CN1155592C - 具有镇静催眠作用的酸枣仁总黄酮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种酸枣仁总黄酮的制备方法，取酸枣仁，加热，粉碎，脱脂后，加入40-95%乙醇回流提取，提取液浓缩后上大孔树脂柱，用含水乙醇梯度洗脱，收集35～55%乙醇洗脱部分，回收溶剂后，得总黄酮，其可与药学辅料混合，制备具有镇静催眠作用的药物；该方法不但重现性好，而且杂质减少，总黄酮含量高，从而保证了疗效的稳定，并有利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于中药有效部位的提取分离方法，具体地说是从中药酸枣仁中提取分离具有镇静催眠作用总黄酮的方法。
背景技术
酸枣仁是鼠李科枣属植物(Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu exH.F.Chou)的干燥种子，能养肝宁心，敛汗生津，为传统镇静催眠良药。近年来的化学研究证明酸枣仁药材中含有脂肪油、皂甙、糖、多肽和黄酮类物质。虽有文献分别报道酸枣仁所含的脂肪油、皂甙和黄酮类物质均有镇静、催眠作用，但亦有研究对皂甙的镇静、催眠效果表示质疑。而酸枣仁中黄酮类物质则因其水溶性较大，分离较困难，更难以进行工业化的生产。
现有技术中，从酸枣仁中提取分离总黄酮类物质的方法均为萃取法。如：药材先用石油醚或乙醚索式提取法脱脂后，用甲醇或70％乙醇加热回流提取，再用乙酸乙脂或正丁醇萃取得总黄酮，参见：王健，生、炒酸枣仁中镇静催眠成分初探，中成药，1989，11(1)，19-21；曾路等，酸枣仁化学成分研究；药学学报：1987，22(2)：114-120。再如：药材脱脂后用乙醇加热回流提取，将此醇提取物用水溶解，用正丁醇萃取，正丁醇液用5％氢氧化钾处理，碱水液经盐酸中和后用正丁醇提取得到酚性成分，将酚性成分用甲醇反复重结晶，得总黄酮部位，参见：郭胜民等，酸枣仁中阿魏酸的提取、分离和鉴定，西北药学杂志，1995，10(1)，22-23；郭胜民等，酸枣仁总黄酮的中枢抑制作用，中药材，1998，21(11)，578-579。现有技术中采用萃取法从酸枣仁中提取分离总黄酮类物质，不但重现性不好，而且提取物中杂质较多，黄酮含量不高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是改进从酸枣仁中提取分离具有镇静催眠作用总黄酮的方法，使其不但重现性好，而且杂质减少，总黄酮含量高，从而保证了疗效的稳定，并有利于工业化生产。
为解决该技术问题，本发明研究了下述技术解决方案。
一种酸枣仁总黄酮的制备方法，其特征在于：取酸枣仁，加热，粉碎，脱脂后，加入40-95％乙醇回流提取，提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱，用含水乙醇梯度洗脱，收集35～55％乙醇洗脱部分，回收溶剂，残留物即为总黄酮。
上述酸枣仁总黄酮的制备方法，其特征在于：酸枣仁加热至微黄，粉碎成40目粉，石油醚脱脂后，用45-70％乙醇回流提取，提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱，用含水乙醇梯度洗脱，收集40～50％乙醇洗脱部分，回收溶剂，残留物即为总黄酮。
所述酸枣仁总黄酮的制备方法，其特征在于：酸枣仁用炒、烘焙或微波方法加热至微黄，粉碎成40目粉，石油醚脱脂后，用药材重量6-10倍体积的50-60％乙醇，于80～95℃条件下回流提取，提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱，用含水乙醇梯度洗脱，收集40～50％乙醇洗脱部分，回收溶剂，残留物即为总黄酮。
酸枣仁总黄酮的较好的制备方法是：用药材重量7-9倍体积的50-55％乙醇，于85～90℃条件下回流提取2次，提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱，用含水乙醇梯度洗脱，收集40～50％乙醇洗脱部分，回收溶剂，残留物即为总黄酮。
所述酸枣仁总黄酮的更为合适的制备方法为：用药材重量8倍体积的50％乙醇，于85℃条件下回流提取2次，提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱，依次用25％、45％、70％、95％的乙醇梯度洗脱，收集45％乙醇洗脱液，回收溶剂，残留物即为总黄酮。
前述酸枣仁总黄酮可与药学上适用载体混合，制备具有镇静催眠作用的药物。
本发明工艺所用的药材炮制方法是经实验比较而得出，提取溶剂种类和浓度、提取方法、药材粉碎目数等经过正交设计研究而成，保证了所得到的酸枣仁总黄酮得率高；大孔树脂的洗脱分段，经过严格的小浓度梯度实验，保证了所得到的分段部位中主要黄酮(spinosin，6-feruolspinosin等)的含量达到50～60％，药材中总黄酮的转移率为60～85％。
其研究步骤和详细数据如下：
1.药材
选用鼠李科枣属植物Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥种子，药材的性状特征、粉末特征、理化性质应符合中国药典2000版一部“酸枣仁”项下的内容。
2.优化提取工艺的技术条件
2.1药材炮制
药材经炒制后，提取物中黄酮类成分含量较高。
2.2提取溶剂
根据本课题组长期研究酸枣仁的经验，酸枣仁所含黄酮多为黄酮苷类极性较大的化合物，甲醇或乙醇是优良的提取溶剂，但甲醇毒性较大，所以本发明用乙醇溶液作为总黄酮的提取溶剂，而且采用含水量较高的乙醇提取。
2.3提取方式对提取效率的影响
分别取粉碎成40目的药材粉末约20g，精密称定，以8倍量50％乙醇按下列方法提取：
冷浸：8倍量溶剂冷浸12小时，提取2次。
渗漉：16倍量溶剂渗漉。
热回流：8倍量溶剂85℃热回流，提取2次。
分别合并各种提取液，按紫外分光光度法分别测定提取物中总黄酮量，结果如表1。
表1提取方式对提取效率的影响
样品
总黄酮得
提取方式 总黄酮得量(mg) 浸膏量(g)
重(g)
率(％)
50.00 201.6 5.6
50.01 冷浸 202.5 202.7±1.5 5.3 5.5±0.1 0.41
50.15 204.1 5.5
50.00 220.2 6.3
50.10 渗漉 225.4 222.3±3.2 6.2 6.2±0.4 0.44
50.03 219.7 6.2
50.09 308.6 7.8
50.08 热回流 306.9 306.2±2.6 7.8 7.6±0.2 0.61
50.00 303.2 7.4
以上结果可见，热提的提取效率最高，渗漉次之，冷浸较差，而且三者差异显著。
2.4提取工艺的优化
为了确定乙醇浓度、用量、温度以及提取次数对提取效率的影响，我们进行了正交设计试验研究，以总黄酮的含量为指标，对提取工艺进行了优化。用热回流法提取，提取液浓缩后，按紫外分光光度法测定提取物中总黄酮含量。
提取工艺正交实验涉及溶剂浓度、温度、溶剂用量、提取次数等，分别测定总黄酮量、浸膏量和总黄酮得率。
综合考虑到总黄酮提取总量、含量及得率，同时结合到工业化生产的成本、后处理的难易，以及工艺的稳定与重现性等因素，本发明选用按药材重量计6-10倍体积的40-95％乙醇，于80～95℃条件下进行回流提取。较好的提取分离条件是：用药材重量7-9倍体积的45-70％乙醇，回流提取。较佳条件还有：用药材重量7-9倍体积的50-60％乙醇，于80～90℃条件下回流提取2次。更佳条件为：用药材重量8倍体积的50％乙醇，于85℃条件下回流提取2次。
2.5酸枣仁总黄酮的分离、纯化、浓缩与干燥工艺
2.5.1分离与纯化工艺
本课题组研究表明，酸枣仁提取物经D-101大孔树脂分段，依次用水，25％，45％，70％，95％乙醇洗脱，收集45％乙醇洗脱部分，减压浓缩后干燥，即得总黄酮部分。
2.5.2浓缩与干燥工艺
将45％乙醇洗脱部分过滤，减压回收溶剂，真空干燥，即得总黄酮部位，其中总黄酮的含量可达到50～60％，药材的转移率可达到60～85％。
3.酸枣仁镇静催眠作用研究
按常规，以对戊巴比妥钠阈上、阈下剂量诱导的小鼠睡眠的影响为指标，研究了酸枣仁的总黄酮部位对正常小鼠的镇静催眠药效。
3.1试验材料
3.1.1受试药物
酸枣仁，采自河北邢台市；及从酸枣仁药材中提取的脂肪油，总黄酮和总皂苷部位。
戊巴比妥钠Serva进口，上海化学试剂分装厂分装，批号84-06-12。
3.1.2受试动物
昆明种小白鼠，体重18～22g，雄性，由中国药科大学实验动物中心提供。
3.2方法与结果
3.2.1对戊巴比妥钠阈下剂量潜伏期试验剂量的影响试验
试验方法取昆明种小鼠60只，体重18-22g，雄性，随机分成6组，每组10只。一组为正常对照组，ig生理盐水，另外五组为给药组，分别给药：
样品1：酸枣仁水溶液提取物，用量按5g生药/kg计；
样品2：酸枣仁70％醇溶液提取物，用量相当于5g生药/kg；
样品3：酸枣仁脂肪油吐温80溶液，用量相当于10g生药/kg；
样品4：本发明方法制得的酸枣仁总黄酮，用量相当于10g生药/kg；
样品5：酸枣仁总皂甙，用量相当于10g生药/kg。
以上各样品的给药体积为0.1ml/10g，给药1h后，ip注射0.27％戊巴比妥钠27mg/kg，给药体积为0.1ml/10g。ip后，记录翻正反射消失需要的时间。结果采用student’s t-test进行统计分析表示组间差异，参见表2。
表2、戊巴比妥钠阈下剂量潜伏期试验
| 小鼠编号 | 对照组 | 样品1 | 样品2 | 样品3 | 样品4 | 样品5 |
| 1 | 432 | 461 | 742 | 828 | 324 | 900 |
| 2 | 232 | 503 | 525 | 276 | 394 | 380 |
| 3 | 348 | 777 | 362 | 374 | 252 | 355 |
| 4 | 900 | 867 | 328 | 332 | 351 | 266 |
| 5 | 415 | 373 | 640 | 381 | 249 | 900 |
| 6 | 412 | 517 | 350 | 386 | 675 | 400 |
| 7 | 314 | 278 | 604 | 648 | 343 | 841 |
| 8 | 354 | 324 | 298 | 478 | 253 | 340 |
| 9 | 900 | 381 | 469 | 454 | 310 | 525 |
| 10 | 434 | 321 | 499 | 420 | 415 | 386 |
| X | 474.1 | 480.2 | 481.7 | 457.7 | 256.2 | 529.3 |
| SD | 232.876. | 197.739 | 148.754 | 163.988 | 126.003 | 251.020 |
| P | 0.95 | 0.93 | 0.86 | 0.18** | 0.62 |
**P＜0.05vs.Control
结果表明：酸枣仁的总黄酮部位有显著的可协同阈下剂量戊巴比妥钠诱导睡眠的作用。
3.2.2对戊巴比妥钠阈上剂量睡眠时间的影响试验
试验方法取昆明种小鼠60只，体重18-22g，雄性，随机分成6组，每组10只。一组为正常对照组，ig生理盐水，另外五组为给药组，分别给药：
样品1：酸枣仁水溶液提取物，用量相当于5g生药/kg；
样品2：酸枣仁70％醇溶液提取物，用量相当于5g生药/kg；
样品3：酸枣仁脂肪油吐温80溶液，用量相当于10g生药/kg；
样品4：酸枣仁总黄酮，用量相当于10g生药/kg；
样品5：酸枣仁总皂甙，用量相当于10g生药/kg。
上述各样品给药体积为0.1ml/10g，给药1h后，ip注射0.35％戊巴比妥钠35mg/kg，给药体积为0.1ml/10g。ip后，记录翻正反射消失至翻正反射恢复所需时间，即睡眠时间。结果采用“学生t-试验法”进行统计分析表示组间差异，参见表3。
表3、戊巴比妥钠阈上剂量睡眠期试验
| 小鼠编号 | 空白组 | 样品1 | 样品2 | 样品3 | 样品4 | 样品5 |
| 1 | 414 | 3336 | 100 | 1864 | 2887 | 0 |
| 2 | 117 | 958 | 3600 | 2414 | 2799 | 905 |
| 3 | 140 | 460 | 3600 | 491 | 3600 | 1869 |
| 4 | 0 | 407 | 3600 | 2445 | 2726 | 151 |
| 5 | 41 | 3600 | 746 | 3600 | 899 | 0 |
| 6 | 489 | 1673 | 3600 | 3600 | 157 | 761 |
| 7 | 3600 | 3600 | 1779 | 1907 | 3600 | 1499 |
| 8 | 374 | 725 | 3574 | 2382 | 324 | 245 |
| 9 | 0 | 829 | 2779 | 2077 | 2102 | 87 |
| 10 | 748 | 3600 | 3575 | 897 | 2108 | 48 |
| X | 592.3 | 1918.8 | 2695.3 | 2167.7 | 2120 | 556.5 |
| SD | 1085.084 | 1433.634 | 1341.719 | 993.36 | 1263.49 | 677.748 |
| P | 0.03** | 0.001*** | 0.003*** | 0.009*** | 0.93 |
***P＜0.01，**P＜0.05vs.Control
结果表明：样品1(酸枣仁水溶液提取物)，样品2(酸枣仁70％醇溶液提取物)、样品3(酸枣仁脂肪油吐温80溶液)、样品4(酸枣仁总黄酮)都有增长戊巴比妥钠阈上剂量诱导的睡眠期作用。
综合上述两个实验的结果表明：本发明制备的酸枣仁总黄酮有显著的镇静催眠作用。
具体实施方式
实施例1
取酸枣仁药材20kg，微炒至黄色，有扑鼻香味，粉碎成40目粉，石油醚80℃索式法提取12小时进行脱脂后，采用药材重量6倍体积的45％乙醇75℃热回流提取三次，每次1小时。提取液合并，减压回收溶剂，所得浓缩液用D101大孔树脂分段，洗脱剂为梯度增加的乙醇溶液。收集35-55％乙醇段洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏经真空干燥，即得酸枣仁总黄酮粗品0.17kg，其总黄酮含量为50％，转移率为66％。
实施例2
取酸枣仁药材20kg，微炒至黄色，粉碎成40目粉，石油醚80℃索式法提取12小时进行脱脂后采用药材重量8倍体积的70％乙醇85℃热回流提取二次，每次1小时。提取液合并，减压回收溶剂，所得浓缩液用D101大孔树脂分段，洗脱剂为梯度增加的乙醇溶液。收集45-50％乙醇段洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏经真空干燥，即得酸枣仁总黄酮粗品0.16kg，其总黄酮含量为55％，转移率为70％。
实施例3
取酸枣仁药材20kg，微炒至黄色，粉碎成40目粉，石油醚80℃索式法提取12小时进行脱脂后，采用药材重量10倍体积的95％乙醇95℃热回流提取二次，每次1小时。提取液合并，减压回收溶剂，所得浓缩液用大孔树脂分段，洗脱剂为梯度增加的乙醇溶液。收集45-55％乙醇段洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏经真空干燥，即得酸枣仁总黄酮粗品0.15kg，其总黄酮含量为51％，转移率为60％。
实施例4
取酸枣仁药材20kg，微炒至黄色，有扑鼻香味，粉碎药材至40目，石油醚80℃索式法提取12小时进行脱脂后，以热回流方式，用50％乙醇，8倍量溶剂，85℃，提取2次。合并提取液，减压浓缩至浓缩液体积与药材的重量比为0.8-1.0。浓缩液用多层纱布过滤，上样于D-101大孔树脂顶端，用水，25％，45％，70％，95％乙醇梯度洗脱，收集45％乙醇段洗脱液，减压回收溶剂，真空干燥得0.18kg酸枣仁总黄酮粗品，其总黄酮含量为59％，转移率为84％。
Claims (5)
1、一种酸枣仁总黄酮的制备方法，其特征在于：取酸枣仁，加热，粉碎，脱脂后，加入40-95％乙醇回流提取，提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱，用含水乙醇梯度洗脱，收集35～55％乙醇洗脱部分，回收溶剂，残留物即为总黄酮。
2、根据权利要求1所述酸枣仁总黄酮的制备方法，其特征在于：酸枣仁加热至微黄，粉碎成40目粉，石油醚脱脂后，用45-70％乙醇回流提取，提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱，用含水乙醇梯度洗脱，收集40～50％乙醇洗脱部分，回收溶剂，残留物即为总黄酮。
3、根据权利要求2所述酸枣仁总黄酮的制备方法，其特征在于：酸枣仁用炒、烘焙或微波方法加热至微黄，粉碎成40目粉，石油醚脱脂后，用酸枣仁重量6-10倍的50-60％乙醇，于80～95℃条件下回流提取，提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱，用含水乙醇梯度洗脱，收集40～50％乙醇洗脱部分，回收溶剂，残留物即为总黄酮。
4、根据权利要求3所述酸枣仁总黄酮的制备方法，其特征在于：用酸枣仁重量7-9倍的50-55％乙醇，于85～90℃条件下回流提取2次，提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱，用含水乙醇梯度洗脱，收集40～50％乙醇洗脱部分，回收溶剂，残留物即为总黄酮。
5、根据权利要求4所述酸枣仁总黄酮的制备方法，其特征在于：用酸枣仁重量8倍的50％乙醇，于85℃条件下回流提取2次，提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱，依次用25％、45％、70％、95％的乙醇梯度洗脱，收集45％乙醇洗脱液，回收溶剂，残留物即为总黄酮。
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