CN115551993A - 基因修饰微生物以及有机酸的制造方法 - Google Patents

Abstract

包含能够表达在野生型YeeX蛋白质或其同源物的氨基酸序列中1～数个氨基酸发生置换、插入和/或缺失后的变异型YeeX蛋白质或其同源物的基因的基因修饰微生物与该基因修饰前的微生物相比，提高了有机酸生产能力。

Description

基因修饰微生物以及有机酸的制造方法

技术领域

本发明涉及高产有机酸的基因修饰微生物以及使用了该基因修饰微生物的有机酸的制造方法。

背景技术

利用微生物发酵生产工艺得到的有机酸在工业上被广泛地利用。例如，琥珀酸被用于药品和食品的添加剂、入浴剂等多种产品中，乙酸作为食品和试剂被广泛利用。作为利用了微生物的包括琥珀酸和乙酸等的有机酸的制造方法，专利文献1中公开了一种方法，其中为了降低以从非可食资源得到的糖液为原料时的发酵抑制物质的影响，使用了选自由以下基因组成的组中的至少一个基因的表达与非修饰株相比得到增强的微生物，所述基因为：分别对磷酸甘油酸激酶、磷酸果糖激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及延胡索酸水合酶进行编码的基因；对构成磷酸转移酶系统的蛋白质进行编码的基因；以及对氧化应激应答因子进行编码的基因。

另外，作为碳原子数为6的二羧酸的3-羟基己二酸(IUPAC名：3-羟基己二酸(3-hydroxyhexanedioic acid))、α-氢化己二烯二酸(IUPAC名：(E)-己-2-烯二酸((E)-hex-2-enedioic acid))以及己二酸(IUPAC名：己二酸(hexanedioic acid))也在工业上受到关注。它们通过与多元胺聚合而可以用作聚酰胺的原料。另外，通过在它们的末端加成氨以内酰胺化，也可以单独地成为聚酰胺原料。作为利用了微生物的3-羟基己二酸等的制造方法，专利文献2中公开了：导入对参与3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的生产的多肽进行编码的核酸、或增强了该多肽的表达的基因修饰微生物以及使用了该微生物的物质制造方法。

另一方面，YeeX蛋白质被分类为DUF496家族蛋白。关于YeeX蛋白质的公知信息很少，但是在非专利文献1中，通过二维SDS-PAGE分析确认了大肠杆菌YeeX蛋白质的表达。在专利文献3中，作为表现出辅助蛋白质生产的作用的蛋白质的一个例子，记载了YeeX蛋白质。在任何文献中都没有记载YeeX蛋白质对有机酸生产的影响。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2017-192325号公报

专利文献2：WO2019/107516号

专利文献3：US2007/0298418号

非专利文献

非专利文献1：FEMS Microbiology Letters,vol.169,p.375-382(1998)

发明内容

发明所要解决的课题

在利用了微生物的以有机酸为代表的化学品的制造方法中，以提高产物的产率为课题。具体而言，课题在于向微生物中导入变异，从而提高以有机酸为代表的化学品的生产能力。

用于解决课题的手段

本发明人着眼于对功能未知的YeeX蛋白质进行编码的基因，为了解决上述课题而进行了深入的研究，结果发现，在包含能够表达变异型YeeX蛋白质或其同源物的基因的微生物中，以有机酸为代表的化学品的生产能力提高，从而完成了本发明。

具体而言，本发明由以下的(1)～(10)构成。

(1)一种基因修饰微生物，包含能够表达在野生型YeeX蛋白质或其同源物的氨基酸序列中1～数个氨基酸发生置换、插入和/或缺失后的变异型YeeX蛋白质或其同源物的基因。

(2)根据(1)所述的基因修饰微生物，其中所述变异型YeeX蛋白质或其同源物是在序列号1的氨基酸序列中相当于氨基酸残基74～100的区域的1～数个氨基酸发生置换、插入和/或缺失后的变异型YeeX蛋白质或其同源物。

(3)根据(1)或(2)所述的基因修饰微生物，其中所述变异型YeeX蛋白质或其同源物是具有在序列号1的氨基酸序列中相当于第84位的丙氨酸置换为其他氨基酸的变异的变异型YeeX蛋白质或其同源物。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的基因修饰微生物，其中在基因组上具有能够表达所述变异型YeeX蛋白质或其同源物的基因。

(5)根据(4)所述的基因修饰微生物，其中基因组上的能够表达野生型YeeX蛋白质或其同源物的基因变异或置换为能够表达所述变异型YeeX蛋白质或其同源物的基因。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的基因修饰微生物，其中所述变异型YeeX蛋白质或其同源物具有在序列号1的氨基酸序列中相当于第84位的丙氨酸置换为缬氨酸的变异。

(7)根据(1)～(6)中任一项所述的基因修饰微生物，其中所述微生物具有有机酸生产能力。

(8)根据(1)～(7)中任一项所述的基因修饰微生物，其中所述微生物为属于沙雷氏菌(Serratia)属、大肠杆菌(Escherichia)属、放线杆菌(Actinobacillus)属、Basfia属、假单胞菌(Pseudomonas)属、哈夫尼菌(Hafnia)属、不动杆菌(Acinetobacter)属、Shimwellia属或产气杆菌(Aerobacter)属的微生物。

(9)一种有机酸的制造方法，包括在含有碳源作为发酵原料的培养基中对(7)或(8)所述的基因修饰微生物进行培养。

(10)根据(9)所述的有机酸的制造方法，其中所述有机酸为琥珀酸、乙酸、3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和/或己二酸。

发明的效果

本发明涉及的基因修饰微生物通过包含能够表达变异型YeeX蛋白质或其同源物的基因，从而可以以比该基因修饰前的微生物更高的产率制造以有机酸为代表的化学品。

具体实施方式

以下，更详细地说明本发明，但是本发明不限于以下的实施方式，只要在本发明的主旨的范围内，则可以进行各种变更来实施。

本发明的基因修饰微生物的特征在于，包含能够表达变异型YeeX蛋白质或其同源物的基因。另外，本发明的有机酸的制造方法的特征在于，培养上述基因修饰微生物。

YeeX蛋白质是属于DUF496家族蛋白的蛋白质。另外，“yeeX”是指对YeeX蛋白质进行编码的基因。根据以序列号1的氨基酸序列的二级结构预测作为基础的HHPred(Homologydetection&structureprediction by HMM-HMM comparison)检索结果，表明YeeX蛋白质具有类似于转录调控因子的结构。

YeeX蛋白质的同源物是指与被确定为YeeX蛋白质的氨基酸序列的序列同源性高，推测具有与YeeX蛋白质类似的功能或结构的野生型蛋白质。作为本发明中利用的YeeX蛋白质，相对于序列号1的氨基酸序列，序列同源性优选为50％以上、更优选为55％以上、进一步优选为70％以上、更进一步优选为80％以上、更进一步优选为90％以上、特别优选为95％以上。

作为YeeX蛋白质或其同源物的例子，可以列举出：来自于大肠杆菌的YeeX蛋白质(NCBI Protein ID:NP_416511，序列号1)、来自于格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)的YeeX蛋白质的同源物(NCBI Protein ID:HCJ99940，序列号2)、来自于鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)的YeeX蛋白质的同源物(NCBI Protein ID:AAL09094，序列号3)、来自于产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)的YeeX蛋白质的同源物(NCBI Protein ID:WP_012072666，序列号4)、来自于阴沟产气杆菌(Aerobacter cloacae)的YeeX蛋白质的同源物(NCBI Protein ID:WP_115875767，序列号5)、来自于Basfiasucciniciproducens的YeeX蛋白质的同源物(Protein ID:WP_011200744，序列号6)、来自于Hafnia paralvei的YeeX蛋白质的同源物(Protein ID:WP_004089583，序列号7)、来自于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的YeeX蛋白质的同源物(Protein ID:MXH34489，序列号8)、来自于Shimwellia blattae的YeeX蛋白质的同源物(Protein ID:WP_002439990，序列号9)等。

在本发明中，“序列同源性”是指在2个氨基酸序列或碱基序列中导入间隔(Gap)或不导入间隔而排列的情况下的最佳比对(alignment)中，相同氨基酸或碱基相对于重叠(overlap)的所有氨基酸序列(包括作为翻译起始点的氨基酸)或碱基序列(包括起始密码子)的比例(百分比)，根据式(1)计算。序列同源性可以使用本领域中通用的算法BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)来容易地研究。例如，关于BLAST，任何人都可以从NCBI(National Center for Biotechnology Information)或KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes)等的网站上使用、并且使用默认的参数来容易地研究序列同源性。

序列同源性(％)＝一致数(间隔彼此忽略不计)/较短的序列长度(不包括间隔的长度)×100···式(1)。

根据式(1)，当使用Genetyx的功能(％Identity Matrix)来计算序列号1～9中所述的氨基酸序列间的序列同源性时，序列同源性的值最低的序列号4与9之间的值为54.46％，序列号1～9中所述的氨基酸序列彼此具有至少50％以上的序列同源性。使用Genetyx算出的序列同源性的结果如表1所示。需要说明的是，在下表1中，最左侧的数字表示序列号。

[表1]

对YeeX蛋白质或其同源物进行编码的基因只要是序列号1～9所述的氨基酸序列或可翻译成这些同源物的氨基酸序列的碱基序列即可，没有特别限定，可以参考与各氨基酸对应的密码子(标准遗传密码)来确定。此时，也可以用对于本发明中使用的宿主微生物而言常用的密码子重新设计碱基序列。

作为对具有序列号1和2所述的氨基酸序列的多肽进行编码的基因的碱基序列的具体例子，分别可以列举出序列号10和11所述的碱基序列。

作为YeeX蛋白质及其同源物的特征之一，可以列举出：在序列号1的氨基酸序列中相当于氨基酸残基74～100的区域预测形成α-螺旋结构，种间的排列同源性高。蛋白质的二级结构可以通过使用众所周知的web应用程序Quick2D等分析氨基酸序列来容易地研究。另外，作为YeeX蛋白质及其同源物的特征之一，可以列举出：在序列号1的氨基酸序列中相当于第84位的氨基酸残基是丙氨酸。示出了：通过表2中所示的具有序列号1～9的氨基酸序列的YeeX蛋白质和YeeX蛋白质的同源物的多重排列，序列号1的氨基酸序列的预测形成α-螺旋结构的相当于氨基酸残基74～100的区域、以及相当于第84位氨基酸残基的丙氨酸被保存。

[表2]

本发明中的变异型YeeX蛋白质或其同源物的特征在于，具有在野生型YeeX蛋白质或其同源物的氨基酸序列中1～数个，具体而言为1～10个、优选为1～5个、更优选为1～3个，进一步优选为1～3个、更进一步优选为1或2个、特别优选为1个氨基酸发生置换、插入和/或缺失后的变异。对变异部位没有特别限定，优选的是种间的序列同源性高、预测形成α-螺旋结构的、序列号1的氨基酸序列中相当于氨基酸残基74～100的区域，更优选的是相当于氨基酸残基74～94的区域，进一步优选的是相当于氨基酸残基75～88的区域，更进一步优选的是相当于氨基酸残基82～88的区域，特别优选的是相当于氨基酸残基第84位的丙氨酸。

当变异型YeeX蛋白质或其同源物中的变异部位是序列号1的氨基酸序列中相当于第84位氨基酸残基的丙氨酸时，优选是置换为除了丙氨酸以外的氨基酸的变异。除了丙氨酸以外的氨基酸是任意的氨基酸残基，优选的是作为疏水性氨基酸残基的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸，更优选的是缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，进一步优选的是缬氨酸。

对在本发明的基因修饰微生物中表达变异型YeeX蛋白质或其同源物的方法没有特别限定，作为具体例子，可以列举出以下方法：通过公知的方法向对内在的YeeX蛋白质或其同源物进行编码的基因导入变异、导入利用了能够在微生物内自主复制的表达载体的对YeeX蛋白质或其同源物进行编码的基因、导入使用了在微生物的基因组上进行同源重组等方法的对变异型YeeX蛋白质或其同源物进行编码的基因、或者将对内在的YeeX蛋白质或其同源物进行编码的基因置换为对变异型YeeX蛋白质或其同源物进行编码的基因等，在本发明的基因修饰型微生物中，优选以下方法：向在微生物内可自主复制的表达载体中组装该基因并导入到微生物中的方法；或者通过使用向对内在的YeeX蛋白质或其同源物进行编码的基因导入变异、向微生物的基因组上同源重组等方法将对变异型YeeX蛋白质或其同源物进行编码的基因导入到微生物的基因组中，从而将对变异型YeeX蛋白质或其同源物进行编码的基因置换到宿主微生物的基因组上的方法。

本发明中使用的微生物只要是具有对变异型YeeX蛋白质或变异型YeeX蛋白质的同源物进行编码的基因的基因修饰微生物即可，没有特别限定，优选是具有生产化学品的能力的微生物，更优选是具有生产有机酸或氨基酸的能力的微生物，进一步优选是具有生产有机酸的能力的微生物，具体而言，优选为选自由沙雷氏菌(Serratia)属、大肠杆菌(Escherichia)属、放线杆菌(Actinobacillus)属、Basfia属、假单胞菌(Pseudomonas)属、哈夫尼菌(Hafnia)属、不动杆菌(Acinetobacter)属、Shimwellia属或产气杆菌(Aerobacter)属组成的组中的微生物，更优选属于沙雷氏菌(Serratia)属、大肠杆菌(Escherichia)属、放线杆菌(Actinobacillus)属或Basfia属的微生物，特别优选属于沙雷氏菌(Serratia)属或大肠杆菌(Escherichia)属的微生物。

在本发明的基因修饰微生物具有有机酸生产能力的情况下，其特征在于，以包含能够表达变异型YeeX蛋白质或其同源物的基因的方式，具有比基因修饰前的微生物优异的有机酸生产性。这里，“优异的有机酸生产性”是指在同一宿主微生物、同一发酵条件下，与包含仅能够表达序列号1的野生型YeeX蛋白质的基因的微生物株、或者能够表达YeeX蛋白质的基因发生缺损后的微生物株相比，以高产率生产有机酸。在利用本发明的基因修饰微生物的有机酸的制造方法中，乙酸产率根据式(2)算出。琥珀酸产率、3-羟基己二酸产率、α-氢化己二烯二酸产率或己二酸产率通过将式(2)的乙酸分别换成琥珀酸、3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸或己二酸来算出。

产率(％)＝乙酸(mol)/碳源的消耗量(mol)×100···式(2)。

在本发明中，在将对所表达的变异型YeeX蛋白质进行编码的基因组装在表达载体中的情况下，该表达载体优选由启动子、核糖体结合序列、对所表达的蛋白质进行编码的基因、转录终止序列构成。

在将对变异型YeeX蛋白质进行编码的基因组装在微生物基因组中的情况下，优选的是，基因组组装用核酸由启动子、核糖体结合序列、对所表达的蛋白质进行编码的基因、转录终止序列构成，以置换微生物一直以来具有的野生型YeeX蛋白质或其同源物的形式组装对变异型YeeX蛋白质或其同源物进行编码的基因。另外，也可以包含控制启动子活性的基因。

本发明中所使用的启动子只要是可以在微生物内表达酶即可，没有特别限定，例如可以列举出gap启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、T7启动子等。

在本发明中，在使用表达载体导入基因或进行蛋白质的表达的情况下，只要在该微生物中可自主复制即可，没有特别限定，例如可以列举出pBBR1MCS载体、pBR322载体、pMW载体、pET载体、pRSF载体、pCDF载体、pACYC载体、以及上述载体的衍生型等。

在本发明中，在使用基因组组装用核酸导入基因或进行蛋白质的表达的情况下，使用位点特异性同源重组来导入。对位点同源重组的方法没有特别限定，例如可以列举出：使用λRed重组酶和sacB基因的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.2007；71(12):2905-2911.)；使用λRed重组酶和FLP重组酶的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000；97(12):6640-6645.)。

表达载体或基因组组装用核酸的导入方法只要是将核酸导入在微生物中的方法即可，没有特别限定，例如可以列举出：电穿孔法(J.Bacteriol.1988；170:2796-2801.)；钙离子法(J.Mol.Biol.1970；53(1):159-162.)等。

在本发明的基因修饰微生物具有有机酸生产能力的情况下，作为所生产的有机酸，只要是微生物能够在培养基中生成并累积的有机酸即可，没有特别限定，具体而言，可以列举出：乙酸、琥珀酸、甲酸、丙酮酸、富马酸、苹果酸、草酰乙酸、柠檬酸、乙酰丙酸、3-氧代己二酸、3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸、己二酸、2,5-呋喃二羧酸等羧酸。在这些羧酸中，从显著观察到本发明的效果的角度出发，优选乙酸、琥珀酸、3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和/或己二酸。在本说明书中，有时将3-羟基己二酸简称为3HA、将α-氢化己二烯二酸简称为HMA、将己二酸简称为ADA。

有机酸是通过本发明的基因修饰微生物内在的反应路径生产的。特别地，3HA、HMA和ADA通过下述路线1所示的反应路径生产，在发酵生产这些有机酸时，使用表达对反应A、反应B、反应C、反应D、反应E、反应F以及反应G进行催化的酶的微生物株。

[化学式1]

上述路线1是表示用于生产3HA、HMA和/或ADA所需要的反应路径的例子。这里，反应A表示从乙酰-CoA和琥珀酰-CoA生成3-氧代己二酰-CoA和辅酶A的反应。反应B表示从3-氧代己二酰-CoA生成3-羟基己二酰-CoA的反应。反应C表示从3-羟基己二酰-CoA生成2,3-脱氢己二酰-CoA的反应。反应D表示从2,3-脱氢己二酰-CoA生成己二酰-CoA的反应。反应E表示从3-羟基己二酰-CoA生成3HA的反应。反应F表示从2,3-脱氢己二酰-CoA生成HMA的反应。反应G表示从己二酰-CoA生成ADA的反应。

作为对这些反应进行催化的酶的具体例子，可以列举出：作为对反应A进行催化的酶的酰基转移酶、作为对反应B进行催化的酶的3-氧代己二酰-CoA还原酶、作为对反应C进行催化的酶的烯酰-CoA水合酶、作为对反应D进行催化的酶的烯酰-CoA还原酶、作为对反应E、反应F以及反应G进行催化的酶的CoA转移酶。

作为对对反应A进行催化的酶进行编码的基因的具体例子，可以列举出来自Pseudomonas putida KT2440株的酰基转移酶pcaF(NCBI Gene ID:1041755，序列号13)。

作为对对反应B进行催化的酶进行编码的基因的具体例子，可以列举出来自Serratia marcescens ATCC13880株的3-氧代己二酰-CoA还原酶(NCBI Gene ID:JMPQ01000047.1，序列号14)。

作为对对反应C进行催化的酶进行编码的基因的具体例子，可以列举出来自Pseudomonas putida KT2440株的烯酰-CoA水合酶paaF(NCBI Gene ID:1046932，序列号15)。

作为对对反应D进行催化的酶进行编码的基因的具体例子，可以列举出来自Acinetobacter baylyi ADP1株的烯酰-CoA还原酶dcaA(NCBI-Protein ID:AAL09094.1，序列号16)。

作为对对反应E、F以及G进行催化的酶进行编码的基因的具体例子，可以列举出包含来自Pseudomonas putida KT2440株的pcaI和pcaJ(NCBI Gene ID:1046613、1046612，序列号17、18)的全长的连续序列。pcaI和pcaJ所编码的多肽通过形成复合物来催化反应E、反应F和反应G。

对对反应A～G进行催化的酶进行编码的基因可以是微生物一直以来具有的基因，也可以人为地导入。对基因的导入方法没有特别限定，可以使用向在微生物内可自主复制的表达载体中组装该基因并导入到微生物中的方法、或在微生物的基因组中组装该基因的方法等。

在本发明中，在含有通常的微生物可利用的碳源作为发酵原料的培养基、优选在液体培养基中对所述基因修饰微生物进行培养，制造有机酸。也可以使用除了该基因修饰微生物可利用的碳源以外，还进一步含有氮源、无机盐、以及根据需要的氨基酸或维生素等有机微量营养素的培养基。只要含有上述营养源，则无论是天然培养基还是合成培养基均可以利用。

发酵原料是指该基因修饰微生物可以代谢的原料。“代谢”是指微生物从细胞外吸收的、或者在细胞内由其他化学物质生成的某种化学物质通过酶反应而转化为其他化学物质。作为碳源，优选使用糖类。另外，除了糖以外，只要是作为单一碳源可以用于上述基因修饰微生物的生长，则可以优选使用。作为优选的碳源的具体例子，可以列举出：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖等单糖类；这些单糖类结合而成的蔗糖等二糖类；多糖类；以及含有这些糖类的淀粉糖化液、糖蜜、含纤维素生物质糖化液等。

另外，在生产3HA、HMA和/或ADA的情况下，除了上述列举的糖以外，通过添加作为CoA转移酶的基质的琥珀酸，可以有效地生产3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和/或己二酸。

上述列举的碳源可以只使用一种，也可以组合使用。在碳源的添加中，对培养基中的碳源的浓度没有特别限定，可以根据碳源的种类等进行适当设定，优选的是，糖类为5～300g/L、琥珀酸为0.1～100g/L。

作为氮源，例如可以使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其他辅助使用的有机氮源：例如油渣类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其他氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉精、胰蛋白胨等肽类、各种发酵菌体及其水解物等。对培养基中的氮源的浓度没有特别限定，优选为0.1～50g/L。

作为用于培养该基因修饰微生物的无机盐类，例如可以适当添加使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐以及锰盐等。

关于用于生产有机酸的基因修饰微生物的培养条件，可以根据该基因修饰微生物的种类和外部条件等，对上述成分组成的培养基、培养温度、搅拌速度、pH、通气量、接种量等进行适当地调节或选择设定。在液体培养中存在发泡的情况下，可以在适当培养基中配合矿物油、硅油和表面活性剂等消泡剂。

在所述基因修饰微生物的培养物中生产有机酸直到可回收的量后，可以将所生产的该产物回收。对于所生产的该产物的回收，例如可以在累积量适度提高的时间点停止培养，并按照从该培养物中提取发酵产物的一般方法来进行分离。具体而言，通过离心分离、过滤等将菌体分离后，通过柱层析色谱、离子交换层析色谱、活性炭处理、结晶、膜分离、蒸馏等将该产物从培养物中分离出来。更具体而言，可以列举出：通过在该产物的盐中添加酸性成分来回收析出物的方法；利用反渗透膜或旋蒸仪等对培养物进行浓缩操作以除去水，提高该产物的浓度后，通过蒸馏操作回收，或者通过冷却结晶或绝热结晶使该产物和/或该产物的盐的结晶析出，再通过离心分离或过滤等获得该产物和/或该产物的盐的结晶的方法；在培养物中添加醇类使糖成为酯产物后，通过蒸馏操作回收该产物的酯，然后再通过水解获得该产物的方法等，但不限于此。另外，这些回收方法可以根据产物的物性等适当地选择并优化。

实施例

(参考例1)用于将序列号12所记载的变异型YeeX蛋白质同源物组装在Serratiagrimesii(S.grimesii)NBRC13537株的基因组中的核酸的制作

为了将对变异型YeeX蛋白质同源物进行编码的基因导入到S.grimesii株的基因组中，使用利用了λRed重组酶和sacB基因的方法。通过核酸合成获得了将该核酸组装到基因组中所需的核酸序列(Genewiz公司制)。该核酸序列包括在S.grimesii株的基因组上编码野生型YeeX蛋白质同源物的基因的上游区域840b、sacB基因、编码卡那霉素耐性基因和野生型YeeX蛋白质同源物的基因的下游区域840b(序列号19)。设计了用于对通过核酸合成获得的核酸片段进行PCR扩增的引物(序列号20、21)，按照常规方法进行PCR反应。通过利用了琼脂糖凝胶的电泳法和核酸柱纯化试剂盒(Cytiva公司制)对得到的片段纯化，用于变异株的制作。

(参考例2)质粒1的制作

使用XhoI切断在大肠杆菌和S.grimesii内可自主复制的载体pBBR1MCS-2(MEKovach,(1995),Gene 166:175-176)，得到pBBR1MCS-2/XhoI。为了将构成性表达启动子组装在该载体中，以Escherichia coli(E.coli)str.K-12substr.MG1655的基因组DNA为模板，设计了用于对gapA(NCBI Gene ID:NC_000913.3)的上游区域200b(序列号22)进行PCR扩增的引物(序列号23、24)，按照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio Co.,Ltd.制)将得到的片段和pBBR1MCS-2/XhoI连接起来，并导入到E.coliDH5α中。从得到的重组株中提取该质粒，将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为pBBR1MCS-2::Pgap。接着，使用ScaI切断pBBR1MCS-2::Pgap，得到pBBR1MCS-2::Pgap/ScaI。

为了对对催化反应A的酶进行编码的基因进行扩增，以pseudomonas putidaKT2440株的基因组DNA为模板，设计了用于对酰基转移酶基因pcaF(NCBI Gene ID:1041755，序列号13)的全长进行PCR扩增的引物(序列号25、26)，按照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit将得到的片段和pBBR1MCS-2::Pgap/ScaI连接起来，并导入到大肠菌株DH5α中。从得到的重组株中提取该质粒，将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为pBBR1MCS-2::AT。

接着，使用HpaI切断pBBR1MCS-2::AT，得到pBBR1MCS-2::AT/HpaI。为了对对催化反应E、F以及G的酶进行编码的基因进行扩增，以Pseudomonas putida KT2440株的基因组DNA为模板，设计了用于对包含CoA转移酶基因pcaI和pcaJ(NCBI GeneID:1046613、1046612、序列号17、18)的全长的连续序列进行PCR扩增的引物(序列号27、28)，按照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit将得到的片段和pBBR1MCS-2::AT/HpaI连接起来，并导入到E.coli DH5α中。从得到的重组株中提取该质粒，将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为pBBR1MCS-2::ATCT。

使用ScaI切断pBBR1MCS-2::ATCT，得到pBBR1MCS-2::ATCT/ScaI。为了对对催化反应B的3-氧代己二酰-CoA还原酶进行编码的核酸进行扩增，以Serratia marcescensATCC13880株的基因组DNA为模板，设计了用于对序列号14所记载的核酸进行扩增的引物(序列号29、30)，按照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara BioCo.,Ltd.制)将得到的片段和pBBR1MCS-2::ATCT/ScaI连接起来，并导入到E.coli DH5α中。从得到的重组株中提取该质粒，将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为质粒1。

(参考例3)质粒2的制作

使用SacI切断pMW119(Nippon Gene Co.,Ltd.制)，得到pMW119/SacI。为了将构成性表达启动子组装在该载体中，以E.coli str.K-12substr.MG1655的基因组DNA为模板，设计了用于对gapA(NCBI Gene ID:NC_000913.3)的上游区域200b(序列号22)进行PCR扩增的引物(序列号31、32)，按照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit(TakaraBio Co.,Ltd.制)将得到的片段和pMW119/SacI连接起来，并导入到E.coli DH5α中。从得到的重组株中提取该质粒，将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为pMW119::Pgap。

接着，使用SphI切断pMW119::Pgap，得到pMW119::Pgap/SphI。为了对对催化反应C的酶进行编码的基因进行扩增，以pseudomonas putida KT2440株的基因组DNA为模板，设计了用于对烯酰-CoA水合酶基因paaF(NCBI Gene ID:1046932，序列号15)的全长进行PCR扩增的引物(序列号33、34)，按照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio Co.,Ltd.制)将得到的片段和pMW119::Pgap/SphI连接起来，并导入到E.coliDH5α中。从得到的重组株中提取该质粒，通过常规方法确认了碱基序列。将所得的质粒设为pMW119::EH。

使用HindIII切断pMW119::EH，得到pMW119::EH/HindIII。为了对对催化反应D的酶进行编码的基因进行扩增，设计了用于对来自Acinetobacter baylyi ADP1株的dcaA(NCBI-Protein ID:AAL09094.1，序列号16)的全长进行PCR扩增的引物(序列号35、36)，按照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio Co.,Ltd.制)将得到的片段和pMW119::EH/HindIII连接起来，并导入到E.coli DH5α中。从得到的重组株中提取该质粒，将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为质粒2。

(参考例4)用于表达序列号12所记载的变异型YeeX蛋白质同源物的质粒(质粒3)的制作

使用KpnI切断参考例3中记载的pMW119::Pgap，得到pMW119::Pgap/KpnI。设计了用于对对序列号12所记载的变异型YeeX蛋白质同源物进行编码的基因(序列号37)的全长进行PCR扩增的引物(序列号38、39)，按照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HDCloning Kit将得到的片段和pMW119::Pgap/KpnI连接起来，并导入到E.coli DH5α中。从得到的重组株中提取该质粒，将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为质粒3。

(参考例5)用于将序列号44所记载的变异型YeeX组装在Escherichia coli(E.coli)MG1655株的基因组中的核酸的制作

为了将对变异型YeeX进行编码的基因导入到E.coli MG1655株的基因组中，使用利用了λRed重组酶和sacB基因的方法。通过核酸合成获得了将该核酸组装到基因组中所需的核酸序列(Genewiz公司制)。该核酸序列包括在E.coli株的基因组上编码野生型YeeX的基因的上游区域500b、sacB基因、编码卡那霉素耐性基因和野生型YeeX的基因的下游区域500b(序列号45)。设计了用于对通过核酸合成获得的核酸片段进行PCR扩增的引物(序列号46、47)，按照常规方法进行PCR反应。通过利用了琼脂糖凝胶的电泳法和核酸柱纯化试剂盒(Cytiva公司制)对得到的片段纯化，用于变异株的制作。

(参考例6)用于表达序列号44所记载的变异型YeeX的质粒(质粒4)的制作

使用KpnI切断pCDF-1b质粒，得到pCDF-1b/KpnI。设计了用于对对序列号44所记载的变异型YeeX蛋白质同源物进行编码的基因以及基因的上游区域500b和下游区域500b的全长(序列号48)进行PCR扩增的引物(序列号49、50)，按照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit将得到的片段和pCDF-1b/KpnI连接起来，并导入到E.coli DH5α中。从得到的重组株中提取该质粒，将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为质粒4。

(比较例1)具有对序列号2所记载的蛋白质进行编码的基因的S.grimesii株的培养

作为具有序列号2所记载的野生型YeeX蛋白质同源物的亲株，使用除去了对葡萄糖转运蛋白PtsG(序列号40)进行编码的基因和对丙酮酸激酶PykF和PykA(序列号41、42)进行编码的基因的Serratia grimesii NBRC13537。

将一白金环的S.grimesii亲株接种在5mL的调整为pH7的LB培养基(10g/L的Bacto胰蛋白胨(Difco Laboratories公司制)、5g/L的Bacto酵母提取物(Difco Laboratories公司制)、5g/L的氯化钠)中，在30℃、120min-1振动培养18小时。将0.15mL的该培养液添加到放在带有螺丝帽的试验管中的15mL的调整为pH6.5的培养基I(10g/L的葡萄糖、1g/L的硫酸铵、50mM的磷酸钾、0.025g/L的硫酸镁、0.0625mg/L的硫酸铁、2.7mg/L的硫酸锰、0.33mg/L的氯化钙、1.25g/L的氯化钠、2.5g/L的Bacto胰蛋白胨、1.25g/L的Bacto酵母提取物)中，在30℃、120min-1振动培养48小时。

使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液中离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表3所示。

[利用HPLC进行的葡萄糖、乙酸和琥珀酸的定量分析条件]

HPLC：Shimazu Prominence(株式会社岛津制作所制造)

柱子：Shodex Sugar SH1011(昭和电工株式会社制造)，长300mm，内径8mm，粒径6μm

流动相：0.05M硫酸水溶液

流速：0.6mL/分钟

柱温：65℃

检测器：RI。

[利用LC-MS/MS进行的3HA、HMA以及ADA的定量分析条件]

HPLC：1290Infinity(Agilent Technologies公司制造)

柱子：Synergi hydro-RP(Phenomenex公司制造)，长100mm，内径3mm，粒径2.5μm

流动相：0.1％甲酸水溶液/甲醇＝70/30

流速：0.3mL/分钟

柱温：40℃

LC检测器：DAD(210nm)

MS/MS：Triple-Quad LC/MS(Agilent Technologies公司制造)

离子化方法：ESI负模式。

(比较例2)编码YeeX蛋白质的基因缺损了的S.grimesii/yeeX缺损株的制作和培养

利用电穿孔将用于表达λRed重组酶所需的pKD46质粒导入到比较例1所记载的S.grimesii株中。导入后，将该株在含有500μg/mL的氨苄西林的LB琼脂培养基中于30℃进行培养。利用电穿孔将参考例1中制作的核酸片段导入到所得菌株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基中于30℃进行培养。所获得的重组株是对YeeX蛋白质同源物进行编码的基因序列全长被重组用盒式序列置换了的S.grimesii/pKD46/yeeX缺损株。为了从S.grimesii/pKD46/yeeX缺损株中除去pKD46质粒，将一白金环的该菌株接种在5mL的LB培养基(10g/L的Bacto胰蛋白胨(Difco Laboratories公司制)、5g/L的Bacto酵母提取物(Difco Laboratories公司制)、5g/L的氯化钠)中，在37℃、120min-1振动培养48小时。将10μL的该培养液在LB琼脂培养基中于30℃进行培养，选出缺乏氨苄西林耐性的菌落，得到S.grimesii/yeeX缺损株。

将一白金环的该菌株接种在5mL的调整为pH7的含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基(10g/L的Bacto胰蛋白胨(Difco Laboratories公司制)、5g/L的Bacto酵母提取物(DifcoLaboratories公司制)、5g/L的氯化钠)中，在30℃、120min-1振动培养18小时。将0.15mL的该培养液添加到放置在带有螺丝帽的试验管中的15mL的调整为pH6.5的含有25μg/mL卡那霉素的培养基I(10g/L的葡萄糖、1g/L的硫酸铵、50mM的磷酸钾、0.025g/L的硫酸镁、0.0625mg/L的硫酸铁、2.7mg/L的硫酸锰、0.33mg/L的氯化钙、1.25g/L的氯化钠、2.5g/L的Bacto胰蛋白胨、1.25g/L的Bacto酵母提取物)中，在30℃、120min-1振动培养48小时。

使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液中离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表3所示。

(实施例1)具有对变异型YeeX蛋白质同源物(序列号12)进行编码的基因的S.grimesii/YeeX变异株的制作和培养

为了对核酸序列(序列号43)的全长进行扩增，使用序列号20和21的引物，按照常规方法进行PCR反应，该核酸序列包括在S.grimesii株的基因组上编码野生型YeeX蛋白质同源物的基因的上游区域840b、编码序列号12所记载的变异型YeeX蛋白质同源物的基因和编码野生型YeeX蛋白质同源物的基因的下游区域840b。通过利用了琼脂糖凝胶的电泳法和核酸柱纯化试剂盒(Cytiva公司制)将得到的片段纯化，用于变异株的制作。

通过电穿孔将该核酸片段(序列号43)导入到比较例2所制作的具有pKD46质粒的S.grimesii/yeeX缺损株中。导入后，将该菌株在含有50g/L蔗糖的培养基I琼脂培养基中于30℃培养。将得到的菌落在LB琼脂培养基和含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基中于30℃培养，选出没有卡那霉素耐性的菌株。所得到的菌株是将对基因组上的序列号1的氨基酸序列的相当于第84位的丙氨酸未置换的YeeX蛋白质同源物(序列号2)进行编码的基因置换为序列号1的氨基酸序列的相当于第84位的丙氨酸置换为缬氨酸后的变异型YeeX蛋白质同源物(序列号12)进行编码的基因而得的S.grimesii/YeeX变异株。

将该菌株通过与比较例1同样的方法培养后，使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表3所示。

(比较例3)具有质粒1的S.grimesii株的制作和培养

通过电穿孔将参考例2中制作的质粒1导入到比较例1所记载的S.grimesii株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基中于30℃培养。将获得的重组株设为S.grimesii/质粒1株。

将该菌株通过与比较例2同样的方法培养后，使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表3所示。

(实施例2)具有质粒1的S.grimesii/YeeX变异株的制作和培养

通过电穿孔将参考例2中制作的质粒1导入到实施例1中制作的S.grimesii/YeeX变异株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基中于30℃培养。将获得的重组株设为S.grimesii/质粒1/YeeX变异株。

将该菌株通过与比较例2同样的方法培养后，使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表3所示。

(实施例3)具有质粒1和质粒3的S.grimesii株的制作和培养

通过电穿孔将参考例4中制作的质粒3导入到比较例3中制作的S.grimesii/质粒1株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL卡那霉素和500μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基中于30℃培养。将获得的重组株设为S.grimesii/质粒1/质粒3株。

将一白金环的该菌株接种在5mL的调整为pH7的含有25μg/mL卡那霉素和500μg/mL氨苄西林的LB培养基(10g/L的Bacto胰蛋白胨(Difco Laboratories公司制)、5g/L的Bacto酵母提取物(Difco Laboratories公司制)、5g/L的氯化钠)中，在30℃、120min-1振动培养18小时。将0.15mL的该培养液添加到放置在带有螺丝帽的试验管中的15mL的调整为pH6.5的含有25μg/mL卡那霉素和500μg/mL氨苄西林的培养基I(10g/L的葡萄糖、1g/L的硫酸铵、50mM的磷酸钾、0.025g/L的硫酸镁、0.0625mg/L的硫酸铁、2.7mg/L的硫酸锰、0.33mg/L的氯化钙、1.25g/L的氯化钠、2.5g/L的Bacto胰蛋白胨、1.25g/L的Bacto酵母提取物)中，在30℃、120min-1振动培养48小时。

使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表3所示。

(比较例4)具有质粒1和质粒2的S.grimesii株的制作和培养

通过电穿孔将参考例3中制作的质粒2导入到比较例3中制作的S.grimesii/质粒1株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL卡那霉素和500μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基中于30℃培养。将获得的重组株设为S.grimesii/质粒1/质粒2株。

将该菌株通过与实施例3同样的方法培养后，使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表3所示。

(实施例4)具有质粒1和质粒2的S.grimesii/YeeX变异株的制作和培养

通过电穿孔将参考例3中制作的质粒2导入到实施例1中制作的S.grimesii/YeeX变异株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL卡那霉素和500μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基中于30℃培养。将获得的重组株设为S.grimesii/质粒1/质粒2/YeeX变异株。

将该菌株通过与实施例3同样的方法培养后，使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表3所示。

[表3]

根据比较例1、2及实施例1的结果显而易见的是，与在基因组上具有对野生型YeeX蛋白质同源物(序列号2)进行编码的基因的S.grimesii亲株和S.grimesii/YeeX缺损株相比，在基因组上具有对变异型YeeX蛋白质同源物(序列号12)进行编码的基因的S.grimesii/YeeX变异株以高产率生产了琥珀酸和乙酸等有机酸。

比较例3和实施例2的结果表明，即使是具有表达3HA生产所需的酶的质粒1的S.grimesii/质粒1/YeeX变异株，与具有质粒1的亲株相比，琥珀酸、乙酸、3HA和HMA等有机酸的发酵生产产率也得到提高。

在实施例3中，即使是在基因组上具有对野生型YeeX蛋白质同源物(序列号2)进行编码的基因、具有表达变异型YeeX蛋白质同源物(序列号12)的质粒3和质粒1的S.grimesii/质粒1/质粒3株，也发现有机酸产率的提高。由此表明，即使是使用表达质粒导入变异型YeeX蛋白质同源物而使野生型YeeX蛋白质同源物和变异型YeeX蛋白质同源物这两者都表达的S.grimesii株，也得到了本发明的效果。

根据比较例4和实施例4的结果发现，即使是具有表达ADA生产所需的酶的质粒1和质粒2的S.grimesii/质粒1/质粒2/YeeX变异株，与具有质粒1和质粒2的亲株相比，琥珀酸、乙酸、3HA、HMA和ADA等有机酸的产率也显著提高。

(比较例5)具有对野生型YeeX蛋白质(序列号1)进行编码的基因的E.coli株的培养

使用Escherichia coli MG1655株作为具有序列号1所记载的野生型YeeX蛋白质的亲株。将该菌株通过与比较例1同样的方法培养后，使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表4所示。

(比较例6)对YeeX蛋白质进行编码的基因缺损了的E.coli/yeeX缺损株的制作和培养

通过电穿孔将用于表达λRed重组酶所需的pKD46质粒导入到比较例5所记载E.coli株中。导入后，将该菌株在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基中于30℃培养。通过电穿孔将参考例5中制作的核酸片段导入到所得的菌株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基中于30℃培养。所得到的重组株是对YeeX进行编码的基因序列全长被重组用盒式序列置换后的E.coli/pKD46/yeeX缺损株。为了从E.coli/pKD46/yeeX缺损株中除去pKD46质粒，将一白金环的该菌株接种在5mL的LB培养基(10g/L的Bacto胰蛋白胨(Difco Laboratories公司制)、5g/L的Bacto酵母提取物(Difco Laboratories公司制)、5g/L的氯化钠)中，在37℃、120min-1振动培养48小时。将10μL的该培养液在LB琼脂培养基中于30℃培养，选出缺乏氨苄西林耐性的菌落，得到E.coli/yeeX缺损株。

将该菌株通过与比较例2同样的方法培养后，使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表4所示。

(实施例5)具有编码变异型YeeX蛋白质(序列号44)的基因的E.coli/YeeX变异株的制作和培养

为了对核酸序列(序列号48)的全长进行扩增，使用序列号46和47的引物，按照常规方法进行PCR反应，该核酸序列包括在E.coli株的基因组上编码野生型YeeX蛋白质(序列号1)的基因的上游区域500b、编码序列号44所记载的变异型YeeX蛋白质的基因和编码野生型YeeX蛋白质的基因的下游区域500b。通过利用了琼脂糖凝胶的电泳法和核酸柱纯化试剂盒(Cytiva公司制)对得到的片段纯化，用于变异株的制作。

通过电穿孔将该核酸片段(序列号48)导入到比较例6所制作的具有pKD46质粒的E.coli/yeeX缺损株中。导入后，将该菌株在含有50g/L蔗糖的培养基I琼脂培养基中于30℃培养。将得到的菌落在LB琼脂培养基和含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基中于30℃培养，选出没有卡那霉素耐性的菌株。所得到的菌株是将对基因组上的序列号1的野生型YeeX蛋白质进行编码的基因置换为对序列号1的氨基酸序列的第84位的丙氨酸置换为缬氨酸后的变异型YeeX蛋白质(序列号44)进行编码的基因而得的E.coli/YeeX变异株。

将该菌株通过与比较例1同样的方法培养后，使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表4所示。

(比较例7)具有质粒1的E.coli株的制作和培养

通过电穿孔将参考例2中制作的质粒1导入到比较例5所记载的E.coli株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基中于30℃培养。将获得的重组株设为E.coli/质粒1株。

将该菌株通过与比较例2同样的方法培养后，使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表4所示。

(实施例6)具有质粒1的E.coli/YeeX变异株的制作和培养

通过电穿孔将参考例2中制作的质粒1导入到实施例5中制作的E.coli/YeeX变异株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基中于30℃培养。将获得的重组株设为E.coli/质粒1/YeeX变异株。

将该菌株通过与比较例2同样的方法培养后，使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表4所示。

(实施例7)具有质粒1和质粒4的E.coli株的制作和培养

通过电穿孔将参考例6中制作的质粒4导入到比较例7中制作的E.coli/质粒1株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的LB琼脂培养基中于30℃培养。将获得的重组株设为E.coli/质粒1/质粒4株。

将一白金环的该菌株接种在5mL的调整为pH7的含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的LB培养基(10g/L的Bacto胰蛋白胨(Difco Laboratories公司制)、5g/L的Bacto酵母提取物(Difco Laboratories公司制)、5g/L的氯化钠)中，在30℃、120min-1振动培养18小时。将0.15mL的该培养液添加到放置在带有螺丝帽的试验管中的15mL的调整为pH6.5的含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的培养基I(10g/L的葡萄糖、1g/L的硫酸铵、50mM的磷酸钾、0.025g/L的硫酸镁、0.0625mg/L的硫酸铁、2.7mg/L的硫酸锰、0.33mg/L的氯化钙、1.25g/L的氯化钠、2.5g/L的Bacto胰蛋白胨、1.25g/L的Bacto酵母提取物)中，在30℃、120min-1振动培养48小时。

使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表4所示。

(比较例8)具有质粒1和质粒2的E.coli株的制作和培养

通过电穿孔将参考例3中制作的质粒2导入到比较例7中制作的E.coli/质粒1株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基中于30℃培养。将获得的重组株设为E.coli/质粒1/质粒2株。

将一白金环的该菌株接种在5mL的调整为pH7的含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄西林的LB培养基(10g/L的Bacto胰蛋白胨(Difco Laboratories公司制)、5g/L的Bacto酵母提取物(Difco Laboratories公司制)、5g/L的氯化钠)中，在30℃、120min-1振动培养18小时。将0.15mL的该培养液添加到放置在带有螺丝帽的试验管中的15mL的调整为pH6.5的含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄西林的培养基I(10g/L的葡萄糖、1g/L的硫酸铵、50mM的磷酸钾、0.025g/L的硫酸镁、0.0625mg/L的硫酸铁、2.7mg/L的硫酸锰、0.33mg/L的氯化钙、1.25g/L的氯化钠、2.5g/L的Bacto胰蛋白胨、1.25g/L的Bacto酵母提取物)中，在30℃、120min-1振动培养48小时。

使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表4所示。

(实施例8)具有质粒1和质粒2的E.coli/YeeX变异株的制作和培养

通过电穿孔将参考例3中制作的质粒2导入到实施例5中制作的E.coli/YeeX变异株中。导入后，将该菌株在含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基中于30℃培养。将获得的重组株设为E.coli/质粒1/质粒2/YeeX变异株。

将该菌株通过与比较例8同样的方法培养后，使用Millex-GV(0.22μm、PVDF、Merck公司制造)对从该培养液离心分离菌体后的上清液进行膜处理，利用HPLC和LC-MS/MS分析透过液。对培养上清液中累积的有机酸进行定量分析的结果、以及使用式(2)算出的有机酸的产率如表4所示。

[表4]

根据比较例5、6及实施例5的结果显而易见的是，与在基因组上具有对野生型YeeX蛋白质(序列号1)进行编码的基因的E.coli亲株和E.coli/YeeX缺损株相比，在基因组上具有对变异型YeeX蛋白质(序列号44)进行编码的基因的E.coli/YeeX变异株以高产率生产了琥珀酸和乙酸等有机酸。

比较例7和实施例6的结果表明，即使是具有表达3HA生产所需的酶的质粒1的E.coli/质粒1/YeeX变异株，与具有质粒1的亲株相比，琥珀酸、乙酸和3HA等有机酸的发酵生产产率也得到提高。

在实施例6中，即使是在基因组上具有对野生型YeeX蛋白质(序列号1)进行编码的基因、具有表达变异型YeeX蛋白质(序列号44)的质粒4和质粒1的E.coli/质粒1/质粒4株，也发现有机酸产率的提高。由此表明，即使是使用表达质粒以导入变异型YeeX蛋白质而使野生型YeeX蛋白质和变异型YeeX蛋白质这两者都表达的E.coli株，也得到了本发明的效果。

根据比较例8和实施例8的结果发现，即使是具有表达ADA生产所需的酶的质粒1和质粒2的E.coli/质粒1/质粒2/YeeX变异株，与具有质粒1和质粒2的亲株相比，琥珀酸、乙酸、3HA、HMA和ADA等有机酸的产率也显著提高。

序列表

<110> 东丽株式会社

<120> 基因修饰微生物以及有机酸的制造方法

<130> 21094WO01

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 109

<212> PRT

<213> Escherichia coli MG1655

<400> 1

Met Glu Thr Thr Lys Pro Ser Phe Gln Asp Val Leu Glu Phe Val Arg

1 5 10 15

Leu Phe Arg Arg Lys Asn Lys Leu Gln Arg Glu Ile Gln Asp Val Glu

20 25 30

Lys Lys Ile Arg Asp Asn Gln Lys Arg Val Leu Leu Leu Asp Asn Leu

35 40 45

Ser Asp Tyr Ile Lys Pro Gly Met Ser Val Glu Ala Ile Gln Gly Ile

50 55 60

Ile Ala Ser Met Lys Gly Asp Tyr Glu Asp Arg Val Asp Asp Tyr Ile

65 70 75 80

Ile Lys Asn Ala Glu Leu Ser Lys Glu Arg Arg Asp Ile Ser Lys Lys

85 90 95

Leu Lys Ala Met Gly Glu Met Lys Asn Gly Glu Ala Lys

100 105

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Serratia grimesii NBRC13537

<400> 2

Met Lys Met Asp Asn Ala Asn Lys Pro Ser Phe Gln Asp Val Leu Glu

1 5 10 15

Phe Val Arg Met Phe Arg Arg Lys Asn Lys Leu Gln Arg Glu Ile Ile

20 25 30

Asp Asn Glu Lys Lys Val Arg Asp Asn Gln Lys Arg Val Leu Leu Leu

35 40 45

Asp Asn Leu Ser Glu Tyr Ile Lys Pro Gly Met Ser Ile Glu Asp Val

50 55 60

Gln Gly Ile Ile Gly Asn Met Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Val Asp

65 70 75 80

Asp Tyr Ile Ile Lys Asn Ala Asp Leu Ser Lys Glu Arg Arg Glu Leu

85 90 95

Ser Lys Lys Leu Lys Ala Met Gly Glu Val Lys

100 105

<210> 3

<211> 94

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 3

Phe Arg Arg Lys Asn Lys Leu Gln Arg Glu Ile Gln Asp Ile Glu Lys

1 5 10 15

Lys Ile Arg Asp Asn Gln Lys Arg Val Leu Leu Leu Asp Asn Leu Ser

20 25 30

Asp Tyr Ile Lys Pro Gly Met Ser Val Glu Ala Ile Gln Gly Ile Ile

35 40 45

Ala Ser Met Lys Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Val Asp Asp Tyr Ile Ile

50 55 60

Lys Asn Ala Glu Ile Ser Lys Glu Arg Arg Asp Ile Ser Lys Lys Leu

65 70 75 80

Lys Ala Met Gly Glu Met Lys His Ala Asp Val Lys Ala Glu

85 90

<210> 4

<211> 114

<212> PRT

<213> Actinobacillus succinogenes 130Z

<400> 4

Met Glu Asn Val Asn Lys Gln Ser Phe Gln Glu Val Leu Glu Tyr Val

1 5 10 15

Arg Ile Asn Arg Gln Arg Asn Lys Leu Leu Arg Glu Ile Gly Asp Cys

20 25 30

Glu Arg Lys Ile Arg Asp Asn Lys Lys Arg Val Leu Leu Leu Asp Asn

35 40 45

Leu Thr Asp Tyr Ile Gln Asp Asn Met Thr Ile Glu Asp Ile Arg Ala

50 55 60

Ile Ile Asn Asn Met His Asp Asp Tyr Glu Asn Arg Val Asp Asp Tyr

65 70 75 80

Val Ile Lys Ala Ala Glu Leu Ser Lys Gln Arg Arg Asp Leu Lys Thr

85 90 95

Arg Met Lys Glu Leu Lys Ala Ser His Ala Ala Leu Ala Lys Lys Gly

100 105 110

Lys Glu

<210> 5

<211> 111

<212> PRT

<213> Aerobacter cloacae

<400> 5

Met Glu Thr Thr Lys Pro Ser Phe Gln Asp Val Leu Glu Phe Val Arg

1 5 10 15

Leu Phe Arg Arg Lys Asn Lys Leu Gln Arg Glu Ile Gln Asp Val Glu

20 25 30

Lys Lys Ile Arg Asp Asn Gln Lys Arg Val Leu Leu Leu Asp Asn Leu

35 40 45

Ser Asp Tyr Ile Lys Pro Gly Met Ser Val Glu Ala Ile Gln Gly Ile

50 55 60

Ile Ala Ser Met Lys Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Val Asp Asp Tyr Ile

65 70 75 80

Ile Lys Asn Ala Glu Leu Ser Lys Glu Arg Arg Asp Ile Ser Lys Lys

85 90 95

Leu Lys Val Met Gly Glu Ile Lys Asn Gly Glu Ala Lys Gly Glu

100 105 110

<210> 6

<211> 114

<212> PRT

<213> Basfia succiniciproducens

<400> 6

Met Glu Asn Val Asn Lys Gln Ser Phe Gln Asp Val Leu Glu Tyr Val

1 5 10 15

Arg Leu Tyr Arg Leu Arg Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ile Gly Asp Asn

20 25 30

Asp Arg Lys Ile Arg Asp Asn Gln Lys Arg Val Leu Leu Leu Asp Asn

35 40 45

Leu Ser Gln Tyr Ile Thr Asn Asp Met Ser Val Glu Asp Ile Arg Ala

50 55 60

Ile Ile Glu Asn Met Arg Asp Asp Tyr Glu Gly Arg Val Asp Asp Tyr

65 70 75 80

Met Ile Arg Asn Ala Asp Leu Ser Lys Glu Arg Arg Glu Ile Lys Glu

85 90 95

Lys Met Lys Ala Gln Lys Lys Ala His Ala Glu Leu Leu Lys Lys Ala

100 105 110

Asp Asp

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> Hafnia paralvei

<400> 7

Met Glu Asn Val Asn Lys Pro Thr Phe Gln Asn Val Leu Glu Phe Val

1 5 10 15

Arg Met Phe Arg Arg Lys Asn Lys Leu Gln Arg Glu Ile Val Asp Asn

20 25 30

Glu Lys Lys Ile Arg Asp Asn Gln Lys Arg Val Leu Leu Leu Asp Asn

35 40 45

Leu Ser Glu Tyr Ile Lys Pro Gly Met Ser Val Glu Ala Ile Gln Ala

50 55 60

Ile Ile Ala Asp Met Arg Gly Asn Tyr Glu Asp Arg Val Asp Asp Tyr

65 70 75 80

Ile Ile Lys Asn Ala Asp Leu Ser Lys Glu Arg Arg Glu Leu Ser Lys

85 90 95

Lys Leu Lys Ala Leu Gly Glu Gly Glu Ser Lys

100 105

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 8

Met Glu Thr Thr Lys Pro Ser Phe Gln Asp Val Leu Glu Phe Val Arg

1 5 10 15

Leu Tyr Arg Arg Lys Asn Lys Leu Gln Arg Glu Ile Gln Asp Val Glu

20 25 30

Lys Lys Ile Arg Asp Asn Gln Lys Arg Val Leu Leu Leu Asp Asn Leu

35 40 45

Ser Asp Tyr Ile Lys Pro Gly Met Ser Val Glu Ala Ile Gln Gly Ile

50 55 60

Ile Ala Ser Met Lys Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Val Asp Asp Tyr Ile

65 70 75 80

Ile Lys Asn Ala Glu Leu Ser Lys Glu Arg Arg Asp Ile Ser Lys Lys

85 90 95

Leu Lys Val Met Gly Glu Ala Lys Val Glu Gly

100 105

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> Shimwellia blattae

<400> 9

Met Glu Asn Thr Lys Pro Ser Phe Gln Asp Val Leu Glu Phe Val Arg

1 5 10 15

Leu Phe Arg Arg Lys Asn Lys Leu Gln Arg Glu Ile Gln Asp Val Glu

20 25 30

Lys Lys Ile Arg Asp Asn Gln Lys Arg Val Leu Leu Leu Asp Asn Leu

35 40 45

Ser Asp Tyr Ile Lys Pro Gly Met Thr Val Glu Ala Ile Gln Gly Ile

50 55 60

Ile Ala Ser Met Lys Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Val Asp Asp Tyr Ile

65 70 75 80

Ile Lys Asn Ala Glu Leu Ser Lys Glu Arg Arg Asp Ile Ser Lys Lys

85 90 95

Leu Lys Val Met Gly Glu Met Lys Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Ala

100 105 110

<210> 10

<211> 330

<212> DNA

<213> Escherichia coli MG1655

<400> 10

atggaaacta ccaagccttc attccaggac gtactggaat ttgttcgtct gttccgtcgt 60

aagaacaaac tgcaacgtga aattcaggac gttgagaaaa agatccgtga caaccagaag 120

cgcgtcctgc tgctggacaa cctgagcgat tacatcaagc cggggatgag cgttgaagca 180

atccagggca tcatcgccag catgaaaggt gactatgaag atcgcgttga cgattacatc 240

atcaaaaatg ccgagctctc caaagaacgc cgcgatatct ccaaaaagct gaaagctatg 300

ggcgaaatga aaaacggcga agcgaagtaa 330

<210> 11

<211> 324

<212> DNA

<213> Serratia grimesii NBRC13537

<400> 11

atgaagatgg ataatgcaaa taagccgagt ttccaggacg ttctggagtt tgtgcgtatg 60

ttccgccgta aaaataagct gcaacgcgaa attatcgaca acgaaaagaa agttcgtgat 120

aaccaaaagc gtgtgctgct actcgacaac ctgagtgagt acatcaagcc aggcatgagc 180

attgaagacg ttcagggcat cattggcaac atgcgcagcg actatgaaga tcgcgttgat 240

gactacatca tcaaaaatgc cgatctgtct aaagaacgtc gcgaactgtc caaaaagctg 300

aaagctatgg gcgaagtgaa gtaa 324

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

Met Lys Met Asp Asn Ala Asn Lys Pro Ser Phe Gln Asp Val Leu Glu

1 5 10 15

Phe Val Arg Met Phe Arg Arg Lys Asn Lys Leu Gln Arg Glu Ile Ile

20 25 30

Asp Asn Glu Lys Lys Val Arg Asp Asn Gln Lys Arg Val Leu Leu Leu

35 40 45

Asp Asn Leu Ser Glu Tyr Ile Lys Pro Gly Met Ser Ile Glu Asp Val

50 55 60

Gln Gly Ile Ile Gly Asn Met Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Val Asp

65 70 75 80

Asp Tyr Ile Ile Lys Asn Val Asp Leu Ser Lys Glu Arg Arg Glu Leu

85 90 95

Ser Lys Lys Leu Lys Ala Met Gly Glu Val Lys

100 105

<210> 13

<211> 774

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida KT2440

<400> 13

atgccgcgat atatcgatgt gcaggcgccc gaacatggcg ttcagctcat taccctgcaa 60

cggcccgagg ccttgaatgc cctgtgcacc gagctactgg cagaactggc cgctgcgctg 120

caggctgccg ggaacgacga gcatgtccgt gccacagtga ttaccggcag cgccaaggca 180

ttcgccgcag gcgccgacat ccgcgagatg gccgatcgcg acctggtcgg catcctcaat 240

gacccgcgcg tagcgcattg gcaaagcatc gccgcattcg ccaaaccgct gattgctgca 300

gtcaacggct atgccctggg tggcggttgc gaactggcaa tgtgcgccga catcgtcatc 360

gccagtaccg acgcccgttt cggccagccg gaaatcaacc ttggcatcat ccccggtgct 420

ggcggcaccc agcgcctgtt acgtgccgtc ggtaagccgt tggccatgca gatggtgctg 480

acgggggaag ccatcactgc cctccgcgcc cagcaggccg gcctggtcag cgaaatcacc 540

cagcccgaac tcaccgtaga acgcgccatg caggttgccc gcagcatcgc cgccaaagcg 600

ccgctggctg tgcgcctggc caaggaggcg ttactgaagg ccggtgatac cgacctggcc 660

agcggcctgc gcttcgagcg ccatgccttc accctgctgg cgggcaccgc cgaccgcgat 720

gaaggcatcc gcgccttcca ggaaaagcgc caggcccgct tccaagggcg ctga 774

<210> 14

<211> 1530

<212> DNA

<213> Serratia marcescens ATCC13880

<400> 14

atggcagaaa gtaatgcggc aattcaatcg gctgcgatta tcggcgcggg aacgatgggc 60

agaggcatcg cttatctttt cgcgcaaaaa ggcattcgca cggtgcttta taatcgcaac 120

ggcaataccc tcaatcaggc tcgcgaatat atcgcgcaag acctgaacaa gaaagtcgaa 180

cagggcaaga tcgcgctgca ggataaaggc gcggtgctgg ccaatctaat gttcacttca 240

gtgtttgagg ccatcgccga cagcgagctg gtgatagaaa ccatcgccga gcaagaacaa 300

accaaacttg aggtgctggc ggccatcgcc gcggtggtca agcccgacac gctgatcgcc 360

accaatacct cctcactgtc gcttaacaag ctggctactg cggtgacgca cagcgaacgc 420

tttatcggtt tgcatttttt caaccccgcg ccgctgatga agctgattga aatcattccg 480

gcctacttta ccgcgcacgc caccaccgaa cgctgccgcc aactggtggc ggcgttgggg 540

aaacacgatg tcgtctgcca ggccacgccg gggttcatcg tcaatcgcat ggcccgcccc 600

tactacctgg aagggttccg cctgttggaa gaacacgtgg cgcgcgcggc tcagatcgac 660

cgcgccctca aggccggcgg gcgcttccgc atggggccgc tcgagctgac cgattttatc 720

ggccaagaca tcaactatca ggtcagtcgg caaatctggc aggatatgca atacgacccg 780

cgctataccc ccggtcatct gcagcgttca ctggtcgatg ccggtctgtt ggggaaaaag 840

aacggccgct cctattttgc cgccgaagaa accgccccgc cggtgacggc cgccagcaat 900

gcagacgtcg agacgctgcg cgtttacggc gagcaccctt tttttaccct gttacagcag 960

cgagccgcgc ttcagtggcc acagctgcgc gtggaacaac ggccggcatt accggggctg 1020

gggtcggccg tccagatcaa tgacgctttc accgtcagca tcaccgatgg ccgcacggcg 1080

agccaactgg ccgagcagac ggcagcggat gcctttgtgg tcgatgtcgc cctgaactac 1140

gccgacacga cgtatctggc ggcggcgcac agccgccacg cctctgcggc caataaggcg 1200

ctgtttttac gcctgctgca cacggcaatc ccgcaggttg aatttatcaa ggactctccg 1260

gcgcttatcg tcgcccgcgt cctcagcagc ctgatcaatg agtcggtgat catggtggaa 1320

agcggcgtct gcagccggga agacatcgat gtcgccgccg tcgcgggcgt taactacgcc 1380

ggcggcattt tcgactggct cggcaaactg ggggagaaaa acgtcaggac aacgctgagc 1440

aatctggctc agctgctgca cgcggcgcgc tatgcgccgc attacaccct tctgcacgcc 1500

gcgcaaccgg cgctgacgac cacgccttaa 1530

<210> 15

<211> 774

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida KT2440

<400> 15

atgccgcgat atatcgatgt gcaggcgccc gaacatggcg ttcagctcat taccctgcaa 60

cggcccgagg ccttgaatgc cctgtgcacc gagctactgg cagaactggc cgctgcgctg 120

caggctgccg ggaacgacga gcatgtccgt gccacagtga ttaccggcag cgccaaggca 180

ttcgccgcag gcgccgacat ccgcgagatg gccgatcgcg acctggtcgg catcctcaat 240

gacccgcgcg tagcgcattg gcaaagcatc gccgcattcg ccaaaccgct gattgctgca 300

gtcaacggct atgccctggg tggcggttgc gaactggcaa tgtgcgccga catcgtcatc 360

gccagtaccg acgcccgttt cggccagccg gaaatcaacc ttggcatcat ccccggtgct 420

ggcggcaccc agcgcctgtt acgtgccgtc ggtaagccgt tggccatgca gatggtgctg 480

acgggggaag ccatcactgc cctccgcgcc cagcaggccg gcctggtcag cgaaatcacc 540

cagcccgaac tcaccgtaga acgcgccatg caggttgccc gcagcatcgc cgccaaagcg 600

ccgctggctg tgcgcctggc caaggaggcg ttactgaagg ccggtgatac cgacctggcc 660

agcggcctgc gcttcgagcg ccatgccttc accctgctgg cgggcaccgc cgaccgcgat 720

gaaggcatcc gcgccttcca ggaaaagcgc caggcccgct tccaagggcg ctga 774

<210> 16

<211> 1155

<212> DNA

<213> Acinetobacter baylyi ADP1

<400> 16

atgattcgcg atgaagggat gttgcaacaa ttactttcga caatacgaga ttttgtaaaa 60

aatgaattga ttcctcgaga gcatgaagtt gcagaaaagg attgtattcc tgaagatatt 120

attcagcaaa tgcgagaact aggcctattt ggtttaacca ttcccgaaga atacggtgga 180

cttggaatca caatggaaga agaggtgaat gtcgcgtttg aacttggtca gacatcccca 240

gcatttcgtt cattgattgg cacaaataat ggcattggtt caagtggttt aatcattgat 300

ggaactgagg agcaaaaaca gaaatatttg ccacgttatg ccagtggaga aattattggt 360

tcattttgct taactgaacc agaagcgggt tcagatgctg cctctttaaa aacgacagcg 420

gtaaaagatg gtgatttcta catattaaat ggaaccaagc gttttattac caatgcaccg 480

catgcagcaa catttaccgt aatggcacgc accaatccag caattaaagg ggcaggtgga 540

atttctgctt ttttggtaga agccaataca ccaggtatca cactaggcaa aatagatcag 600

aaaatgggac aaaaaggctc tcatacctgt gatgtgattt ttgaaaattg tcgagtacct 660

gcatctgcat taattggtgg cgttgaaggc gttggtttta aaacagcaat gaaagtgctg 720

gataaaggcc gtctacatat tggtgcatat agtgtaggtg ttgcagagcg tatgttgaat 780

gatgcactac attatgctgt cgagcgtaag cagtttggtc aacccattgc aaattttcaa 840

ttgattcaag ccatgctggc agactctaaa gccgaaattt atgcggctaa atgtatggtt 900

ttggatgcag cacgtcgccg tgatgaaggc caaaatatta gtacagaagc ctcatgtgcc 960

aagatgtttg caacagaaat gtgtggtcga gtcgcagatc gctgtgtgca aattcatggt 1020

ggggcaggtt acatcagtga atattcgatt gagcgttttt atcgtgacgt gcgtttattc 1080

cgtctttatg agggtacgac ccaagttcag caaattatta ttgccaaaaa tatgattaag 1140

gaagtgacgt cctaa 1155

<210> 17

<211> 696

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida KT2440

<400> 17

ttgatcaata aaacgtacga gtccatcgcc agcgcggtgg aagggattac cgacggttcg 60

accatcatgg tcggtggctt cggcacggct ggcatgccgt ccgagctgat cgatggcctc 120

attgccaccg gtgcccgcga cctgaccatc atcagcaaca acgccggcaa cggcgagatc 180

ggcctggccg ccctgctcat ggcaggcagc gtgcgcaagg tggtctgctc gttcccgcgc 240

cagtccgact cctacgtgtt cgacgaactg taccgcgccg gcaagatcga gctggaagtg 300

gtcccgcagg gcaacctggc cgagcgtatc cgcgccgcag gctccggcat tggtgcgttc 360

ttctcgccaa ccggctacgg caccctgctg gccgagggca aggaaacccg tgagatcgat 420

ggccgcatgt acgtgctgga aatgccgctg cacgccgact tcgcactgat caaggcgcac 480

aagggtgacc gttggggcaa cctgacctac cgcaaggccg cccgcaactt cggcccgatc 540

atggccatgg ctgccaagac cgccatcgcc caggtcgacc aggtcgtcga actcggtgaa 600

ctggacccgg aacacatcat caccccgggt atcttcgtcc agcgcgtggt cgccgtcacc 660

ggtgctgccg cttcttcgat tgccaaagct gtctga 696

<210> 18

<211> 642

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida KT2440

<400> 18

atgaccatca ccaaaaagct ctcccgcacc gagatggccc aacgcgtggc cgcagacatc 60

caggaaggcg cgtacgtaaa cctgggcatc ggcgcaccga ccctggtggc caactacctg 120

ggcgacaagg aagtgttcct gcacagcgag aacggcctgc tgggcatggg cccaagccct 180

gcgccgggcg aggaagacga tgacctgatc aacgccggca agcagcacgt caccctgctg 240

accggtggtg ccttcttcca ccatgccgat tcgttctcga tgatgcgtgg cggccacctg 300

gacatcgctg tactgggcgc cttccaggtg tcggtcaagg gcgacctggc caactggcac 360

acgggtgccg aaggctcgat cccggccgta ggcggtgcaa tggacctggc caccggcgcc 420

cgccaggtgt tcgtgatgat ggaccacctg accaagaccg gcgaaagcaa gctggtgccc 480

gagtgcacct acccgctgac cggtatcgct tgcgtcagcc gcatctacac cgacctggcc 540

gtactggaag tgacacctga agggctgaaa gtggtcgaaa tctgcgcgga catcgacttt 600

gacgagctgc agaaactcag tggcgtgccg ctgatcaagt ga 642

<210> 19

<211> 4998

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA片段

<400> 19

ttggttgaac gctttttggc ttaatggcct tttgaacacc acaacactga ggaaaatgaa 60

atgaaaacaa aaagtagcct ggttttattg ctgccactgg cgttaagttt cgcggccttt 120

ggtggagagt tcagcggcaa agtcattaag ctgggcgtcg accccaccta tccgccgttg 180

gaatacaaga ctccacaggg tgcgctgacc ggattcggtg tcgatattgc gcaggcaatg 240

tgcgatcaaa tgcaggccaa atgcatttgg gtcgaaagca gttgggatgg gatgatcccg 300

gggttgcagg caaaaaagtt tgacgccatt gcctcgtcca tgaccattac gccgcagcgt 360

caggcgcaaa tagccttctc ggataaagtg tccaatgccc cggcacggtt ggtagcccgt 420

aaaggcagcg atctgcaacc taccgcggct tcgctgaaag gcaaatccgt tggcgtacaa 480

cagggatcca gccaggaagc ttacgccaac gcgctatggc gaccagctgg ggtcaatgtg 540

gtgtcctacc aaagccagca ggaagccaat gaagatttgg tcaatggacg gttggatgcg 600

tcactgttgg ccagtgtcag cgccagtgag tttttccata cgcctgccgg gaaggatttt 660

gcctttaccg gtgctgagct caatgacagc aaatatttcg gtatcggcga cggtattggg 720

ttgcgtaaag aggatacggc attgctcaat gcatttaatg ccgcgctgaa agcgatcatc 780

gccaacggca cttataagaa agtgaacgat aaatactttg attttgacgt gtatggttca 840

gggcaataag atccttttta acccatcaca tatacctgcc gttcactatt atttagtgaa 900

atgagatatt atgatatttt ctgaattgtg attaaaaagg caactttatg cccatgcaac 960

agaaactata aaaaatacag agaatgaaaa gaaacagata gattttttag ttctttaggc 1020

ccgtagtctg caaatccttt tatgattttc tatcaaacaa aagaggaaaa tagaccagtt 1080

gcaatccaaa cgagagtcta atagaatgag gtcgaaaagt aaatcgcgcg ggtttgttac 1140

tgataaagca ggcaagacct aaaatgtgta aagggcaaag tgtatacttt ggcgtcaccc 1200

cttacatatt ttaggtcttt ttttattgtg cgtaactaac ttgccatctt caaacaggag 1260

ggctggaaga agcagaccgc taacacagta cataaaaaag gagacatgaa cgatgaacat 1320

caaaaagttt gcaaaacaag caacagtatt aacctttact accgcactgc tggcaggagg 1380

cgcaactcaa gcgtttgcga aagaaacgaa ccaaaagcca tataaggaaa catacggcat 1440

ttcccatatt acacgccatg atatgctgca aatccctgaa cagcaaaaaa atgaaaaata 1500

tcaagttcct gaattcgatt cgtccacaat taaaaatatc tcttctgcaa aaggcctgga 1560

cgtttgggac agctggccat tacaaaacgc tgacggcact gtcgcaaact atcacggcta 1620

ccacatcgtc tttgcattag ccggagatcc taaaaatgcg gatgacacat cgatttacat 1680

gttctatcaa aaagtcggcg aaacttctat tgacagctgg aaaaacgctg gccgcgtctt 1740

taaagacagc gacaaattcg atgcaaatga ttctatccta aaagaccaaa cacaagaatg 1800

gtcaggttca gccacattta catctgacgg aaaaatccgt ttattctaca ctgatttctc 1860

cggtaaacat tacggcaaac aaacactgac aactgcacaa gttaacgtat cagcatcaga 1920

cagctctttg aacatcaacg gtgtagagga ttataaatca atctttgacg gtgacggaaa 1980

aacgtatcaa aatgtacagc agttcatcga tgaaggcaac tacagctcag gcgacaacca 2040

tacgctgaga gatcctcact acgtagaaga taaaggccac aaatacttag tatttgaagc 2100

aaacactgga actgaagatg gctaccaagg cgaagaatct ttatttaaca aagcatacta 2160

tggcaaaagc acatcattct tccgtcaaga aagtcaaaaa cttctgcaaa gcgataaaaa 2220

acgcacggct gagttagcaa acggcgctct cggtatgatt gagctaaacg atgattacac 2280

actgaaaaaa gtgatgaaac cgctgattgc atctaacaca gtaacagatg aaattgaacg 2340

cgcgaacgtc tttaaaatga acggcaaatg gtacctgttc actgactccc gcggatcaaa 2400

aatgacgatt gacggcatta cgtctaacga tatttacatg cttggttatg tttctaattc 2460

tttaactggc ccatacaagc cgctgaacaa aactggcctt gtgttaaaaa tggatcttga 2520

tcctaacgat gtaaccttta cttactcaca cttcgctgta cctcaagcga aaggaaacaa 2580

tgtcgtgatt acaagctata tgacaaacag aggattctac gcagacaaac aatcaacgtt 2640

tgcgccaagc ttcctgctga acatcaaagg caagaaaaca tctgttgtca aagacagcat 2700

ccttgaacaa ggacaattaa cagttaacaa ataaaaacgc aaaagaaaat gccgatatcc 2760

tattggcatt ttcttttatt tcttatcaac ataaaggtga atcccatatg aactatataa 2820

aagcaggcaa atggctaacc gtattcctaa cctttttagg aatattgctg tttatcgact 2880

tgtcgactct agaggatcct gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag 2940

agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccctca cgctgccgca agcactcagg 3000

gcgcaagggc tgctaaagga agcggaacac gtagaaagcc agtccgcaga aacggtgctg 3060

accccggatg aatgtcagct actgggctat ctggacaagg gaaaacgcaa gcgcaaagag 3120

aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg gcgatagcta gactgggcgg ttttatggac 3180

agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga agccctgcaa 3240

agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat caagatctga 3300

tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 3360

tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 3420

ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 3480

cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 3540

cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 3600

gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 3660

gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 3720

cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 3780

tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 3840

cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 3900

ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 3960

gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 4020

gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 4080

gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 4140

gaaatgaccg agatacaggt ttgtggcggt caggcacaac actcatcgcc ctatcttact 4200

cactttgctg tccggacaaa aacccgaagc gcctgcttca tgatctgacc ccctattcgc 4260

gcccggtagc agtacagacc ttgagcaggt cgcccagttc ttccagttgt tgtgtcagct 4320

ccatgctcag ccagacataa ccgtaaattg gcgcttcgcc gtgctgactg acactggctt 4380

cctgcatcag cgttttcagt tcagcggcga tttcgcttag ctcgcctgcc acgacagatt 4440

gttgcgcttg tgggccatta cgcatcgtgt ccgccaatga ttcaagcgac cgcagcgtca 4500

gcaattgcgc actgcgcagg gttttcgcat tcagcataat gaaatgggtt tcacgcgagg 4560

cccaataagc gtccgccaac agctccagag tacagaccag attgcggctc aacgtttgta 4620

ccgcttcaaa tacagccgga ggaatatggg tttctttact gctgggaaca atcaggccgc 4680

gcaatttgac cacctgattc aagagatctt tcaactgcgg ttccaaccgc ggccgctcta 4740

tcatgttcgg tgacaaataa gcaccgtaga ttttactcgc gctttgcaag caatccgcca 4800

tctgcatacg ccacagaatg taggcgcgct gagggtaaat gctggtgaac aacaacgcca 4860

gcaacgaacc aaaaattacg tcaccactgc gccacaacgc ggtatgcatg tcacctgccc 4920

ccgcgccaca aaccaccgcc agtgtaatcc ccaccaacag tgccatatag ggccgcttac 4980

cgagtgtcag atagccgc 4998

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

ttggttgaac gctttttggc 20

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

gcggctatct gacactcg 18

<210> 22

<211> 200

<212> DNA

<213> Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655

<400> 22

cgtaattgcc ctttaaaatt cggggcgccg accccatgtg gtctcaagcc caaaggaaga 60

gtgaggcgag tcagtcgcgt aatgcttagg cacaggattg atttgtcgca atgattgaca 120

cgattccgct tgacgctgcg taaggttttt gtaattttac aggcaacctt ttattcacta 180

acaaatagct ggtggaatat 200

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

taccgtcgac ctcgacgtaa ttgcccttta 30

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

ggccccccct cgagtcatta agtactatat tccaccagct a 41

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

ctggtggaat atatgcacga cgtattcatc tg 32

<210> 26

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

ctcgagtcat taagtgttaa ctcaaacccg ctcgatggcc a 41

<210> 27

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

gagcgggttt gagttcaatt gtagctggtg gaatatttga tcaataaaac gtacg 55

<210> 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

gagtcattaa gtgtttcact tgatcagcgg cacg 34

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

ctggtggaat atagtactat ggcagaaagt aatgc 35

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

ttccaccagc taagtgctag cttaaggcgt ggtcgtcag 39

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

cggccagtga attcgagctc cgtaattgcc ctttaaaatt 40

<210> 32

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

gatccccggg taccgcatgc tatattccac cagctatttg t 41

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

gctggtggaa tatagatgcc gcgatatatc gatg 34

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

attacgccaa gcttgtcagc gcccttggaa gcgg 34

<210> 35

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

gggcgctgac aagcttagct ggtggaatat atgattcgcg atgaagggat 50

<210> 36

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

tgattacgcc aagcttttag gacgtcactt ccttaa 36

<210> 37

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA片段

<400> 37

atgaagatgg ataatgcaaa taagccgagt ttccaggacg ttctggagtt tgtgcgtatg 60

ttccgccgta aaaataagct gcaacgcgaa attatcgaca acgaaaagaa agttcgtgat 120

aaccaaaagc gtgtgctgct actcgacaac ctgagtgagt acatcaagcc aggcatgagc 180

attgaagacg ttcagggcat cattggcaac atgcgcagcg actatgaaga tcgcgttgat 240

gactacatca tcaaaaatgt cgatctgtct aaagaacgtc gcgaactgtc caaaaagctg 300

aaagctatgg gcgaagtgaa gtaa 324

<210> 38

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

aaatagctgg tggaatatag catgcatgaa gatggataat gcaaataagc 50

<210> 39

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

cgactctaga ggatccccgg gtaccttact tcacttcgcc catagc 46

<210> 40

<211> 477

<212> PRT

<213> Serratia grimesii NBRC13537

<400> 40

Met Phe Lys Asn Ala Phe Ala Asn Leu Gln Lys Val Gly Lys Ser Leu

1 5 10 15

Met Leu Pro Val Ser Val Leu Pro Ile Ala Gly Ile Leu Leu Gly Val

20 25 30

Gly Ser Ala Asn Phe Ser Trp Leu Pro Ala Val Val Ser His Val Met

35 40 45

Ala Glu Ala Gly Gly Ser Val Phe Ala Asn Met Pro Leu Ile Phe Ala

50 55 60

Ile Gly Val Ala Leu Gly Phe Thr Asn Asn Asp Gly Val Ser Ala Leu

65 70 75 80

Ala Ala Val Val Ala Tyr Gly Ile Met Val Lys Thr Met Ala Val Val

85 90 95

Ala Pro Leu Val Leu His Leu Pro Ala Glu Glu Ile Ala Ala Lys His

100 105 110

Leu Ala Asp Thr Gly Val Leu Gly Gly Ile Ile Ser Gly Ser Ile Ala

115 120 125

Ala Tyr Met Phe Asn Arg Phe Phe Arg Ile Gln Leu Pro Glu Tyr Leu

130 135 140

Gly Phe Phe Ala Gly Lys Arg Phe Val Pro Ile Ile Ser Gly Leu Ala

145 150 155 160

Ala Ile Val Leu Gly Val Val Leu Ser Phe Ile Trp Pro Pro Ile Gly

165 170 175

Thr Ala Ile Gln Thr Phe Ser Gln Trp Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Val

180 185 190

Val Ala Phe Gly Ile Tyr Gly Val Val Glu Arg Ala Leu Val Pro Phe

195 200 205

Gly Leu His His Ile Trp Asn Val Pro Phe Gln Met Gln Ile Gly Glu

210 215 220

Tyr Thr Asn Ala Ala Gly Gln Val Phe His Gly Asp Ile Pro Arg Tyr

225 230 235 240

Met Ala Gly Asp Pro Thr Ala Gly Lys Leu Ser Gly Gly Phe Leu Phe

245 250 255

Lys Met Tyr Gly Leu Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ile Trp His Ser Ala

260 265 270

Lys Pro Glu Asn Arg Ala Lys Val Gly Gly Ile Met Ile Ser Ala Ala

275 280 285

Leu Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Thr Glu Pro Ile Glu Phe Ser Phe

290 295 300

Met Phe Val Ala Pro Ile Leu Tyr Ala Ile His Ala Ile Leu Ala Gly

305 310 315 320

Leu Ala Phe Pro Ile Cys Ile Leu Leu Gly Met Arg Asp Gly Thr Ser

325 330 335

Phe Ser His Gly Leu Ile Asp Phe Ile Val Leu Ser Gly Asn Ser Ser

340 345 350

Lys Ile Trp Leu Phe Pro Ile Val Gly Ile Ile Tyr Gly Leu Val Tyr

355 360 365

Tyr Thr Ile Phe Arg Val Leu Ile Ala Lys Leu Asp Leu Lys Thr Pro

370 375 380

Gly Arg Glu Asp Thr Val Ser Glu Gln Val Ala Gln Gly Gly Ser Glu

385 390 395 400

Met Ser Ala Ala Leu Val Gln Ala Phe Gly Gly Lys Glu Asn Ile Thr

405 410 415

Asn Leu Asp Ala Cys Ile Thr Arg Leu Arg Val Ser Val Ala Asp Val

420 425 430

Ser Lys Val Asp Gln Ala Gly Leu Lys Lys Leu Gly Ala Ala Gly Val

435 440 445

Val Val Ala Gly Ser Gly Val Gln Ala Ile Phe Gly Thr Lys Ser Asp

450 455 460

Asn Leu Lys Thr Asp Met Asp Glu Tyr Ile Arg Asn His

465 470 475

<210> 41

<211> 470

<212> PRT

<213> Serratia grimesii NBRC13537

<400> 41

Met Lys Lys Thr Lys Ile Val Cys Thr Ile Gly Pro Lys Thr Glu Ser

1 5 10 15

Glu Glu Met Leu Thr Asn Leu Leu Asn Ala Gly Met Asn Val Met Arg

20 25 30

Leu Asn Phe Ser His Gly Asp Tyr Glu Glu His Gly Asn Arg Ile Lys

35 40 45

Asn Met Arg Ala Val Met Ala Lys Thr Gly Gln Asn Ala Gly Ile Leu

50 55 60

Leu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Ile Arg Thr Met Lys Leu Glu Gly Gly

65 70 75 80

Lys Asp Ala Ala Leu Val Ala Gly Gln Thr Phe Thr Phe Thr Thr Asp

85 90 95

Gln Ser Val Ile Gly Asn Asn Glu Arg Val Ala Val Thr Tyr Ala Gly

100 105 110

Phe Ser Ala Asp Leu Lys Ile Gly Asn Thr Val Leu Val Asp Asp Gly

115 120 125

Leu Ile Gly Met Glu Val Thr Asn Val Thr Glu Asn Glu Val Val Cys

130 135 140

Lys Val Leu Asn Ser Gly Asp Leu Gly Glu Asn Lys Gly Val Asn Leu

145 150 155 160

Pro Gly Val Ser Ile Gln Leu Pro Ala Leu Ala Glu Lys Asp Lys Arg

165 170 175

Asp Leu Ile Phe Gly Cys Glu Gln Gly Val Asp Phe Val Ala Ala Ser

180 185 190

Phe Ile Arg Lys Arg Ser Asp Val Leu Glu Ile Arg Glu His Leu Lys

195 200 205

Ala His Gly Gly Glu Gln Ile Gln Ile Ile Ser Lys Ile Glu Asn Gln

210 215 220

Glu Gly Leu Asn Asn Phe Asp Glu Ile Leu Glu Ala Ser Asp Gly Ile

225 230 235 240

Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Ile Pro Val Glu Glu Val

245 250 255

Ile Phe Ala Gln Lys Met Met Ile Glu Lys Cys Asn Arg Ala Arg Lys

260 265 270

Val Val Ile Thr Ala Thr Gln Met Leu Asp Ser Met Ile Lys Asn Pro

275 280 285

Arg Pro Thr Arg Ala Glu Ala Gly Asp Val Ala Asn Ala Ile Leu Asp

290 295 300

Gly Thr Asp Ala Val Met Leu Ser Gly Glu Ser Ala Lys Gly Lys Tyr

305 310 315 320

Pro Leu Glu Ala Val Thr Ile Met Ala Thr Ile Cys Glu Arg Thr Asp

325 330 335

Arg Val Met Pro Ser Arg Ile Asp Ser Leu Asn Asp Asn Arg Lys Leu

340 345 350

Arg Ile Thr Glu Ala Val Cys Arg Gly Ala Val Glu Thr Ala Glu Lys

355 360 365

Leu Asp Ala Pro Leu Ile Val Val Ala Thr Ser Gly Gly Lys Ser Ala

370 375 380

Lys Ser Val Arg Lys Tyr Phe Pro Asn Ala Val Ile Leu Ala Leu Thr

385 390 395 400

Thr Asn Glu Val Thr Ala His Gln Leu Ile Leu Ser Lys Gly Val Ile

405 410 415

Pro Gln Met Val Lys Glu Ile Ala Ser Thr Asp Asp Phe Tyr Arg Ile

420 425 430

Gly Lys Glu Ala Ala Leu Ala Ser Gly Leu Ala Gln Lys Gly Asp Val

435 440 445

Val Val Met Val Ser Gly Ala Leu Val Pro Ser Gly Thr Thr Asn Thr

450 455 460

Ala Ser Val His Val Leu

465 470

<210> 42

<211> 480

<212> PRT

<213> Serratia grimesii NBRC13537

<400> 42

Met Ser Arg Arg Leu Arg Arg Thr Lys Ile Val Thr Thr Leu Gly Pro

1 5 10 15

Ala Thr Asp Arg Asp Asn Asn Leu Glu Lys Ile Ile Ala Ala Gly Ala

20 25 30

Asn Val Val Arg Leu Asn Phe Ser His Gly Ser Ala Glu Asp His Gln

35 40 45

Ala Arg Ala Asp Lys Val Arg Glu Ile Ala Ala Lys Leu Gly Arg His

50 55 60

Val Ala Ile Leu Gly Asp Leu Gln Gly Pro Lys Ile Arg Val Ser Thr

65 70 75 80

Phe Lys Glu Gly Lys Ile Phe Leu Asn Ile Gly Asp Lys Phe Leu Leu

85 90 95

Asp Ala Asn Met Ser Lys Gly Glu Gly Asp Lys Glu Lys Val Gly Ile

100 105 110

Asp Tyr Lys Gly Leu Pro Ala Asp Val Val Pro Gly Asp Val Leu Leu

115 120 125

Leu Asp Asp Gly Arg Val Gln Leu Lys Val Leu Glu Val Gln Gly Met

130 135 140

Lys Val Phe Thr Glu Val Thr Val Gly Gly Pro Leu Ser Asn Asn Lys

145 150 155 160

Gly Ile Asn Lys Leu Gly Gly Gly Leu Ser Ala Glu Ala Leu Thr Glu

165 170 175

Lys Asp Lys Ala Asp Ile Val Thr Ala Ala Lys Ile Gly Val Asp Tyr

180 185 190

Leu Ala Val Ser Phe Pro Arg Thr Gly Glu Asp Leu Asn Tyr Ala Arg

195 200 205

Arg Leu Ala Arg Asp Ala Gly Cys Asn Ala Lys Ile Val Ser Lys Val

210 215 220

Glu Arg Ala Glu Ala Val Cys Ser Asp Glu Ala Met Asp Asp Ile Ile

225 230 235 240

Leu Ala Ser Asp Val Val Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu

245 250 255

Ile Gly Asp Pro Glu Leu Val Gly Ile Gln Lys Lys Leu Ile Arg Arg

260 265 270

Ala Arg Thr Leu Asn Arg Ala Val Ile Thr Ala Thr Gln Met Met Glu

275 280 285

Ser Met Ile Thr Asn Pro Met Pro Thr Arg Ala Glu Val Met Asp Val

290 295 300

Ala Asn Ala Val Leu Asp Gly Thr Asp Ala Val Met Leu Ser Ala Glu

305 310 315 320

Thr Ala Ala Gly Gln Tyr Pro Ala Glu Thr Val Ala Ala Met Ala Arg

325 330 335

Val Cys Leu Gly Ala Glu Lys Ile Pro Ser Ile Asn Val Ser Lys His

340 345 350

Arg Leu Asp Val Gln Phe Asp Asn Ile Glu Glu Ala Ile Ala Met Ser

355 360 365

Ser Met Tyr Ala Ala Asn His Leu Lys Gly Val Thr Ala Leu Ile Ala

370 375 380

Met Thr Glu Ser Gly Arg Thr Ala Leu Met Met Ser Arg Ile Ser Ser

385 390 395 400

Gly Leu Pro Ile Phe Ala Met Ser Arg His Glu His Thr Leu Asn Leu

405 410 415

Thr Ala Leu Tyr Arg Gly Val Thr Pro Val Tyr Phe Asp Ser His Glu

420 425 430

Asp Gly Val Ile Ala Ala Asn Asp Ala Val Asn Arg Leu Arg Asp Lys

435 440 445

Gly Phe Leu Val Ser Gly Asp Leu Val Ile Val Thr Gln Gly Asp Val

450 455 460

Met Glu Thr Val Gly Thr Thr Asn Thr Ser Arg Ile Leu Arg Val Glu

465 470 475 480

<210> 43

<211> 2137

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA片段

<400> 43

ttggttgaac gctttttggc ttaatggcct tttgaacacc acaacactga ggaaaatgaa 60

atgaaaacaa aaagtagcct ggttttattg ctgccactgg cgttaagttt cgcggccttt 120

ggtggagagt tcagcggcaa agtcattaag ctgggcgtcg accccaccta tccgccgttg 180

gaatacaaga ctccacaggg tgcgctgacc ggattcggtg tcgatattgc gcaggcaatg 240

tgcgatcaaa tgcaggccaa atgcatttgg gtcgaaagca gttgggatgg gatgatcccg 300

gggttgcagg caaaaaagtt tgacgccatt gcctcgtcca tgaccattac gccgcagcgt 360

caggcgcaaa tagccttctc ggataaagtg tccaatgccc cggcacggtt ggtagcccgt 420

aaaggcagcg atctgcaacc taccgcggct tcgctgaaag gcaaatccgt tggcgtacaa 480

cagggatcca gccaggaagc ttacgccaac gcgctatggc gaccagctgg ggtcaatgtg 540

gtgtcctacc aaagccagca ggaagccaat gaagatttgg tcaatggacg gttggatgcg 600

tcactgttgg ccagtgtcag cgccagtgag tttttccata cgcctgccgg gaaggatttt 660

gcctttaccg gtgctgagct caatgacagc aaatatttcg gtatcggcga cggtattggg 720

ttgcgtaaag aggatacggc attgctcaat gcatttaatg ccgcgctgaa agcgatcatc 780

gccaacggca cttataagaa agtgaacgat aaatactttg attttgacgt gtatggttca 840

gggcaataac ggcggattgg cgggaaacaa aaaataaaag ggccaggcaa atgcccggcc 900

cgataaaaac ggttacttca cttcgcccat agctttcagc tttttggaca gttcgcgacg 960

ttctttagac agatcgacat ttttgatgat gtagtcatca acgcgatctt catagtcgct 1020

gcgcatgttg ccaatgatgc cctgaacgtc ttcaatgctc atgcctggct tgatgtactc 1080

actcaggttg tcgagtagca gcacacgctt ttggttatca cgaactttct tttcgttgtc 1140

gataatttcg cgttgcagct tatttttacg gcggaacata cgcacaaact ccagaacgtc 1200

ctggaaactc ggcttatttg cattatccat cttcataccc ttgctttagt aatacacaga 1260

ttcatttgct tacggccaca atgataccaa gatacaggtt tgtggcggtc aggcacaaca 1320

ctcatcgccc tatcttactc actttgctgt ccggacaaaa acccgaagcg cctgcttcat 1380

gatctgaccc cctattcgcg cccggtagca gtacagacct tgagcaggtc gcccagttct 1440

tccagttgtt gtgtcagctc catgctcagc cagacataac cgtaaattgg cgcttcgccg 1500

tgctgactga cactggcttc ctgcatcagc gttttcagtt cagcggcgat ttcgcttagc 1560

tcgcctgcca cgacagattg ttgcgcttgt gggccattac gcatcgtgtc cgccaatgat 1620

tcaagcgacc gcagcgtcag caattgcgca ctgcgcaggg ttttcgcatt cagcataatg 1680

aaatgggttt cacgcgaggc ccaataagcg tccgccaaca gctccagagt acagaccaga 1740

ttgcggctca acgtttgtac cgcttcaaat acagccggag gaatatgggt ttctttactg 1800

ctgggaacaa tcaggccgcg caatttgacc acctgattca agagatcttt caactgcggt 1860

tccaaccgcg gccgctctat catgttcggt gacaaataag caccgtagat tttactcgcg 1920

ctttgcaagc aatccgccat ctgcatacgc cacagaatgt aggcgcgctg agggtaaatg 1980

ctggtgaaca acaacgccag caacgaacca aaaattacgt caccactgcg ccacaacgcg 2040

gtatgcatgt cacctgcccc cgcgccacaa accaccgcca gtgtaatccc caccaacagt 2100

gccatatagg gccgcttacc gagtgtcaga tagccgc 2137

<210> 44

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 44

Met Glu Thr Thr Lys Pro Ser Phe Gln Asp Val Leu Glu Phe Val Arg

1 5 10 15

Leu Phe Arg Arg Lys Asn Lys Leu Gln Arg Glu Ile Gln Asp Val Glu

20 25 30

Lys Lys Ile Arg Asp Asn Gln Lys Arg Val Leu Leu Leu Asp Asn Leu

35 40 45

Ser Asp Tyr Ile Lys Pro Gly Met Ser Val Glu Ala Ile Gln Gly Ile

50 55 60

Ile Ala Ser Met Lys Gly Asp Tyr Glu Asp Arg Val Asp Asp Tyr Ile

65 70 75 80

Ile Lys Asn Val Glu Leu Ser Lys Glu Arg Arg Asp Ile Ser Lys Lys

85 90 95

Leu Lys Ala Met Gly Glu Met Lys Asn Gly Glu Ala Lys

100 105

<210> 45

<211> 4301

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA片段

<400> 45

tgctggagtt gcaaatcaat gcatactggg ccacgcgccc cagccatttc gtgttattga 60

acgcgcaaaa acttcgtgat acccagcaca tgatgcagca aatactgctg agccttgttc 120

atgcgctgta cgaaggtaat ccgcagccgg tttttgccaa tacggaaaaa ttgaacgatg 180

ctgtggaaga gctgcgtcag ttgctcaata accaccatga cctgaaggtt gtggaaacac 240

caatctatgg ttatgtgtgg ctgaacatgg aaacggcgca tcagcttgag ttgctatcga 300

atctgatttg ccgggccttg cgcaaataat tcctgaactt cagaatcatc ttgctgctgc 360

ttcgattcag caaggataaa gggtatgata gtgaaaaggg ataaaagcat tgtcatctgc 420

ggcagctatg agtaatgttg gccctaacga atagcggttg cttaaacgaa tccgactctc 480

acattatcag gggtataaaa gatccttttt aacccatcac atatacctgc cgttcactat 540

tatttagtga aatgagatat tatgatattt tctgaattgt gattaaaaag gcaactttat 600

gcccatgcaa cagaaactat aaaaaataca gagaatgaaa agaaacagat agatttttta 660

gttctttagg cccgtagtct gcaaatcctt ttatgatttt ctatcaaaca aaagaggaaa 720

atagaccagt tgcaatccaa acgagagtct aatagaatga ggtcgaaaag taaatcgcgc 780

gggtttgtta ctgataaagc aggcaagacc taaaatgtgt aaagggcaaa gtgtatactt 840

tggcgtcacc ccttacatat tttaggtctt tttttattgt gcgtaactaa cttgccatct 900

tcaaacagga gggctggaag aagcagaccg ctaacacagt acataaaaaa ggagacatga 960

acgatgaaca tcaaaaagtt tgcaaaacaa gcaacagtat taacctttac taccgcactg 1020

ctggcaggag gcgcaactca agcgtttgcg aaagaaacga accaaaagcc atataaggaa 1080

acatacggca tttcccatat tacacgccat gatatgctgc aaatccctga acagcaaaaa 1140

aatgaaaaat atcaagttcc tgaattcgat tcgtccacaa ttaaaaatat ctcttctgca 1200

aaaggcctgg acgtttggga cagctggcca ttacaaaacg ctgacggcac tgtcgcaaac 1260

tatcacggct accacatcgt ctttgcatta gccggagatc ctaaaaatgc ggatgacaca 1320

tcgatttaca tgttctatca aaaagtcggc gaaacttcta ttgacagctg gaaaaacgct 1380

ggccgcgtct ttaaagacag cgacaaattc gatgcaaatg attctatcct aaaagaccaa 1440

acacaagaat ggtcaggttc agccacattt acatctgacg gaaaaatccg tttattctac 1500

actgatttct ccggtaaaca ttacggcaaa caaacactga caactgcaca agttaacgta 1560

tcagcatcag acagctcttt gaacatcaac ggtgtagagg attataaatc aatctttgac 1620

ggtgacggaa aaacgtatca aaatgtacag cagttcatcg atgaaggcaa ctacagctca 1680

ggcgacaacc atacgctgag agatcctcac tacgtagaag ataaaggcca caaatactta 1740

gtatttgaag caaacactgg aactgaagat ggctaccaag gcgaagaatc tttatttaac 1800

aaagcatact atggcaaaag cacatcattc ttccgtcaag aaagtcaaaa acttctgcaa 1860

agcgataaaa aacgcacggc tgagttagca aacggcgctc tcggtatgat tgagctaaac 1920

gatgattaca cactgaaaaa agtgatgaaa ccgctgattg catctaacac agtaacagat 1980

gaaattgaac gcgcgaacgt ctttaaaatg aacggcaaat ggtacctgtt cactgactcc 2040

cgcggatcaa aaatgacgat tgacggcatt acgtctaacg atatttacat gcttggttat 2100

gtttctaatt ctttaactgg cccatacaag ccgctgaaca aaactggcct tgtgttaaaa 2160

atggatcttg atcctaacga tgtaaccttt acttactcac acttcgctgt acctcaagcg 2220

aaaggaaaca atgtcgtgat tacaagctat atgacaaaca gaggattcta cgcagacaaa 2280

caatcaacgt ttgcgccaag cttcctgctg aacatcaaag gcaagaaaac atctgttgtc 2340

aaagacagca tccttgaaca aggacaatta acagttaaca aataaaaacg caaaagaaaa 2400

tgccgatatc ctattggcat tttcttttat ttcttatcaa cataaaggtg aatcccatat 2460

gaactatata aaagcaggca aatggctaac cgtattccta acctttttag gaatattgct 2520

gtttatcgac ttgtcgactc tagaggatcc tgtgtaggct ggagctgctt cgaagttcct 2580

atactttcta gagaatagga acttcggaat aggaacttca agatcccctc acgctgccgc 2640

aagcactcag ggcgcaaggg ctgctaaagg aagcggaaca cgtagaaagc cagtccgcag 2700

aaacggtgct gaccccggat gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca 2760

agcgcaaaga gaaagcaggt agcttgcagt gggcttacat ggcgatagct agactgggcg 2820

gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg 2880

aagccctgca aagtaaactg gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga 2940

tcaagatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg 3000

cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag 3060

acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt 3120

tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta 3180

tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg 3240

ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt 3300

gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat 3360

ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg 3420

atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca 3480

gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc 3540

catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc 3600

gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat 3660

attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc 3720

gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga 3780

ctctggggtt cgaaatgacc gttcccgttt tattcaatga gggttgcccg gcaaccctca 3840

ttgctcattg attcttatct gtgtatcacc gtcatcattc tcatccgaga accaatcgaa 3900

attaacaaca gccttcttct gtatgcagca aggcaaaaag ttctgtaact ccattgttat 3960

taactgcact ggttactaac acgttgtgcg ctccagcttc ccgtaaccaa cttttcacca 4020

aagatatttg ttccatgctg gctaaatctg ctttggttac tactccaatg accgggtgat 4080

tcatggcccg gtagggcgtt tttacctcta attcctgctt cagcgctgag attcctgctt 4140

gttgccagaa aagcaggcac ctgccgtctg aacggtatcg atccggaagc gtatctgcgc 4200

catattctga gcatactgcc ggaatggccc tccaaccgtg ttgacgaact cctgccatgg 4260

aacgtagttc tcaccaataa ataagcgtca atacggtgct c 4301

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

tgctggagtt gcaaatcaat gc 22

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

gagcaccgta ttgacgctta tt 22

<210> 48

<211> 1330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA片段

<400> 48

tgctggagtt gcaaatcaat gcatactggg ccacgcgccc cagccatttc gtgttattga 60

acgcgcaaaa acttcgtgat acccagcaca tgatgcagca aatactgctg agccttgttc 120

atgcgctgta cgaaggtaat ccgcagccgg tttttgccaa tacggaaaaa ttgaacgatg 180

ctgtggaaga gctgcgtcag ttgctcaata accaccatga cctgaaggtt gtggaaacac 240

caatctatgg ttatgtgtgg ctgaacatgg aaacggcgca tcagcttgag ttgctatcga 300

atctgatttg ccgggccttg cgcaaataat tcctgaactt cagaatcatc ttgctgctgc 360

ttcgattcag caaggataaa gggtatgata gtgaaaaggg ataaaagcat tgtcatctgc 420

ggcagctatg agtaatgttg gccctaacga atagcggttg cttaaacgaa tccgactctc 480

acattatcag gggtataaaa atggaaacta ccaagccttc attccaggac gtactggaat 540

ttgttcgtct gttccgtcgt aagaacaaac tgcaacgtga aattcaggac gttgagaaaa 600

agatccgtga caaccagaag cgcgtcctgc tgctggacaa cctgagcgat tacatcaagc 660

cggggatgag cgttgaagca atccagggca tcatcgccag catgaaaggt gactatgaag 720

atcgcgttga cgattacatc atcaaaaatg ccgagctctc caaagaacgc cgcgatatct 780

ccaaaaagct gaaagctatg ggcgaaatga aaaacggcga agcgaagtaa ttcccgtttt 840

attcaatgag ggttgcccgg caaccctcat tgctcattga ttcttatctg tgtatcaccg 900

tcatcattct catccgagaa ccaatcgaaa ttaacaacag ccttcttctg tatgcagcaa 960

ggcaaaaagt tctgtaactc cattgttatt aactgcactg gttactaaca cgttgtgcgc 1020

tccagcttcc cgtaaccaac ttttcaccaa agatatttgt tccatgctgg ctaaatctgc 1080

tttggttact actccaatga ccgggtgatt catggcccgg tagggcgttt ttacctctaa 1140

ttcctgcttc agcgctgaga ttcctgcttg ttgccagaaa agcaggcacc tgccgtctga 1200

acggtatcga tccggaagcg tatctgcgcc atattctgag catactgccg gaatggccct 1260

ccaaccgtgt tgacgaactc ctgccatgga acgtagttct caccaataaa taagcgtcaa 1320

tacggtgctc 1330

<210> 49

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

accaccatca cgtgggtacc tgctggagtt gcaaatcaat gc 42

<210> 50

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

cgtcgtcatc attcgaaccg gagcaccgta ttgacgctta tt 42

Claims (10)

1.一种基因修饰微生物，包含能够表达在野生型YeeX蛋白质或其同源物的氨基酸序列中1～数个氨基酸发生置换、插入和/或缺失后的变异型YeeX蛋白质或其同源物的基因。

2.根据权利要求1所述的基因修饰微生物，其中所述变异型YeeX蛋白质或其同源物是在序列号1的氨基酸序列中相当于氨基酸残基74～100的区域中的1～数个氨基酸发生置换、插入和/或缺失后的变异型YeeX蛋白质或其同源物。

3.根据权利要求1或2所述的基因修饰微生物，其中所述变异型YeeX蛋白质或其同源物是具有在序列号1的氨基酸序列中相当于第84位的丙氨酸置换为其他氨基酸的变异的变异型YeeX蛋白质或其同源物。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的基因修饰微生物，其中在基因组上具有能够表达所述变异型YeeX蛋白质或其同源物的基因。

5.根据权利要求4所述的基因修饰微生物，其中基因组上的能够表达野生型YeeX蛋白质或其同源物的基因变异或置换为能够表达所述变异型YeeX蛋白质或其同源物的基因。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的基因修饰微生物，其中所述变异型YeeX蛋白质或其同源物具有在序列号1的氨基酸序列中相当于第84位的丙氨酸置换为缬氨酸的变异。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的基因修饰微生物，其中所述微生物具有有机酸生产能力。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的基因修饰微生物，其中所述微生物为属于沙雷氏菌属、大肠杆菌属、放线杆菌属、Basfia属、假单胞菌属、哈夫尼菌属、不动杆菌属、Shimwellia属或产气杆菌属的微生物。

9.一种有机酸的制造方法，包括在含有碳源作为发酵原料的培养基中对权利要求7或8所述的基因修饰微生物进行培养。

10.根据权利要求9所述的有机酸的制造方法，其中所述有机酸为琥珀酸、乙酸、3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和/或己二酸。