CN115606581A - 干细胞冻存液及冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及间充质干细胞冻存液及冻存方法。本发明提供了埃洛石纳米管尚未被发现的新用途，研究结果显示，添加了埃洛石纳米管的干细胞冻存液能够显著降低细胞冻存损伤，细胞冻存6个月后存活率可达到72％以上，而如果冻存液同时含有埃洛石纳米管和聚磷酸盐则能够使细胞存活率达到90％以上；采用本发明添加了埃洛石纳米管和聚磷酸盐的冻存液冻存细胞无需经过“慢冻”过程，直接置于液氮中低温保存亦可保持高的细胞存活率；本发明冻存液成分简单，且不含胎牛血清和有毒性的DMSO，安全性更高。

Description

干细胞冻存液及冻存方法
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域。更具体地，涉及干细胞冻存液及冻存方法。
背景技术
目前，间充质干细胞的冻存液主要为含有牛来源血清成分的5％-20％胎牛血清(FBS)、细胞基础培养基(IDMEM或α-MEM或F12/DMEM)和10％DMSO。其中，DMSO属于冷冻保护剂，可以保护细胞在降温过程中免受晶体物质的伤害，但其含量越高对细胞的毒性作用越大，而FBS为人源细胞引入了动物源的成分，有一定的安全隐患，如引入支原体、牛源致病菌等，并具有批次不稳定性，而如果不添加FBS，细胞复苏后活率则较低。因此，无血清，DMSO含量低甚至不含DMSO的干细胞冻存液的研发难点在于如何提高间充质干细胞冻存后的复苏率。
埃洛石纳米管(HNTs)为天然的硅铝酸盐，已有报道将其作为细胞粘附的基质材料表现出良好的生物相容特性及较小的毒性，但未见将其用作冻存干细胞。
发明内容
本发明的发明人经过大量的研究，发现埃洛石纳米管可以充当冷冻保护剂的效果，将其加入到冻存液体系中能够获得较高的冻存细胞的复苏率，当其聚磷酸盐联合使用时，效果更加显著，获得了更高的细胞复苏率，且无需常规“慢冻”过程，直接置于超低温保存较长时间亦可获得高的细胞复苏率。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明其中一个方面提供了埃洛石纳米管在超低温冻存细胞中的用途。埃洛石纳米管作为具有良好生物相容性的基质材料，发明人意外发现，埃洛石纳米管可以在低温冷冻过程中充当成核基体的作用，降低突破成核势垒所需要的能量，促进胞外晶核的生长，减少胞内冰的生成几率，降低细胞胞内冰晶损伤，从而提高冻存细胞复苏率。
实际上，埃洛石纳米管的纵横比(管径/管长)与其异相成核具有一定的约束关系，因为纵横比一方面影响了埃洛石纳米管在培养基中的分散，另一方面发现，只有在某个合适的纵横比区间内，才能发挥预期的效果。在本发明其中一个实施方式中，埃洛石纳米管埃洛石纳米管的纵横比优选为30～80，进一步优选为50～80，这时埃洛石纳米管的管径通常介乎20～40nm，管长介乎1μm～1.6μm。
本发明中所述细胞优选为干细胞，所述干细胞包括全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞，在本发明其中一个实施方式中，所述干细胞优选为多能干细胞。
根据埃洛石纳米管表现出的这个特性，本发明另一方面提供了一种干细胞冻存液，包含埃洛石纳米管。根据表1结果可知，加入埃洛石纳米管冻存干细胞6个月后，细胞复苏率保持在72％的水平。
在本发明其中一个实施方式中，在所述冻存液中，埃洛石纳米管的浓度为5～30μg/mL，优选为10～30μg/mL，更优选为20～30μg/mL，例如可以是20μg/mL、21μg/mL、22μg/mL、23μg/mL、24μg/mL、25μg/mL、26μg/mL、27μg/mL、28μg/mL、29μg/mL或30μg/mL。虽然摸索试验结果显示随着埃洛石纳米管浓度的增加，其促进胞外冰晶成核作用越强，但是浓度越高，胞外冰晶成核速率较快，且冰晶呈棱角锋利的树枝状，有可能损伤到细胞膜；同时产生的晶核若较多，对复苏过程也存在潜在威胁，因此最佳的浓度范围为20～30μg/mL。
作为本发明另一个意外的发现，在冻存液中同时添加某些聚磷酸盐类能够增强埃洛石纳米管的成核作用，这些聚磷酸盐类优选为六偏磷酸钠或三聚磷酸钠，更优选为三聚磷酸钠，在这些聚磷酸盐的存在下，埃洛石纳米管的成核作用变得非常显著，试验结果显示，加入特定纵横比的埃洛石纳米管与聚磷酸钠盐组合冻存脐带间充质干细胞6个月后，细胞存活率可达到90％以上，最高可达到96.81％，与单独加入埃洛石纳米管相比提高了33.8％。
在本发明其中一个实施方式中，冻存液中三聚磷酸钠的浓度为0.1～1.5g/L，优选为0.3～1.5g/L，更优选为0.8～1.5g/L，例如可以是0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L或1.5g/L。
在本发明其中一个实施方式中，还包含基础培养基；所述基础培养基包括DMEM、DMEM/F12培养基，优选为DMEM培养基。
本发明另一方面提供了一种间充质干细胞冻存液，其至少包含以下成分：
三聚磷酸钠 0.1～1.5g/L；
埃洛石纳米管 5～30μg/mL；和
DMEM培养基 余量。
在本发明其中一个实施方式中，所述冻存液至少包含以下成分：
三聚磷酸钠 0.1～1.5g/L；
埃洛石纳米管 10～30μg/mL；和
DMEM培养基 余量。
在本发明其中一个实施方式中，所述冻存液至少包含以下成分：
三聚磷酸钠 1.2g/L；
埃洛石纳米管 25μg/mL；和
DMEM培养基 余量。
在本发明其中一个实施方式中，所述冻存液至少包含以下成分：
三聚磷酸钠 1.0g/L；
埃洛石纳米管 15μg/mL；和
DMEM培养基 余量。
在本发明其中一个实施方式中，所述冻存液至少包含以下成分：
三聚磷酸钠 0.8g/L；
埃洛石纳米管 22μg/mL；和
DMEM培养基 余量。
在本发明其中一个实施方式中，所述冻存液至少包含以下成分：
三聚磷酸钠 1.5g/L；
埃洛石纳米管 30μg/mL；和
DMEM培养基 余量。
本发明另一方面提供了间充质干细胞冻存方法，包括使用所述冻存液冻存间充质干细胞的步骤。
试验显示，采用添加了埃洛石纳米管和聚磷酸盐的冻存液冻存细胞无需经过“慢冻”过程，直接置于液氮中低温保存亦可保持高的细胞存活率。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了埃洛石纳米管尚未被发现的新用途，研究结果显示，添加了埃洛石纳米管的干细胞冻存液能够显著降低细胞冻存损伤，细胞冻存6个月后存活率可达到72％以上，而如果冻存液同时含有埃洛石纳米管和聚磷酸盐则能够使细胞存活率达到90％以上。
(2)采用本发明添加了埃洛石纳米管和聚磷酸盐的冻存液冻存细胞无需经过“慢冻”过程，直接置于液氮中低温保存亦可保持高的细胞存活率。
(3)本发明冻存液成分简单，且不含胎牛血清和有毒性的DMSO。
附图说明
图1为各组干细胞复苏后生长曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1、干细胞冻存液
三聚磷酸钠 1.2g/L；
埃洛石纳米管 25μg/mL；和
DMEM培养基 余量。
其中，埃洛石纳米管的管径为20nm，管长为1μm。
实施例2、干细胞冻存液
三聚磷酸钠 1.0g/L；
埃洛石纳米管 15μg/mL；和
DMEM培养基 余量。
其中，埃洛石纳米管的管径为20nm，管长为1.6μm。
实施例3、干细胞冻存液
三聚磷酸钠 0.8g/L；
埃洛石纳米管 22μg/mL；和
DMEM培养基 余量。
其中，埃洛石纳米管的管径为40nm，管长为1.2μm。
实施例4、干细胞冻存液
三聚磷酸钠 1.5g/L；
埃洛石纳米管 30μg/mL；和
DMEM培养基 余量。
其中，埃洛石纳米管的管径为40nm，管长为1.6μm。
实施例5、干细胞冻存液
六偏磷酸钠 1.2g/L；
埃洛石纳米管 25μg/mL；和
DMEM培养基 余量。
其中，埃洛石纳米管的管径为20nm，管长为1.2μm。
对比例1、与实施例1相比，区别在于，不包含三聚磷酸钠。
对比例2、与实施例1相比，区别在于，不包含埃洛石纳米管。
对比例3、与实施例1相比，区别在于，埃洛石纳米管的管径为20nm，管长为2μm。
对比例4、与实施例1相比，区别在于，埃洛石纳米管的管径为40nm，管长为0.8μm。
试验例一、脐带间充质干细胞冻存试验
1.1细胞冻存：取经鉴定符合的生长状态良好的P6代脐带间充质干细胞，0.25％胰酶消化，1200rpm/min离心收集细胞，采用实施例1～5以及对比例1～4冻存液重悬细胞，使冻存液中细胞的密度为1×107个/mL，轻轻吸打混匀，分装于冻存管中，每管1mL；将冻存管置于液氮中，冻存6个月。
1.2细胞复苏：将冻存管中液氮中取出，快速置于38℃水浴锅中，轻轻震荡冻存管，直至细胞悬液完全融化；加入DMEM培养基稀释细胞悬液，用培养基把冻存管洗2次，1500rpm离心4min，弃上清，加入DMEM培养基重悬，轻轻吹匀，与台盼蓝染色液按1:1混匀后进行活细胞计数，计算细胞存活率，活细胞率(％)＝活细胞总数/细胞总数×100％。
表1：
Figure BDA0003884905440000051
Figure BDA0003884905440000061
注：对照组为含10％FBS、10％DMSO的DMEM/F12培养基；与实施例1相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
根据表1结果可知，加入埃洛石纳米管冻存干细胞6个月后，细胞复苏率保持在72％的水平，而加入特定纵横比的埃洛石纳米管与聚磷酸钠盐组合冻存脐带间充质干细胞6个月后，细胞存活率可达到90％以上，最高可达到96.81％，与单独加入埃洛石纳米管相比提高了33.8％；而埃洛石纳米管纵横比的改变均会导致冻存效果有明显的改变。
1.3生长曲线测定：将各组复苏的干细胞按1×105/mL接种于培养皿中，加入DMEM培养基，置于37℃，5CO2条件下培养，待细胞达到80-90％融合度时，采用0.25％胰酶消化，1200rpm/min离心收集细胞，采用DMEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×104/mL，按每孔100μL接种于96孔板中，总设7块培养板，每块培养板分组，每组设3个复孔，将培养板置于37℃，5CO2条件下培养，每隔24h取出一块培养板，向样品孔中加入20μL浓度为5mg/ml的MTT，继续孵育4h，吸出孔内液体，终止培养，每孔加入150μLDMSO，摇床室温震荡10min，采用酶联免疫检测仪测定OD490nm，结果如图1所示。
由图1结果可知，经实施例1冻存6个月的细胞复苏后生长曲线呈标准的S型，且在96h达到增殖顶峰，增殖速率明显较其他组快。
1.4表面抗原表达：将实施例1～5组复苏的干细胞按1×105/mL接种于培养皿中，加入DMEM培养基，置于37℃，5CO2条件下培养，待细胞达到80-90％融合度时，采用0.25％胰酶消化，按1:3的比例传代培养，取P3代细胞，采用流式细胞仪鉴定其表面抗原表达情况，结果如表2所示。
表2：
Figure BDA0003884905440000062
Figure BDA0003884905440000071
根据表2可知，采用埃洛石纳米管和聚磷酸盐冻存的各组细胞复苏后，各组细胞表面抗原CD44、CD73、CD90和CD105表达阳性率均＞95％，CD34、CD45、CD19和CD14表达阳性率均＜5％，表明，冻存后细胞表型仍然维持稳定。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.埃洛石纳米管在超低温冻存细胞中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述埃洛石纳米管的纵横比为30～80。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述细胞为干细胞。
4.一种干细胞冻存液，其特征在于，包含埃洛石纳米管。
5.根据权利要求4所述干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液中，埃洛石纳米管的浓度为5～30μg/mL。
6.根据权利要求4或5所述干细胞冻存液，其特征在于，还包括三聚磷酸钠0.1～1.5g/L。
7.根据权利要求4或5所述干细胞冻存液，其特征在于，还包含基础培养基。
8.一种干细胞冻存液，其特征在于，其至少包含以下成分：
三聚磷酸钠0.1～1.5g/L；
埃洛石纳米管5～30μg/mL；和
DMEM培养基余量。
9.根据权利要求8所述干细胞冻存液，其特征在于，其至少包含以下成分：
三聚磷酸钠0.1～1.5g/L；
埃洛石纳米管10～30μg/mL；和
DMEM培养基余量。
10.干细胞冻存方法，其特征在于，包括使用根据权利要求4～9任一项所述冻存液冻存干细胞的步骤。
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Address before: 510420 room A418, 4th floor, building 1, No. 1368-1392, Baiyun Avenue North, Baiyun District, Guangzhou, Guangdong Province

Applicant before: Guangzhou Meijian Biotechnology Co.,Ltd.

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