、フェムトキセチン、イホキセチン、シアノドチエピン、リトキセチン、ダポキセチン、ネファゾドン、セリクラミン及びトラゾドン；
ノルアドレナリン（ノルエピネフリン）再取り込み阻害薬、例えばマプロチリン、ロフェプラミン、ミルタゼピン、オキサプロチリン、フェゾラミン、トモキセチン、ミアンセリン、ブプロピオン、ブプロピオン代謝産物ヒドロキシブプロピオン、ノミフェンシン及びビルオキサジン（ＶＩＶＡＬＡＮ（登録商標））、特に選択的ノルアドレナリン再取り込み阻害薬、例えばレボキセチン、特に（Ｓ，Ｓ）－レボキセチン：二重セロトニン－ノルアドレナリン再取り込み阻害剤、例えばベンラファキシン、ベンラファキシン代謝産物Ｏ－デスメチルベンラファキシン、クロミプラミン、クロミプラミン代謝産物デスメチルクロミプラミン、デュロキセチン、ミルナシプラン及びイミプラミン；
誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）阻害剤、例えばＳ－［２－［（１－イミノエチル）アミノ］エチル］－Ｌ－ホモシステイン、Ｓ－［２－［（１－イミノエチル）アミノ］エチル］－４、４－ジオキソ－Ｌ－システイン、Ｓ－［２－［（１－イミノエチル）アミノ］エチル］－２－メチル－Ｌ－システイン、（２Ｓ，５Ｚ）－２－アミノ－２－メチル－７－［（１－イミノエチル）アミノ］－５－ヘプテン酸、２－［［（１Ｒ，３Ｓ）－３－アミノ－４－ヒドロキシ－１－（５－チアゾリル）－ブチル］チオ］－５－クロロ－３－ピリジンカルボニトリル；２－［［（１Ｒ，３Ｓ）－３－アミノ－４－ヒドロキシ－１－（５－チアゾリル）ブチル］チオ］－４－クロロベンゾニトリル、（２Ｓ，４Ｒ）－２－アミノ－４－［［２－クロロ－５－（トリフルオロメチル）フェニル］チオ］－５－チアゾールブタノール、２－［［（１Ｒ，３Ｓ）－３－アミノ－４－ヒドロキシ－１－（５－チアゾリル）ブチル］チオ］－６－（トリフルオロメチル）－３－ピリジンカルボニトリル、２－［［（１Ｒ，３Ｓ）－３－アミノ－４－ヒドロキシ－１－（５－チアゾリル）ブチル］チオ］－５－クロロベンゾニトリル、Ｎ－［４－［２－（３－クロロベンジルアミノ）エチル］フェニル］チオフェン－２－カルボキサミジン又はグアニドエチルジスルフィド；
ドネペジルなどのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤；
プロスタグランジンＥ_２サブタイプ４（ＥＰ４）アンタゴニスト、例えばＮ－［（｛２－［４－（２－エチル－４，６－ジメチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）フェニル］エチル｝アミノ）－カルボニル］－４－メチルベンゼンスルホンアミド、又は４－［（１Ｓ）－１－（｛［５－クロロ－２－（３－フルオロフェノキシ）ピリジン－３－イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸等；
ロイコトリエンＢ４アンタゴニスト、例えば、１－（３－ビフェニル－４－イルメチル－４－ヒドロキシ－クロマン－７－イル）－シクロペンタンカルボン酸（ＣＰ－１０５６９６）、５－［２－（２－カルボキシエチル）－３－［６－（４－メトキシフェニル）－５Ｅ－ヘキセニル］オキシフェノキシ］－吉草酸（ＯＮＯ－４０５７）又はＤＰＣ－１１８７０；
５－リポキシゲナーゼ阻害剤、例えばジロートン、６－［（３－フルオロ－５－［４－メトキシ－３，４，５，６－テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）フェノキシ－メチル］－１－メチル－２－キノロン（ＺＤ－２１３８）、又は２，３，５－トリメチル－６－（３－ピリジルメチル）、１，４－ベンゾキノン（ＣＶ－６５０４）；
ナトリウムチャネル遮断薬、例えば、リドカイン又はブピビカイン
オンダンセトロンなどの５－ＨＴ３アンタゴニスト；
グリコサミノグリカン層置換剤及び抗炎症剤、例えばペントサンポリサルフェート（ＥＬＭＩＲＯＮ（商標））；
β－３アゴニスト、例えばＹＭ－１７８（ミラベグロン又は２－アミノ－Ｎ－［４－［２－［［（２Ｒ）－２－ヒドロキシ－２－フェニルエチル］アミノ］エチル］フェニル］－４－チアゾリジンアセトアミド）、ソラベグロン、ＫＵＣ－７４８３（リトベグロン又は２－［４－［２－［［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシ－２－（４－ヒドロキシフェニル）－１－メチルエチル］アミノ］エチル］－２，５－ジメチルフェノキシ］－酢酸）又はＡＫ－１３４；
ヒドロキシジンなどの抗ヒスタミン剤；
Ｈ_２アンタゴニスト、例えばシメチジン；又はラニチジン
硝酸銀；
ステロイド；
ドキソルビシン；
コンドロイチン硫酸；
クロモグリク酸二ナトリウム；
オキシクロロセン（Ｃｌｏｒｐａｃｔｉｎの商標）；及び
シクロスポリンなどの免疫抑制剤。

以下の例は、本発明の特定の実施形態を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。

材料及び方法
コンドロイチン硫酸、ＥＰ注射用グレードをＢｉｏｉｂｅｒｉｃａから入手した（供給元からのＧＰＣデータ：Ｍｎ＝１１，４００、Ｍｗ＝１３，７００Ｄａ、ＰＤＩ＝１．２１）。コンドロイチン硫酸Ａ二ナトリウムの構造反復単位の当量重量は、５０３．３５ｇ／当量である。（Ｃ_１４Ｈ_１９Ｏ_１４ＳＮａ_２）、ヒドロキシル当量は、５０３．３５／３＝１６７．７８ｇ／ＯＨ当量である。ジビニルスルホン９９％は、ＡＣＲＯＳ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。カルボキシメチルセルロース（ＭＷ＝２５０ｋＤａ、９０ｋＤａ、置換度＝０．８０、２２６．１６ｇ／当量、１１３．０８ｇ／ＯＨ当量）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

ＤＬＳのプロトコル
動的光散乱分析を、ＷｙａｔｔのＣｙｃｌｉｃ Ｏｌｅｆｉｎ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ使い捨てマイクロキュベットを使用してＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ装置（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で行った。データを２５℃で１０秒の取得時間で収集し、流体力学的半径を２０回の取得にわたって平均した。ＤＹＮＡＭＩＣＳソフトウェアバージョン７．５（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してデータをフィッティングして、流体力学的半径を得、モル質量を推定した。

例１：塩化ナトリウムの存在下で反応物を段階的添加することによる、ボトルブラシ様構造を有する可溶性高ＭＷのコンドロイチン硫酸組成物の１ポット合成（段階１及び２で）。最適化されたタンジェンシャルフロー濾過プロトコルを用いた生成物の精製。
１Ａ段階的添加による反応
コンドロイチン硫酸ナトリウム（０．３０６ｇ、１．８２３ｍｍｏｌ当量のヒドロキシル基）及び塩化ナトリウム（８５．２ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの反応容器中のＤＩ水９．７４６ｇに溶解した。無色透明の溶液が得られた。ＤＶＳ（０．２５４ｇ、２１６ｕＬ、２．１５ｍｍｏｌ）をマイクロリットルピペットにより容量測定的に加えた。穏やかに混合した後、溶液は透明で無色であった。マイクロリットルピペットを使用して１．０３ｍＬの１．０Ｎ ＮａＯＨを添加することによって反応を開始させた。ＮａＯＨを添加すると、溶液はすぐに淡黄色になり、透明のままであった。反応はコンドロイチン硫酸が３．０４ｗｔ％であり、ＮａＯＨが０．１Ｍである（ｐＨ １３）。反応物をロティサリーで穏やかに混合した。１５分後、さらなるコンドロイチン硫酸ナトリウム（０．９０９ｇ、５．４２ｍｍｏｌ当量のヒドロキシル基）を加え、反応混合物をロティサリーで撹拌した。反応溶液はより粘性になったが、透明で流動性のままであった。ＮａＯＨによる開始の２時間後、マイクロリットルピペットを用いて１．０３ｍＬの１．０Ｎ ＨＣｌを添加することによって反応を停止させた。透明な流体反応混合物を５０ｇのＰＢＳを含有するバイアルに添加し、ＰＢＳを添加して総重量を８０ｇにした。希釈した反応混合物を、０．４５ｕｍのＰＶＤＦシリンジフィルターを通して簡単に濾過した。

１Ｂ．タンジェンシャルフロー濾過を用いた精製
Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂ ＫＲ２ｉ ＴＦＦシステムを、２５０ｍｌの供給物リザーバー、及び改質ポリエーテルスルホンフィルター繊維（直径１ｍｍ、１００ｋＤａのＭＷＣＯ、全表面積７５ｃｍ^２、部品番号Ｄ０２－Ｅ１００－１０－Ｎ）を含む２０ｃｍ中空繊維フィルターモジュールと共に使用した。例１１Ａの希釈生成物の８０ｇ全量を供給物リザーバーに充填した。タンジェンシャルフロー濾過を２００ｍｌ／分の流速で開始し、流速を３００ｍｌ／分に増加させ、入口圧力を２５ｐｓｉｇ未満に維持した。透過するために失われた溶液の量を追加のＰＢＳで連続的に補う透析モードでＴＦＦを実行した。このようにして、保持液の量は、５ボリューム（４００ｍｌ）の透過液が生成されたので、濾過手順中に一定のままであった。次いで、供給物リザーバーに（ＰＢＳの代わりに）ＤＩ水を補充し、さらに５ボリュームの透過液（４００ｍｌ）が得られるまで濾過を続けることによって、ＴＦＦを脱塩モードで継続した。次いで、ＤＩ水の補充を中断し、濾過を濃縮モードで実行して、保持液量を約５０ｍＬまで減少させた。次いで、ＴＦＦを停止させ、システムをフラッシングして（１０ｍｌのＤＩ水）、ホールドアップボリュームを回収した。次いで、精製された保持液を７２時間の凍結乾燥によって乾燥させ、精製された生成物（０．５３８ｇ、出発コンドロイチン硫酸重量に対して４５％の収率）を白色の毛羽立った固体として得た。

この例は、０．１５Ｍ塩化ナトリウムの存在下での段階的添加反応プロトコルにより、０．４５ｕｍの膜を通して濾過可能であり、１００ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを用いたタンジェンシャルフロー濾過によって精製された可溶性ポリマーが提供されることを実証している。ＴＦＦ精製後、可溶性ポリマーが良好な収率で得られた。それは、出発物質よりも有意に高い分子量及び分岐した立体配座を有すると予想される。

例２：段階１及び段階２のコンドロイチン硫酸比を変化させて、得られるボトルブラシ様構造を有する高ＭＷのコンドロイチン硫酸組成物のサイズを制御する。
例１の手順を一般化し、繰り返し、その結果、いくつかの反応では全体的なコンドロイチン硫酸及びＤＶＳ量は一定に保たれたが、段階１と段階２との間のコンドロイチン硫酸の配分が変化した。すべての反応を１２０分間実行し、次いでＨＣｌで反応停止させ、希釈し、０．４５ミクロンｍＰＥＳシリンジフィルターを通して濾過した後、例１に記載したとおり正確に１００ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターを用いてＴＦＦによって精製した。次いで、凍結乾燥後に乾燥生成物を得た。

これらの反応の生成物を、Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒを用いて行った静的及び動的光散乱測定を用いて特性評価した。これらの高度に分岐した材料のＮａｎｏＳｔａｒの静的光散乱機能を使用したＭＷ決定は、それらの珍しい樹状構造のため定性的である。しかしながら、ＭＷの結果ならびに半径の決定は、同一の実験条件及び装置設定を使用して得られ、それによってポリマーサイズの相対的な順位付けを行うことができる。これらの材料の正確なＭＷ測定値は、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳなどのより厳密な方法によって得られなければならない。

この実験の結果を以下の表に示す。データは、コンドロイチン硫酸及びＤＶＳの総量が一定に保持された場合、得られたポリマーコンジュゲートの分子量が、段階１と段階２との間のコンドロイチン硫酸の相対的な分配によって強く影響されたことを示す。段階１での反応に投入されるコンドロイチン硫酸の割合が増加すると、より高い分子量のポリマーが得られた。この観察は、ビニルスルホン官能性分岐コンドロイチン硫酸組成物を生成する第１段階で有意な量の分子量増大が起こる機構と一致している。段階１での拡張ネットワーク（ゲル）形成が回避されるのは、反応のこの段階におけるＣＳの全体的な濃度が比較的低いままであるからである。段階２で添加されるさらなるＣＳは、成長する分岐コンドロイチン硫酸組成物上の反応性基を反応停止し、さらなる分子量を構築するのに役立つ。段階２での拡張ネットワーク（ゲル）形成は、反応性ビニルスルホン基の大部分が成長中の分岐ポリマー上の新たなペンダントであり、反応のこの段階における遊離ＤＶＳの濃度が比較的低いと予想されるため回避される。

例３：ボトルブラシ様構造を有する可溶性の高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物のＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる特性評価
ＳＥＣ特性評価は、独立したＩＳＯ １７０２５認定の分析研究所を使用して検証した。ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳの実験条件を以下にまとめる。

この評価のために、例１に記載されている一般的な２段階手順を使用して材料を調製したが、いくつかの重要な反応パラメータを、分子量に対するこれらのパラメータの影響を観察するために変更した。示されている結果は、２つの再現可能なクロマトグラムの平均である。光散乱を用いた分子量測定の重要なパラメータは比屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）であり、これは溶質濃度を変化させたときに起こる溶液の屈折率の変化として定義される。このプロジェクトで使用されたｄｎ／ｄｃ値は０．１４２７ｍＬ／ｇであり、文献［Ｌｉ，Ｌ．；Ｌｉ，Ｙ．；Ｆｅｎｇ，Ｄ．；ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅｓ，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａ Ｈｉｇｈ Ａｎｔｉ－Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｓ２０１６，１７（１０），１６８５］に見られるとおりである。以下の表は、この結果を要約する。コンドロイチン硫酸ナトリウム出発物質の分析を比較のために含めた。

結果は、段階的添加手順で作製された本発明の例の重量平均分子量（Ｍｗ）が、それらが作製されたコンドロイチン硫酸よりも何倍も大きいモル質量を有することを示す。これらの材料はいくらか多分散性であるが、屈折率及び光散乱クロマトグラムは妥当なピーク形状を示した。

例４：ボトルブラシ様構造を有する可溶性の高ＭＷのコンドロイチン硫酸組成物の１Ｈ－ＮＭＲによる特性評価：ペンダントビニルスルホン基の定量化
上記の手順を使用して生成された分岐コンドロイチン硫酸組成物を、１Ｈ－ＮＭＲを使用して特性評価した。それぞれの場合において、分岐高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物をＤ２Ｏ（１５ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、標準的な５ｍｍホウケイ酸ＮＭＲチューブに入れた。プロトンＮＭＲスペクトルは、自動チューニング及びマッチングを使用する５ｍｍの広帯域プローブ、ならびにデータ取得及び処理用のＤｅｌｔａ ５．３ソフトウェア、ならびに処理用のＭＮｏｖａソフトウェアを備えたＪＥＯＬ ＥＣＺ ４００核磁気共鳴分光計で収集した。

ＣＳの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、ウシ気管由来コンドロイチン硫酸についての公開されているスペクトルと完全に一致することが見出された［Ｍｕｃｃｉ，Ａ．，Ｓｃｈｅｎｅｔｔｉ，Ｌ．，＆Ｖｏｌｐｉ，Ｎ．（２０００），１Ｈ ａｎｄ １３Ｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｏｒｉｇｉｎ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，４１（１），３７－４５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０１４４－８６１７（９９）０００７５－２］。１．５～５．０ｐｐｍ領域において、ＣＳ及び分岐高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、分岐高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物のスペクトルに存在する３．６及び４．１ｐｐｍにおける２つの新たな強いピークを除いて、非常に類似している。これらの新しい共鳴は、架橋リンカー基からの、分岐高ＭＷ組成物中に存在するジエチルスルホニル基のメチレンプロトンに由来すると予想される。この化学構造は反応スキームＢで説明されていることを注記する。４．１におけるメチレンシグナルは、スルホン基に結合したメチレンに起因し、３．６０におけるメチレンは、連結反応において形成されたエーテル基に結合したメチレンに起因する。

本発明者らは、分岐高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物に組み込まれたＤＶＳの相対量が増加すると、１Ｈ－ＮＭＲスペクトルが４．１及び３．６におけるジエチルスルホニルピークの強度の比例的増加を示すことを見出した。残りのＣＳピークは変化しなかった。

予想外にも、本発明者らはまた、４．１及び３．６におけるジエチルスルホニルピークに加えて、場合によっては、分岐高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルもスペクトルのビニル領域において共鳴を示し、分岐高ＭＷポリマー生成物にペンダント様式で結合した残留ビニルスルホン基の存在を示していることを発見した。これらのペンダント反応性ビニルスルホン基は、６．４、６．５及び６．９ｐｐｍで３つの明確に定義された多重シグナルとして観察された。なお、ペンダントビニルスルホン基の化学構造は、反応スキームＡに示されている。

次いで、本発明者らは、ビニルスルホンピークの強度が反応条件によって影響されることを実証した。一連の反応を、上記の標準的な手順を用いて行った。しかしながら、この実験では、異なる時間に反応をＨＣｌで反応停止させた。標準的なワークアップ、ＴＦＦ精製及び凍結乾燥の後、分岐高ＭＷバイオポリマー生成物を１Ｈ－ＮＭＲによって分析した。得られた一連のスペクトルにおいて、ビニルスルホン官能基の相対含有量を、２．０～２．１ｐｐｍにおけるアセトアミドシグナルの積分面積（３水素原子を表す）を３つのビニルシグナルの総積分面積（３水素原子も表す）と比較することによって決定した。各コンドロイチン硫酸二糖反復単位は単一のアセトアミド基を含有するので、これらのシグナルの積分面積の比は、分岐高ＭＷバイオポリマー上のペンダントビニルスルホン含有量の程度を提供する。例えば、アセトアミド共鳴及びビニル共鳴の強度が同じである場合（１００：１００）、分岐高ＭＷバイオポリマー生成物中のすべてのＣＳ二糖反復単位もまた、１つのペンダントビニルスルホン基を含有する。この一連の実験で使用した反応条件、及び１Ｈ－ＮＭＲによって決定したペンダントビニルスルホンのアセトアミド積分ピーク面積に対する比を以下に示す。

このプロセスからの分岐高ＭＷバイオポリマー生成物上の残留ビニルスルホン基の存在は、先験的に予想されなかった。最初に、すべての反応性ビニルスルホンが、意図されるようにコンドロイチン硫酸上のヒドロキシル基によって、又は高アルカリ（ｐＨ＝１３）反応混合物中に存在する水酸化物イオンによって消費されることが予想された。実際、データは、反応条件の所与のセットの場合、反応時間が増加するにつれてビニルスルホンシグナルの相対強度が減少することを示している。反応時間が延びると、これらのペンダントビニル基は、段階２の添加からの利用可能なコンドロイチン硫酸によって消費されて生成物のＭＷを増加させるか、又は水酸化物イオンによって消費されてペンダントヒドロキシエチルスルホニル部分を生成する。そのようなペンダントヒドロキシエチルスルホン基は、架橋剤としてＤＶＳを使用するバイオポリマーヒドロゲルの調製では非反応性副産物として報告されている［Ｃｈａｎｇ，Ｇ．，Ｂｏｎｅｙ，Ｊ．，Ｋｏｎｏｗｉｃｚ，Ｐ．，Ｓｋｒａｂｕｔ，Ｅ．，Ｙｕ，Ｌ．Ｐ．，Ｃｏｕｒｙ，Ａ．，＆Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｐ．（２００７，Ａｐｒｉｌ）．Ａｓｓａｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｃｅｎｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｉｎｙｌ ｓｕｌｆｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｐｏｓｔｅｒ．バイオマテリアル学会２００７年年次総会（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）において］。反応性ビニルスルホン基を有する分岐高ＭＷバイオポリマーを制御可能に提供する本発明の方法の能力は、予想外であった。本発明のプロセスの条件に応じて、得られた分岐高ＭＷバイオポリマー上の反応性ビニル部分の相対量を制御して、反応性バイオポリマー材料を意図的に提供するか、又は反応性官能基を実質的に含まないバイオポリマー組成物を提供することができる。本発明者らはまた、ペンダント反応性ビニル－スルホン基を有する分岐高ＭＷ ＧＡＧバイオポリマーが非常に有用であることを提案する。このようなバイオポリマーは、反応性求核基を含有する表面又は生体表面を効果的に修飾することができる。例えば、哺乳動物組織表面は、典型的には、リジン及びシステインリッチタンパク質由来のアミン基及びスルフィド基の両方を有する様々なタンパク質性材料で構成される。組織及び細胞表面上のそのような反応性基は、ビニルスルホンを含む反応性の求電子剤と共に求核試薬として適切に作用することが周知である。ビニルスルホン官能性分岐高ＭＷバイオポリマーは、医療デバイス及び治療材料として有用な治療可能性を提供するために、組織及び細胞表面の持続的な表面修飾が可能な高活性表面修飾バイオポリマーのクラスを含む。分岐高ＭＷ ＧＡＧバイオポリマーは、比類なく革新的である。これらの材料はまた、適切に官能化された表面、又は組織表面などの生体表面上に分岐硫酸化ＧＡＧバイオポリマー材料の共有結合コーティングを生成する能力から、有用性を有する。

例５：ボトルブラシ様構造を有する両親媒性ｎ－ヘキシル官能化高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の３段階１ポットプロセスでの調製。
本発明者らはさらに、分岐高ＭＷ ＧＡＧバイオポリマー上の残留ビニル－スルホン基ペンダントが、合成プロセスの最後に適切な求核剤で効果的に反応停止され得ることを実証した。このように、新規の３段階プロセスを設計し、実施した。段階１及び段階２を先の例に記載したように実施して可溶性の高ＭＷ分岐ＧＡＧバイオポリマーを得たが、酸を添加して反応を停止する代わりに、求核性クエンチャー化合物を過剰に添加して、残りのすべてのビニルスルホン基と完全に反応させた。短い反応時間の後、次いで、反応物をＨＣｌで中和し、前と同様にワークアップし、精製した。この新規な３段階プロセスは、クエンチャー化合物に由来するさらなる構造要素又は官能基を有する可溶性の高ＭＷ分岐ＧＡＧバイオポリマーを生成した。多くの構造要素又は官能基をポリマー構造に導入することができる。この例は、段階３のクエンチャー剤としてｎ－ヘキシルアミンを使用する３段階プロセスで調製された、ｎ－ヘキシル官能化両親媒性分岐高ＭＷ ＧＡＧバイオポリマーの合成を説明する。

段階１。コンドロイチン硫酸ナトリウム（０．５００ｇ、２．７８３ｍｍｏｌ当量のヒドロキシル基）及び塩化ナトリウム（１０１ｍｇ）を２０ｍＬの反応容器中のＤＩ水１０．３７５ｇに溶解した。無色透明の溶液が得られた。ＤＶＳ（０．３２９ｇ、２７９ｕＬ、２．７８ｍｍｏｌ）をマイクロリットルピペットにより容量測定的に加えた。穏やかに混合した後、溶液は透明で無色であった。マイクロリットルピペットを使用して１．１５３ｍＬの１．０Ｎ ＮａＯＨを添加することによって反応を開始させた。ＮａＯＨを添加すると、溶液はすぐに淡黄色になり、透明のままであった。１１．５ｍｌの反応物はコンドロイチン硫酸が４．２ｗｔ％であり、ＮａＯＨが０．１Ｍである（ｐＨ １３）。反応物をロティサリーで穏やかに混合した。

段階２。１５分後、コンドロイチン硫酸ナトリウムの追加部分（０．５００ｇ、２．７８３ｍｍｏｌ当量のヒドロキシル基）を加え、反応混合物をロティサリーで撹拌した。反応溶液はコンドロイチン硫酸が８ｗｔ％であり、わずかに粘性が増したが、透明で流動性のままであった。

段階３。ＮａＯＨの導入による反応開始の１００分後、反応混合物の２５％を除去し、ＨＣｌで反応停止させて対照材料を得た。残りの反応混合物に、ｎ－ヘキシルアミン（０．２８２ｍｌ、２．０９ｍｍｏｌ）を添加し、透明な反応混合物を振盪し、ロティサリーミキサーに置いた。反応に投入したアミンクエンチャーの量は、最初のＤＶＳ投入と同じモル量であった。この量を選択したのは、成長するポリマー上に残っているペンダントビニルスルホン基の濃度を大幅に超過すると考えられたからである。３０分間の混合後、反応物を、マイクロリットルピペットを使用して２．９６５ｍｌの１．０Ｎ ＨＣｌを加えることによって完全に中和した。溶液のｐＨは約６．５であった。透明な流体反応混合物をＰＢＳで６０ｍｌに希釈し、０．４５ミクロンのシリンジフィルターで濾過した。

精製。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂ ＫＲ２ｉ ＴＦＦシステムを、２５０ｍｌの供給物リザーバー、及び改質ポリエーテルスルホンフィルター繊維（直径１ｍｍ、１００ｋＤａのＭＷＣＯ、全表面積７５ｃｍ２、部品番号Ｄ０２－Ｅ１００－１０－Ｎ）を含む２０ｃｍ中空繊維フィルターモジュールと共に使用した。希釈生成物の６０ｍｌ全量を供給物リザーバーに充填した。タンジェンシャルフロー濾過を２００ｍｌ／分の流速で開始し、流速を３００ｍｌ／分に増加させ、入口圧力を２５ｐｓｉｇ未満に維持した。透過するために失われた溶液の量を追加のＰＢＳで連続的に補う透析モードでＴＦＦを実行した。このようにして、保持液の量は、５ボリューム（３００ｍｌ）の透過液が生成されたので、濾過手順中に一定のままであった。次いで、供給物リザーバーに（ＰＢＳの代わりに）ＤＩ水を補充し、さらに５ボリュームの透過液（３００ｍｌ）が得られるまで濾過を続けることによって、ＴＦＦを脱塩モードで継続した。次いで、ＤＩ水の補充を中断し、濾過を濃縮モードで実行して、保持液量を約４０ｍＬまで減少させた。次いで、ＴＦＦを停止させ、システムをフラッシングして（１０ｍｌのＤＩ水）、ホールドアップボリュームを回収した。次いで、精製された保持液を７２時間の凍結乾燥によって乾燥させ、精製された生成物（０．４６８ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。

Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、２５
ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が２０３ｋＤａであることを示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、ビニル共鳴が全く存在しないこと、及びｎ－ヘキシル基を表すいくつかの新しいピークを示した。コンドロイチン硫酸アセトアミドピークとヘキシル基のメチルピークの積分ピーク面積の比は１００：１７であり、生成物がコンドロイチン硫酸二糖単位の１７％にｎ－ヘキシル置換基を含むことを示唆している。生成物の両親媒性は、希釈水溶液の表面張力が低い外観によって明らかであった（振盪でいくらかの泡の形成）。

例６：ボトルブラシ様構造を有する両親媒性ｎ－オクチル官能化高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の３段階１ポットプロセスでの調製。
段階３において、クエンチャーとしてｎ－オクチルアミン（０．３４５ｍｌ、２．０９ｍｍｏｌ）を添加したことを除いて、例５について記載した手順を上記のとおり正確に繰り返した。例２０とは異なり、ｎ－オクチルアミンの添加によって、反応混合物が濃くなり、濁った。したがって、追加ボリューム（１２ｍｌ）の脱イオン水を段階３の反応に添加して、透明性及び流れを回復させた。次いで、この溶液を例２０に記載されるようにワークアップ及び精製して、精製生成物（０．５１２ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、３６ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が３２０ｋＤａであることを示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、ビニル共鳴が全く存在しないこと、及びｎ－ヘキシル基を表すいくつかの新しいピークを示した。コンドロイチン硫酸アセトアミドピークとヘキシル基のメチルピークの積分ピーク面積の比は１００：１２であり、生成物がコンドロイチン硫酸二糖単位の１３％にｎ－ヘキシル置換基を含むことを示唆している。生成物の両親媒性は、希釈水溶液の表面張力が低い外観によって明らかであった（振盪で強力な泡の形成）。

例７：ボトルブラシ様構造を有するピロリジン官能化高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の３段階１ポットプロセスでの調製。
段階３において、クエンチャーとしてピロリジン（０．１７４ｍｌ、２．０９ｍｍｏｌ）を添加したことを除いて、例５について記載した３段階手順を上記のとおり正確に繰り返した。ピロリジンの添加後、反応混合物は透明性及び流動性を維持した。次いで、この溶液を例２０に記載されるようにワークアップ及び精製して、精製生成物（０．３７３ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、２７ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が２５３ｋＤａであることを示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、ビニル共鳴が全く存在しないことを示した。この場合、付加されたピロリジン基のメチレン共鳴はコンドロイチン硫酸ピークによって不明瞭であった。

例８：ボトルブラシ様構造を有するグルタチオン官能化高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の３段階１ポットプロセスでの調製。
段階３において、クエンチャーとしてグルタチオン（０．６４２ｇ、２．０９ｍｍｏｌ）を添加したことを除いて、例５について記載した３段階手順を上記のとおりに繰り返した。固体グルタチオンは反応混合物中に非常に迅速に溶解して、透明な溶液をもたらした。例２０で見られたように、グルタチオンの添加後、反応混合物は透明性及び流動性を維持した。次いで、この溶液をワークアップ及び精製して、精製生成物（０．３６９ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、２１ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が１４３ｋＤａであることを示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、ビニル共鳴が全く存在しないことを示した。この場合、付加されたグルタチオン基の共鳴は、コンドロイチン硫酸ピークによって部分的に不明瞭であった。

例９：ボトルブラシ様構造を有するラクトシルアミン官能化高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の３段階１ポットプロセスでの調製。
段階３において、クエンチャーとしてラクトシルアミンを添加したことを除いて、例５について記載した３段階手順を繰り返した（コンドロイチン硫酸ナトリウム０．５００ｇのスケールで）。ラクトシルアミンの添加後、反応混合物は透明性及び流動性を維持した。次いで、この溶液をワークアップ及び精製して、精製生成物（０．３７３ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、２７ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が２５３ｋＤａであることを示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、ビニル共鳴が全く存在しないことを示す。この場合、付加されたラクトシル基のメチレン共鳴はコンドロイチン硫酸ピークによって不明瞭である。

例１０：ボトルブラシ様構造を有する２－エトキシエチルアミン官能化高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の３段階１ポットプロセスでの調製。
段階１。コンドロイチン硫酸ナトリウム（０．１７３０ｇ、２．７８３ｍｍｏｌ当量のヒドロキシル基）及び塩化ナトリウム（０．０４６５ｍｇ）を２０ｍＬの反応容器中のＤＩ水４．７７９０ｇに溶解した。無色透明の溶液が得られた。ＤＶＳ（０．０９１ ｇ、７７．１μＬ、０．７８６ｍｍｏｌ）をマイクロリットルピペットにより容量測定的に加えた。穏やかに混合した後、溶液は透明で無色であった。マイクロリットルピペットを使用して０．５３１ｍＬの１．０Ｎ ＮａＯＨを添加することによって反応を開始させた。ＮａＯＨを添加すると、溶液はすぐに淡黄色になり、透明のままであった。反応はコンドロイチン硫酸が３．２ｗｔ％であり、ＮａＯＨが０．１Ｍである（ｐＨ １３）。反応物をロティサリーで穏やかに混合した。

段階２。１５分後、コンドロイチン硫酸ナトリウムの追加部分（０．５１８０ｇ、２．７８３ｍｍｏｌ当量のヒドロキシル基）を加え、反応混合物をロティサリーで撹拌した。反応溶液はコンドロイチン硫酸が１１．５ｗｔ％であり、わずかに粘性が増したが、透明で流動性のままであった。

段階３。ＮａＯＨの導入による反応開始の１２０分後、反応溶液を２ｍＬのＤＩ水を用いて希釈した。穏やかに混合した後、溶液は透明で無色のままであった。反応溶液はコンドロイチン硫酸が８．１ｗｔ％であり、粘度が低下した。３０分後、０．０８０５ｍＬの２－エキソチエチルアミンを反応溶液に添加した。反応に投入したアミンクエンチャーの量は、最初のＤＶＳ投入と同じモル量であった。この量を選択したのは、成長するポリマー上に残っているペンダントビニルスルホン基の濃度を大幅に超過すると考えられたからである。１５分間の混合後、反応物を、マイクロリットルピペットを使用して０．９８１ｍＬの１．０Ｎ ＨＣｌを加えることによって完全に中和した。溶液のｐＨは約６．５であった。透明な流体反応混合物をＰＢＳで４０ｍＬに希釈し、０．４５ミクロンのシリンジフィルターで濾過した。

精製。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂ ＫＲ２ｉ ＴＦＦシステムを、５０ｍＬの供給物リザーバー、及び改質ポリエーテルスルホンフィルター繊維（直径０．５ｍｍ、１００ｋＤａのＭＷＣＯ、全表面積１１５ｃｍ^２、部品番号Ｄ０２－Ｅ１００－０５－Ｎ）を含む２０ｃｍ中空繊維フィルターモジュールと共に使用した。希釈生成物の４０ｍＬ全量を供給物リザーバーに充填した。タンジェンシャルフロー濾過を１５０ｍｌ／分の流速で開始し、膜貫通圧を１５に設定し、入口圧力を２５ｐｓｉｇ未満に維持しながら１８まで上昇させた。透過するために失われた溶液の量を追加のＰＢＳで連続的に補う自動透析モードでＴＦＦを実行した。このようにして、保持液の量は、５ボリューム（２００ｍＬ）の透過液が生成されたので、濾過手順中に一定のままであった。次いで、供給物リザーバーに（ＰＢＳの代わりに）ＤＩ水を補充し、さらに５ボリュームの透過液（２００ｍＬ）が得られるまで濾過を続けることによって、ＴＦＦを脱塩モードで継続した。次いで、ＤＩ水の補充を中断し、濾過を濃縮モードで実行して、保持液量を約４０ｍＬに戻した。次いで、ＴＦＦを停止させ、システムをフラッシングして（５ｍＬのＤＩ水）、ホールドアップボリュームを回収した。精製された保持液を０．２ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過し、次いで、７２時間の凍結乾燥によって乾燥させて、精製された生成物（０．３５６７ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。

Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、４３．５ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が１９０２ｋＤａであることを示した。ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる生成物の分析は、Ｍ_ｎ＝２６８０００及びＭ_ｗ＝２４７００００を示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、ビニル共鳴が全く存在しないこと、及び２－エトキシエチルアミンのメチル基を表すいくつかの新しいピークを示した。コンドロイチン硫酸アセトアミドピークと２－エトキシエチルアミン基のメチルピークの積分ピーク面積の比は１００：４であり、生成物がコンドロイチン硫酸二糖単位の４％に２－エトキシエチルアミン置換基を含むことを示唆している。

例１８：ボトルブラシ様構造を有する高ビニル官能化（４つのうち１つ）高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の３段階１ポットプロセスでの調製。
本発明者らは、溶解度を保持しながら、分岐高ＭＷ ＧＡＧバイオポリマーにさらなるビニル－スルホン基を付加することができることを実証した。段階３において重要な希釈工程を行って、段階４においてさらなる架橋剤との反応を可能にする。

本例の段階１及び段階２を、例１０と同一の条件で実行した。

段階３。ＮａＯＨの導入による反応開始の１２０分後、反応溶液を２ｍＬのＤＩ水を用いて希釈した。穏やかに混合した後、溶液は透明で無色のままであった。反応溶液はコンドロイチン硫酸が８．１ｗｔ％であり、粘度が低下した。５分後、０．０７７１ｍＬのＤＶＳを反応溶液に添加した。反応に添加したＤＶＳの量は、最初のＤＶＳ投入と同じモル量であった。１５分間の混合後、反応物を、マイクロリットルピペットを使用して０．５３１ｍＬの１．０Ｎ ＨＣｌを加えることによって完全に中和した。溶液のｐＨは約６．５であった。透明な流体反応混合物をＰＢＳで４０ｍＬに希釈し、０．４５ミクロンのシリンジフィルターで濾過した。

精製。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂ ＫＲ２ｉ ＴＦＦシステムを、５０ｍＬの供給物リザーバー、及び改質ポリエーテルスルホンフィルター繊維（直径０．５ｍｍ、１００ｋＤａのＭＷＣＯ、全表面積１１５ｃｍ^２、部品番号Ｄ０２－Ｅ１００－０５－Ｎ）を含む２０ｃｍ中空繊維フィルターモジュールと共に使用した。希釈生成物の４０ｍＬ全量を供給物リザーバーに充填した。タンジェンシャルフロー濾過を１５０ｍｌ／分の流速で開始し、膜貫通圧を１５に設定し、入口圧力を２５ｐｓｉｇ未満に維持しながら１８まで上昇させた。透過するために失われた溶液の量を追加のＰＢＳで連続的に補う自動透析モードでＴＦＦを実行した。このようにして、保持液の量は、５ボリューム（２００ｍＬ）の透過液が生成されたので、濾過手順中に一定のままであった。次いで、供給物リザーバーに（ＰＢＳの代わりに）ＤＩ水を補充し、さらに５ボリュームの透過液（２００ｍＬ）が得られるまで濾過を続けることによって、ＴＦＦを脱塩モードで継続した。次いで、ＤＩ水の補充を中断し、濾過を濃縮モードで実行して、保持液量を約４０ｍＬに戻した。次いで、ＴＦＦを停止させ、システムをフラッシングして（５ｍＬのＤＩ水）、ホールドアップボリュームを回収した。精製された保持液を０．２ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過し、次いで、７２時間の凍結乾燥によって乾燥させて、精製された生成物（０．３７７２ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。

Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、４４ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が３９３ｋＤａであることを示した。ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる生成物の分析は、Ｍ_ｎ＝１６７０００及びＭ_ｗ＝６７７０００を示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、より高い値のビニル共鳴シグナルを示した。コンドロイチン硫酸アセトアミドピークとビニルピークの積分ピーク面積の比は１００：２４であり、生成物がコンドロイチン硫酸二糖単位の２４％にビニルを含むことを示唆している。

例１９：ボトルブラシ様構造を有する中間高ビニル官能化（４つのうち２つ）高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の３段階１ポットプロセスでの調製。
本例の段階１及び段階２を、ロティサリー撹拌の代わりに撹拌プレートを混合方法として使用したことを除いて、例１０と同一の条件で実行した。

段階３。ＮａＯＨの導入による反応開始の１０５分後、反応溶液を４ｍＬのＤＩ水を用いて希釈した。穏やかに混合した後、溶液は透明で無色のままであった。反応溶液はコンドロイチン硫酸が６．３ｗｔ％であり、わずかに粘性が低下した。１５分後、０．０５７８ｍＬのＤＶＳを反応溶液に添加した。反応に添加したＤＶＳの量は、最初のＤＶＳ投入の７５％に相当した。１５分間の混合後、反応物を、マイクロリットルピペットを使用して０．５８１ｍＬの１．０Ｎ ＨＣｌを加えることによって完全に中和した。溶液のｐＨは約６．５であった。透明な流体反応混合物をＰＢＳで４０ｍＬに希釈し、０．４５ミクロンのシリンジフィルターで濾過した。

精製。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂ ＫＲ２ｉ ＴＦＦシステムを、５０ｍＬの供給物リザーバー、及び改質ポリエーテルスルホンフィルター繊維（直径０．５ｍｍ、１００ｋＤａのＭＷＣＯ、全表面積１１５ｃｍ^２、部品番号Ｄ０２－Ｅ１００－０５－Ｎ）を含む２０ｃｍ中空繊維フィルターモジュールと共に使用した。希釈生成物の４０ｍＬ全量を供給物リザーバーに充填した。タンジェンシャルフロー濾過を１５０ｍｌ／分の流速で開始し、膜貫通圧を１５に設定し、入口圧力を２５ｐｓｉｇ未満に維持しながら１８まで上昇させた。透過するために失われた溶液の量を追加のＰＢＳで連続的に補う自動透析モードでＴＦＦを実行した。このようにして、保持液の量は、５ボリューム（２００ｍＬ）の透過液が生成されたので、濾過手順中に一定のままであった。次いで、供給物リザーバーに（ＰＢＳの代わりに）ＤＩ水を補充し、さらに５ボリュームの透過液（２００ｍＬ）が得られるまで濾過を続けることによって、ＴＦＦを脱塩モードで継続した。次いで、ＤＩ水の補充を中断し、濾過を濃縮モードで実行して、保持液量を約４０ｍＬに戻した。次いで、ＴＦＦを停止させ、システムをフラッシングして（５ｍＬのＤＩ水）、ホールドアップボリュームを回収した。精製された保持液を０．２ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過し、次いで、７２時間の凍結乾燥によって乾燥させて、精製された生成物（０．３８００ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。

Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、４６．４ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が３７５ｋＤａであることを示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、より高い値のビニル共鳴シグナルを示した。コンドロイチン硫酸アセトアミドピークとビニルピークの積分ピーク面積の比は１００：１６であり、生成物がコンドロイチン硫酸二糖単位の１６％に残留ビニルを含むことを示唆している。

例２０：ボトルブラシ様構造を有する中程度ビニル官能化（４つのうち３つ）高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の３段階１ポットプロセスでの調製。
本例の段階１及び段階２を、ロティサリー撹拌の代わりに撹拌プレートを混合方法として使用したことを除いて、例１０と同一の条件で実行した。

段階３。ＮａＯＨの導入による反応開始の１０５分後、反応溶液を４ｍＬのＤＩ水を用いて希釈した。穏やかに混合した後、溶液は透明で無色のままであった。反応溶液はコンドロイチン硫酸が６．３ｗｔ％であり、粘度が低下した。１５分後、０．０３８６ｍＬのＤＶＳを反応溶液に添加した。反応に添加したＤＶＳの量は、最初のＤＶＳ投入の５０％に相当した。１５分間の混合後、反応物を、マイクロリットルピペットを使用して０．５８１ｍＬの１．０Ｎ ＨＣｌを加えることによって完全に中和した。溶液のｐＨは約６．５であった。透明な流体反応混合物をＰＢＳで４０ｍＬに希釈し、０．４５ミクロンのシリンジフィルターで濾過した。

精製。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂ ＫＲ２ｉ ＴＦＦシステムを、５０ｍＬの供給物リザーバー、及び改質ポリエーテルスルホンフィルター繊維（直径０．５ｍｍ、１００ｋＤａのＭＷＣＯ、全表面積１１５ｃｍ^２、部品番号Ｄ０２－Ｅ１００－０５－Ｎ）を含む２０ｃｍ中空繊維フィルターモジュールと共に使用した。希釈生成物の４０ｍＬ全量を供給物リザーバーに充填した。タンジェンシャルフロー濾過を１５０ｍｌ／分の流速で開始し、膜貫通圧を１５に設定し、入口圧力を２５ｐｓｉｇ未満に維持しながら１８まで上昇させた。透過するために失われた溶液の量を追加のＰＢＳで連続的に補う自動透析モードでＴＦＦを実行した。このようにして、保持液の量は、５ボリューム（２００ｍＬ）の透過液が生成されたので、濾過手順中に一定のままであった。次いで、供給物リザーバーに（ＰＢＳの代わりに）ＤＩ水を補充し、さらに５ボリュームの透過液（２００ｍＬ）が得られるまで濾過を続けることによって、ＴＦＦを脱塩モードで継続した。次いで、ＤＩ水の補充を中断し、濾過を濃縮モードで実行して、保持液量を約４０ｍＬに戻した。次いで、ＴＦＦを停止させ、システムをフラッシングして（５ｍＬのＤＩ水）、ホールドアップボリュームを回収した。精製された保持液を０．２ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過し、次いで、７２時間の凍結乾燥によって乾燥させて、精製された生成物（０．３３５０ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。

Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、３８．１ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が３４０ｋＤａであることを示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、より高い値のビニル共鳴シグナルを示した。コンドロイチン硫酸アセトアミドピークとビニルピークの積分ピーク面積の比は１００：１２であり、生成物がコンドロイチン硫酸二糖単位の１２％に残留ビニルを含むことを示唆している。

例２１：ボトルブラシ様構造を有する低ビニル官能化（３つのうち３つ）高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の３段階１ポットプロセスでの調製。
本例の段階１及び段階２を、ロティサリー撹拌の代わりに撹拌プレートを混合方法として使用したことを除いて、例１０と同一の条件で実行した。

段階３。ＮａＯＨの導入による反応開始の１０５分後、反応溶液を４ｍＬのＤＩ水を用いて希釈した。穏やかに混合した後、溶液は透明で無色のままであった。反応溶液はコンドロイチン硫酸が６．３ｗｔ％であり、粘度が低下した。４５分後、０．０１９３ｍＬのＤＶＳを反応溶液に添加した。反応に添加したＤＶＳの量は、最初のＤＶＳ投入の２５％に相当した。１５分間の混合後、反応物を、マイクロリットルピペットを使用して０．５８１ｍＬの１．０Ｎ ＨＣｌを加えることによって完全に中和した。溶液のｐＨは約６．５であった。透明な流体反応混合物をＰＢＳで４０ｍＬに希釈し、０．４５ミクロンのシリンジフィルターで濾過した。

精製。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂ ＫＲ２ｉ ＴＦＦシステムを、５０ｍＬの供給物リザーバー、及び改質ポリエーテルスルホンフィルター繊維（直径０．５ｍｍ、１００ｋＤａのＭＷＣＯ、全表面積１１５ｃｍ^２、部品番号Ｄ０２－Ｅ１００－０５－Ｎ）を含む２０ｃｍ中空繊維フィルターモジュールと共に使用した。希釈生成物の４０ｍＬ全量を供給物リザーバーに充填した。タンジェンシャルフロー濾過を１５０ｍｌ／分の流速で開始し、膜貫通圧を１５に設定し、入口圧力を２５ｐｓｉｇ未満に維持しながら１８まで上昇させた。透過するために失われた溶液の量を追加のＰＢＳで連続的に補う自動透析モードでＴＦＦを実行した。このようにして、保持液の量は、５ボリューム（２００ｍＬ）の透過液が生成されたので、濾過手順中に一定のままであった。次いで、供給物リザーバーに（ＰＢＳの代わりに）ＤＩ水を補充し、さらに５ボリュームの透過液（２００ｍＬ）が得られるまで濾過を続けることによって、ＴＦＦを脱塩モードで継続した。次いで、ＤＩ水の補充を中断し、濾過を濃縮モードで実行して、保持液量を約４０ｍＬに戻した。次いで、ＴＦＦを停止させ、システムをフラッシングして（５ｍＬのＤＩ水）、ホールドアップボリュームを回収した。精製された保持液を０．２ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過し、次いで、７２時間の凍結乾燥によって乾燥させて、精製された生成物（０．２８１８ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。

Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、２８．２５ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が２１７ｋＤａであることを示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、より高い値のビニル共鳴シグナルを示した。コンドロイチン硫酸アセトアミドピークとビニルピークの積分ピーク面積の比は１００：８であり、生成物がコンドロイチン硫酸二糖単位の８％に残留ビニルを含むことを示唆している。

例２２：ボトルブラシ様構造を有する両親媒性ｎ－ヘキシル官能化高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の４段階１ポットプロセスでの調製。
本発明者らはさらに、高度置換ビニルスルホン分岐高ＭＷ ＧＡＧバイオポリマーが、ｎ－ヘキシルアミンを効果的に反応停止させて、高度置換両親媒性ポリマーを生成することができることを実証した。

本例の段階１及び段階２を、ロティサリー撹拌の代わりに撹拌プレートを混合方法として使用したことを除いて、例１０と同一の条件で実行した。

段階３。ＮａＯＨの導入による反応開始の１０５分後、反応溶液を４ｍＬのＤＩ水を用いて希釈した。穏やかに混合した後、溶液は透明で無色のままであった。反応溶液はコンドロイチン硫酸が６．３ｗｔ％であり、粘度が低下した。１５分後、０．０５７８ｍＬのＤＶＳを反応溶液に添加した。反応に添加したＤＶＳの量は、最初のＤＶＳ投入の７５％に相当した。

段階４。１５分間混合した後、０．１００９ｍＬのヘキシルアミンを反応溶液に添加した。反応に投入したアミンクエンチャーの量は、最初のＤＶＳ投入と同じモル量であった。この量を選択したのは、成長するポリマー上に残っているペンダントビニルスルホン基の濃度を大幅に超過すると考えられたからである。ヘキシルアミンを添加すると、溶液は直ちに濁った。１５分間の混合後、反応物を、マイクロリットルピペットを使用して１．１８１ｍＬの１．０Ｎ ＨＣｌを加えることによって完全に中和した。溶液のｐＨは約６．５であった。透明な流体反応混合物をＰＢＳで４０ｍＬに希釈し、０．４５ミクロンのシリンジフィルターで濾過した。

精製。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂ ＫＲ２ｉ ＴＦＦシステムを、５０ｍＬの供給物リザーバー、及び改質ポリエーテルスルホンフィルター繊維（直径０．５ｍｍ、１００ｋＤａのＭＷＣＯ、全表面積１１５ｃｍ^２、部品番号Ｄ０２－Ｅ１００－０５－Ｎ）を含む２０ｃｍ中空繊維フィルターモジュールと共に使用した。希釈生成物の４０ｍＬ全量を供給物リザーバーに充填した。タンジェンシャルフロー濾過を１５０ｍＬ／分の流速で開始し、膜貫通圧を１５に設定し、入口圧力を２５ｐｓｉｇ未満に維持しながら１８まで上昇させた。透過するために失われた溶液の量を追加のＰＢＳで連続的に補う自動透析モードでＴＦＦを実行した。このようにして、保持液の量は、５ボリューム（２００ｍＬ）の透過液が生成されたので、濾過手順中に一定のままであった。次いで、供給物リザーバーに（ＰＢＳの代わりに）ＤＩ水を補充し、さらに５ボリュームの透過液（２００ｍＬ）が得られるまで濾過を続けることによって、ＴＦＦを脱塩モードで継続した。次いで、ＤＩ水の補充を中断し、濾過を濃縮モードで実行して、保持液量を約４０ｍＬに戻した。次いで、ＴＦＦを停止させ、システムをフラッシングして（５ｍＬのＤＩ水）、ホールドアップボリュームを回収した。精製された保持液を０．２ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過し、次いで、７２時間の凍結乾燥によって乾燥させて、精製された生成物（０．４１０２ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。

Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、３４．５ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が２８４ｋＤａであることを示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、ビニル共鳴が全く存在しないこと、及びｎ－ヘキシル基を表すいくつかの新しいピークを示した。コンドロイチン硫酸アセトアミドピークとヘキシル基のメチルピークの積分ピーク面積の比は１００：１８であり、生成物がコンドロイチン硫酸二糖単位の１８％にｎ－ヘキシル置換基を含むことを示唆している。生成物の両親媒性は、希釈水溶液の表面張力が低い外観によって明らかであった（振盪でいくらかの泡の形成）。

例２３：ボトルブラシ様構造を有するボロン酸及び２－エトキシエチルアミン官能化高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の５段階１ポットプロセスでの調製。
本発明者らはさらに、分岐高ＭＷ ＧＡＧバイオポリマー上の残留ビニル－スルホン基ペンダントが、合成プロセスの最後に適切な求核剤で効果的に反応停止され得ることを実証した。このように、新規の６段階プロセスを設計し、実施した。段階１及び段階２を先の例に記載したように実施して可溶性の高ＭＷ分岐ＧＡＧバイオポリマーを得たが、酸を添加して反応を反応停止する代わりに、溶液を段階３においてＤＩ水で希釈し、段階４においてさらなるＤＶＳを添加した。段階５では、求核性クエンチャー化合物を過剰に添加して、残りのビニルスルホン基の一部と反応させた。この特定の求核試薬は、すべての残留ビニルシグナルを反応停止させないことが見出されたので、段階６において追加の求核性クエンチャーを添加して、ビニルシグナルが完全に反応停止されることを確実にした。短い反応時間の後、次いで、反応物をＨＣｌで中和し、前と同様にワークアップし、精製した。この新規な６段階プロセスは、クエンチャー化合物に由来するさらなる構造要素又は官能基を有する可溶性の高ＭＷ分岐ＧＡＧバイオポリマーを生成した。多くの構造要素又は官能基をポリマー構造に導入することができる。この例は、段階３においてＤＩ水、段階４においてＤＶＳ、段階５においてクエンチャー剤としてのｎ－ヘキシルアミン、及び段階６において２－エトキシエチルアミンを使用する６段階プロセスで調製された、ｎ－ヘキシル官能化両親媒性分岐高ＭＷ ＧＡＧバイオポリマーの合成を説明する。

本例の段階１及び段階２を、ロティサリー撹拌の代わりに撹拌プレートを混合方法として使用したことを除いて、例１０と同一の条件で実行した。

段階３。ＮａＯＨの導入による反応開始の１０５分後、反応溶液を４ｍＬのＤＩ水を用いて希釈した。穏やかに混合した後、溶液は透明で無色のままであった。反応溶液はコンドロイチン硫酸が６．３ｗｔ％であり、わずかに粘性が低下した。１５分後、０．０１９３ｍＬのＤＶＳを反応溶液に添加した。反応に添加したＤＶＳの量は、最初のＤＶＳ投入の２５％に相当した。

段階４。１５分後、Ｊｉａｎｇｙｉｎ ＰｈａｒｍａＡｄｖａｎｃｅ，Ｉｎｃ製の複素環化合物（（４－（（２－アミノエチル）カルバモイル）－３－フルオロフェニル）ボロン酸塩酸塩、Ｃ_９Ｈ_１３ＢＣｌＦＮ_２Ｏ_３）０．２０１７ｇを反応溶液に添加した。この添加の際に、反応溶液のｐＨは低下したので、ＨＣｌをｐＨ＝１３になるまで添加した。穏やかに混合すると、溶液はわずかに濁った。１５分後、０．０８０５ｍＬの２－エキソチエチルアミンを反応溶液に添加した。反応に投入したアミンクエンチャーの量は、最初のＤＶＳ投入と同じモル量であった。この量を選択したのは、成長するポリマー上に残っているペンダントビニルスルホン基の濃度を大幅に超過すると考えられたからである。１５分間の混合後、反応物を、マイクロリットルピペットを使用して０．９８１ｍＬの１．０Ｎ ＨＣｌを加えることによって完全に中和した。溶液のｐＨは約６．５であった。透明な流体反応混合物をＰＢＳで４０ｍＬに希釈し、０．４５ミクロンのシリンジフィルターで濾過した。

精製。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂ ＫＲ２ｉ ＴＦＦシステムを、５０ｍＬの供給物リザーバー、及び改質ポリエーテルスルホンフィルター繊維（直径０．５ｍｍ、１００ｋＤａのＭＷＣＯ、全表面積１１５ｃｍ^２、部品番号Ｄ０２－Ｅ１００－０５－Ｎ）を含む２０ｃｍ中空繊維フィルターモジュールと共に使用した。希釈生成物の４０ｍＬ全量を供給物リザーバーに充填した。タンジェンシャルフロー濾過を１５０ｍＬ／分の流速で開始し、膜貫通圧を１５に設定し、入口圧力を２５ｐｓｉｇ未満に維持しながら１８まで上昇させた。透過するために失われた溶液の量を追加のＰＢＳで連続的に補う自動透析モードでＴＦＦを実行した。このようにして、保持液の量は、５ボリューム（２００ｍＬ）の透過液が生成されたので、濾過手順中に一定のままであった。次いで、供給物リザーバーに（ＰＢＳの代わりに）ＤＩ水を補充し、さらに５ボリュームの透過液（２００ｍＬ）が得られるまで濾過を続けることによって、ＴＦＦを脱塩モードで継続した。次いで、ＤＩ水の補充を中断し、濾過を濃縮モードで実行して、保持液量を約４０ｍＬに戻した。次いで、ＴＦＦを停止させ、システムをフラッシングして（５ｍＬのＤＩ水）、ホールドアップボリュームを回収した。精製された保持液を０．２ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過し、次いで、７２時間の凍結乾燥によって乾燥させて、精製された生成物（０．３８４６ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。

Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、２５．１ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が７０１．４ｋＤａであることを示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、ビニル共鳴の完全な非存在、ならびに予想されたアリール及び２－エトキシエチルアミン共鳴を示す。コンドロイチン硫酸アセトアミドピークとアリール及び２－エトキシエチルアミンメチルピークの積分ピーク面積の比はそれぞれ１００：６．９及び１００：１．５であり、生成物がコンドロイチン硫酸二糖単位の６．９％及び１．５％にアリール及び２－エトキシエチルアミン置換基を含むことを示唆している。

例２４：ボトルブラシ様構造を有するラクトシルアミン官能化高ＭＷコンドロイチン硫酸組成物の２段階１ポットプロセスでの調製。
本発明者らはさらに、分岐高ＭＷ ＧＡＧバイオポリマー上の残留ビニル－スルホン基ペンダントが、合成プロセスの最後に適切な求核剤で効果的に反応停止され得ることを実証した。このように、新規な２段階プロセスを設計し、実施した。高ビニルＳｕｐｅｒＧＡＧ及びラクトシルアミンをｐＨ １３の生理食塩水に溶解して、ラクトシルアミンで残留ビニル基を反応停止させた。ラクトシルアミンは、すべての残留ビニル基を反応停止させないことが観察されているので、追加の求核試薬を段階２で添加して、すべての残留ビニルシグナルを確実に反応停止させた。短い反応時間の後、次いで、反応物をＨＣｌで中和し、前と同様にワークアップし、精製した。この新規な２段階プロセスは、クエンチャー化合物に由来するさらなる構造要素又は官能基を有する可溶性の高ＭＷ分岐ＧＡＧバイオポリマーを生成した。多くの構造要素又は官能基をポリマー構造に導入することができる。この例は、段階１においてクエンチャー剤としてラクトシルアミン、及び段階２において２－エトキシエチルアミンを使用する２段階プロセスで調製された、ラクトシルアミン及び２－エトキシエチルアミン官能化分岐高ＭＷ ＧＡＧバイオポリマーの合成を説明する。

段階１。ＳｕｐｅｒＧＡＧ ００７－０３３－２（０．１００ｇ）及びラクトシルアミン（０．５００ｍｇ）を２０ｍＬの反応容器中で３．０ｇの０．９％生理食塩水に溶解した。無色透明の溶液が得られた。マイクロリットルピペットを使用して０．６００ｍＬの１．０Ｎ ＮａＯＨを添加することによって反応を開始させた。ＮａＯＨを添加すると、溶液は透明で無色のままであった。反応物を撹拌棒を用いて撹拌プレート上で穏やかに混合した。

段階２。４５分後、０．０８０５ｍＬの２－エトキシエチルアミンを反応バイアルに添加した。反応に投入したアミンクエンチャーの量は、上記のＳｕｐｅｒＧＡＧ合成プロセスにおける最初のＤＶＳ投入と同じモル量であった。この量を選択したのは、成長するポリマー上に残っているペンダントビニルスルホン基の濃度を大幅に超過すると考えられたからである。穏やかに混合した後、溶液は透明で無色のままであった。１５分間の混合後、反応物を、マイクロリットルピペットを使用して０．９８１ｍＬの１．０Ｎ ＨＣｌを加えることによって完全に中和した。溶液のｐＨは約６．５であった。透明な流体反応混合物をＰＢＳで４０ｍＬに希釈し、０．４５ミクロンのシリンジフィルターで濾過した。

精製。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂ ＫＲ２ｉ ＴＦＦシステムを、５０ｍＬの供給物リザーバー、及び改質ポリエーテルスルホンフィルター繊維（直径０．５ｍｍ、１００ｋＤａのＭＷＣＯ、全表面積１１５ｃｍ^２、部品番号Ｄ０２－Ｅ１００－０５－Ｎ）を含む２０ｃｍ中空繊維フィルターモジュールと共に使用した。希釈生成物の４０ｍＬ全量を供給物リザーバーに充填した。タンジェンシャルフロー濾過を１５０ｍＬ／分の流速で開始し、膜貫通圧を１５に設定し、入口圧力を２５ｐｓｉｇ未満に維持しながら１８まで上昇させた。透過するために失われた溶液の量を追加のＰＢＳで連続的に補う自動透析モードでＴＦＦを実行した。このようにして、保持液の量は、５ボリューム（２００ｍＬ）の透過液が生成されたので、濾過手順中に一定のままであった。次いで、供給物リザーバーに（ＰＢＳの代わりに）ＤＩ水を補充し、さらに５ボリュームの透過液（２００ｍＬ）が得られるまで濾過を続けることによって、ＴＦＦを脱塩モードで継続した。次いで、ＤＩ水の補充を中断し、濾過を濃縮モードで実行して、保持液量を約４０ｍＬに戻した。次いで、ＴＦＦを停止させ、システムをフラッシングして（５ｍＬのＤＩ水）、ホールドアップボリュームを回収した。精製された保持液を０．２ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過し、次いで、７２時間の凍結乾燥によって乾燥させて、精製された生成物（０．０．０６９ｇ）を白色の毛羽立った固体として得た。

Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳによる生成物の分析は、４８．３ｎｍの流体力学的半径及び静的光散乱からのＭｗ推定値が２３０７ｋＤａであることを示した。プロトンＮＭＲによる生成物の分析は、ビニル共鳴が全く存在しないこと、及び２－エトキシエチルアミン中のメチル基を表すいくつかの新しいピークを示した。この例では、付加されたラクトシルアミン基の共鳴は、コンドロイチン硫酸ピークによって不明瞭である。定量化は不可能であるが、検査により、ラクトシルアミンの添加と一致する様式でスペクトルが変化したことが明らかになる。コンドロイチン硫酸アセトアミドピークとメチルピークの積分ピーク面積の比は１００：１２であり、生成物がコンドロイチン硫酸二糖単位の１２％に２－エトキシエチルアミン置換基を含むことを示唆している。

例２５：ラットにおけるＭＲＩで定量化した膀胱透過性と組み合わせた組成物の間質性膀胱炎の治療についての評価。
ラットモデルを使用して、間質性膀胱炎（ＩＣ）の発症における主要な原因であると理解されている漏出性膀胱病理を再現する。卵巣切除（ＯＶＸ）された雌のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（２５０ｇ～３００ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入する。ラットは、温度及び湿度が制御された状態でケージあたり２匹収容される。ＯＶＸラットを使用するのは、ホルモン循環の何らかの影響を回避するため、さらに雄ラットは尿道を通してカテーテルを挿入することができないためである。すべての動物は、食物及び水を自由に摂取することができ、実験前に最低１週間、施設のハウジングに順応する。実験プロトコルは、適切な動物実験委員会によって承認される。

経尿道治療
体重２５０～３００グラムの７週齢のＯＶＸ雌ＳＡＳ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（登録商標）ラットを硫酸プロタミン（ＰＳ）で処置して、文献［Ｔｏｗｎｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ ２０１５，ｖｏｌ １９３，ｐｐ １３９４－１４００］に記載されているように漏出性膀胱を誘導する。ラットを、酸素の定常供給と共にイソフルラン（３％）で約１０分間麻酔し、膀胱を空にした後、潤滑された１８ゲージの静脈内カテーテル（Ｓｕｒｆｌｏ，Ｔｅｒｕｍｏ，Ｅｌｋｔｏｎ，ＭＤ）及び特注のガイドワイヤを使用してカテーテル処置する。カテーテルが恥骨を通過した直後にカテーテルを停止し、「ボトムアウト」させないことによって膀胱を傷つけないように注意する。膀胱外傷の指標としての血尿について動物を監視し、尿又は溶液中に血液を有するいかなる動物も使用しない。ＰＳ（４００μｌ生理食塩水中１ｍｇ／ｍｌ）をカテーテルを通して膀胱にゆっくり注入する。１５分後、下腹部圧迫を加えることによって膀胱を空にする。次いで、膀胱を生理食塩水（４００μｌ×３）ですすぎ、その後、経尿道カテーテルを取り出し、動物をそのホームケージに戻す。

膀胱及び結腸のＭＲＩ撮像
膀胱透過性を磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって評価する。ＭＲＩ実験のために、ラットを８００～１，０００ｍｌのＯ２と共に、イソフルラン（１．５％～３．０％）で麻酔する。ＭＲＩを、７テスラの３０ｃｍ口径ＢｉｏＳｐｅｃ（登録商標）ＭＲＩシステムで行う。膀胱画像の場合、インビボ診断用ＣＥ－ＭＲＩは、具体的には、膀胱内カテーテルを介して投与されるＧｄ－ＤＴＰＡ（０．２ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇを生理食塩水で８００ｍｌに希釈）を使用して、膀胱造影画像上に透過性の膀胱尿路上皮喪失を可視化する。膀胱造影画像は、３分４３秒ごとに合計２０分間取得される。結腸造影画像の場合、Ｇｄ－ＤＴＰＡ（０．２ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇを生理食塩水で２００ｍｌに希釈）を、２４ゲージの０．７５インチＢＤ ＩＮＳＹＴＥ（商標）ＡＵＴＯＧＵＡＲＤ（商標）シールド静脈内尾静脈カテーテルを介して静脈内投与する。画像を３０分間取得する。すべてのＭＲＩ画像は、Ｔ１強調ＲＡＲＥ（弛緩増強による迅速な取得）ＭＲＩパルスシーケンスを、反復時間１，２００ミリ秒、エコー時間９ミリ秒、ＲＡＲＥ係数４、アベレージ４、画像スライス厚１ｍｍ、２５６×２５６マトリックス、及びモーションを伴う６．５×６．５ｃｍ２の視野及び脂肪抑制を含む、特定のパラメータで使用して取得される。

バイオポリマー処置
本発明のバイオポリマーは、ＰＳ処置の２４時間後に漏出性膀胱に注入される。バイオポリマーを経尿道カテーテル処置によって、ＰＳ曝露の２４時間後に投与する。バイオポリマーを生理食塩水（２０ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、滅菌濾過（０．２μｍ ＰＶＤＦシリンジフィルター）した後、投与する。バイオポリマー投与は、ＭＲＩ撮像について記載された麻酔プロトコルの下で行われる。

ＭＲＩを、ＰＳ曝露の２４時間後、ポリマー処置の直後に行う。ＭＲＩを、ＰＳ曝露の５日後、バイオポリマー処置の４日後に再度行う。

データ分析及び統計
ＭＲＩシグナル強度は、画像中の関心領域（ＲＯＩ）から測定される。４つ又は５つのＲＯＩを、膀胱周辺部、結腸粘膜、膀胱周囲の脂肪体、周囲の結腸組織及び内側大腿筋の高強度領域において、対照データセットの対応する領域と共に使用することができる。これらのデータは、ＰａｒａＶｉｓｉｏｎ（商標）、バージョン５．０を使用して表示することができる。統計分析をポストチューキー多重比較検定を含むＡＮＯＶＡを使用して行い、ＩｎＳｔａｔ（ＧＲＡＰＨ－ＰＡＤ（登録商標））を使用して処置群における差を評価する。群間のシグナル強度差は、ｐ＜０．０５、＜０．０１又は＜０．００１で統計学的に有意であるとみなす。

例２６：組成物の間質性膀胱炎治療についての評価
２つの動物モデルを使用した。先に詳細に記載したラットモデルを使用して、ＳｕｐｅｒＧＡＧがＴＥＥＲ「ゴールドスタンダード」を使用して不透過性を回復させることを確認した。この同じモデルを使用して、膀胱不透過性の回復によって腹痛結果がなくなることを確認した。不透過性の回復は、本発明者らの研究室で開発された、ＭＲＩを使用するＩＣ／ＢＰＳのモデルとしてますます受け入れられているトランスジェニックマウスモデルでも確認された。マウス膀胱は、信頼性の高いＴＥＥＲ測定には小さすぎる。

午前９時（０日目）から開始して、ＯＶＸ雌Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットをイソフルラン－酸素で麻酔し、２４ｇａの静脈内カテーテル（Ｔｅｒｕｍｏ Ｍｅｄｉｃａｌ）でカテーテル処置し、４００μＬの１ｍｇ／ｍｌ硫酸プロタミンを膀胱に注入した。硫酸プロタミンのこの用量は、通常使用され、最小限の目に見える尿路上皮損傷をもたらす１／１０である。硫酸プロタミンを１０分後に取り外し、動物をケージに戻した。翌日（１日目）の午前９時から開始して、動物を再びイソフルラン－酸素で麻酔し、生理食塩水中２０ｍｇ／ｍｌのＳｕｐｅｒＧＡＧ ４００μｌ又は対照として生理食塩水単独のいずれかを注入した。ＣＳは臨床的に使用されるので、比較のために、動物のセットに４００μｌの２０ｍｇ／ｍｌ ＣＳを注入した。膀胱壁との相互作用はＧＡＧ鎖上の負電荷によって静電的である可能性が高いので、等しい重量のＳｕｐｅｒＧＡＧ及びＣＳを比較した。午後１２時に開始して、ラットを安楽死させ、膀胱を単離した。尿路上皮上にクランプされた小さなチャンバーを使用して、膀胱を開き、尿路上皮を上に向けて全体をマウントした。電位差（ＰＤ）及び短絡電流（Ｉｓｃ）の電気生理学的変数を測定して、前述のように膀胱及び結腸の両方でＴＥＥＲを評価した。偽処置動物に、硫酸プロタミン又はＳｕｐｅｒＧＡＧ／ＣＳの代わりに生理食塩水を注入して、カテーテル損傷のアーチファクトを説明した。

膀胱感受性を、ラットモデルの恥骨上領域に適用されたｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを使用して評価した。雌ＯＶＸラットに硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）を膀胱内注入し、２４時間後にｉ）ビヒクル、ｉｉ）ＣＳ（２０ｍｇ／ｍｌ）又はｉｉｉ）ＳｕｐｅｒＧＡＧ（２０ｍｇ／ｍｌ）で処置した。対照は、硫酸プロタミン又は任意の処置の代わりに偽点滴注入を受けた動物からなった。３時間後に膀胱感受性を評価した。各ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを１０回の適用のために１～２秒間適用した。フィラメントを最低から最高の力まで試験した。腹部の急激な収縮、即座のリッキング又はグルーミング又は跳躍は、陽性反応とみなされた。

ＵＲＯ－ＭＣＰ－１トランスジェニックモデルは前に記載した。透過性を伴う膀胱炎を、１００μｌの生理食塩水中の１μｇのＬＰＳの準侵害用量でのＬＰＳの膀胱内投与によって誘導した（０日目、午前９時）。一つの対照群には、生理食塩水（１００μｌ）のみを投与した（生理食塩水ＵＲＯ－ＭＣＰ－１）。野生型（ＷＴ）マウスからなる別の対照群にも生理食塩水のみを投与した（生理食塩水－ＷＴ）。ＬＰＳ注射の１時間後に過剰なＬＰＳを除去するために、膀胱を生理食塩水で３回洗浄した。翌日（１日目、午前９時）、動物をＣＳ又はＳｕｐｅｒＧＡＧ（生理食塩水中２０ｍｇ／ｍｌ；１００μｌ）又は生理食塩水で処置し、初期透過性を３時間後に評価した（１日目、午後１２：００）。

透過性のＭＲＩ評価のために、マウスを麻酔し、上記のように処置したが、マウスを安楽死させる代わりに、１日目、３日目及び５日目にマウスを麻酔し、造影剤Ｇｄ－ＤＴＰＡを注入し、ＭＲＩ器具に入れた。ＭＲＩ実験を、７テスラの３０ｃｍ口径Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ ＭＲＩシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ、米国）で行った。ＬＰＳ注入の１、３及び５日後にＭＲＩスキャンを得た。膀胱画像では、膀胱尿路上皮の透過性喪失を可視化するために、Ｇｄ－ＤＴＰＡ（生理食塩水で１００μｌに希釈した０．０３４ｍＭ Ｇｄ－ＤＴＰＡ）を膀胱内カテーテルを通して投与した。膀胱ＣＥ－ＭＲＩシグナル強度変化を、コントラスト後７分測定した。すべてのＭＲ画像について、Ｔ１強調ＲＡＲＥ（弛緩増強による迅速な取得）ＭＲＩパルスシーケンスを以下のパラメータ：反復時間（ＴＲ）１２００ｍｓ、エコー時間（ＴＥ）９ｍｓ、ＲＡＲＥ係数４、アベレージ４、画像スライス厚１ｍｍ、マトリックス２５６×２５６、視野（ＦＯＶ）３．５×３．５ｃｍ２、ならびにモーション及び脂肪抑制の両方を用いて使用した。動物を安楽死させ、組織病理学のために膀胱をホルマリンに入れた。

ＭＲＩシグナル強度を、Ｐａｒａｖｉｓｉｏｎ（ｖ ５．０、Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ）に表示された画像内の関心領域（ＲＯＩ）から測定した（膀胱周辺の高強度領域で、生理食塩水対照動物データセットの対応する領域と共に４～５つのＲＯＩを撮影した）。

ＳｕｐｅｒＧＡＧ注入は、硫酸プロタミンラットモデルにおける膀胱不透過性の回復においてビヒクル対照よりも効果的であった。バイオポリマーによる処置の３時間後に行った硫酸プロタミン－ラットモデルからの切除膀胱膜のＴＥＥＲ測定（括弧内は１群あたりのラット数）。偽処置対照は、ＴＥＥＲ＝２５００±２４９Ωｃｍを示した。不透過性の回復は疼痛応答を低減する。ＯＶＸ雌ラットに１ｍｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを膀胱内注入し、２４時間後にビヒクル、ＣＳ（２０ｍｇ／ｍｌ）又はＳｕｐｅｒＧＡＧ－１（２０ｍｇ／ｍｌ）で処置した。対照は、硫酸プロタミン又は任意の処置、又はビヒクルが後に続く硫酸プロタミンの代わりに疑似注入を受けた動物からなった。３時間後、膀胱感受性を、恥骨上領域に適用されたｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを使用して評価した。各フィラメントを１０回の適用のために１～２秒間適用した。フィラメントを最低から最高の力まで試験した。腹部の急激な収縮、即座のリッキング又はグルーミング又は跳躍は、陽性反応とみなされた。中程度の圧迫（２～４ｇ）では、ＳｕｐｅｒＧＡＧは疼痛応答を半分以上低減し、ＣＳよりも疼痛緩和に有効であった。より高い力（１５ｇ）では、圧迫は膀胱以外の臓器に影響を及ぼした可能性が高く、緩和効果を圧倒した。

ＳｕｐｅｒＧＡＧは、対照と比較して、ＵＲＯ－ＭＣＰ－１ ＩＣマウスモデルの膀胱透過性を改善した。生理食塩水処置ＵＲＯ－ＭＣＰ－１マウスと比較したＬＰＳ処置ＵＲＯ－ＭＣＰ－１マウス（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、又は生理食塩水処置ＷＴマウスと比較したＬＰＳ処置ＵＲＯ－ＭＣＰ－１マウス（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）において、ＭＲＩシグナル強度のパーセント変化に有意な増加があった。ＳｕｐｅｒＧＡＧは、間質性膀胱炎のＵＲＯＭＣＰ－１モデルにおいて増加した膀胱透過性をほぼ正常なレベルまで回復させた。ＳｕｐｅｒＧＡＧ及びＣＳモノマーを、臨床的に使用される用量でもある（２０ｍｇ／ｍｌ）で等量のＣＳに滴下した。ＳｕｐｅｒＧＡＧ又はＣＳ投与ＬＰＳ処置ＵＲＯＭＣＰ－１マウスでは、ＬＰＳ処置ＵＲＯ－ＭＣＰ－１マウスと比較して、ＭＲＩシグナル強度（ＳＩ）のパーセント変化において有意な減少があった（＊１日目の両方についてｐ＜０．０５；＊＊＊３日目の両方についてｐ＜０．０００１）。ＳｕｐｅｒＧＡＧ ＬＰＳ ＵＲＯ－ＭＣＰ－１マウスのみが、ＬＰＳ ＵＲＯ－ＭＣＰ－１マウスと比較して、５日目のＭＲＩ ＳＩの変化％を有意に減少させた（＊＊ｐ＜０．０１）。

データは、ＵＲＯ－ＭＣＰ１トランスジェニックマウスモデルを用い、ＣＥ－ＭＲＩを使用して透過性を評価すると、ＳｕｐｅｒＧＡＧが膀胱透過性を正常値に回復させることを実証している。生理食塩水処置ＵＲＯ－ＭＣＰ１マウス又は野生型マウスのいずれについて、準侵害用量のＬＰＳは膀胱透過性を誘導するのに対し、生理食塩水の注入は、誘導しない。代表的な膀胱の画像、対照、生理食塩水処置ＵＲＯ－ＭＣＰ１、硫酸プロタミン処置及び生理食塩水処置野生型マウス。ラット硫酸プロタミンモデルでは正常対照値が高い（２５００Ωｃｍ２）のに対して、マウスＬＰＳモデルでは、透過性をＣＥ－ＭＲＩで直接評価し、正常値は低いことに留意されたい。マウスモデルの場合、対照とは、透過性を誘導する処置を行った後、不透過性を回復させる薬剤の代わりにビヒクルを投与して得られた値をいう。ＬＰＳのみ（対照－ＰＰＳ）、ＳｕｐｅｒＧＡＧ（Ｓ－ＧＡＧ）又はＣＳのいずれかで処置した同じマウスの１、３及び５日目の反復測定によって決定された経時変化。ＳｕｐｅｒＧＡＧ ｐｒｅｐとＣＳとの比較における小さな効果サイズは、統計学的有意性を試験するために、はるかに大きな試料サイズを必要とする。それにもかかわらず、データは、ＣＳが対照と有意差がなかったのに対して、ＳｕｐｅｒＧＡＧが対照よりも有意に低かったので、特に治療後５日目にＳｕｐｅｒＧＡＧがＣＳよりも有効であることを示している。

同等物
本開示はその詳細な説明と併せて説明されてきたが、前述の説明は例示を意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。

本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用されるすべての米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書で引用されるすべての公開された外国特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される他のすべての公開された参考文献、文書、原稿及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (23)

1. 水溶性硫酸化ＧＡＧコンジュゲートを調製する方法であって、
   ｉ）２ｗｔ％～２０ｗｔ％濃度の水溶液中の硫酸化ＧＡＧを有効量の連結剤、例えば二官能リンカーと接触させる工程であって、ＧＡＧヒドロキシ基対連結剤のモル比が、連結剤が硫酸化ＧＡＧと反応して、ペンダント連結基を特徴とする可溶性ポリマーを含む溶液を形成するのに十分な条件下で、ゲル形成に必要とされるものよりも小さい、上記工程；
   ｉｉ）追加の硫酸化ＧＡＧを工程（ｉ）の溶液に、ペンダント連結基の一部と反応して、残存するペンダント連結基を特徴とするボトルブラシ様構造を有する可溶性ポリマーコンジュゲートを形成するのに十分な量で添加する工程；及び
   ｉｉｉ）反応性部分を特徴とする修飾因子を、残存するペンダント連結基が反応性修飾因子と反応して、修飾因子を有する水溶性硫酸化ＧＡＧボトルブラシ様コンジュゲートを形成するのに十分な条件下で添加する工程
   を含む上記方法。
2. 工程ｉ）の生成物が実質的に直鎖構造を有する、請求項１記載の方法。
3. 工程－ｉｉｉの硫酸化ＧＡＧコンジュゲート生成物が、１００，０００Ｄａ～５，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１又は２記載の方法。
4. 工程－ｉの硫酸化ＧＡＧが、約１，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、又はこれらの数字のいずれか２つを含む範囲、好ましくは５，０００Ｄａ～３０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
5. 工程ｉ）の溶液中に存在するＧＡＧヒドロキシル基当量の、連結剤（ｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）のモルに対する比が０．８～４．０である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
6. 工程ｉ）の硫酸化ＧＡＧが、工程ｉｉ）で添加されたものと同一である、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
7. ペンダント反応性基がビニルである、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
8. 連結剤がジビニルスルホンである、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
9. プロトンＮＭＲによって測定した場合、ペンダント反応性基が、工程ｉｉ）で形成された可溶性ポリマー中に二糖反復単位の２％～３０％で存在する、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
10. 工程ｉ及びｉｉで添加される硫酸化ＧＡＧの総量が、１５／８５～８０／２０、好ましくは２０／８０～４０／６０の比で配分される、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
11. 工程ｉｉｉで導入される修飾因子の反応性部分がアミンである、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
12. 修飾因子が標的化部分を含む、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法。
13. 修飾因子がラクトシルアミンである、請求項１～１２のいずれか一項記載の方法。
14. 修飾因子が、ｉｎ ｓｉｔｕで哺乳動物組織と共有結合を形成する部分を含む、請求項１～１３のいずれか一項記載の方法。
15. 修飾因子が疎水性部分を含む、請求項１～１４のいずれか一項記載の方法。
16. 請求項１～１５のいずれか一項記載の方法で生成されたポリマーコンジュゲートであって、複数の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ポリマー鎖を含み、各硫酸化ＧＡＧポリマー鎖が、連結剤に由来するリンカーを介して１つ又は複数の硫酸化ＧＡＧポリマー鎖に連結されており、かつポリマーコンジュゲートが水溶液に可溶性であり、及び個々の非連結硫酸化ＧＡＧの３倍～３００倍の分子量を有する、ポリマーコンジュゲート。
17. 請求項１６に記載のポリマーコンジュゲートを軟組織に投与することを含む、軟組織を治療する方法。
18. 軟組織及び／又はその状態が、皮膚、顔面しわ（ｒｈｙｔｉｄｓ）（しわ）、瘢痕、創傷、熱傷（ｂｕｍ）、皮膚潰瘍、皮膚がんの切除、血管状態、末梢性動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、静脈疾患、血管損傷、不適切な血管発生、声帯、筋肉、結合組織、腱、靭帯、歯周靭帯、前十字靭帯、臓器、筋膜、膀胱、腸、骨盤底、筋骨格系の軟組織、脊椎の軟組織、椎間板、脊椎関節、椎間（ｚｙｇａｐｏｐｈｙｓｉｃａｌ）関節（ファセット）、肋椎関節、仙腸関節、仙椎関節及び環軸関節から選択される、請求項１７記載の方法。
19. 軟組織が、椎間板、皮膚、心臓弁、関節軟骨、軟骨、半月板、脂肪組織、頭蓋顔面、眼、腱、靭帯、筋膜、線維組織、滑膜、筋肉、神経、血管、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
20. 軟組織が、哺乳動物における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解に関連する疾患、障害又は状態について治療される、請求項１７記載の方法。
21. 請求項１６に記載のポリマーコンジュゲートを患者の膀胱に投与することを含む、間質性膀胱炎を治療する方法。
22. 請求項１６に記載のポリマーコンジュゲートを患者の創傷に投与することを含む、創傷を治療する方法。
23. 請求項１６に記載のポリマーコンジュゲートを患者の軟組織に投与することを含む、軟組織を再生する方法。
    

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