CN115554242A - 一种甘草次酸修饰细菌纤维素包载紫杉醇胶束及其制备方法 - Google Patents
一种甘草次酸修饰细菌纤维素包载紫杉醇胶束及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物载体技术领域，具体涉及一种甘草次酸修饰细菌纤维素包载紫杉醇胶束及其制备方法。本发明通过甘草次酸修饰细菌纤维素得到两亲性聚合物载体(BC‑GA)并负载疏水性药物紫杉醇(PTX)获得载药纳米胶束(BC‑GA‑PTX)，提高了PTX的口服生物利用度，BC‑GA‑PTX对肝癌细胞有明显抑制作用，在模拟胃肠道介质中能稳定存在，且对肝脏存在靶向作用，能够实现药物缓释，帮助药物在病灶部位的富集，改善了药物稳定性、增强药物疗效、降低药物毒性。本发明得到两亲性聚合物载体BC‑GA，在自组装后可以形成外壳亲水内核疏水的纳米胶束，为细菌纤维素负载难溶性药物提供了一种新的思路方法。
Description
技术领域
本发明属于药物载体技术领域，具体涉及一种甘草次酸修饰细菌纤维素包载紫杉醇胶束及其制备方法。
技术背景
紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是经临床检验的疗效最为显著的抗癌药物之一，目前已经成为抗癌一线用药，对癌症的治疗具有重要作用。但由于紫杉醇的水溶性差、口服生物利用度较低以及市售注射剂TaxolTM溶媒易引起严重不良反应等问题，严重阻碍了紫杉醇的临床使用。同时因为紫杉醇缺乏靶向性，会对正常细胞和肿瘤细胞进行无差别攻击，造成强烈的毒副作用。因此，改善紫杉醇的生物利用度和靶向性具有十分重要的意义。
甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)是从传统中药甘草根及根茎中提取的一种五环三萜化合物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤作用，同时具有明显的肝靶向特征。近年来大量研究表明肝脏具有甘草次酸特异性结合位点，GA与该位点的结合呈可饱和性、高度特异性。因此将GA作为肝靶向配体来进行靶向治疗可使药物准确作用于病变部位，减少药物对其他器官的损伤，基于GA修饰的药物制剂能显著增加药物的溶解度和生物利用度，可通过直接跨膜作用在实现病变部位的高度积累。
细菌纤维素(Bacterial Cellulose，BC)是由小分子的碳水化合物经微生物发酵形成的纤维类物质，是国际公认的一种优异的新型天然生物材料，具有高度的生物相容性和独特的亲水性，越来越多的研究将其作为药物递送的载体。虽然细菌纤维素理化特性独特，但它具有很强的分子内/间氢键作用及高结晶度，不能在水和大多数常规有机溶剂中溶解，因而载药过程比较困难。目前普遍应用于水溶性或醇溶性药物吸附法载药，载药效率低下。
基于此，本发明以肝靶向配体甘草次酸修饰细菌纤维素以制备两亲性聚合物载体，该载体通过分子自组装形成纳米胶束同时包载抗癌药物紫杉醇，以制得具有靶向性的载药纳米胶束。该载药纳米胶束可以改善紫杉醇的水溶性，将其靶向至病灶部位，提高紫杉醇口服给药的生物利用度，减少紫杉醇的毒副作用。目前尚未见有以甘草次酸修饰细菌纤维素所得的两亲性聚合物为载体，再包载抗肿瘤药物紫杉醇构建自组装BC-GA-PTX纳米胶束传递系统的相关报道。且该两亲性聚合物载体，除包载紫杉醇外，还可以用于其他难溶性药物的负载。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘草次酸修饰细菌纤维素包载紫杉醇胶束及其制备方法，以解决紫杉醇水溶性差、生物利用度低、毒性强等缺陷以及细菌纤维素负载难溶性药物的局限性。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种甘草次酸修饰细菌纤维素包载紫杉醇胶束及其制备方法，包括以下步骤：
(1)以丁二酸酐作为连接臂将甘草次酸与细菌纤维素进行接枝，得到两亲性载体BC-GA聚合物，合成路线如下：
(2)取BC-GA聚合物溶于蒸馏水中，配制得到BC-GA聚合物水溶液；
(3)取紫杉醇溶于无水乙醇中，配制得到浓度为1mg/mL的紫杉醇乙醇溶液；
(4)将步骤(3)所得紫杉乙醇溶液在冰浴下滴加在步骤(2)所得的BC-GA聚合物水溶液中，所得物料于冰浴下超声进行自组装反应，物料移至室温环境下，搅拌器搅拌，挥发除去乙醇，离心，分离出上清溶液进行冷冻干燥，得到BC-GA-PTX纳米胶束。
步骤(1)中所述的BC-GA聚合物的优选制备方法如下：
1)将干燥的细菌纤维素剪成0.5cm2的小段，溶于四丁基醋酸铵浓度为5～30％的DMSO溶液，至细菌纤维素浓度为0.1mol，搅拌至无胶状物凝聚，得到细菌纤维素溶液，得到溶液A；
2)称取甘草次酸与丁二酸酐加入到DMSO溶液中，得到甘草次酸与丁二酸酐摩尔比1:1的混合溶液，在40℃水浴锅中加热搅拌24h，得到溶液B；
3)向溶液B中加入含DMAP与EDC的DMSO溶液，控制体系中GA：DMAP：EDC＝1:1:1摩尔比，继续搅拌1h进行活化，得到溶液C；
4)取溶液C加入到溶液A中混合均匀，控制体系中BC:GA＝2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5摩尔比，40℃下继续加热搅拌24h，得到溶液D；
5)溶液D逐滴加入到自身5倍体积比的无水乙醇中，搅拌5～10min，离心除去上清，沉淀物再用无水乙醇洗涤3～4次，离心除去未反应的甘草次酸、细菌纤维素及含有四丁基醋酸铵的DMSO溶剂等杂质，留下的沉淀物溶于蒸馏水中，超声得到均一的溶液，离心，取上清液，冷冻干燥，得到BC-GA聚合物；
步骤(2)中所述的BC-GA聚合物为BC:GA＝2:1～1:5摩尔比合成的载体，优选BC:GA＝1:1～1:3摩尔比合成的载体；
步骤(2)中所述的BC-GA聚合物在水溶液中的浓度为0.1～2.5mg/mL，优选范围为0.5～1.5mg/mL；
步骤(4)中所述的水溶液与乙醇溶液的体积比为10:0.5～10:3，优选范围为10:0.5～10:2；
步骤(4)中所述的超声时间为5～35min，优选范围为5～20min；
步骤(4)中所述的超声功率为90～630W，优选范围为180～450W。
本发明的优点如下：
(1)本发明提供的BC-GA在浓度为0.01-2mg/mL范围内对斑马鱼无明显毒性作用，BC-GA载体形成胶束包载紫杉醇的载药量高达17.89％，可作为安全的疏水性药物载体被广泛使用和开发。
(2)本发明提供的BC-GA-PTX纳米胶束对HepG2细胞的抑制率高达87.5％，高于紫杉醇原药的68.4％，BC-GA-PTX纳米胶束的生物利用度约为紫杉醇原药的2.38倍。
(3)本发明提供的BC-GA两亲性载体的临界胶束浓度仅为0.063mg/mL，能够抵抗胃肠液的稀释，增加药物的稳定性，BC-GA两亲性载体负载抗肿瘤药物紫杉醇后的粒径为291.2±5.6nm，可以在血液循环保持稳定，且对肝脏存在靶向作用，减少药物的毒副作用。
(4)本发明通过甘草次酸修饰细菌纤维素，最终得到了具有两亲性的细菌纤维素聚合物，在自组装后可以形成外壳亲水内核疏水的纳米胶束，为细菌纤维素负载难溶性药物提供了一种新的思路方法。
附图说明：
图1为BC-GA(a)、BC(b)和GA(c)的红外光谱图；
图2为GA和BC-GA的核磁共振氢谱图；
图3为不同浓度的BC-GA对斑马鱼胚胎整体发育影响的效果图；
图4为BC-GA聚合物与BC-GA-PTX载药胶束的透射电镜图；
图5为PTX与BC-GA物理混合(a)、BC-GA-PTX(b)、PTX(c)、BC(d)、BC-GA(e)的X-射线衍射图；
图6为PTX与BC-GA-PTX在人工胃液(a)和人工肠液(b)中的累计释放曲线；
图7为BC-GA-PTX、PTX、PTX与BC-GA的物理混合在大鼠体内的血药浓度-时间曲线图；
图8为不同浓度的PTX与BC-GA-PTX载药胶束与HepG2细胞孵育48h对细胞抑制趋势图；
图9为BC-GA负载近红外荧光染料DIR所得纳米胶束BC-GA-DIR以及DIR在小鼠口服24h内的体内荧光成像图(A)、小鼠离体器官的荧光成像图(B)及器官吸收荧光强度(*p<0.05；**p<0.01,***p<0.001)图(C)；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将干燥的细菌纤维素剪成0.5cm2的小段，溶于四丁基醋酸铵浓度为20％的DMSO溶液，至细菌纤维素浓度为0.1mol，拌器搅拌至无胶状物凝聚，得到细菌纤维素溶液，得到溶液A；称取4.7g甘草次酸与1g丁二酸酐加入到20mL DMSO溶液中，将该混合溶液在40℃水浴锅中加热搅拌24h，得到溶液B；向溶液B中加入含DMAP与EDC的DMSO溶液，控制体系中GA：DMAP：EDC＝1:1:1摩尔比，继续搅拌1h进行活化，得到溶液C；取溶液C加入到溶液A中混合均匀，控制体系中BC:GA＝1:1摩尔比，40℃下继续加热搅拌24h，得到溶液D；溶液D逐滴加入到自身5倍体积比的无水乙醇中，搅拌5min，离心除去上清，沉淀物再用无水乙醇洗涤4次，离心除去未反应的甘草次酸、细菌纤维素及含有四丁基醋酸铵的DMSO溶剂等杂质，留下的沉淀物溶于蒸馏水中，超声得到均一的溶液，离心，取上清液，冷冻干燥，得到BC-GA聚合物；将BC-GA聚合物溶液蒸馏水中，配制得到浓度为1mg/mL的BC-GA聚合物水溶液；紫杉醇溶于无水乙醇中，配制得到浓度为1mg/mL的紫杉醇乙醇溶液；所得紫杉乙醇溶液在冰浴下滴加至BC-GA聚合物水溶液中，水溶液与乙醇溶液的体积比为10:0.5，混合物于冰浴下超声进行自组装反应，超声功率180W，超声时间20min，超声结束后将物料移至室温环境下，搅拌器搅拌，挥发除去乙醇，离心，分离出上清溶液进行冷冻干燥，得到BC-GA-PTX纳米胶束。制备所得的BC-GA-PTX纳米胶束载药量为17.76％，包封率为54.55％。
实施例2
将干燥的细菌纤维素剪成0.5cm2的小段，溶于四丁基醋酸铵浓度为15％的DMSO溶液，至细菌纤维素浓度为0.1mol，拌器搅拌至无胶状物凝聚，得到细菌纤维素溶液，得到溶液A；称取4.7g甘草次酸与1g丁二酸酐加入到20mL DMSO溶液中，将该混合溶液在40℃水浴锅中加热搅拌24h，得到溶液B；向溶液B中加入含DMAP与EDC的DMSO溶液，控制体系中GA：DMAP：EDC＝1:1:1摩尔比，继续搅拌1h进行活化，得到溶液C；取溶液C加入到溶液A中混合均匀，控制体系中BC:GA＝1:2摩尔比，40℃下继续加热搅拌24h，得到溶液D；溶液D逐滴加入到自身5倍体积比的无水乙醇中，搅拌10min，离心除去上清，沉淀物再用无水乙醇洗涤3次，离心除去未反应的甘草次酸、细菌纤维素及含有四丁基醋酸铵的DMSO溶剂等杂质，留下的沉淀物溶于蒸馏水中，超声得到均一的溶液，离心，取上清液，冷冻干燥，得到BC-GA聚合物；将BC-GA聚合物溶液蒸馏水中，配制得到浓度为1.5mg/mL的BC-GA聚合物水溶液；紫杉醇溶于无水乙醇中，配制得到浓度为1mg/mL的紫杉醇乙醇溶液；所得紫杉乙醇溶液在冰浴下滴加至BC-GA聚合物水溶液中，水溶液与乙醇溶液的体积比为10:1.5，混合物于冰浴下超声进行自组装反应，超声功率360W，超声时间15min，超声结束后将物料移至室温环境下，搅拌器搅拌，挥发除去乙醇，离心，分离出上清溶液进行冷冻干燥，得到BC-GA-PTX纳米胶束。制备所得的BC-GA-PTX纳米胶束载药量为17.76％，包封率为54.55％。
实施例3
将干燥的细菌纤维素剪成0.5cm2的小段，溶于四丁基醋酸铵浓度为25％的DMSO溶液，至细菌纤维素浓度为0.1mol，拌器搅拌至无胶状物凝聚，得到细菌纤维素溶液，得到溶液A；称取4.7g甘草次酸与1g丁二酸酐加入到20mL DMSO溶液中，将该混合溶液在40℃水浴锅中加热搅拌24h，得到溶液B；向溶液B中加入含DMAP与EDC的DMSO溶液，控制体系中GA：DMAP：EDC＝1:1:1摩尔比，继续搅拌1h进行活化，得到溶液C；取溶液C加入到溶液A中混合均匀，控制体系中BC:GA＝1:3摩尔比，40℃下继续加热搅拌24h，得到溶液D；溶液D逐滴加入到自身5倍体积比的无水乙醇中，搅拌8min，离心除去上清，沉淀物再用无水乙醇洗涤4次，离心除去未反应的甘草次酸、细菌纤维素及含有四丁基醋酸铵的DMSO溶剂等杂质，留下的沉淀物溶于蒸馏水中，超声得到均一的溶液，离心，取上清液，冷冻干燥，得到BC-GA聚合物；将BC-GA聚合物溶液蒸馏水中，配制得到浓度为1.5mg/mL的BC-GA聚合物水溶液；紫杉醇溶于无水乙醇中，配制得到浓度为1mg/mL的紫杉醇乙醇溶液；所得紫杉乙醇溶液在冰浴下滴加至BC-GA聚合物水溶液中，水溶液与乙醇溶液的体积比为10:1，混合物于冰浴下超声进行自组装反应，超声功率360W，超声时间10min，超声结束后将物料移至室温环境下，搅拌器搅拌，挥发除去乙醇，离心，分离出上清溶液进行冷冻干燥，得到BC-GA-PTX纳米胶束。制备所得的BC-GA-PTX纳米胶束载药量为17.89％，包封率为59.81％。
Claims (5)
1.一种甘草次酸修饰细菌纤维素包载紫杉醇胶束及其制备方法，包括以下步骤：
(1)以丁二酸酐作为连接臂将甘草次酸与细菌纤维素进行接枝，得到两亲性载体BC-GA聚合物，合成路线如下：
(2)取BC-GA聚合物溶于蒸馏水中，配制得到BC-GA聚合物水溶液；
(3)取紫杉醇溶于无水乙醇中，配制得到浓度为1mg/mL的紫杉醇乙醇溶液；
(4)将步骤(3)所得紫杉乙醇溶液在冰浴下滴加在步骤(2)所得的BC-GA聚合物水溶液中，所得物料于冰浴下超声进行自组装反应，物料移至室温环境下，搅拌器搅拌，挥发除去乙醇，离心，分离出上清溶液进行冷冻干燥，得到BC-GA-PTX纳米胶束。
2.根据权利要求1所述的一种甘草次酸修饰细菌纤维素包载紫杉醇胶束及其制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的BC-GA聚合物的制备方法如下：
1)将干燥的细菌纤维素剪成0.5cm2的小段，溶于四丁基醋酸铵浓度为5～30％的DMSO溶液，至细菌纤维素浓度为0.1mol，搅拌至无胶状物凝聚，得到细菌纤维素溶液，得到溶液A；
2)称取甘草次酸与丁二酸酐加入到DMSO溶液中，得到甘草次酸与丁二酸酐摩尔比1:1的混合溶液，在40℃水浴锅中加热搅拌24h，得到溶液B；
3)向溶液B中加入含DMAP与EDC的DMSO溶液，控制体系中GA：DMAP：EDC＝1:1:1摩尔比，继续搅拌1h进行活化，得到溶液C；
4)取溶液C加入到溶液A中混合均匀，控制体系中BC:GA＝2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5摩尔比，40℃下继续加热搅拌24h，得到溶液D；
5)溶液D逐滴加入到自身5倍体积比的无水乙醇中，搅拌5～10min，离心除去上清，沉淀物再用无水乙醇洗涤3～4次，离心除去未反应的甘草次酸、细菌纤维素及含有四丁基醋酸铵的DMSO溶剂等杂质，留下的沉淀物溶于蒸馏水中，超声得到均一的溶液，离心，取上清液，冷冻干燥，得到BC-GA聚合物。
3.根据权利要求1所述的一种甘草次酸修饰细菌纤维素包载紫杉醇胶束及其制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的BC-GA聚合物为BC:GA＝2:1～1:5摩尔比合成的载体，BC-GA聚合物在水溶液中的浓度为0.1～2.5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种甘草次酸修饰细菌纤维素包载紫杉醇胶束及其制备方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的水溶液与乙醇溶液的体积比为10:0.5～10:3，所述的超声时间为5～35min，所述的超声功率为90～630W。
5.权利要求1-4中任一项所述方法制备得到的甘草次酸修饰细菌纤维素包载紫杉醇胶束。
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