CN115611995B

CN115611995B - 一种竹节参多糖及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115611995B
Application number: CN202211545157.3A
Authority: CN
Inventors: 周义发; 高玉伟; 孙琳; 吕朝相; 台桂花; 齐静; 崔梁楠; 王铁成; 及莉; 钟武; 李松; 夏咸柱
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA; Northeast Normal University
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA; Northeast Normal University
Priority date: 2022-12-05
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2042-12-05
Also published as: CN115611995A

Abstract

本发明提供了一种竹节参多糖及其制备方法和应用，属于天然提取物技术领域。本发明以竹节参为原料，经水提醇沉的方法提取总多糖，再依次经过离子交换层析柱（Cl‑型）和凝胶排阻层析柱分离纯化，获得分子量在50.0 kDa~100.0 kDa之间的多糖。细胞水平实验表明，所述竹节参多糖具有抑制包括野生型和变异型在内的多种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2毒株的增殖复制的作用。竹节参多糖从中药中提取得到，属于天然活性物质，毒副作用小，具有较高的使用安全性。

Description

一种竹节参多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种竹节参多糖及其制备方法和应用。

背景技术

冠状病毒（coronavirus，CoV），是一种具有囊膜的正链RNA病毒，因其囊膜表面的棒状凸起形如花冠，故名冠状病毒。根据血清学特性和遗传学差异，该病毒主要分为α、β、γ和δ属，其中β属中的SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2均能引起严重的呼吸系统疾病。该病毒具有传染性强、致病性高、变异频率快和难以防控等特点。人类感染后能引起轻症至重症肺炎，导致部分重症患者死亡，给社会安全和经济发展带来巨大的挑战。目前，对该类病毒的防控措施主要以疫苗注射和抗病毒药物治疗为主。然而，现有疫苗对不断变异的毒株抵抗作用有限，且具有滞后性。尽管一些药物(瑞德西韦、莫那匹纳韦、甲磺酸卡莫司他、阿比朵尔等)在治疗方面为COVID-19患者赢得了宝贵的时间，但这些药物的抗病毒作用效果有限，且毒副作用较大，可能导致患者出现恶心、呕吐、肝酶升高以及肝组织损伤等副反应。因此筛选、寻找或开发一类具有普遍适用性的抗冠状病毒药物具有重要意义。

竹节参（Panax japonicus C. A. Mey，又名竹节三七、竹节人参、白三七等）为五加科人参属(Panax L.)多年生植物，主要分布于湖北、贵州、云南、陕西、甘肃、安徽等地区，兼具北药人参和南药三七的功效，既补气又补血，被民间誉为“草药之王”，以根茎入药，具有活血化瘀，消肿止痛，提高机体免疫力，延缓衰老，并具有护肝、抗炎、抗疲劳、抗肿瘤等疗效。目前，对竹节参功效范围大多集中益气活血、抗炎镇痛和增强机体抵抗力等方面。尽管现有技术中有关于竹节参在抗病毒活性方面应用的报道，但其发挥抗病毒药效的活性成分并不明确。目前，对竹节参多糖的研究主要集中在调血脂和抗肿瘤方面，在预防和治疗病毒方面的应用尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种竹节参多糖及其制备方法和应用，制备得到多糖组分，具有抗新型冠状病毒的活性。

本发明提供了一种竹节参多糖，单糖组成包括以下种类的单糖：鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖；

所述木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖的总摩尔量与半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的摩尔量之比为（0.45~0.92）：（1.63~3.12）：（0.99~1.41）：（2.62~3.54）：（2.40~2.92）。

优选的，所述竹节参多糖是一种RG-I型果胶,由[→2)-α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA-(1→]二糖重复单位交替连接形成主链，在Rhap的O-4位形成分支连接有侧链，主链分支度为45%~65%，所述侧链包括以下成分：α-L-1,5-阿拉伯聚糖、β-D-1,4-半乳聚糖、I型阿拉伯半乳聚糖和II型阿拉伯半乳聚糖；

所述竹节参多糖的分子量在50.0 kDa~100.0 kDa之间，所述竹节参多糖包括以下摩尔百分比的单糖：阿拉伯糖26.2%~35.4%、半乳糖24.0%~29.2%、半乳糖醛酸16.3%~31.2%、鼠李糖9.9%~14.1%、木糖1.5%~4.7%、葡萄糖醛酸1.8%~3.0%和甘露糖1.2%~1.5%。

本发明提供了所述竹节参多糖的制备方法，包括以下步骤：

1）竹节参干燥根茎经过水提醇沉，将醇沉后的体系固液分离，收集固相，得到竹节参总多糖；

2）将步骤1）中所述竹节参总多糖溶解，上样于离子交换层析柱，依次使用蒸馏水、0.2 M氯化钠溶液、0.3 M氯化钠溶液洗脱，收集0.2 M氯化钠溶液洗脱组分并采用截留分子量为3500 Da的透析袋透析除盐，得到竹节参多糖；

3）将步骤2）中所述竹节参多糖溶解后上样于凝胶排阻层析柱，用0.15 M氯化钠溶液洗脱后，收集有效的色谱峰所对应的洗脱溶液，经除盐和冻干，得到精制的竹节参多糖。

优选的，步骤1）中所述醇沉时体系中乙醇水溶液的终浓度为体积百分含量的50%~80%。

优选的，步骤2）中离子交换层析柱的上样线性流速为15 ~30 mL/min，洗脱线性流速为15 ~60 mL/min；每升离子交换层析柱填料的载样量不超过50 g。

优选的，步骤3）中所述凝胶排阻层析柱的上样线性流速为2.5~5 mL/min，洗脱线性流速为0.3~0.5 mL/min；上样溶液的体积不超过凝胶排阻层析柱体积的2%。

本发明提供了所述竹节参多糖或所述竹节参多糖的制备方法制备得到竹节参多糖在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。

优选的，所述新型冠状病毒包括野生型毒株和/或变异型毒株。

本发明提供了一种新型冠状病毒增殖抑制剂，包括所述竹节参多糖和辅料。

本发明提供了一种抗新型冠状病毒药物，包括所述竹节参多糖和药学上可接受的辅料。

本发明提供了一种竹节参多糖，本发明以竹节参为原料经过水提醇沉方法提取总多糖，再依次经过离子交换层析柱（Cl^-型）和凝胶排阻层析柱分离纯化获得。所述竹节参多糖在细胞水平验证具有抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2等多种新型冠状病毒的增殖复制作用，能够广泛抗新型冠状病毒。此外，竹节参多糖从中药中提取得到，属于天然活性物质，毒副作用小，具有较高的使用安全性。

综上，竹节参多糖具有抑制新型冠状病毒感染的功效，可作为潜在的抗新型冠状病毒的候选药物，为病毒传播的防控和抗病毒药物的研发提供了获选天然的候选分子。

附图说明

图1为竹节参多糖分子量分布的高效凝胶排阻色谱检测结果图；

图2为竹节参多糖单糖组成的高效液相色谱检测结果图；

图3为竹节参多糖的核磁共振波谱（¹³C NMR）图；

图4为竹节参多糖对MDCK细胞生长安全性的影响结果图；

图5为竹节参多糖抑制新型冠状病毒野生型毒株感染力的检测结果图；

图6为竹节参多糖抑制新型冠状病毒变异型感染力的检测结果图。

实施方式

在本发明中，所述竹节参多糖由[→2)-α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA-(1→]二糖重复单位交替连接形成主链，在Rhap的O-4位形成分支连接有侧链，主链分支度为45%~65%，所述侧链包括以下成分：α-L-1,5-阿拉伯聚糖、β-D-1,4-半乳聚糖、I型阿拉伯半乳聚糖和II型阿拉伯半乳聚糖。

在本发明实施例中，所述竹节参多糖的分子量优选为50.0 kDa~100.0 kDa，所述竹节参多糖包括以下摩尔百分比的单糖：阿拉伯糖26.2%~35.4%、半乳糖24.0%~29.2%、半乳糖醛酸16.3%~31.2%、鼠李糖9.9%~14.1%、木糖1.5%~4.7%、葡萄糖醛酸1.8%~3.0%和甘露糖1.2%~1.5%。

本发明提供了所述竹节参多糖的制备方法，包括以下步骤：

本发明首先将竹节参干燥根茎经过水提醇沉，将醇沉后的体系固液分离，收集固相，得到竹节参总多糖。

在本发明中，所述竹节参干燥根茎的重量与水的体积比为1:10~20（kg/L），更优选为1:15。所述水提时，水温优选为85~100℃，更优选为90~95℃。所述水提的次数优选为2~4次，更优选为3次。每次水提的时间优选为2~4h，更优选为3h。合并三次水提得到的提取液，减压浓缩至原体积的1/15~1/60，在4000 r/min的条件下离心20 min~30 min，收集上清液。得到上清液后进行醇沉。所述醇沉时体系中乙醇的终浓度优选为体积百分含量50%~80%，更优选为60%~70%。所述醇沉的时间优选为10~14h，更优选为12h。

得到竹节参总多糖后，本发明将竹节参总多糖溶解，上样于离子交换层析柱，依次使用蒸馏水、0.2 M氯化钠溶液、0.3 M氯化钠溶液洗脱，收集0.2 M氯化钠溶液洗脱组分采用截留分子量为3500 Da的透析袋透析除盐，得到竹节参多糖。

在本发明中，溶解后的竹节参总多糖溶液的浓度优选为50~100 g/L，更优选为60~90 g/L，进一步优选为70~80 g/L，最优选为75 g/L。

在本发明中，离子交换层析柱的上样流速优选为15~30 mL/min，更优选为20~25mL/min；每升填料的载样量不超过50 g。在本发明实施例中，所述离子交换层析柱购自博格隆（上海）生物技术有限公司，规格为5.0×30.0 cm；填料优选为DEAE-纤维素，购自上海源叶生物科技有限公司。

在本发明中，所述洗脱时，线性流速优选为15~60 mL/min，更优选为30 ~45 mL/min。在本发明实施例中，所述蒸馏水、0.2 M氯化钠溶液和0.3 M氯化钠溶液的洗脱体积为5L。

得到竹节参多糖后，本发明将所述竹节参多糖溶解后上样于凝胶排阻层析柱，用0.15 M氯化钠溶液洗脱后，收集有效的色谱峰所对应的洗脱溶液，经除盐和冻干，得到精制的竹节参多糖。

在本发明中，溶解后的竹节参多糖溶液的浓度优选为50~100 g/L，更优选为60~90g/L，进一步优选为70~80 g/L，最优选为75 g/L。溶解后，经过离心，取上清液进行上样。所述离心的转速优选为10000~12000 rpm，更优选为12000 rpm。所述离心的时间优选为20~30min，更优选为25 min。

在本发明中，所述凝胶排阻层析柱的上样流速优选为2.5 mL/min~5 mL/min，更优选为3 mL/min~4 mL/min。上样溶液的体积不超过凝胶排阻层析柱体积的2%。所述洗脱时，线性流速优选为0.3~0.5 mL/min，更优选为0.4 mL/min。在本发明实施例中，所述凝胶排阻层析柱优选为Sepharose CL-6B凝胶排阻层析柱，层析柱购自博格隆（上海）生物技术有限公司，规格为4.6×100.0 cm；填料购自美国通用医疗公司（GE Healthcare）。由高效凝胶排阻色谱检测图谱可见，在13~21 min内出现多糖对应的色谱峰。

在本发明中，所述竹节参多糖还优选以竹节参多糖的衍生物的形式存在。所述竹节参多糖的衍生物包括竹节参多糖的盐类衍生物、竹节参多糖的溶剂化物和/或竹节参多糖的水合物。所述竹节参多糖的衍生物包括竹节参多糖的盐类衍生物、竹节参多糖的溶剂化物和/或竹节参多糖的水合物。所述竹节参多糖的盐类衍生物优选为竹节参多糖钠盐、竹节参多糖钾盐和竹节参多糖铵盐。所述竹节参多糖的溶剂化物优选为竹节参多糖与甘油、二甲基亚砜、乙醇、丙二醇和聚乙二醇中的至少一种溶剂形成的溶剂化物。

在本发明中，所述新型冠状病毒（SARS-CoV-2）包括野生型毒株和/变异型毒株。所述变异型毒株优选包括奥密克戎毒株。

在本发明中，所述精制的竹节参多糖在细胞水平证明，对细胞无毒副作用，保证使用安全性。同时，在细胞水平上，所述竹节参多糖能够抑制新型冠状病毒的复制。可见，所述竹节参多糖具有抗新型冠状病毒感染的作用，扩宽了竹节参多糖的药物学功效，为抗病毒药物的制备提供了新思路。

本发明提供了一种病毒增殖抑制剂，包括所述竹节参多糖和辅料。

在本发明中，所述竹节参多糖还优选以竹节参多糖的衍生物的形式存在。所述竹节参多糖的衍生物包括竹节参多糖的盐类衍生物、竹节参多糖的溶剂化物和/或竹节参多糖的水合物。

本发明对所述抑制剂的辅料没有特殊限制，采用本领域所熟知的抑制剂的辅料即可。本发明对所述抑制剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的抑制剂的制备方法即可。所述抑制剂的有效成分含量为大于或等于10mg/ml。

本发明提供了一种抗病毒药物，包括所述竹节参多糖和药学上可接受的辅料。

在本发明中，所述竹节参多糖还优选以竹节参多糖的衍生物的形式存在。所述竹节参多糖的衍生物包括竹节参多糖的盐类衍生物、竹节参多糖的溶剂化物和/或竹节参多糖的水合物。所述竹节参多糖的盐类衍生物优选为竹节参多糖钠盐、钾盐和铵盐。所述竹节参多糖的溶剂化物优选为竹节参多糖的甘油、二甲基亚砜、乙醇、丙二醇、聚乙二醇溶剂化物。

本发明对抗病毒药物的辅料没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物的辅料即可。本发明对抗病毒药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物的制备方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种竹节参多糖及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例

1.称取中药竹节参（干燥根茎）1000 g，使用18 L蒸馏水在90℃的条件下提取3 h后收集提取液，重复提取3次。合并三次的提取液，在温度为60℃，真空度为0.1 Mpa的条件下进行减压浓缩至终体积为2 L。将浓缩后的提取液进行离心（4000 rpm×30 min），收集上清后向溶液中加入6 L的95%乙醇，静置沉淀12 h。进一步离心（4000 rpm×30 min）以收集沉淀，依次向沉淀中加入95％乙醇、无水乙醇、乙醚，充分搅拌后离心，沉淀减压干燥过夜。共得到167 g竹节参总多糖，记为WJP。

2.称取40 g的WJP溶解于400 mL的蒸馏水中，离心（4000 rpm×30 min）后上样于DEAE-纤维素离子交换层析柱（Cl-型；5.0×30.0 cm），上样流速为15 mL/min。依次使用5 L的蒸馏水、5 L的0.2 M氯化钠溶液和5 L的0.3 M氯化钠溶液进行洗脱，洗脱流速为15 mL/min，收集0.2 M氯化钠溶液的洗脱组分，减压浓缩后使用透析袋进行透析除盐（截留分子量为3500 Da），冷冻干燥后得到14 g的竹节参多糖，记为WJPA。

3.称取500 mg的WJPA溶解于5 mL的蒸馏水中，离心（12000 rpm×30 min）后上样于Sepharose CL-6B凝胶排阻层析柱（4.6×100.0 cm），上样流速为2.5 mL/min，使用0.15M氯化钠溶液进行洗脱，洗脱流速为0.4 mL/min，利用自动部分收集器收集样品，每 20 min收集一管。利用苯酚-硫酸显色测定洗脱曲线，收集合适的洗脱峰，减压浓缩后使用截留分子量为3500 Da的透析袋进行透析除盐，冻干后得到156 mg的竹节参多糖，记为WJPA-b。

4. WJPA-b的高效凝胶排阻色谱检测结果如图1所示，平均分子量为68.0 kDa；单糖组成的高效液相检测结果如图2所示，由阿拉伯糖（30.5%）、半乳糖（28.5%）、半乳糖醛酸（20.9%）、鼠李糖（14.1%）、葡萄糖醛酸（2.8%）、木糖（2.0%）和甘露糖（1.2%）组成；其¹³C NMR谱图如图3所示，由[→2)-α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA-(1→]二糖重复单位交替连接形成主链，在Rhap的O-4位形成分支连接有侧链，主链分支度为60%，所述侧链涉及以下成分：α-L-1,5-阿拉伯聚糖、β-D-1,4-半乳聚糖、I型阿拉伯半乳聚糖和II型阿拉伯半乳聚糖。

实施例

1.称取中药竹节参（干燥根茎）1000 g，使用16 L蒸馏水在90℃的条件下提取3 h后收集提取液，重复提取3次。合并三次的提取液，在温度为60℃，真空度为0.1 Mpa的条件下进行减压浓缩至终体积为2 L。将浓缩后的提取液进行离心（4000 rpm×30 min），收集上清后向溶液中加入3 L的95%乙醇，静置沉淀12 h。进一步离心（4000 rpm×30 min）以收集沉淀，依次向沉淀中加入95％乙醇、无水乙醇、乙醚，充分搅拌后离心，沉淀减压干燥过夜。共得到135 g竹节参总多糖，记为WJP。

2.称取40 g的WJP溶解于400 mL的蒸馏水中，离心（4000 rpm×30 min）后上样于DEAE-纤维素离子交换层析柱（Cl-型；5.0×30.0 cm），上样流速为15 mL/min。依次使用5 L的蒸馏水、5 L的0.2 M氯化钠溶液和5 L的0.3 M氯化钠溶液进行洗脱，洗脱流速为30 mL/min，收集0.2 M氯化钠溶液的洗脱组分，减压浓缩后使用透析袋进行透析除盐（截留分子量为3500 Da），冷冻干燥后得到16.5 g的竹节参多糖，记为WJPA。

3.称取500 mg的WJPA溶解于5 mL的蒸馏水中，离心（12000 rpm×30 min）后上样于Sepharose CL-6B凝胶排阻层析柱（4.6×100.0 cm），上样流速为2.5 mL/min，使用0.15M氯化钠溶液进行洗脱，洗脱流速为0.4 mL/min，利用自动部分收集器收集样品，每20 min收集一管。利用苯酚-硫酸显色测定洗脱曲线，收集合适的洗脱峰，减压浓缩后使用截留分子量为3500 Da的透析袋进行透析除盐，冻干后得到173 mg的竹节参多糖，记为WJPA-b。

4. WJPA-b的高效凝胶排阻色谱检测结果如图1所示，平均分子量为83.0 kDa；单糖组成的高效液相检测结果如图2所示，由阿拉伯糖（35.4%）、半乳糖（29.2%）、半乳糖醛酸（16.3%）、鼠李糖（9.9%）、木糖（4.7%）、葡萄糖醛酸（3.0%）和甘露糖（1.5%）组成；¹³C NMR谱图如图3所示，由[→2)-α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA-(1→]二糖重复单位交替连接形成主链，在Rhap的O-4位形成分支连接有侧链，主链分支度为65%，所述侧链涉及以下成分：α-L-1,5-阿拉伯聚糖、β-D-1,4-半乳聚糖、I型阿拉伯半乳聚糖和II型阿拉伯半乳聚糖。

实施例

1.称取中药竹节参（干燥根茎）1000 g，使用20 L蒸馏水在90℃的条件下提取3 h后收集提取液，重复提取3次。合并三次的提取液，在温度为60℃，真空度为0.1 Mpa的条件下进行减压浓缩至终体积为2 L。将浓缩后的提取液进行离心（4000 rpm×30 min），收集上清后向溶液中加入8 L的95%乙醇，静置沉淀12 h。进一步离心（4000 rpm×30 min）以收集沉淀，依次向沉淀中加入95％乙醇、无水乙醇、乙醚，充分搅拌后离心，沉淀减压干燥过夜。共得到183 g竹节参总多糖，记为WJP。

2. 称取40 g的WJP溶解于400 mL的蒸馏水中，离心（4000 rpm×30 min）后上样于DEAE-纤维素离子交换层析柱（Cl- 型；5.0×30.0 cm），上样流速为15 mL/min。依次使用5L的蒸馏水、5 L的0.2 M氯化钠溶液和5 L的0.3 M氯化钠溶液进行洗脱，洗脱流速为45 mL/min，收集0.2 M氯化钠溶液的洗脱组分，减压浓缩后使用透析袋进行透析除盐（截留分子量为3500 Da），冷冻干燥后得到11.5 g的竹节参多糖，记为WJPA。

3. 称取500 mg的WJPA溶解于5 mL的蒸馏水中，离心（12000 rpm×30 min）后上样于Sepharose CL-6B凝胶排阻层析柱（4.6×100.0 cm），上样流速为2.5 mL/min，使用0.15M氯化钠溶液进行洗脱，洗脱流速为0.4 mL/min，利用自动部分收集器收集样品，每20 min收集一管。利用苯酚-硫酸显色测定洗脱曲线，收集合适的洗脱峰，减压浓缩后使用截留分子量为3500 Da的透析袋进行透析除盐，冻干后得到144 mg的竹节参多糖，记为WJPA-b。

4. WJPA-b的高效凝胶排阻色谱检测结果如图1所示，平均分子量为52.0 kDa；单糖组成的高效液相检测结果如图2所示，由阿拉伯糖（26.2%）、半乳糖（24.0%）、半乳糖醛酸（31.2%）、鼠李糖（14.1%）、葡萄糖醛酸（1.8%）、木糖（1.5%）和甘露糖（1.2%）组成；¹³C NMR谱图如图3所示，由[→2)-α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA-(1→]二糖重复单位交替连接形成主链，在Rhap的O-4位形成分支连接有侧链，主链分支度为45%，所述侧链涉及以下成分：α-L-1,5-阿拉伯聚糖、β-D-1,4-半乳聚糖、I型阿拉伯半乳聚糖和II型阿拉伯半乳聚糖。

实施例

竹节参多糖对细胞安全性的评价

考克斯班尼犬肾脏细胞系（MDCK），来源于军事兽医研究所病毒学研究室。将于液氮中储存的MDCK细胞取出，连续传三代将其复苏，待细胞长势良好后用于实验研究。

将MDCK细胞接种与96孔板，并进行细胞计数，每孔细胞量为1×10⁵，在37℃，5％CO₂恒温细胞孵育箱中培养过夜。待细胞密度在70~80%时分别加入实施例1、2和3制备的多糖溶液，使其终浓度分别为0μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL，800μg/mL和1000μg/mL，共6个浓度，每个浓度测6个复孔。另设立PBS对照，同样进行6个重复，继续培养，每天在显微镜下观察细胞状态。加药48h左右时，每孔加入10μL的MTT溶液（5mg/mL），于37℃、5％CO₂的孵育箱继续培养3~4小时后，加入100μL二甲基亚砜（DMSO）溶液，轻轻混匀后置于37℃、5％CO₂条件中继续孵育10~15分钟后进行OD₅₇₀值的测定。使用Graphpad Prism 8.0对所测数据进行分析，按照公式I计算WJPA-b多糖对MDCK细胞生长的活力影响。

MDCK细胞活力（%）=WJPA-b多糖处理组OD₅₇₀值/对照组OD₅₇₀值×100% 公式I

其中，所述对照组OD₅₇₀值为浓度0μg/mL的多糖溶液处理组OD₅₇₀值。

检测结果如表1和图4所示，1000μg/mL的WJPA-b多糖在对MDCK细胞未观察到显著的生长抑制现象。

表1 WJPA-b对MDCK细胞生长的影响（平均值±标准差，单位为%）

实施例

竹节参多糖对野生型新型冠状病毒（SARS-CoV-2/K005321）在细胞水平复制的影响

非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)来源于军事兽医研究所病毒学研究室。竹节参多糖由上述实施例1~3制备得到。将于液氮中储存的Vero-E6细胞取出，连续传三代将其复苏，待细胞长势良好后用于实验研究。将长势良好的Vero-E6细胞以胰酶消化后进行细胞计数，接种于96孔板，每孔细胞量为1×10⁵。在接种12小时内且细胞处于单层状态时进行药物作用的研究。将于-80℃保存新型冠状病毒野生型毒株（SARS-CoV-2/K005321）放置于冰上缓慢融化，分别将含量为MOI=0.1的病毒稀释液接种于96孔板中，接毒5h后进行给药，在96孔板中分别加入50μL梯度浓度的实施例1、2和3制备的竹节参多糖稀释液（0μg/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL），同时还设置细胞对照组即正常培养的细胞。每个处理进行3个重复。将接种后的细胞板放置于37℃，5%的CO₂培养箱中继续培养后运用MTT法检测细胞活性，加药24h左右时，每孔加入10μL的MTT溶液（5mg/mL），于37℃、5％CO₂孵育箱培养3~4小时后，加入100μL二甲基亚砜（DMSO）溶液，轻轻混匀后置于37℃、5％CO₂条件中继续孵育10~15分钟后对细胞悬液进行OD₅₇₀值测定，按照公式II计算抑制率。

抑制率（%）=(WJPA-b多糖处理组OD₅₇₀值-病毒对照组OD₅₇₀值)÷(细胞对照组OD₅₇₀值-病毒对照组OD₅₇₀值)×100% 公式II

其中，病毒对照组OD₅₇₀值是指浓度为0μg/mL的竹节参多糖稀释液处理组的OD值。

实验结果揭示，竹节参多糖对新型冠状病毒野生型毒株（SARS-CoV-2/K005321）在细胞水平的复制有一定的抑制作用。检测结果如表2和图5所示，三组WJPA-b多糖在Vero-E6细胞上对新型冠状病毒野生型毒株（SARS-CoV-2/K005321）的半数抑制浓度EC₅₀值分别为11.38μg/mL、11.65μg/mL、13.3μg/mL。

表2 WJPA-b对新冠病毒野生型毒株（SARS-CoV-2/K005321）抑制率（平均值±标准差，单位为%）

实施例

竹节参多糖对变异型新型冠状病毒（SARS-CoV-2/Omicron BA.1）在细胞水平复制的影响

人肝癌细胞(Huh7)来源于军事兽医研究所病毒学研究室。竹节参多糖是上述实施例1~3制备得到。将于液氮中储存的Huh7细胞取出，连续传三代将其复苏，待细胞长势良好后用于实验研究。将长势良好的Huh7细胞以胰酶消化后进行细胞计数，接种于96孔板，每孔细胞量为1×10⁵。在接种12小时内且细胞处于单层状态时进行药物作用的研究。将于-80℃保存变异型新型冠状病毒毒株（SARS-CoV-2/Omicron BA.1）放置于冰上缓慢融化，分别将含量为MOI=0.1的病毒稀释液接种于96孔板中，接毒5h后进行给药，在96孔板中分别加入50μL梯度浓度的实施例1、2和3制备的竹节参多糖溶液（0μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL，800μg/mL，1000μg/mL），进行3个重复。将接种后的细胞板放置于37℃，5%的CO₂培养箱中继续培养，6小时加药处理，并在48h后运用RT-qPCR法（Characterization of TwoHeterogeneous Lethal Mouse-Adapted SARS-CoV-2 Variants RecapitulatingRepresentatinve Aspects of Human COVID-19.Front immunol,2022,2,7:13:821664,DOI:10.3389,fimmu.2022.821664.）检测病毒Ct值，按照公式III计算病毒核酸拷贝数。

病毒核酸拷贝数=10^{│[(Ct-41.02)÷3.444]│}×33.33 公式III。

实验结果揭示竹节参多糖对新型冠状病毒变异型毒株（SARS-CoV-2/OmicronBA.1）在细胞水平的复制有一定的抑制作用。检测结果如表3和图6所示，三组WJPA-b多糖可有效降低新型冠状病毒变异型毒株（SARS-CoV-2/Omicron BA.1）在Huh7细胞中的病毒RNA拷贝数。

表3 WJPA-b对新冠病毒变异型毒株（SARS-CoV-2/Omicron BA.1）拷贝数影响结果（平均值±标准差，单位为病毒RNA拷贝数/mL）

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种竹节参多糖，其特征在于，单糖组成包括以下种类的单糖：鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖；

所述木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖的总摩尔量与半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的摩尔量之比为（0.45~0.92）：（1.63~3.12）：（0.99~1.41）：（2.62~3.54）：（2.40~2.92）；

所述竹节参多糖是一种RG-I型果胶，由[→2)-α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA-(1→]二糖重复单位交替连接形成主链，在Rhap的O-4位形成分支连接有侧链，主链分支度为45%~65%，所述侧链包括以下成分：α-L-1,5-阿拉伯聚糖、β-D-1,4-半乳聚糖、I型阿拉伯半乳聚糖和II型阿拉伯半乳聚糖；

所述竹节参多糖的分子量为50.0 kDa~100.0 kDa；

所述竹节参多糖含有以下摩尔百分比的单糖：阿拉伯糖26.2%~35.4%、半乳糖24.0%~29.2%、半乳糖醛酸16.3%~31.2%、鼠李糖9.9%~14.1%、木糖1.5%~4.7%、葡萄糖醛酸1.8%~3.0%和甘露糖1.2%~1.5%。

2.权利要求1所述竹节参多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）竹节参干燥根茎经水提醇沉，将醇沉后的体系固液分离，收集固相，得到竹节参总多糖；

（2）将步骤1）中所述竹节参总多糖溶解，上样于离子交换层析柱，依次使用蒸馏水、0.2M氯化钠溶液、0.3 M氯化钠溶液洗脱，收集0.2 M氯化钠溶液洗脱组分并采用截留分子量为3500 Da的透析袋透析除盐，得到竹节参多糖；

（3）将步骤2）中所述竹节参多糖溶解后上样于凝胶排阻层析柱，用0.15 M氯化钠溶液洗脱后，收集有效的色谱峰对应的洗脱溶液，经除盐和冻干，得到精制的竹节参多糖。

3.根据权利要求2所述竹节参多糖的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述醇沉时体系中乙醇的终浓度为体积百分含量50%~80%。

4. 根据权利要求2所述竹节参多糖的制备方法，其特征在于，步骤2）中离子交换层析柱的上样线性流速为15~30 mL/min，洗脱线性流速为15 ~60 mL/min；每升离子交换层填料的载样量不超过50 g。

5. 根据权利要求2~4任意一项所述竹节参多糖的制备方法，其特征在于，步骤3）中所述凝胶排阻层析柱的上样线性流速为2.5 ~5 mL/min，洗脱线性流速为0.3~0.5 mL/min；上样溶液的体积不超过凝胶排阻层析柱体积的2%。

6.权利要求1所述竹节参多糖或权利要求2~5任意一项所述竹节参多糖的制备方法制备得到竹节参多糖在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述竹节参多糖或所述竹节参多糖的制备方法制备得到竹节参多糖在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒包括野生型毒株和/或变异型毒株。

8.一种新型冠状病毒增殖抑制剂，其特征在于，包括权利要求1所述竹节参多糖和辅料。

9.一种抗新型冠状病毒药物，其特征在于，包括权利要求1所述竹节参多糖和药学上可接受的辅料。