CN108751212A - 一种用作siRNA保护的埃洛石纳米管材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用作siRNA保护的埃洛石纳米管材料及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：(1)原矿埃洛石经过粉磨预处理；(2)将预处理后的原矿埃洛石溶于去离子水中得到原矿埃洛石溶液，超声分散；(3)将超声分散后的溶液在5000‑7000r/min的转速下第一次离心10min，取上清液在9000‑9200r/min的转速下第二次离心15min，50‑70℃条件下干燥24h即得埃洛石纳米管。本发明通过对成本低廉、简单易得的原矿埃洛石进行简单的预处理、超声和分步离心后，得到的尺寸可控在202‑276nm之间的埃洛石纳米管，细胞毒性小，生物相容性好，可高效装载保护siRNA。

Description

一种用作siRNA保护的埃洛石纳米管材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种非病毒的siRNA保护材料，具体涉及一种用作siRNA保护的埃洛石纳米管材料及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤是全世界人类死亡的主要原因之一。近年恶性肿瘤的临床治疗，抗肿瘤新药研发以及精准综合诊疗等方面取得了重大的进步。RNA干扰(RNAi)是一种能够有效抑制基因表达的靶向性转录后基因沉默机制。通过将小干扰RNA(siRNA)递送入特定的细胞内，引起信使RNA失活，从而达到阻止细胞内相关癌基因蛋白表达的目的。由于RNAi可以特异性的抑制基因表达，所以可用于基因病、病毒感染、癌症等治疗。
不管是用于体外亦或体内治疗，siRNA都面临着复杂的环境，培养基、体液中均存在大量核酸类酶，导致裸露的siRNA易于被降解。以血液为例，由于核酸酶的存在，siRNA的半衰期不到15min。因此制备出一种能够保护siRNA不被核酸酶降解的纳米材料尤为重要。基于纳米材料能够将siRNA包裹于材料内，由于空间位阻的存在而使核酸酶难以接触siRNA分子，不利于核酸酶发挥作用而起到保护效果。埃洛石(HNTs)为一种天然的粘土矿物，其特殊的管状形貌有利于实现对siRNA的管内装载，从而达到保护的目的。而天然的埃洛石管长较长(约1μm)，且易于团聚成微球，不利于对siRNA的直接装载。因此需制备出一种分散度良好、管长适中的埃洛石纳米管高效装载siRNA，实现保护作用。
发明内容
针对siRNA容易被环境中的核酸酶作用降解的问题，本发明提出了一种用作siRNA保护的埃洛石纳米管材料及其制备方法，通过对成本低廉、简单易得的原矿埃洛石进行简单的粉磨预处理、超声和分步离心后，得到的尺寸可控在202-276nm之间的埃洛石纳米管，生物相容性好，可高效装载保护siRNA。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种用作siRNA保护的埃洛石纳米管材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)原矿埃洛石经过粉磨预处理；
(2)将预处理后的原矿埃洛石溶于去离子水中得到浓度为0.01-0.03g/mL的原矿埃洛石溶液，于400-600W功率下超声25min；
(3)将超声分散后的溶液在5000-7000r/min的转速下第一次离心10min，取上清液在9000-9200r/min的转速下第二次离心15min，50-70℃条件下干燥24h即得埃洛石纳米管，管长为202-276nm。
另外，本发明还需要保护由所述制备方法制备得到的埃洛石纳米管材料以及该材料在siRNA保护方面的应用。
本发明的优点和有益效果在于：
(1)原矿埃洛石易于团聚结块形成微米级的团聚物，对siRNA装载保护效果差，且其本身难以进入细胞，不适合用作siRNA保护载体。而本发明的埃洛石纳米管通过对预处理后的原矿埃洛石进行超声分散，然后采取分两次离心的方式，第一次在5000-7000r/min转速下离心，取第一次离心后的上清液再在9000-9200r/min的转速下离心分离，将埃洛石纳米管管长可控在202-276nm的范围内，所得埃洛石纳米管细胞毒性小，生物相容性好，对siRNA装载效率高。
(2)本发明的埃洛石纳米管通过两次离心，将管长可控在202-276nm的范围内，相比于分别采取5000-7000r/min和9000-9200r/min进行一次分离得到的产物，其管长在600nm以上，容易刺穿细胞，产生较大的细胞毒性。而本发明的埃洛石纳米管通过两次分离，可控管长，对siRNA装载效率明显提高，细胞毒性更小。
(3)埃洛石纳米管的原料来源广，成本低，制备过程简单，制备条件温和，绿色无污染，对操作人员的影响较小，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为粉磨后的原矿埃洛石和实施例1所得埃洛石纳米管的SEM图。
图2为实施例1-3所得埃洛石纳米管和对比例1-3所得产物的细胞毒性图，nc为不加材料的对照组，细胞存活率为83％。
图3为实施例1-3所得埃洛石纳米管和对比例1-3所得产物装载siRNA后所得溶液的凝胶电泳结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本说明书中的术语u-HNTs-500W-5000r-9100r，u代表超声，HNTs代表埃洛石，500W代表功率，5000r代表第一次离心转速，9100r代表第二次离心转速。
实施例1
埃洛石纳米管制备：
称取0.60g经粉磨后的原矿埃洛石，加入60mL去离子水中。在400W功率下超声分散25min。超声分散溶液于5000r/min条件下第一次离心10min，再将上清液于9000r/min条件下第二次离心15min，50℃下干燥24h，即得埃洛石纳米管u-HNTs-400W-5000r-9000r，平均管长约为276nm，细胞毒性试验结果表明其细胞存活率为81.5％。
RNA装载：
以pH＝7.6生理盐水，配置3mg/mL的u-HNTs-400W-5000r-9000r溶液。取1管1ODRNA粉末，在1000r/min的转速下离心5min后向每管加入125μL DEPC水，盖上管盖，振荡溶解后得到20μM RNA溶液。向所得RNA溶液中加入90μL u-HNTs-400W-5000溶液，30s振荡混匀3次，真空浸渍3h，得到siRNA/u-HNTs-400W-5000r-9000r溶液。
实施例2
埃洛石纳米管制备：
称取1.20g经粉磨后的原矿埃洛石，加入60mL去离子水中。在500W功率下超声分散25min。超声分散溶液于6000r/min条件下第一次离心10min，再将上清液于9100r/min条件下第二次离心15min，60℃下干燥24h，即得埃洛石纳米管u-HNTs-500W-6000r-9100r，平均管长约为247nm，细胞毒性试验结果表明其细胞存活率为80.2％。
RNA装载：
装载过程同实施例1，采用u-HNTs-500W-6000r-9100r对RNA进行装载，得到siRNA/u-HNTs-500W-6000r-9100r溶液。
实施例3
埃洛石纳米管制备：
称取1.80g经粉磨后的原矿埃洛石，加入60mL去离子水中。在600W功率下超声分散25min。超声分散溶液于7000r/min条件下第一次离心10min，再将上清液于9200r/min条件下第二次离心15min，70℃下干燥24h，即得埃洛石纳米管u-HNTs-600W-7000r-9200r，平均管长约为202nm，细胞毒性试验结果表明其细胞存活率为78.7％。
RNA装载：
装载过程同实施例1，采用u-HNTs-600W-7000r-9200r对RNA进行装载，得到siRNA/u-HNTs-600W-7000r-9200r溶液。
对比例1
称取0.60g经粉磨后的原矿埃洛石，加入60mL去离子水中。在400W功率下超声分散25min。超声分散溶液于5000r/min条件下离心10min，50℃下干燥24h，即得埃洛石纳米管u-HNTs-400W-5000r，平均管长约为683nm，细胞毒性试验结果表明其细胞存活率为53.2％。
RNA装载：
装载过程同实施例1，采用u-HNTs-400W-5000r对RNA进行装载，得到siRNA/u-HNTs-400W-5000r溶液。
对比例2
称取0.60g经粉磨后的原矿埃洛石，加入60mL去离子水中。在400W功率下超声分散25min。超声分散溶液于9000r/min条件下离心10min，50℃下干燥24h，即得埃洛石纳米管u-HNTs-400W-9000r，平均管长约为618nm，细胞毒性试验结果表明其细胞存活率为59.4％。
RNA装载：
装载过程同实施例1，采用u-HNTs-400W-9000r对RNA进行装载，得到siRNA/u-HNTs-400W-9000r溶液。
对比例3
粉磨后的原矿埃洛石装载RNA：
装载过程同实施例1，采用HNTs对RNA进行装载，得到siRNA/HNTs溶液。
图1为粉磨后的原矿埃洛石和实施例1所得埃洛石纳米管的SEM图。a为粉磨后的原矿埃洛石的SEM图，b为实施例1所得埃洛石纳米管的SEM图。由图可知，粉磨后的原矿埃洛石易于团聚结块形成微米级的团聚物，而实施例1所得埃洛石纳米管则表现出了明显的分散性，颗粒比较均匀。
图2为实施例1-3所得埃洛石纳米管和对比例1-3所得产物的细胞毒性图，不加材料对照组的细胞存活率为83％。由图可知，实施例1-3所得埃洛石纳米管经过两次分离，将管长可控在202-276nm的范围内，无明显细胞毒性，细胞存活率高，均达到78％以上。对比例1-2采用一次离心得到的产物，由于管长较长，容易刺穿细胞，产生相对较大的细胞毒性，细胞存活率低于60％。而对比例3的粉磨后的原矿埃洛石易于团聚结块形成微米级的团聚物，团聚部分难以进入细胞，未团聚部分进入细胞产生一定的细胞毒性，导致细胞存活率相对较低，略高于60％。
图3为实施例1-3所得埃洛石纳米管和对比例1-3所得产物装载siRNA后所得溶液的凝胶电泳结果图。由图可知，实施例1-3所得埃洛石纳米管对siRNA的装载效果最优，上清液中基本无siRNA剩余。对比例1-2采用一次离心得到的产物，表现出对siRNA具备一定的装载效果，而对比例3的粉磨后的原矿埃洛石装载效果最差，装载完成后上清液中明显有siRNA剩余。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种用作siRNA保护的埃洛石纳米管材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原矿埃洛石经过粉磨预处理；
(2)将预处理后的原矿埃洛石溶于去离子水中得到浓度为0.01-0.03g/mL的原矿埃洛石溶液，于400-600W功率下超声25min；
(3)将超声分散后的溶液在5000-7000r/min的转速下第一次离心10min，取上清液在9000-9200r/min的转速下第二次离心15min，50-70℃条件下干燥24h即得埃洛石纳米管。
所述埃洛石纳米管的管长为202-276nm。
2.根据权利要求1所述的制备方法制备得到的埃洛石纳米管材料。
3.一种权利要求2所述埃洛石纳米管材料在siRNA保护方面的应用。
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