CN101631552A - 双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂在制备药物组合物中的用途 - Google Patents
双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂在制备药物组合物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂在具有抗动脉粥样硬化和抗局部缺血作用的药物组合物制备中的用途，并且涉及它们在动脉粥样硬化和局部缺血性(例如心脏)疾病的预防和治疗方法中的用途。本发明还涉及能够鉴定双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂的筛选方法。
Description
本发明涉及双糖链蛋白聚糖(biglycan)或双糖链蛋白聚糖活性增强剂在制备具有抗动脉粥样硬化和抗局部缺血作用的药物组合物中的用途，并且涉及它们在动脉粥样硬化和局部缺血性(例如心脏)疾病的预防和治疗方法中的用途。本发明还涉及能够鉴定双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂的筛选方法。
发明背景
双糖链蛋白聚糖及其在心血管系统中的作用
双糖链蛋白聚糖是亮氨酸富集的小分子蛋白聚糖(SLRP)家族的成员，其特征是存在重复的亮氨酸富集氨基酸基序[Fisher，L.W.，Termine，J.D.，和Young，M.F.：Deduced protein sequence of bone small proteoglycan I(biglycan)shows homology with proteoglycan II(decorin)and severalnonconnective tissue proteins in a variety of species.J.Biol.Chem.264，4571-4576(1989)]。
最近的结果显示，蛋白聚糖不仅是细胞外基质的刚性组分，而且在胶原的沉积、细胞因子与生长因子的活化和失活中发挥重要作用。关于双糖链蛋白聚糖的药物应用，应当提到美国专利申请号20050059580公开了双糖链蛋白聚糖可应用于与异常营养不良相关蛋白质复合物(DAPC)相关的病症、特别是肌营养不良的治疗和预防方法中。
在我们体内几乎每个组织中均已发现双糖链蛋白聚糖，但是它在器官中不是均匀分布的。双糖链蛋白聚糖已显示在细胞表面、细胞周围和细胞外基质中表达[Bianco P.，Fisher，L.W.，Young，M.F.，Termine，J.D.和Gehron Robey，P.：Expression and localization of the two smallproteoglycans biglycan and decorin in developing human skeletal andnon-skeletal tissues.J.Histochem.Cytochem.38，1549-1568(1990)；Wadhwa S，Embree MC，Bi Y，Young M：Regulation，regulatory activities，and function of biglycan.Crit Rev Eukaryot Gene Expr.2004；14(4)：301-315.]。其表达模式在不同的病理学条件中有变化。
双糖链蛋白聚糖表达由转录机制和非转录机制调节。双糖链蛋白聚糖的功能依赖于其微环境，因此取决于所研究的组织和病理学。在心血管系统中，双糖链蛋白聚糖可在动脉粥样硬化中发挥关键作用[Fedarko，N.S.，Termine，J.D.，Young，M.F.和Robey，P.G.：Temporal regulation ofhyaluronan and proteoglycan metabolism by human bone-cells invitro.J.Biol.Chem.265，12200-12209(1990)；Klezovitch，O.和Scanu，A.M.：Domains of Apolipoprotein E Involved in the Binding to the Protein Coreof biglycan of the Vascular Extracellular Matrix：Potential Relationshipbetween Retention and Anti-Atherogenic Properties of this Apolipoprotein.Trends Cardiovasc.Med.11，263-268(2001)]。心脏中双糖链蛋白聚糖的表达是遍在的，在心瓣(heart leaflet)的中心层具有结实的丝状链[Latif，N.，Sarathchandra，P.，Taylor，P.M.，Antoniw，J.和Yacoub，M.H.：Localization and pattern of expression of extracellular matrix componentsin human heart valves.J.Heart Valve Dis.14，542-548(2005)]。
已经证明不同的蛋白聚糖(PG)类型以可变的量存在于主动脉层中，在那里它们参与(保持)主动脉壁的结构完整性以及若干种生物功能，例如脂蛋白氧化和凝血[Wight，T.N.，Kinsella，M.G.和Qwarnstrom，E.E.：Therole of proteoglycans in cell adhesion，migration and proliferation.Curr.Op.Cell Biol.4，793-801(1992)以及Camejo，G.，Hurt-Camejo，E.，Wiklund，O.和Bondjers，G.：Association of apo B lipoproteins with arterialproteoglycans：Pathological significance and molecular basis.Atherosclerosis 139，205-222(1998)]。
在动脉血管中，平滑肌细胞合成双糖链蛋白聚糖。血管中动脉粥样硬化斑块的形成与双糖链蛋白聚糖表达的提高相关[Riessen，R.，Isner，J.M.，Blessing，E.，Loushin，C，Nikol，S.和Wight，T.N.：Regional differences inthe distribution of the proteoglycans biglycan and decorin in theextracellular matrix of atherosclerotic and restenotic human coronaryarteries.Am.J.Pathol.144，962-974(1994)]。TGF-β被鉴定为双糖链蛋白聚糖表达的正调节物[Breuer，B.，Schmidt，G.和Kresse，H.：Non-uniforminfluence of transforming growth factor-beta on the biosynthesis ofdifferent forms of small chondroitin sulphate/dermatan sulphateproteoglycan.Biochem.J.269，551-554(1990)]。
损伤前(prelesional)动脉中异常的机械应激通过TGF-β调节导致双糖链蛋白聚糖表达提高。与动脉粥样硬化斑块相关的因素也显示引起双糖链蛋白聚糖表达的提高[Chang，M.Y.，Tsoi，C.，Wight，T.N.和Chait，A.：Lysophosphatidylcholine Regulates Synthesis of biglycan and theProteoglycan Form of Macrophage Colony Stimulating Factor.ArteriosclerThromb Vase Biol 23，809-815(2003)]。
根据上述文章(见Fedarko等人、Klezovitch等人、Riessen等人和Chang等人)，技术人员应当得出结论：双糖链蛋白聚糖水平的提高应当促进动脉粥样硬化斑块的形成，即其在该病症中应显示负作用。
最近有研究显示双糖链蛋白聚糖的表达被炎症介质一氧化氮(NO)下调[Schaefer，L.，Beck，K.F.，Raslik，I.，Walpen，S.，Mihalik，D.，Micegova，M.，Macakova，K.，Schonherr.E.及其他：biglycan，a Nitric Oxide-regulatedGene，Affects Adhesion，Growth，and Survival of Mesangial Cells.J.Biol.Chem.278，26227-26237(2003)]。NO由于其血管舒张、抗氧化、抗血小板和抗中性白细胞的作用而成为重要的心脏保护分子，并且对正常的心脏功能是必需的[Ferdinandy，P.和Schulz，R.：Nitric oxide，superoxide，andperoxynitrite in myocardial ischaemia-reperfusion injury andpreconditioning.Br.J.Pharmacol.138，532-543(2003)]。NO在体内由一组三种NO合酶(NOS)生产：神经元同工型(nNOS)、诱导型同工型(iNOS)和内皮同工型(eNOS)。所有三种NOS同工型均存在于人心脏中。与组成型表达的NOS同工型(nNOS和eNOS)不同，iNOS主要在转录水平上被调节。通常在任何细胞类型中都只有很少(如果有的话)可检测的iNOS表达。然而，响应炎症细胞因子或内毒素时，几乎在每种有核细胞类型中iNOS的mRNA和蛋白质均大幅上调[Nathan，C：Inducible nitric oxidesynthase：What difference does it make？J.Clin.Invest 100，2417-2423(1997)]。
对iNOS表达的诱导通过细胞因子诱导的转录因子例如IFN调节因子1和NF-κB介导，所述转录因子可直接结合iNOS启动子内的特异序列元件[Kamijo R，Harada H，Matsujama T，Bosland M，Gerecitano J，ShapiroD，Le J，Koh SI及其他：Requirement for transcription factor IRF-1 in NOsynthase induction in macrophages.Scienee 263，1612-1615(1994)；Xie，Q.W.，Cho，H.，Kashiwabara，Y.，Baum，M.，Weidner，J.R.，Elliston，K.，Mumford，R.和Nathan，C：Carboxyl terminus of inducible nitric oxidesynthase.Contribution to NADPH binding and enzymatic actiVity.J.Biol.Chem.269，28500-28505(1994)]。
eNOS和nNOS的NO生产是搏动和钙依赖性的(NOS活化需要钙/钙调蛋白复合物)，而iNOS的NO生产是连续的并且不依赖于钙[Blatter，L.A.，Taha，Z.，Mesaros，S.，Shacklock，P.S.，Wier，W.G.和Malinski，T.：Simultaneous Measurements of Ca2+and Nitric Oxide inBradykinin-Stimulated Vascular Endothelial Cells.Circ Res 76，922-924(1995)]。最近显示在巨噬细胞中，双糖链蛋白聚糖发挥促炎蛋白质的作用，通过p38、ERK和NF-κB活化TNF-α和巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)[Schaefer，L.，Babelova，A.，Kiss，E.，Hausser，H.J.，Baliova，M.，Krzyzankova，M.，Marsche，G.，Young，M.F.及其他：The matrixcomponent biglycan is proinflammatory and signals through Toll-likereceptors 4 and 2 in macrophages.J.Clin.Invest.115，2223-2233(2005)]。
我们的目标是研究双糖链蛋白聚糖在细胞信号转导中的作用，特别是研究血管和心脏中NO介导的机制。
此处应当强调，在说明书的一些其他部分中，措辞“双糖链蛋白聚糖”以更宽泛的含义使用，见“术语的定义”部分。
局部缺血性心脏病和心脏保护：高脂血症的作用
局部缺血性心脏病是工业化世界中主要的死因。该病症的治疗进入了一个新的时期，其中可通过允许血流快速返回心肌膜局部缺血区的步骤(即再灌注疗法)将死亡率大致折半。
然而，再灌注可导致其他并发症，例如降低的心脏收缩功能(抑顿)和心律失常。另外，存在下述实验证据：再灌注可增强导致坏死和细胞凋亡的不可逆的细胞损伤。因此，开发抗局部缺血(当抗局部缺血治疗保护心脏组织免受局部缺血/再灌注损伤时，抗局部缺血作用被称作心脏保护性作用)物质从而改进心肌功能、降低心律失常的发病率、延迟坏死的发生和限制局部缺血/再灌注期间的总梗死形成程度具有巨大的临床重要性。
较早的减轻局部缺血/再灌注损伤后果的药理学途径的实验效能有限或不能转化为有用的临床治疗。然而，最近显示心脏具有可观的适应局部缺血/再灌注胁迫的能力，并且局部缺血/再灌注中心脏的这种分子可塑性成为密集研究的焦点，人们希望对其根本的机制可予以治疗性利用。局部缺血性预适应(preconditioning)是一种被充分描述的适应性应答，其中短暂地进行局部缺血能可观地增强心脏耐受随后的局部缺血性损伤的能力[见综述：Przyklenk K，Kloner RA.Ischemic preconditioning：exploring theparadox.Prog.Cardiovasc.Dis.40(6)：517-47(1998)]。
另外，在较长时间局部缺血后应用的局部缺血/再灌注的短暂循环也赋予(心脏)针对心肌局部缺血/再灌注后果的心脏保护，这是称作局部缺血后适应(postconditioning)的现象。这两种主要形式的内源抗局部缺血的、心脏保护机制的发现鼓励人们开发新途径来保护局部缺血/再灌注的心肌膜，并且扩展了我们对局部缺血/再灌注期间损伤和存活的分子基础的知识[见综述：Baxter GF，Ferdinandy P.Delayed preconditioning ofmyocardium：current perspectives.Basic Res.Cardiol.96：329-44(2001)]。心脏能够适应局部缺血胁迫的机制是相当复杂的，然而，一氧化氮(NO)似乎有着重要的作用[见综述：Ferdinandy P，Schulz R.Nitric oxide，superoxide，and peroxynitrite in myocardial ischemia-reperfusion injuryand preconditioning.Br.J.Pharmacol.138：532-543(2003)]。
尽管人的局部缺血性心脏病是由其他系统性疾病和病症引起或与之相关的复杂病症，但是对心脏保护的大部分实验研究已经在幼年动物模型中进行，其中在不存在其他疾病过程和心血管疾病风险因素时施加局部缺血/再灌注。局部缺血性心脏病由大量病原学风险因素引起，并且总是与其他疾病状态共存。这些疾病状态包括系统性高血压和相关的左心室肥大、高脂血症和动脉粥样硬化、糖尿病和胰岛素抗性、心力衰竭和衰老。这些系统性疾病和衰老对心脏产生多种生物化学作用，所述作用能够潜在地影响局部缺血/再灌注损伤自身的产生，并且干扰对于抗局部缺血、心脏保护措施的应答。
因此，我们已展示高脂血症同样导致人类中预适应作用的丧失[Ungi I.，Ungi T.，Ruzsa Z.，Nagy E.，Zimmermann Z.，Csont T.，Ferdinandy P.Hypercholesterolemia attenuates the anti-ischemic effect ofpreconditioning during coronary angioplasty.Chest 128：1623-1628(2005)]。因此，开发保护局部缺血性心脏的合理治疗途径需要下述临床前研究，所述临床前研究检查与并发疾病状态和风险因素(例如高脂血症)特异性相关的心脏保护。高脂血症对胁迫适应机制的心脏保护作用的干扰机制包括由于自由基(包括过氧亚硝酸盐)形成提高而破坏NO依赖性途径[见综述Ferdinandy P.，Szilvassy Z.，Baxter GF.Adaptation tomyocardial stress in disease states：is preconditioning a healthy heartphenomenon？Trends Pharmacol.Sci.19：223-9(1998)；Ferdinandy P.Myocardial ischaemia/reperfusion injury and preconditioning：effects ofhypercholesterolaemia/hyperlipidaemia.Br.J.Pharmacol.138：283-5(2003)；Ferdinandy P，Schuiz R，Baxter GF.Interaction of cardiovascularrisk factors with myocardial ischemia/reperfusion injury，preconditioningand postconditioning.Pharmacol Rev 59：418-458(2007)；及见上文]。
我们先前已经展示高脂血症导致过氧亚硝酸盐形成增加和轻微的收缩功能障碍，其特征是左心室舒张末期压的提高[Onody A.，Csonka C，GiriczZ.，Ferdinandy P.Hyperlipidemia induced by a cholesterol-rich diet leadsto enhanced peroxynitrite formation in rat hearts.Cardiovasc.Res.58：663-70(2003)]。Ahmed等人已经显示，与进行假手术的大鼠相比，在大鼠心肌梗死模型中，心力衰竭大鼠的左心室和右心室的非局部缺血组织中心肌双糖链蛋白聚糖mRNA水平均显著提高。他们提出，双糖链蛋白聚糖表达与心肌梗死后的局部缺血性心力衰竭相关，并且提出对双糖链蛋白聚糖基因表达进行药理学抑制具有有益作用[Ahmed MS.，Oie E.，VingeLE.，Yndestad A.，Andersen G.GO.，Andersson Y.，Attramadal T.，Attramadal H.：Induction of myocardial biglycan in heart failure in rats-an extracellular matrix component targeted by AT(1)receptor antagonism.Cardiovasc.Res.60：557-568(2003)]。
另一研究提出，心肌梗死后提高的双糖链蛋白聚糖表达与愈合过程期间的心脏纤维化相关，但是未提出双糖链蛋白聚糖和心脏保护的关系。另外，在该研究中提高的双糖链蛋白聚糖表达可能与梗死形成后心脏收缩功能障碍相关[Yamamoto，K.，Kusachi，S.，Ninomiya，Y.，Murakami，M.，Doi，M.，Takeda，K.，Shinji，T.，Higashi，T.及其他：Increase in the Expression ofbiglycan mRNA Expression Co-localized Closely with that of Type ICollagen mRNA in the Infarct Zone After Experimentally-InducedMyocardial Infarction in Rats.J.MoI.Cell.Cardiol.30，1749-1756(1998)]。
此处我们要强调，以这些相关的现有技术为基础，技术人员应当得出下述结论：双糖链蛋白聚糖的水平提高应当促进与急性心肌梗死相关的心脏功能障碍，即它应当在该病症中发挥负作用。
本发明的发明人的目标是进一步研究双糖链蛋白聚糖对动脉粥样硬化疾病和对心脏功能障碍的作用，特别是对动脉粥样硬化斑块形成和局部缺血性再灌注损伤的作用，所述作用通过存在或不存在高脂血症时的梗塞大小进行测量。
发明内容
目前，令人吃惊地发现，双糖链蛋白聚糖(见“术语的定义”部分)显示有效的抗动脉粥样硬化和抗局部缺血(例如心脏保护)作用。另外，根据我们的实验，这些作用与高脂血症存在或不存在相独立。
根据我们在下文描述的实验，我们发现双糖链蛋白聚糖在心脏重塑中具有重要的作用，并且介导心脏保护。另外，根据结果可以推测，双糖链蛋白聚糖的添加会预防和治疗细胞由于缺氧/局部缺血和再灌注/再充氧而诱导的任何损伤，这些损伤的治疗由术语抗局部缺血治疗涵盖。
我们的目标是在靶组织或器官中、优选在心脏中增强双糖链蛋白聚糖的活性，特别是通过提高双糖链蛋白聚糖的局部水平和/或通过增强剂(见“术语的定义”部分)提高双糖链蛋白聚糖的比活性来实现。这可通过以下方法之一实现：
a)提高靶组织或器官中的双糖链蛋白聚糖表达；
b)通过以下方法向靶组织或器官中引入外源双糖链蛋白聚糖基因或蛋白质：
i)基因疗法：向靶组织或器官中递送重组DNA，所述重组DNA为裸DNA或包埋在脂质体中或包装在腺病毒、逆转录病毒或杆状病毒中；
ii)体细胞疗法：引入过表达双糖链蛋白聚糖的成肌细胞；
iii)干细胞疗法：引入过表达双糖链蛋白聚糖蛋白质的造血干细胞或胚胎干细胞(ES)；
iv)向靶组织或器官中递送重组的双糖链蛋白聚糖蛋白质，所述蛋白质在哺乳动物细胞中体外生产或从哺乳动物组织中纯化(例如来自关节软骨)。
因此，本发明涉及以下主题：
1.双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂作为活性成分在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗动脉粥样硬化和/或局部缺血性(例如心脏)疾病。
2.在预防或治疗动脉粥样硬化和/或局部缺血性(例如心脏)疾病时用作活性成分的双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂。
3.双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂在动脉粥样硬化和/或局部缺血性(例如心脏)疾病的预防或治疗中作为活性成分的用途。
4.在有需要的哺乳动物中预防或治疗动脉粥样硬化和/或局部缺血性(例如心脏)疾病的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效量作为活性成分的双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂。
5.根据上述项目1到4中任一项的用途或产品或方法，其中活性成分选自：双糖链蛋白聚糖(优选核心蛋白聚糖)、双糖链蛋白聚糖的诱导剂或活化剂、含有编码双糖链蛋白聚糖的核酸的递送体系、以及编码双糖链蛋白聚糖的核酸(裸核酸)。
6.根据上述项目5的用途或产品或方法，其中活性成分是内源(天然)双糖链蛋白聚糖过表达的活化剂或诱导剂。
7.根据项目6的用途或产品或方法，其中内源(天然)双糖链蛋白聚糖的过表达由小分子活化，优选由寡肽或多肽或水杨酸钠或氧固醇(oxysterol)或溶血脂质(lysolipid)活化。
8.根据上述项目5的用途或产品或方法，其中活性成分是含有编码双糖链蛋白聚糖的核酸的基因递送体系，其中所述基因递送体系确保双糖链蛋白聚糖的重组过表达，优选通过基因或细胞(包括体细胞和胚胎干细胞)治疗技术确保双糖链蛋白聚糖的重组过表达。
9.根据上述项目1到8中任一项的用途或产品或方法，其中在旁路手术、优选冠状动脉旁路手术的情况下，在植入之前将活性成分离体掺入自体移植物中。
10.根据上述项目1到9中任一项的用途或产品或方法，其中抗局部缺血性疾病是急性或慢性的局部缺血性心脏病，并且在存在或不存在高脂血症时发挥心脏保护作用。
11.根据项目10的用途或产品或方法，其中急性或慢性局部缺血性心脏病选自：存在或不存在高脂血症时的急性心肌局部缺血、稳定或不稳定的心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、心脏手术引起的心肌局部缺血。
12.根据上述项目1到9中任一项的用途或产品或方法，其中针对下述疾病发挥所述抗动脉粥样硬化作用，所述疾病与任何动脉粥样硬化斑块的形成相关联，例如冠状动脉硬化、颈动脉硬化、外周动脉硬化。
另外，本发明涉及能够鉴定引起双糖链蛋白聚糖活性提高的这类双糖链蛋白聚糖活性增强剂的筛选方法。因此，本发明还涉及以下主题：
13.用于鉴定发挥抗动脉粥样硬化和/或抗局部缺血(例如心脏保护)作用的双糖链蛋白聚糖活性增强剂的方法，特征是：
a)在适合双糖链蛋白聚糖在基础细胞中表达的条件下，将候选增强剂与所述基础细胞接触；
b)检测所述基础细胞中对双糖链蛋白聚糖的抗动脉粥样硬化和/或抗局部缺血(例如心脏保护)作用特异的基因或蛋白质的表达水平和/或活性；
c)将检测的表达和/或活性水平与
-未应用候选物的基础细胞中获得的参照水平，和/或
-过表达双糖链蛋白聚糖的其他细胞中获得的参照水平
进行比较，其中与基础细胞中和/或过表达的其他细胞中定义的参照水平相比，认为所述特异基因或蛋白质的增强的水平或活性表明下述事实：各自的候选物是发挥抗动脉粥样硬化和/或抗局部缺血(例如心脏保护)作用的双糖链蛋白聚糖活性增强剂。
14.根据项目13的方法，其中体外检测双糖链蛋白聚糖表达，优选通过使用双糖链蛋白聚糖启动子-EGFP构建体进行检测。
15.根据项目13或14的方法，其中在步骤b)中检测蛋白质水平，并且步骤c)的参照水平来自于过表达双糖链蛋白聚糖的细胞。
16.根据项目15的方法，其中所述检测为对双糖链蛋白聚糖的抗动脉粥样硬化和/或抗局部缺血(例如心脏保护)作用特异的蛋白质选自：i-NOS、n-NOS、e-NOS、突触结合蛋白、Mcl-1和Pyk2。
17.根据项目16的方法，其中所述参照水平通过Panorama Ab微阵列细胞信号转导试剂盒(Sigma，CSAA1)鉴定。
在本发明的另一实施方案中，双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂可用作细胞或组织培养物的补剂和用于在移植前储存器官的溶液的补剂。任何细胞类型均可受益于这些补剂。因此，本发明还涉及以下主题：
18.细胞或组织培养物的补剂或用于在移植前储存器官的溶液的补剂，所述补剂与已知的辅料(auxilieries)一起包含双糖链蛋白聚糖(优选核心蛋白聚糖)或双糖链蛋白聚糖活性增强剂。
19.根据项目18的补剂，其中双糖链蛋白聚糖活性增强剂选自：双糖链蛋白聚糖表达的诱导剂或活化剂、含有编码双糖链蛋白聚糖的核酸(基因)的递送体系、和编码双糖链蛋白聚糖的核酸(裸核酸)。
术语“已知的辅料”包括细胞或组织培养物补剂制备中或用于在移植前储存器官的溶液的补剂制备中通常应用的载体、添加剂、溶液和其他已知成分。
发明详述
上述可应用性是以我们的实验结果为基础的，所述实验结果证明提高的双糖链蛋白聚糖活性(优选其来自于提高的双糖链蛋白聚糖水平)在与任何的动脉粥样硬化斑块形成相关联的动脉粥样硬化疾病(如冠状动脉硬化、颈动脉硬化、外周动脉硬化)中和局部缺血性疾病例如心脏疾病中具有有效的预防和/或治疗作用，所述心脏疾病如急性局部缺血性心脏病，如急性心肌局部缺血和/或不稳定心绞痛和/或心肌梗死、和/或涉及心肌局部缺血的心脏手术操作。另外，该心脏保护作用涉及梗塞大小的减小、梗塞后心肌功能的改进和/或高脂血症诱导的心脏功能障碍的改进。上述作用在存在或不存在高脂血症时发生。
以发现的抗局部缺血作用为基础，本发明可用于与局部缺血胁迫相关的一些其他疾病(局部缺血性疾病)的情况，所述疾病例如局部缺血性中风，局部缺血性肾损伤、肝损伤、皮肤损伤、骨骼肌损伤和脑损伤，以及外周血管疾病。本发明具有可观的重要性，因为双糖链蛋白聚糖是大部分组织中的遍在分子，因此其应当在被治疗动物或人的整个身体中发挥其抗局部缺血作用。
术语的定义
本发明的定义和讨论中(即说明书和权利要求书中)使用的最重要的术语在下文定义。其他术语应当根据技术人员所已知的普遍含义使用。
双糖链蛋白聚糖
双糖链蛋白聚糖是亮氨酸富集的小分子蛋白聚糖(SLRP)家族[有时称作亮氨酸富集重复(LRR)蛋白质家族]的成员，并且由在N端Ser-Gly位点被两个糖胺聚糖链取代的38kDa核心蛋白组成。核心蛋白含有十个亮氨酸富集重复，两侧侧翼是由二硫键稳定的环。其在亮氨酸富集重复内含有用于糖基化的额外位点(N联糖基化位点)。糖胺聚糖的品质根据长度和组成二者变化。糖胺聚糖链的主链由N-乙酰半乳糖胺和葡糖醛酸的重复二糖单元组成，后者通常通过5位碳上的差向异构化被转化为艾杜糖醛酸。随着链的伸长，它们被硫酸化修饰，分别得到硫酸软骨素和硫酸皮肤素。差向异构化和硫酸化的程度在组织之间有所变化。也存在具有单个糖胺聚糖取代的双糖链蛋白聚糖同工型(http://www.cmb.lu.se/ctb/html/biglycan.htm)。
根据上述定义，术语“双糖链蛋白聚糖”在人类的情况下包括相似的化合物家族[人双糖链蛋白聚糖作为“小分子骨蛋白聚糖(bone smallproteoglycan)”在例如Fischer等人，J.Biol.Chem.264：4571(1989)中有所描述；GenBank登录号J04599]。当然，相似的化合物可存在于其他动物中。
另外，术语“双糖链蛋白聚糖”旨在包括上述化合物的类似物、衍生物和部分，与美国专利申请号20050059580中应用的双糖链蛋白聚糖的定义一致。在以下部分中引用了该文件对双糖链蛋白聚糖的一般讨论的最重要部分(见说明书的第000054段)，但是此处我们要强调，整个该文件作为参考并入本说明书。例如，这类双糖链蛋白聚糖类似物的一个优选的实例是蛋白聚糖II(核心蛋白聚糖)。
术语“双糖链蛋白聚糖”还表示下述蛋白聚糖，其具有来源于人或其他动物的双糖链蛋白聚糖的至少一种生物活性。优选的双糖链蛋白聚糖包括Torpedo DAG-125(包含美国专利申请号20050059580中的SEQ ID NO：1-3)、人双糖链蛋白聚糖、及其同源物。优选的同源物是具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性和甚至更优选至少约98％或99％同一性的蛋白聚糖或蛋白质或肽。甚至更优选的同源物是与人双糖链蛋白聚糖或Torpedo DAG-125具有一定同源性(或同一性)百分比并且具有这些蛋白聚糖的至少一种生物活性的同源物。术语双糖链蛋白聚糖不限于全长双糖链蛋白聚糖，而是还包括具有至少一种双糖链蛋白聚糖活性的部分。
本文使用的术语“双糖链蛋白聚糖”包括所有上述变体。
双糖链蛋白聚糖活性增强剂
可通过使用双糖链蛋白聚糖或通过双糖链蛋白聚糖活性增强剂实现期望的活性提高，所述双糖链蛋白聚糖活性增强剂选自：
-双糖链蛋白聚糖表达的诱导剂或活化剂，
-含有编码双糖链蛋白聚糖的核酸(基因)的递送体系，和
-编码双糖链蛋白聚糖的核酸(裸基因)。
双糖链蛋白聚糖表达的诱导剂或活化剂
这些术语涉及通过以下方式增强靶组织或器官中双糖链蛋白聚糖活性的这类物质：
a)通过诱导双糖链蛋白聚糖表达，优选通过诱导内源(天然)双糖链蛋白聚糖表达来提高双糖链蛋白聚糖的表达；这些物质在说明书中称作“诱导剂”或“双糖链蛋白聚糖诱导剂”；或
b)提高双糖链蛋白聚糖的比活性，优选内源(天然)双糖链蛋白聚糖的比活性；这些物质在说明书中被称作“活化剂”或“双糖链蛋白聚糖活化剂”。
术语“双糖链蛋白聚糖的内源(天然)表达”涉及双糖链蛋白聚糖的下述表达，即所述表达是待治疗或预防疾病的人体或动物体的天然功能。
双糖链蛋白聚糖的诱导剂
诱导剂可以是例如：
i)无机化合物例如水杨酸钠，有机小分子如分子量少于5kD的寡肽和多肽、基因或蛋白质等；
ii)细胞因子例如转化生长因子β(TGF-β)和
iii)辅因子，即正常或增强的双糖链蛋白聚糖活性所必需的内源小分子或肽。
在优选的实施方案中，生产双糖链蛋白聚糖的诱导剂可以是本领域已知的不同生长因子和小分子，例如转化生长因子β(TGF-β)[Ungefroren H，Groth S，Ruhnke M，Kalthoff H，Fandrich F.Transforming growthfactor-beta(TGF-beta)type I receptor/ALK5-dependent activation of theGADD45beta gene mediates the induction of biglycan expression byTGF-beta J.Biol Chem.280：2644-52(2005)；Kaji，T.，Yamada，A.，Miyajima，S.，Yamamoto，C，Fujiwara，Y.，Wight，T.N.和Kinsella，M.G.：Cell Density-dependent Regulation of Proteoglycan Synthesis byTransforming Growth Factor-beta 1 in Cultured Bovine Aortic EndothelialCells.J.Biol.Chem.275，1463-1470(2000)]、氧固醇(例如7-酮胆固醇和7-β-羟基胆固醇)和溶血脂质(例如溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酸)[ChangMY，Tsoi C，Wight TN，Chait A.Lysophosphatidylcholine regulatessynthesis of biglycan and the proteoglycan form of macrophage colonystimulating factor.Arterioscler Thromb Vase Biol.23：809-15(2003)]以及水杨酸盐、优选水杨酸钠[Silva AM，Reis LF.Sodium salicylate induces theexpression of the immunophilin FKBP51 and biglycan genes and inhibitsp34cdc2 mRNA both in vitro and in vivo.Biol Chem.275(46)：36388-93(Nov 17，2000)]已经显示诱导双糖链蛋白聚糖。
概括而言，诱导剂可以是无机化合物或有机化合物如蛋白质、核酸(基因)、肽(例如寡肽和多肽)、肽模拟物(peptidomimetic)、碳水化合物或脂质。可通过已知的筛选技术(例如高通量分析)或通过根据本发明的体外筛选方法，筛选含有这类化合物的化学品文库以鉴定双糖链蛋白聚糖表达的诱导剂。
优选诱导剂是“小”有机分子，即分子量少于5kD、优选少于4kD、更优选少于3kD的分子。
双糖链蛋白聚糖的活化剂
双糖链蛋白聚糖的活化剂可以是例如增强活性双糖链蛋白聚糖从无活性双糖链蛋白聚糖的形成的物质，或通过任何其他方法增强双糖链蛋白聚糖活性的物质。例如，如果双糖链蛋白聚糖的具体实施方案是双糖链蛋白聚糖核心蛋白，则其可通过翻译后糖酵解(glycolization)活化。
概括而言，活化剂可以是无机化合物或有机化合物如蛋白质、核酸(基因)、肽(例如寡肽或多肽)、肽模拟物、碳水化合物或脂质。可通过已知的筛选技术(例如高通量分析)或通过根据本发明的筛选方法，筛选含有这类化合物的化学品文库以鉴定双糖链蛋白聚糖活性的增强剂。
优选活化剂是“小”有机分子，即分子量少于5kD、优选少于4kD、更优选少于3kD的分子。
靶器官或组织
术语“靶器官或组织”涉及人或动物体中应当预防或治疗疾病的部分，其可以是例如心脏、肾、肝、骨骼肌、皮肤、脑组织。在心脏保护性作用的情况下，其为心脏，优选是其中可发生或发生过局部缺血性发作的心脏部分或其相邻部分，在抗动脉粥样硬化作用的情况下，其为其中可发生或发生过动脉粥样硬化斑块形成的人或动物体部分或其相邻部分。
重组DNA
重组DNA表示通过重组技术生产的DNA。这表示该短语也包括天然基因，只要所述天然基因是通过重组技术产生的。
重组蛋白质/双糖链蛋白聚糖
重组蛋白质/双糖链蛋白聚糖表示这样的蛋白质/双糖链蛋白聚糖，其由通过重组技术产生的基因表达而来。这表示该短语也包括天然蛋白质/双糖链蛋白聚糖，只要所述天然蛋白质/双糖链蛋白聚糖是由通过重组技术生产的天然基因表达而来即可。
基因疗法
该术语包括可应用于将外源双糖链蛋白聚糖基因或蛋白质引入靶组织或器官的第一组方法。
该短语包括编码双糖链蛋白聚糖的重组基因到靶组织的任何递送，所述递送通过含有编码双糖链蛋白聚糖的基因的递送体系(即在重组载体或脂质体中或包装在病毒中)或者甚至以裸基因的形式进行。
基因疗法的优选实施方案是在靶组织或器官中表达重组的双糖链蛋白聚糖。该实施方案涉及双糖链蛋白聚糖的这类表达，所述表达不是待治疗或预防疾病的人或动物体的天然功能。可应用的方法在美国专利申请号20050059580中详述。在以下部分中引用了对所述方法的一般讨论的最重要部分(见说明书的第0079到0081段)，但是此处我们要强调，整个文件作为参考并入本说明书。
如本文所使用的，术语“转染”表示通过核酸介导的基因转移将核酸(例如表达载体)引入受体细胞中。术语“转导”在本文中通常用于通过核酸的病毒递送进行核酸转染的时候。如本文所使用的，“转化”是指下述过程，其中细胞的基因型由于细胞摄取外源DNA或RNA而改变，并且例如转化的细胞表达重组形式的多肽，或者在来自转移的基因的反义表达的情况下，天然存在形式的重组蛋白质的表达被破坏。
如本文所使用的，术语“转基因”是指引入细胞中的核酸序列。人们认为来自引入了转基因的细胞的子细胞也含有转基因(除非其已缺失)。转基因可以编码例如部分或完全异源的多肽(即对引入它的转基因动物或细胞是外来的)，或与引入它的转基因动物或细胞的内源基因是同源的，但是该转基因设计为以这样的方式插入动物基因组中或(其本身即)以这样的方式插入动物的基因组中，所述插入方式改变插入所述转基因的细胞的基因组(例如所述转基因在与天然基因不同的位点插入)。或者，转基因也可以存在于附加体中。转基因可包含所选择的编码序列最佳表达可能必需的一个或多个转录调节序列和任何其他核酸(例如内含子)。
如本文所使用的，术语“载体”是指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的优选载体是附加体，即能够染色体外复制的核酸。优选的载体是能够自主复制和/或表达与之连接的核酸的载体。能够指导与之有效连接的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中有用的表达载体通常是“质粒”的形式，质粒通常指环形双链DNA环，其载体形式不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括发挥等价功能的这些其他形式的表达载体、和本领域中随后已知的其他形式的表达载体。
编码本发明蛋白聚糖的基因可以处于组成型启动子或诱导型启动子的控制下。这些分子生物学术语是本领域公知的。
也可应用美国专利申请号20050059580中公开的一些其他基因疗法技术，见例如基于逆转录病毒的、基于腺病毒的载体(特别见说明书的第0132到0139段)。
另外，也可使用非病毒方法在人或动物组织中引起蛋白质的表达。可应用的方法在美国专利申请号20050059580中详述。在以下部分中引用了对方法的一般讨论的最重要部分(见说明书的第0140到0145段)，但是此处我们要强调，整个文件作为参考并入本说明书。
基因转移的大部分非病毒方法依赖于哺乳动物用于进行大分子摄入和胞内运输的正常机制。在优选的实施方案中，本发明的非病毒基因递送体系依赖于靶细胞摄入基因的内吞通路。这类的示范性的基因递送体系包括脂质体衍生的体系、多聚赖氨酸缀合物和人工病毒包膜。
在一个代表性的实施方案中，编码目的蛋白质的基因可以包埋进表面上带有正电荷的脂质体中(例如脂质转染)，并且所述脂质体(任选地)用针对靶组织细胞表面抗原的抗体标记(Mizuno等人，(1992)No ShinkeiGeka 20：547-551；PCT公开WO91/06309；日本专利申请1047381；和欧洲专利公开EP-A-43075)。例如，可使用下述脂质体进行肌细胞、神经细胞或心脏细胞的脂质转染，所述脂质体用针对特异的组织相关抗原的单克隆抗体标记(Mizuno等人，(1992)Neurol.Med.Chir.32：873-876)。
在另一个示例性的实施方案中，基因递送体系包含与基因结合剂例如多聚赖氨酸交联的抗体或细胞表面配体(见例如PCT公开WO93/04701、WO92/22635、WO92/20316、WO92/19749和WO92/06180)。例如，可使用可溶的多核苷酸载体用任何受试基因构建体体内转染特异的细胞，所述多核苷酸载体包含与多聚阳离子例如多聚赖氨酸缀合的抗体(见美国专利号5,166,320)。还应当理解，使用能增强基因从内体结构逸出的试剂，可改进通过介导的胞吞作用对受试核酸构建体的有效递送。例如，可使用整个腺病毒或流感HA基因产物的融合肽作为部分递送体系，诱导含DNA的内体的有效破坏(Mulligan等人，(1993)Science 260-926；Wagner等人，(1992)PNAS USA 89：7934；和Christiano等人，(1993)PNAS USA90：2122)。
编码双糖链蛋白聚糖蛋白质的核酸也可以作为“裸”DNA施用给受试者，如例如美国专利号5,679,647和Carson等人的相关专利中、WO90/11092和Feigner等人(1990)Science 247：1465中所述。
在临床情况中，可通过大量方法中的任何方法将基因递送体系引入患者中，所述方法中的每一种都是本领域熟悉的。例如，可例如通过静脉注射将基因递送体系的药物制剂系统性地引入，并且靶细胞中构建体的特异转导主要根据转染的特异性而发生，所述转染的特异性由基因递送媒介、由控制基因表达的转录调节序列引起的细胞类型或组织类型表达、或其组合提供。在其他实施方案中，重组基因的最初递送更加有限，进入动物的引入是非常集中的。例如，可通过导管(见美国专利号5,328,470)或通过立体定位注射(例如Chen等人，(1994)PNAS USA 91：3054-3057)引入基因递送运媒介。
在临床情况中，在经皮冠状动脉介入期间的急性心肌梗死中，可通过冠状动脉导管将重组双糖链蛋白聚糖引入冠状动脉中。
在经皮冠状动脉介入期间，重组基因通过导管引入时可被导入冠状动脉中。
体细胞疗法
该术语包括可用于将外源双糖链蛋白聚糖基因或蛋白质引入靶组织或器官中的第二组方法。
在优选的实施方案中，可通过以下方法完成表达活性重组双糖链蛋白聚糖的心脏细胞的生产及其进入心脏组织的引入：
i)可分离来自16天龄胚胎的心脏细胞，并在细胞培养物中维持。可用编码双糖链蛋白聚糖蛋白质的重组DNA转化培养的心脏细胞。转化效率可以非常高(达80％)，因此不需要后续的选择，并且经转化的细胞可容易地再引入心脏组织中。
ii)使用胚胎干细胞：存在从不同的哺乳动物胚泡细胞中分离胚胎干细胞(ES)的公知方法。可将这些衍生自胚泡细胞的ES细胞维持在培养物中，并可以通过电穿孔用不同的重组DNA构建体转化。在适当条件下转化的细胞可体外分化为成肌细胞[Sachinidis A，Fleischmann BK，Kolossov E，Wartenberg M，Sauer H，Hescheler J.Cardiac specific differentiation ofmouse embryonic stem cells.Cardiovasc Res.，58：278-91(2003)；Guo XM，Wang CY，Tian XC，Yang X.Engineering cardiac tissue from embryonicstem cells.Methods Enzymol.；420：316-38(2006)]。然后，可将过表达双糖链蛋白聚糖的这些转化的成肌细胞再引入心肌膜或冠状动脉中。
干细胞疗法
该术语包括可用于向靶组织或器官中引入外源双糖链蛋白聚糖基因或蛋白质的第三组方法，其使用以下方法之一：
使用胚胎干细胞：存在从不同的哺乳动物胚泡细胞中分离胚胎干细胞(ES)的公知方法。可将这些衍生自胚泡细胞的ES细胞维持在培养物中，并可以通过电穿孔用不同的重组DNA构建体转化。可在适当的抗生素溶液中选择经转化的细胞并将其克隆。可将过表达双糖链蛋白聚糖蛋白质的克隆的ES细胞引入心肌膜或冠状动脉。生产双糖链蛋白聚糖的ES细胞的分化会由于不同的生长因子而在心脏中原位发生。
使用造血干细胞：可从骨髓中分离造血干细胞，使用标准方法体外维持并用重组的双糖链蛋白聚糖构建体转化。可将过表达双糖链蛋白聚糖蛋白质的经转化的造血干细胞注射进血管中，它们从那里开始受由受损的心脏细胞释放的不同生长因子吸引而向心脏迁移。如果双糖链蛋白聚糖用荧光分子标记或与荧光蛋白例如EGFP或DsRed融合，则可根据它们的荧光监测生产双糖链蛋白聚糖的造血干细胞的积累和分化。
递送重组或天然的经纯化的双糖链蛋白聚糖蛋白质
该术语包括可用于向靶组织或器官中引入外源双糖链蛋白聚糖基因或蛋白质的第四组方法。
因此，在优选的实施方案中，可将在哺乳动物中通过重组DNA技术生产或从哺乳动物软骨中纯化的双糖链蛋白聚糖蛋白质注射进靶器官的血管系统中。也可应用其他施用途径，例如通过皮下注射或植入物施用。
在哺乳动物细胞中，双糖链蛋白聚糖经历翻译后修饰，并且两条硫酸软骨素糖胺聚糖/硫酸皮肤素糖胺聚糖链被添加至核心蛋白上。可以在用CMV-双糖链蛋白聚糖重组DNA构建体转染并随后在G418中选择后，在成肌细胞培养物(即H9C2)中生产重组的双糖链蛋白聚糖蛋白质。可使用Ni-NTA树脂从成肌细胞中快速纯化用6xHis标记的双糖链蛋白聚糖蛋白质[Crowe J，Masone BS，Ribbe J..One-step purification of recombinantproteins with the 6xHis tag and Ni-NTA resin.Mol Biotechnol.1995.Dec；4(3)：247-58]。
可使用别处所述的以下方法，从不同哺乳动物物种的软骨细胞中纯化天然的双糖链蛋白聚糖蛋白质[Pogany G，Hernandez DJ，Vogel KG.The invitro interaction of proteoglycans with type I collagen is modulated byphosphate.Arch Biochem Biophys.1994 Aug 15；313(1)：102-11；SchonherrE，Witsch-Prehm P，Harrach B，Robenek H，Rauterberg J，Kresse H.Interaction of biglycan with type I collagen.J Biol Chem.1995 Feb 10；270(6)：2776-83.；Roughley PJ，Melching LI，Recklies AD.Changes in theexpression of decorin and biglycan in human articular cartilage with ageand regulation by TGF-beta.Matrix Biol.1994Jan；14(1)：51-9.]。
在另一优选的实施方案中，可在植入前用上述方法离体处理旁路移植物或任何静脉自体移植物。
筛选方法
本发明还提供了能够鉴定双糖链蛋白聚糖活性增强剂的筛选方法。
在优选的实施方案中，在所述对双糖链蛋白聚糖的抗动脉粥样硬化和/或心脏保护作用特异的基本细胞中对基因或蛋白质的这类水平进行鉴定。在该情况下，所检测的表达水平与在未使用候选分子的基本细胞或过表达双糖链蛋白聚糖的其他细胞中获得的特异水平相比较。这些特异的水平适用于选择那些分别发挥期望的抗动脉粥样硬化作用和/或心脏保护作用的候选物。
术语“候选物”包括可用于增强双糖链蛋白聚糖活性的任何物质，特别是在双糖链蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖表达诱导剂或活化剂和基因疗法工具的定义下列举的物质。
i)在优选的实施方案中，双糖链蛋白聚糖表达的诱导剂：筛选方法是以体外报道分子测定为基础的，其中用双糖链蛋白聚糖启动子驱动的报道基因稳定转化哺乳动物细胞系(优选成肌细胞培养物，例如H9C2)。报道基因可以是任何可容易鉴定的基因，例如EGFP、DsRed、萤光素酶或氯霉素乙酰转移酶(CAT)等。通过小分子诱导双糖链蛋白聚糖表达后，细胞会发射绿色(EGFP)或红色(DsRed)的荧光，可通过放射性定量测量发光(萤光素酶)或增强的酶活性(CAT)。可通过将报道基因插入在双糖链蛋白聚糖启动子控制下的大基因组基因座(附加体、人工染色体)中，进行细胞报道分子测定(称作基因组报道分子测定，GRA)，如先前针对胎儿血红细胞所述[Vadolas J，Wardan H，Orford M，Williamson R，loannou PA.Cellular genomic reporter assays for screening and evaluation of inducersof fetal hemoglobin.Hum Mol Genet.，13(2)：223-33(Jan 15，2004)]。通过同源重组将报道基因插入在双糖链蛋白聚糖启动子控制下的内源双糖链蛋白聚糖基因座是另一种备选方案。
ii)双糖链蛋白聚糖比活性的增强剂：这些筛选方法是以下述蛋白质的鉴定为基础的，所述蛋白质能够与双糖链蛋白聚糖蛋白质相互作用和/或结合，并通过糖酵解或引起分子的构象变化而增强其活性。可通过经典的酵母双杂交体系研究蛋白质-蛋白质相互作用。另一高通量方法是使用蛋白质芯片。可以将双糖链蛋白聚糖蛋白质锚定在玻璃表面上，并可对芯片施用来自药物处理过的心脏细胞/成肌细胞的心脏细胞裂解产物。在随后的洗涤步骤后，可鉴定与双糖链蛋白聚糖结合的蛋白质。然后，可在心脏细胞培养物中体外测试经纯化的蛋白质的增强剂活性。
培养物或储藏溶液的补剂
本发明还提供了细胞或组织培养物的补剂，或可用于在移植前储藏器官的溶液的补剂，所述补剂含有双糖链蛋白聚糖活性的增强剂。
可在小规模实验中例如通过用渐增量的本发明的特异增强剂孵育细胞或器官来测定要添加至补剂中的化合物量。优选的细胞包括真核细胞，例如肌细胞、神经元细胞和心脏细胞。
药物组合物
根据本发明，双糖链蛋白聚糖活性的增强剂可与可药用的辅料和任选的其他治疗剂一起应用。术语“可药用的”表示与组合物的其他成分相容，并且对其接受者无害。
可通过例如任何标准参考文献中所述的常规药学方法制备所述药物组合物，所述标准参考文献例如Gennaro等人，Remington′s PharmaceuticalSciences(18版，Mack Publishing Company，1990，特别见第8部分：Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture)。药物组合物的实例为片剂、胶囊剂、丸剂、囊剂、口服施用的液体形式例如溶液、悬浮液和乳剂；一般用于口服施用或肠施用的受控释放形式；用于肠胃外施用的形式，例如可注射的形式。
附图概述
图1显示通过QRT-PCR分析的转基因和对照小鼠的主动脉和心脏中双糖链蛋白聚糖的mRNA表达。
缩写的含义：
C：对照(野生型动物)；
Bg+/+：双糖链蛋白聚糖过表达。
图2显示对照和转基因心脏样品中iNOS、eNOS和nNOS(A部分)、pyk2和突触结合蛋白(B部分)的Western分析；表达被标准化为内源小鼠β-肌动蛋白水平。
缩写的含义：
C：对照(野生型动物)；
β-act：β-肌动蛋白；
Tg：转基因动物。
图3显示测试动物中的血清胆固醇水平。
图4显示不同测试动物中的主动脉血流值。
图5显示不同测试动物中的心肌超氧化物水平。
图6显示不同测试动物中的主动脉斑块面积值。
图3到6中缩写的含义：
对照：野生型动物；
Chol.：用高胆固醇膳食处理的动物；
ApoB：ApoB转基因动物。
图7显示了在施加了缺氧和再充氧的心肌细胞中，不同浓度的外源双糖链蛋白聚糖的细胞保护作用(以抗局部缺血作用为基础)。图8显示在施加了缺氧和再充氧的心肌细胞中，不同浓度的外源双糖链蛋白聚糖核心蛋白的细胞保护作用。
图9显示在施加了缺氧和再充氧的心肌细胞中，不同浓度的外源双糖链蛋白聚糖类似物核心蛋白聚糖的细胞保护作用。
图7到9中缩写的含义：
BGN：双糖链蛋白聚糖；
＊：与缺氧对照相比p＜0.05(ANOVA分析后进行LSD post-hoc检验；在图8的情况下，缺氧BGN核心100nM组由于该组的高变异而未被包括在统计中)。
本发明通过以下的实施例进一步阐述。
实施例1
生成双糖链蛋白聚糖转基因制剂和通过双糖链蛋白聚糖在心脏中诱导血管和心脏保护的细胞转导通路
在该研究中，我们生成了过表达人双糖链蛋白聚糖基因的转基因小鼠。使用蛋白质组学研究了转基因后代的心脏蛋白质谱。
转基因构建体含有与CMV启动子融合的人双糖链蛋白聚糖cDNA。还向cDNA的3’端融合了V5表位和6x His标记序列。使用PCR分析新生小鼠的基因型，并使用基于Taqman探针的定量实时PCR(QRT-PCR)测试来自PCR阳性转基因小鼠不同组织(肝、脑、心脏和肌肉)的转基因表达(数据未显示)。选择表达最高水平人双糖链蛋白聚糖mRNA的转基因品系1052进行进一步研究。通过QRT-PCR评价转基因小鼠和年龄匹配的对照小鼠的主动脉和心脏中人双糖链蛋白聚糖在mRNA水平上的表达(图1)。
使用QRT-PCR和抗体阵列(antibody array)，我们检测到提高的TGFβ1和TGFβ2基因表达水平(数据未显示)，以及提高的Pyk2、RAF-1和mcl-1的蛋白质水平(表I)。双糖链蛋白聚糖以高亲和力结合TGF β。TGF β在密集和稀疏的两种内皮细胞中促进双糖链蛋白聚糖的合成[Kaji，T.，Yamada，A.，Miyajima，S.，Yamamoto，C.，Fujiwara，Y.，Wight，T.N.和Kinsella，M.G.：Cell Density-dependent Regulation of ProteoglycanSynthesis by Transforming Growth Factor-beta 1 in Cultured BovineAortic Endothelial Cells.J.Biol.Chem.275，1463-1470(2000)]。近期已知诱导心肌双糖链蛋白聚糖可在心肌组织中令该相互作用的平衡移位，并增强TGF β活性[Ahmed，M.S.，Oie，E.，Vinge，L.E.，Yndestad，A.，Andersen，G.O.，Andersson，Y.，Attramadal，T.和Attramadal，H.：Induction ofmyocardial biglycan in heart failure in rats-an extracellular matrixcomponent targeted by AT1 receptor antagonism.Cardiovasc.Res.60，557-568(2003)]。与TGF β的异二聚化可影响TGF β(在局部浓度中)的有效性和TGF β的活性。TGF β是成纤维细胞增殖和细胞外基质组分(尤其是胶原和纤连蛋白)合成的重要介质[de Andrade，C.R.，Cotrin，P.，Graner，E.，Almeida，O.P.，Sauk，J.J.和Coletta，R.D.：Transforming growthfactor-beta1 autocrine stimulation regulates fibroblast proliferation inhereditary gingival fibromatosis.J.Periodontol.1726-1733(2001)]。存在若干数据指出TGF β在心力衰竭中的心肌重塑和纤维化中的重要性[Lijnen，P.J.，Petrov，V.V.和Fagard，R.H.：Induction of Cardiac Fibrosis byTransforming Growth Factor-[beta]1.Mol.Gen.Metabol.71，418-435(2000)]。
为了鉴定在双糖链蛋白聚糖转基因小鼠心脏中表达改变的蛋白质，使用Panorama Ab微阵列细胞信号转导试剂盒(Sigma，CSAA1)。该阵列含有224种针对下述细胞蛋白质的抗体，所述细胞蛋白质涉及细胞凋亡、细胞周期、细胞胁迫和信号转导。其他组抗体针对(核、细胞骨架和神经元特异的)结构蛋白质。使用双糖链蛋白聚糖转基因小鼠心脏组织的蛋白质谱分析(protein profiling)检测到pky2蛋白质的上调。这些蛋白质是在细胞存活和凋亡性细胞死亡中起决定性作用的不同信号转导通路的关键分子。Pyk2也称为相关粘附斑酪氨酸激酶(related adhesion focaltyrosine kinase)(RAFTK)，其通过Src激酶-p38下游信号转导在心脏重塑和心肌细胞中凋亡通路的激活中起决定性作用[Melendez，J.，Turner，C，Avraham，H.，Steinberg，S.F.，Schaefer，E.和Sussman，M.A.：Cardiomyocyte Apoptosis Triggered by RAFTK/pyk2 via Src Kinase IsAntagonized by Paxillin.J.Biol.Chem.279，53516-53523(2004)]。尽管在该研究中未研究涉及细胞凋亡信号转导的激酶磷酸化，但是p38以及细胞凋亡通路的其他促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)成员在抗体微阵列研究中显示上调。先前已经报道在受梗死形成影响的心肌区中双糖链蛋白聚糖mRNA水平提高，说明梗塞区愈合期间双糖链蛋白聚糖的关键性作用，并表明其参与心脏重塑[Yamamoto，K.，Kusachi，S.，Ninomiya，Y.，Murakami，M.，Doi，M.，Takeda，K.，Shinji，T.，Higashi，T.及其他：Increase in theExpression of biglycan mRNA Expression Co-localized Closely with that ofType I Collagen mRNA in the Infarct Zone After Experimentally-InducedMyocardial Infarction in Rats.J.Mol.Cell.Card.30，1749-1756(1998)]。此处我们还显示，双糖链蛋白聚糖转基因小鼠的心脏中涉及Ca++传感的另一蛋白质--突触结合蛋白(syt)也上调。Syt是含有串联的钙结合C2结构域(C2A和C2B)的跨膜蛋白质，并在突触传递中起重要作用。突触结合蛋白I被认为是同步神经递质释放的快速钙传感器[Yoshihara，M.，Adolfsen，B.和Littleton，J.T.：Is synaptotagmin the calcium sensor？Curr.Opin.Neurobiol.13，315-323(2003)]。
通过抗体阵列研究获得的结果总结在表I中。
| 点 | 抗体名称 | Sigma登录号 | 过表达倍数 |
| 5.1Dab | i-NOS | N7782 | 1.67 |
| 5.2Dab | n-NOS | N7155 | 2.20 |
| 5.3Dab | e-NOS | N2643 | 2.14 |
| 6.3Cab | 突触结合蛋白 | S2177 | 1.83 |
| 7.4Cab | Mcl-1 | M8434 | 1.83 |
| 8.1Dab | Pyk2 | P3902 | 1.99 |
表I：PanoramaTM Ab微阵列的抗体列表，其识别在双糖链蛋白聚糖转基因心脏中被诱导的蛋白质表达。
bg+/+转基因小鼠的心脏中所有三种NOS蛋白质均检测到提高的水平。这些提高对nNOS而言为2.2倍，对eNOS而言为2.14倍，对iNOS而言为1.67倍。在神经生物学过程中发挥作用的蛋白质中，检测到提高水平的突触结合蛋白(1.83倍)。已知高水平的mcl-1促进细胞存活，而其下调起始细胞凋亡。从阵列上存在的信号转导蛋白质中，与其他蛋白质相同，我们发现Mcl-1(1.83倍)和Pyk 2(1.99倍)有可观的提高。
为了确认通过抗体微阵列研究获得的结果，进行了western印迹实验(图2的A部分和B部分)。在第一个实验中，比较了来自对照和转基因小鼠心脏的iNOS、eNOS和nNOS的表达水平。与对照样品相比较并标准化为内源β-肌动蛋白表达，在转基因心脏组织中检测到eNOS过表达为约2倍、iNOS为1.9倍、nNOS为1.7倍。发现提高的突触结合蛋白(2.05倍)和pyk 2(2倍)蛋白质水平(图2B)。这些western印迹结果证实了先前通过微阵列分析获得的发现。
也对心脏冷冻切片进行了免疫组织化学分析，以显影pyk2、突触结合蛋白和NOS蛋白质的定位。在双糖链蛋白聚糖转基因心脏切片中，心肌组织和内皮细胞显示提高的eNOS和iNOS免疫反应性(数据未显示)。
检测到转基因内皮中eNOS的丰富的染色。iNOS定位于心肌膜各处的细胞质。尽管分布并未变化，但是在转基因心脏切片中强度显著提高。突触结合蛋白和Pyk 2在细胞质各处显示弥散染色(图3B)，然而在双糖链蛋白聚糖转基因心脏切片中它们均显示提高的免疫反应性，pyk 2累积在细胞间连接点中。
在该研究中显示，使用蛋白质组学可以在双糖链蛋白聚糖转基因小鼠的心脏中检测到所有三种NOS被诱导的表达。也通过western印迹分析和免疫组织化学对这些数据进行了证实。作为重要的信号转导分子，一氧化氮在多种生物学过程如神经传递、心脏保护和免疫防御中起决定性作用。NO通过其血管舒张作用、抗氧化作用、抗血小板作用和抗中性白细胞作用而具有心脏保护效果，并且其对于正常的心脏功能是关键的，尽管超量生产NO可以变得对细胞有毒[见综述Ferdinandy P，Schulz R.Nitric oxide，superoxide，and peroxynitrite in myocardial ischemia-reperfusion injuryand preconditioning.Br.J.Pharmacol.138：532-543(2003)]。局部NO过量可抑制双糖链蛋白聚糖表达，该负调节之前已由Schaefer等人[见上文]证实。我们发现在我们的双糖链蛋白聚糖转基因小鼠中诱导的提高的在心脏保护中具有重要作用的蛋白质的水平，暗示了双糖链蛋白聚糖在心脏重塑中的重要性及其可能的心脏保护作用。
总之，我们目前的研究揭示了心脏中双糖链蛋白聚糖蛋白质的过表达导致心脏组织中蛋白质谱的多重改变，涉及心脏重塑、信号转导、心脏保护和Ca++信号转导的机制。
实施例2
双糖链蛋白聚糖的过表达预防动脉粥样硬化和高脂血症诱导的心脏功能障碍
该实施例显示双糖链蛋白聚糖转基因减少实验性动脉粥样硬化的发生并减轻高脂血症诱导的心肌功能障碍。
方法：
用富含2％胆固醇的实验室饲料或标准饲料喂养野生型(对照，C57/B6x CBA)、仅过表达人apoB-100蛋白质(apoB)的转基因小鼠、及过表达人apoB-100和双糖链蛋白聚糖(apoB x BG)二者的双转基因小鼠17-19周。在膳食周期结束时，分离心脏用于测量基本心脏功能(分离的工作心脏制备)和生物化学参数(用光泽精化学发光(lucigenin chemiluminescence)测量超氧化物)，并取出主动脉用于脂质染色。收集血样并测定血清脂质和葡萄糖[该实施例中使用的方法的详细描述见Onody A，Csonka C，Giricz Z，Ferdinandy P.Hyperlipidemia induced by cholesterol-rich diet leads toenhanced peroxynitrite formation in rat hearts.Cardiovasc Res 58：663-670(2003)]。为了测定心肌收缩功能，测量主动脉血流。
结果：
与正常膳食喂养的野生型小鼠相比，无论是富含胆固醇的膳食、单独或与双糖链蛋白聚糖组合的apoB-100转基因均不影响血清总胆固醇和LDL胆固醇(图3)。然而，在apoB转基因和apoB x BG双转基因动物中，由于富含胆固醇的膳食，血清胆固醇和LDL胆固醇显著提高(图4)。另一方面，没有一项处理显著影响HDL胆固醇和血清葡萄糖水平。与正常膳食喂养的野生型相比，单独或与双糖链蛋白聚糖组合的ApoB转基因显著提高血清中的甘油三酯水平，然而在转基因小鼠中，胆固醇显著降低血清甘油三酯。
测定了主动脉血流以评价分离的小鼠心脏的心脏性能。当动物接受正常膳食时，apoB转基因和apoB x BG双转基因均不影响主动脉血流(图5)。然而，在人apoB-100转基因小鼠中富含胆固醇的膳食使主动脉血流显著恶化，但在野生型或apoB x BG转基因小鼠中没有作用(图4)。
测量作为高脂血症诱导的心脏功能障碍主要因素的心肌超氧化物含量[见上文所示的Onody等人(2003)]，以检测双糖链蛋白聚糖转基因是否可降低心肌膜中的超氧化物生产。在apoB小鼠中富含胆固醇的膳食令心脏超氧化物显著增加，但是在野生型和apoB x BG转基因小鼠中则并非如此。在用正常膳食喂养的小鼠中，单独的apoB或apoB x BG双转基因未改变心脏超氧化物(图5)。
与野生型小鼠相比，发现apoB小鼠主动脉中的动脉粥样硬化斑块面积增加。富含胆固醇的膳食进一步增加了apoB转基因小鼠中的斑块形成。尽管apoB x双糖链蛋白聚糖双转基因小鼠中的斑块形成增加了，但是在双转基因动物中，富含胆固醇的膳食显著降低动脉粥样硬化斑块面积(图6)。
结论：
这是第一次证明双糖链蛋白聚糖转基因的存在减少动脉粥样硬化的发生并减轻高脂血症诱导的心脏功能障碍。
实施例3
双糖链蛋白聚糖的过表达降低心肌局部缺血/再灌注损伤，包括梗塞大小和梗塞后心脏功能障碍
该实施例显示，在被施以局部缺血和再灌注的小鼠心脏中，双糖链蛋白聚糖转基因的存在减小梗塞大小并减轻梗塞后的收缩功能衰竭。
方法：
分离野生型对照和过表达双糖链蛋白聚糖基因的转基因动物的心脏，灌注Krebs-Henselit溶液并进行30分钟局部缺血和120分钟再灌注。在灌注结束时，缓慢地向主动脉中施用5分钟5mL溶于磷酸缓冲液(pH 7.4)中的1％氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma-Aldrich)，从而将心肌膜染色。将TTC-染色的心脏冷冻(-20℃)，切成约1mm厚的切片，并在玻璃平板之间扫描。通过面积法定量图片中TTC染色的红色面积和未染色的苍白色面积。梗塞大小表示为总心脏体积的百分比[该实施例中使用的方法的详述在Giricz Z，Lalu MM，Csonka C，Bencsik P，Schulz R，Ferdinandy P.Hyperlipidemia attenuates the infarct-size limiting effect of ischemicpreconditioning：role of matrix metalloproteinase-2 inhibition.JPharmacol Exp Ther，316：154-161(2006)中给出]。
结果：双糖链蛋白聚糖转基因的存在导致梗塞大小减少约25-35％[梗塞大小从野生型组中的61.2±4.5％减少至转基因组中的44.1±5.8％(两组中均为n＝6)]，并在胆固醇喂养和正常喂养的动物中导致局部缺血后的心肌功能改进约20％(这些实验在数量更少的动物中进行)。
结论：这是第一次证明双糖链蛋白聚糖发挥心脏保护作用(以抗局部缺血作用为基础)，所述心脏保护作用包括梗塞大小的减小和局部缺血后心肌功能的改进。
实施例4
双糖链蛋白聚糖保护心肌细胞免受缺氧/再充氧损伤(局部缺血/再灌注损伤的模型)
方法：对原代培养物中分离的新生大鼠心肌细胞进行2.5小时模拟的局部缺血和2小时再充氧，并用锥虫蓝(trypan blue)摄取评价不可逆的细胞损伤程度，如[Li X，Heinzel FR，Boengler K，Schulz R，Heusch G.Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involveintercellular communication through gap junctions.J Mol Cell Cardiol.36：161-163，2004]中所述。在缺氧/再充氧之前用1nM-100nM的一系列浓度双糖链蛋白聚糖核心蛋白(BGN-核心)和全长双糖链蛋白聚糖(BGN)处理细胞20小时。在双糖链蛋白聚糖情况下(图7)重复实验的数量(n)如下：在缺氧组中n＝14，BGN分别为1、3和30nM的组中n＝5，BGN为10nM的组中n＝12，BGN为100nM的组中n＝12。在双糖链蛋白聚糖核心蛋白的情况下(图8)重复实验的数量(n)如下：在缺氧组中n＝6，BGN分别为1、3、10和30nM的组中n＝5，BGN为100nM的组中n＝4。
另外用核心蛋白聚糖处理细胞，所述核心蛋白聚糖为另一SLRP，其具有与双糖链蛋白聚糖相似的化学结构但是仅含有一个葡萄糖氨基聚糖侧链[Scott PG，Dodd CM，Bergmann EM，Sheehan JK，Bishop PN.Crystalstructure of the biglycan dimer and evidence that dimerization is essentialfor folding and stability of class I small leucine-rich repeat proteoglycans.J.Biol Chem.281：13324-13332(2006)；以及Fisher，L.W.，Termine，J.D.和Young，M.F.：Deduced protein sequence of bone small proteoglycan I(biglycan)shows homology with proteoglycan II(decorin)and severalnonconnective tissue proteins in a variety of species.J.Biol.Chem.264，4571-4576(1989)]。在核心蛋白聚糖的情况下(图9)实验的数量(n)如下：分别为在缺氧组中n＝7，在所有核心蛋白聚糖组中n＝5。
结果：
双糖链蛋白聚糖(图7)和双糖链蛋白聚糖核心蛋白(图8)二者均浓度依赖性地保护肌细胞使其免于缺氧/再充氧诱导的细胞死亡。
核心蛋白聚糖还发挥细胞保护作用，但是与双糖链蛋白聚糖相比程度较小(图9)。
此处我们应提到，在双糖链蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖核心蛋白的情况下，细胞保护作用的浓度依赖性似乎显示为U-形曲线，其中最大作用在30nm左右，例如在20到40nm的区间中(精确的浓度依赖性需要进一步实验验证)。
结论：这是第一次证明双糖链蛋白聚糖及其类似物核心蛋白聚糖在缺氧/局部缺血/再充氧损伤中发挥细胞保护作用。
实施例5
“双糖链蛋白聚糖模拟物”的筛选方法
该实施例显示抗体阵列测定的基础，所述抗体阵列测定可用于体内或离体测试任何靶器官组织中模拟双糖链蛋白聚糖作用的分子。
方法：如实施例1中所示，针对i-NOS、n-NOS、e-NOS、突触结合蛋白、Mcl-1和Pyk2，对用任何测试物质(小分子、寡肽、多肽等)处理后的组织样品进行蛋白质阵列测定。如果测试物质改变这些蛋白质的表达模式，并且该变化在统计学上与实施例1中得到的并无差异，则可以认为测试分子是有效的双糖链蛋白聚糖模拟物。
结论：这是筛选有效双糖链蛋白聚糖模拟物的首个测定体系。
Claims (19)
1.双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂作为活性成分在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗动脉粥样硬化和/或局部缺血性(例如心脏)疾病。
2.在预防或治疗动脉粥样硬化和/或局部缺血性(例如心脏)疾病时用作活性成分的双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂。
3.双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂在动脉粥样硬化和/或局部缺血性(例如心脏)疾病的预防或治疗中作为活性成分的用途。
4.在有需要的哺乳动物中预防或治疗动脉粥样硬化和/或局部缺血性(例如心脏)疾病的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效量作为活性成分的双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂。
5.根据权利要求1到4中任一项的用途或产品或方法，其中活性成分选自：双糖链蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖类似物、优选核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖的诱导剂或活化剂、含有编码双糖链蛋白聚糖的核酸的递送体系、以及编码双糖链蛋白聚糖的核酸(裸核酸)。
6.根据权利要求5的用途或产品或方法，其中活性成分是内源(天然)双糖链蛋白聚糖过表达的活化剂或诱导剂。
7.根据权利要求6的用途或产品或方法，其中内源(天然)双糖链蛋白聚糖的过表达由小分子活化，优选由寡肽或多肽或水杨酸钠或氧固醇或溶血脂质活化。
8.根据权利要求5的用途或产品或方法，其中活性成分是含有编码双糖链蛋白聚糖的核酸的递送体系，其中所述基因递送体系确保双糖链蛋白聚糖的重组过表达，优选通过基因或细胞(包括干细胞)治疗技术确保双糖链蛋白聚糖的重组过表达。
9.根据权利要求1到8中任一项的用途或产品或方法，其中在旁路手术、优选冠状动脉旁路手术的情况下，在植入之前将活性成分离体掺入自体移植物中。
10.根据权利要求1到9中任一项的用途或产品或方法，其中抗局部缺血性疾病是急性或慢性的局部缺血性心脏病，并且在存在或不存在高脂血症时发挥心脏保护作用。
11.根据权利要求10的用途或产品或方法，其中急性或慢性局部缺血性心脏病选自：存在或不存在高脂血症时的急性心肌局部缺血、稳定或不稳定的心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、心脏手术引起的心肌局部缺血。
12.根据权利要求1到9中任一项的用途或产品或方法，其中针对下述疾病发挥所述抗动脉粥样硬化作用，所述疾病与任何动脉粥样硬化斑块的形成相关联，例如冠状动脉硬化、颈动脉硬化、外周动脉硬化。
13.用于鉴定发挥抗动脉粥样硬化和/或抗局部缺血作用的双糖链蛋白聚糖活性增强剂的方法，特征是：
a)在适合双糖链蛋白聚糖在基础细胞中表达的条件下，将候选增强剂与所述基础细胞接触；
b)检测所述基础细胞中对双糖链蛋白聚糖的抗动脉粥样硬化和/或抗局部缺血作用特异的基因或蛋白质的表达水平和/或活性；
c)将检测的表达和/或活性水平与
-未应用候选物的基础细胞中获得的参照水平，和/或
-过表达双糖链蛋白聚糖的其他细胞中获得的参照水平
进行比较，其中与基础细胞中和/或过表达的其他细胞中定义的参照水平相比，认为所述特异基因或蛋白质的增强的水平或活性表明下述事实：各自的候选物是发挥抗动脉粥样硬化和/或抗局部缺血作用的双糖链蛋白聚糖活性增强剂。
14.根据权利要求13的方法，其中体外检测双糖链蛋白聚糖表达，优选通过使用双糖链蛋白聚糖启动子-EGFP构建体进行检测。
15.根据权利要求13或14的方法，其中在步骤b)中检测蛋白质水平，并且步骤c)的参照水平来自于过表达双糖链蛋白聚糖的细胞。
16.根据权利要求15的方法，其中所述检测为对双糖链蛋白聚糖的抗动脉粥样硬化和/或抗局部缺血作用特异的蛋白质选自：i-NOS、n-NOS、e-NOS、突触结合蛋白、Mcl-1和Pyk2。
17.根据权利要求16的方法，其中所述参照水平通过Panorama Ab微阵列细胞信号转导试剂盒(Sigma，CSAA1)鉴定。
18.细胞或组织培养物的补剂或用于在移植前储存器官的溶液的补剂，所述补剂与已知的辅料一起包含双糖链蛋白聚糖、优选核心蛋白聚糖、或双糖链蛋白聚糖活性增强剂。
19.根据权利要求18的补剂，其中双糖链蛋白聚糖活性增强剂选自：双糖链蛋白聚糖表达的诱导剂或活化剂、含有编码双糖链蛋白聚糖的核酸(基因)的递送体系、和编码双糖链蛋白聚糖的核酸(裸核酸)。
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Effective date of registration: 20130424 Address after: Szeged Applicant after: Hungary Pharmaceutical 2000 Ltd. Address before: Szeged Applicant before: Szeged biological research center MTA point Applicant before: Hungary Pharmaceutical 2000 Ltd. |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130807 Termination date: 20200110 |