CN115521880A - 一种用于生物合成增值产品的甲基营养型酵母的无甲醇培养方法 - Google Patents

一种用于生物合成增值产品的甲基营养型酵母的无甲醇培养方法 Download PDF

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Abstract

本文描述了一种生产转基因细胞产物的方法，其中感兴趣的基因可操作地链接到除AOX1以外的可诱导启动子。当宿主细胞在非抑制性碳源上生长以解除对可诱导启动子的抑制时激活转基因细胞产物的产生，且向宿主细胞培养物添加足够量的诱导剂化合物以诱导可诱导启动子，该诱导剂化合物选自：甲醛；S‑甲酰谷胱甘肽；S‑羟甲基谷胱甘肽；甲酸；甲酸的碱金属盐；和甲酸的碱土金属盐。

Description

一种用于生物合成增值产品的甲基营养型酵母的无甲醇培养 方法
技术领域
本发明涉及甲基营养型酵母(例如毕赤酵母或Komagataella phaffii)的培养/发酵领域，以生产诸如重组蛋白或小分子化合物的增值产品。
背景技术
甲基营养型酵母，如毕赤酵母，也称为Komagataella phaffii，广泛作为生产重组蛋白的宿主生物。这种酵母利用廉价的底物甲醇作为唯一碳源的能力、其高细胞密度发酵能力、其分泌机制以及强大且严格调控的启动子，使其在生物技术中得到广泛应用。尽管存在强组成型启动子如GAP(甘油醛-3-P脱氢酶)启动子、TEF1启动子(翻译延伸因子)，但是诱导型启动子如AOX1启动子(醇氧化酶)在生产目的方面具有优势，因为它们允许生物质生长而不形成产物。因此，细胞不会因生长过程中重组产物的积累而受到压力，从而实现更好的过程控制。巴斯德毕赤酵母细胞中的AOX1基因在对甲醇的反应中大幅上调，而当培养基中存在葡萄糖或甘油或任何其他可发酵碳源时，它会保持紧密抑制。因此，在所有诱导型启动子中，AOX1启动子使用最多。由任何诱导型启动子驱动的典型生物过程包括葡萄糖或甘油(分批)阶段的生物质生长，然后诱导表达，接着在切换到甲醇(补料和诱导阶段)后产生重组蛋白/化合物。
为了响应不同的碳源，包括AOX1在内的所有诱导型启动子都具有三种受调控的基因表达状态：分解代谢物抑制(或只是抑制)、去抑制和激活(诱导)。对于AOX1启动子，这些状态已得到很好的描述，与本文描述的其他诱导型启动子不同。当培养基中富含甘油或葡萄糖或乙醇或任何其他可发酵碳源时，AOX1启动子被完全抑制。当这些碳源耗尽时，解除了对AOX1启动子的抑制，这意味着它在大约2-5％的甲醇诱导水平下被激活。当培养物在所谓的非抑制性碳源(例如山梨糖醇、甘露糖醇、丙氨酸或海藻糖)上生长时，也可以解除对AOX1启动子的抑制。当培养物开始消耗甲醇作为碳源时，无论有或没有不可抑制的碳源，AOX1启动子和其他列出的启动子都被完全激活(即诱导)，尽管甲醇被广泛用作AOX1驱动诱导系统的诱导剂，在发酵过程中使用甲醇的许多缺点(例如它的易燃性和毒性)极大地限制了该系统在大规模工业规模上的可行性。最近表明，甲酸盐(甲酸盐)几乎可以像甲醇一样诱导AOX1启动子。然而，本文讨论的其他天然启动子是否可以被甲酸或甲酸盐诱导仍然未知。此外，尚未确定甲酸盐或甲酸是否可以与不可抑制的碳源结合用作诱导剂。
发明内容
发酵/培养过程的安全方面应该受到特别关注的主题。就这方面而言，在工业设施中储存大量危险和易燃的甲醇是非常不可取的。除了使发酵过程变得危险和不环保之外，额外安全措施产生的费用可能会使总生产成本增加15％。此外，甲醇代谢导致放热增加，这在技术上是不利的，因为培养消耗大量能量来冷却生物反应器。甲醇代谢的另一个缺点是培养物的耗氧量高，这是很危险的，因为它需要具有高氧容量的生产设施。因此，为了使生物过程更安全、更便宜，从培养过程中排除甲醇是非常有利的，同时保持甚至超过常规AOX1或其他MUT途径诱导基因的高水平表达。目前有一些基于酵母基因修饰的方法，但没有一种方法可以完全避免在已经设计的菌株中使用甲醇。
本文描述了一种将前述替代诱导剂、甲酸盐(蚁酸盐)或甲酸与任何合适的非抑制性摄食底物(例如山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖或丙氨酸)结合使用的培养方法。还描述了使用甲酸盐(蚁酸盐)或甲酸作为甲醇诱导剂的替代品，具有或不具有以下启动子的非抑制性碳源：NAD+依赖性甲酸脱氢酶(FDH)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:1提供)，醇氧化酶2(AOX2)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:2提供)，过氧蛋白Pex14p(PEX14)启动子(其一个例子以SEQ ID NO：3提供)，二羟基丙酮激酶(DAK)启动子(其一个例子以SEQ ID NO：5提供)，二羟基丙酮合酶1,2(DAS1,2)启动子(其一个例子分别以SEQ ID NO：10SEQ ID NO:11提供)，甲酰基-谷胱甘肽脱氢酶(FGH)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:4提供)，甲醛脱氢酶1(FLD1)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:12提供)，果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:6提供)，过氧化物酶体膜信号受体PTS1(PEX5)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:7提供)，醇脱氢酶2(ADH2)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:8提供)和过氧化氢酶(CAT)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:9提供)。如对本领域技术人员显而易见的，SEQ ID NO：1-12中提供的启动子序列仅用于说明目的，并且这些的合适变体可用于本发明，这取决于所使用的宿主细胞。
如本领域技术人员将理解的，从需要证明条件起作用的角度来看，找到能够诱导某些启动子的新化合物并不是显而易见的。因此，甲醇作为一些非抑制性底物的诱导剂这一事实根本不意味着甲酸盐(或甲酸)应该以相同的方式起作用。这在启动子的激活机制尚不清楚的情况下尤其如此。因此，没有人可以绝对肯定地说代谢物在某些生长条件下可以成为诱导物。虽然针对大量使用的AOX1启动子阐明了一些调节性转录激活因子，但对于上面列出的MUT(甲醇利用)途径示例(SEQ ID NO：1-9)的所有其他启动子，没有显示任何内容。
根据本发明的一个方面，提供了一种生产转基因细胞产物的方法，包括：
(a)提供一种表达系统，其包含：包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含诱导型MUT(甲醇利用)途径启动子，该诱导型MUT(甲醇利用)途径启动子可操作地链接到编码感兴趣的转基因细胞产物的核酸分子；
(b)在合适的碳源上生长宿主细胞，以支持宿主细胞的活跃生长和抑制诱导型MUT启动子，从而提供宿主细胞培养物；
(c)在宿主细胞培养物达到合适的宿主细胞培养密度后，在非抑制性碳源上生长宿主细胞培养物，从而解除对诱导型MUT途径启动子的抑制；
(d)添加一定量的诱导剂化合物，该诱导剂化合物选自以下组，组中包括：甲醛；S-甲酰基谷胱甘肽；S-羟甲基谷胱甘肽；甲酸；甲酸的碱金属盐或铵盐；和甲酸的碱土金属盐；足以将诱导型MUT途径启动子诱导到宿主细胞培养物中，使得诱导型MUT途径启动子启动编码感兴趣的转基因细胞产物的核酸分子的表达；和
(e)从宿主细胞培养物中回收表达的感兴趣的转基因细胞产物。
根据本发明的另一个方面，提供了一种生产转基因细胞产物的方法，包括：
(a)提供一种表达系统，其包含：包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含诱导型MUT(甲醇利用)途径启动子，该诱导型MUT(甲醇利用)途径启动子可操作地链接到编码感兴趣的转基因细胞产物的核酸分子；
(b)在合适的碳源上生长宿主细胞，以支持宿主细胞的活跃生长和抑制诱导型MUT途径启动子，从而提供宿主细胞培养物；
(c)在宿主细胞培养物达到合适的宿主细胞培养密度后：
(c1)向宿主细胞培养物中加入非抑制性碳源，
(c2)加入一定量的诱导剂化合物，该诱导剂化合物选自以下组，组中包括；甲醛；S-甲酰基谷胱甘肽；S-羟甲基谷胱甘肽；甲酸；甲酸的碱金属盐或铵盐；和甲酸的碱土金属盐；足以将诱导型MUT途径启动子诱导到宿主细胞培养物中，使得诱导型MUT途径启动子启动编码感兴趣的转基因细胞产物的核酸分子的表达；和
(c3)从宿主细胞培养物中回收表达的刚兴趣的转基因细胞产物；和
(d)重复步骤(c1)–(c3)。
附图说明
图1响应甘油、山梨糖醇、甲醇和甲酸钾的启动子诱导水平图表。a)针对GS115菌株；b)针对KM71h菌株
图2表达盒在酵母菌株GS115基因组中的整合示意图。
图3摇瓶实验和GS115/pL_hEGF发酵样品的蛋白质印迹；1.GS115(阴性对照)；蛋白质阶梯(目录号BZ0011G，BioBasic，加拿大)；2.GS115/pL_hEGF克隆#1甲醇诱导培养；3-6.GS115/pL_hEGF克隆#1-4甲酸钾诱导；7.GS115/pL_hEGF发酵样品，甲醇诱导/培养48小时；8.GS115/pL_hEGF发酵样品，甲醇诱导/培养72小时；9.GS115/pL_hEGF发酵样品，甲酸钾诱导/48小时培养；10.GS115/pL_hEGF发酵样品，甲酸钾诱导/培养72小时
图4摇瓶实验和GS115/pL_hSOD3发酵样品的蛋白质印迹；1.GS115(阴性对照)；蛋白质阶梯(目录号BZ0011G，BioBasic，加拿大)；2.GS115/pL_hSOD3甲醇诱导培养；3.GS115/pL_hSOD3甲酸钾诱导；4.GS115/pL_hSOD3甲醇诱导，发酵样品/培养48小时；5.GS115/pL_hSOD3甲醇诱导，发酵样品/培养72小时；6.GS115/pL_hSOD3发酵样品，甲酸钾诱导/培养48小时；7.GS115/pL_hSOD3发酵样品，甲酸钾诱导/培养72小时
图5摇瓶实验和GS115/pL_hLF发酵样品的蛋白质印记；1.GS115(阴性对照)；蛋白质阶梯(目录号BZ0011G，BioBasic，加拿大)；2.GS115/pL_hLF克隆#1甲醇诱导培养；3-6.GS115/pL_hLF克隆#1-4甲酸钾诱导；7.GS115/pL_hLF发酵样品，甲醇诱导/培养24小时；8.GS115/pL_hLF发酵样品，甲醇诱导/培养48小时；9.GS115/pL_hLF发酵样品，甲醇诱导/培养72小时；10.GS115/pL_hLF发酵样品，甲酸钾诱导/培养24小时；11.GS115/pL_hLF发酵样品，甲酸钾诱导/培养48小时；12.GS115/pL_hLF发酵样品，甲酸钾诱导/培养72小时
图6A.来自摇瓶实验的样品的SDS-PAGE。蛋白质阶梯(目录号BZ0011G，BioBasic，加拿大)；GS115/pL_RBD甲酸钾诱导；B.摇瓶实验样品的蛋白质印迹。蛋白质阶梯(目录号BZ0011G，BioBasic，加拿大)；GS115/pL_RBD甲酸钾诱导；
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。如果存在任何潜在的歧义，则本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。术语“包括”以及诸如“包含”之类的其他形式的使用不是限制性的。
通常，与本文所述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学结合使用的命名法在本领域中是公知的和常用的。除非另有说明，否则本文提供的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述进行操作。与本文所述的分子生物学的实验室程序和技术相关的命名法是本领域公知的和常用的。
为了更容易理解本公开，选择的术语定义如下。
冠词“一”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。
所有数字名称，例如pH值、温度、时间、浓度、量和分子量，包括范围，都是近似值，可根据需要变化(+)或(-)10％、1％或0.1％。应当理解，尽管并不总是明确说明，但是所有数字名称之前都可以有术语“约”。还应理解，尽管并不总是明确说明，但是本文描述的试剂仅是示例性的并且其等价物在本领域中是已知的。
术语“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的元素，但不排除其他元素。“基本上由……组成”在用于定义组合物和方法时，应意味着排除对组合具有任何重要意义的其他元素。例如，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质影响要求保护的发明的基本和新颖特征的其他元素。“由……组成”是指不包括微量以上所述的其他成分和实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本发明的范围内。
权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案，或者替代方案是互斥的，尽管本公开支持仅指替代方案和“和/或的定义。”
如本文所用，本领域技术人员将理解术语“约”并且其将在一定程度上取决于其使用的上下文而变化。如果存在对本领域普通技术人员不清楚的术语的使用，考虑到其所使用的上下文，“约”将意味着高达特定术语的正负10％。
术语“多核苷酸”是指双链或单链DNA，以及互补的核酸序列。多核苷酸包括由天然存在的碱基、糖和糖间(主链)键组成的核苷或核苷酸单体序列。该术语还包括修饰或取代的序列，其包含非天然存在的单体或其部分。本公开的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶。序列还可以包含修饰的碱基。
术语“蛋白质”或“多肽”是指由核酸分子编码的氨基酸残基序列。在本申请的上下文中，本公开的多肽在一个实施例中可以包括初级蛋白质的各种结构形式。例如，本公开的多肽可以呈酸性或碱性盐形式或呈中性形式。此外，个别氨基酸残基可通过氧化或还原进行修饰。本公开的蛋白质和多肽还可以包括本文所述的蛋白质和多肽的截短体、类似物和同源物，其具有与本公开的蛋白质或多肽基本相同的功能。
如本文所用，“构建物”或“质粒”是指人工创建的核酸，其包含递送载体和一个或多个感兴趣的基因，例如包含本文所述多核苷酸的载体。可以将感兴趣的多核苷酸克隆到感兴趣的质粒中以产生构建体。在一个实施例中，载体是表达载体。可能的表达载体包括但不限黏粒或质粒，只要该载体与所使用的宿主细胞相容。表达载体适合于宿主细胞的转化，这意味着表达载体包含多核苷酸，例如在应用和基于宿主细胞选择的调控序列中所示的多核苷酸，以赋予刚兴趣的基因的表达。
操作性链接(或可操作连接)意指感兴趣的基因以允许该感兴趣的基因表达的方式与调控序列相关联。在一些实施例中，分离和/或纯化的核酸分子、多核苷酸或载体、构建物或包含这些分离和/或纯化的核酸分子的体外表达系统，可用于创建产生多肽或任何小分子化合物的转基因或重组生物体或重组细胞(例如，可选择的重组生物体细胞)。核苷酸序列以接收的方式相关联，例如，当启动子可影响编码序列的表达时，启动子可操作地连接到重组基因的编码序列。
本文描述的是如本文所讨论的用于生产例如重组蛋白或小分子的表达系统。在一些实施例中，表达系统包括如本文所公开的重组载体或其一部分。在一些实施例中，表达系统包括适当的宿主细胞，例如，微生物细胞、酵母细胞、植物细胞或动物细胞。在另一实施例中，宿主表达系统包括酵母细胞。在一个实施例中，酵母细胞包含毕赤酵母、Komagataellakurtzmanii、Komagataella phaffii、安格斯毕赤酵母、吉列尔莫尔毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、肌醇毕赤酵母、多形汉森酵母、博伊丁假丝酵母和解脂耶氏酵母中的一种或多种。
如本文所用，“分批阶段””是指接种后培养/发酵的第一阶段，其中培养物在诱导阶段之前生长至达到所需的光密度(OD600)。如本文所讨论的以及本领域技术人员将显而易见的，特定OD600将取决于多个因素，包括但不限于所感兴趣的转基因细胞产品，例如，正在生产的外源肽或小分子；以及正在使用的宿主细胞。
如本文所用，“诱导阶段”或“补料分批阶段”或“连续阶段”是指继分批阶段之后的第二个培养阶段，在该阶段中诱导培养，这可以被视为通过添加称为诱导剂的化合物来开启感兴趣的基因的表达。
根据本发明的一个方面，提供了一种生产转基因细胞产物的方法，包括：
(a)提供一种表达系统，其包含：包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含诱导型MUT(甲醇利用)途径启动子，该诱导型MUT(甲醇利用)途径启动子可操作地链接到编码感兴趣的转基因细胞产物的核酸分子；
(b)在合适的碳源上生长宿主细胞，以支持宿主细胞的活跃生长和抑制诱导型MUT途径启动子，从而提供宿主细胞培养物；
(c)在宿主细胞培养物达到合适的宿主细胞培养密度后，在非抑制性碳源上生长宿主细胞培养物，从而解除对诱导型MUT途径启动子的抑制；
(d)添加一定量的诱导剂化合物，该诱导剂化合物选自以下组，组中包括：甲醛；S-甲酰基谷胱甘肽；S-羟甲基谷胱甘肽；甲酸；甲酸的碱金属盐；和甲酸的碱土金属盐；足以将诱导型MUT途径启动子诱导到宿主细胞培养物中，使得诱导型MUT途径启动子表达编码感兴趣的转基因细胞产物的核酸分子；和
(e)从宿主细胞培养物中回收表达的感兴趣的转基因细胞产物。
可诱导启动子可选自以下组，组中包括：NAD+依赖性甲酸脱氢酶(FDH)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:1提供)；醇氧化酶2(AOX2)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:2提供)；过氧蛋白Pex14p(PEX14)启动子(其一个例子以SEQ ID NO：3提供)；二羟基丙酮激酶(DAK)启动子(其一个例子以SEQ ID NO：5提供)；二羟基丙酮合酶1,2(DAS1,2)启动子(其一个例子分别以SEQ ID NO：10SEQ ID NO:11提供)；甲酰基-谷胱甘肽脱氢酶(FGH)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:4提供)；甲醛脱氢酶1(FLD1)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:12提供)；果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:6提供)；过氧化物酶体膜信号受体PTS1(PEX5)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:7提供)；醇脱氢酶2(ADH2)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:8提供)；和过氧化氢酶(CAT)启动子(其一个例子以SEQ ID NO:9提供)。如对本领域技术人员显而易见的，SEQ ID NO：1-12中提供的启动子序列仅用于说明目的，且这些启动子序列的合适变体可用于本发明，具体取决于所使用的宿主细胞。
宿主细胞可以是酵母细胞，例如，选自以下组，组中包括：毕赤酵母、Komagataellakurtzmanii、Komagataella phaffii、安格斯塔毕赤酵母、吉列尔莫尔毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、肌醇毕赤酵母、多形汉森酵母、博伊丁假丝酵母和解脂耶氏酵母。在一些实施例中，酵母为毕赤酵母。
在一些实施例中，核酸分子还包含分泌肽，其在感兴趣的转基因细胞产物框架中，优选在相对于感兴趣的产物或感兴趣的基因的转录和翻译方向的上游。
在一些实施例中，核酸分子还包含表达标签，其在感兴趣的转基因细胞产物框架中，优选在感兴趣的产物或感兴趣的基因的C端或N端。
合适的宿主细胞培养密度可为250-350g/L培养物(湿细胞重量)。
如本文所讨论的，在本发明的一些实施例中，步骤(c)、(d)和(e)重复多次。具体而言，尤其是当感兴趣的转基因细胞产品包括分泌序列时，可从生长培养基中回收感兴趣的转基因细胞产品，并可添加额外的非抑制性碳源和诱导剂化合物以维持宿主细胞培养物在分批阶段的生长，从而使产物继续由细胞生产并从培养基中回收。
在一些实施例中，在添加诱导化合物之前确定宿主细胞培养密度，以便添加浓度足以在该宿主细胞培养密度下诱导可诱导启动子的诱导剂化合物。
在一些实施例中，非抑制碳源最初分阶段添加到宿主细胞培养物中，例如，在生长抑制碳源耗尽之前开始添加，以便宿主细胞培养物最初在抑制碳源和非抑制性碳源上生长。在一些实施例中，抑制性碳源最初是主要碳源，并且允许其水平降低，直到非抑制性碳源是唯一碳源。如本文所述，这可防止宿主细胞培养物的生长滞后，因为抑制性碳源逐渐过渡到非抑制性碳源，而不是突然转变到非抑制性碳源。
非抑制性碳源可选自以下组，组中包括：山梨醇、甘露醇、海藻糖和丙氨酸。
可发酵的抑制性碳源可以是甘油或葡萄糖。
在一些实施例中，表达载体或重组载体包含复制源，该复制源使载体能够在例如大肠杆菌中繁殖以用于扩增和克隆目的。
在一些实施例中，重组载体包含可选择的“标记基因”，其能够选择用本申请的重组盒转化的宿主细胞(大肠杆菌和酵母细胞)。选择标记基因的示例包括但不限于编码蛋白质的基因，例如氨基糖苷3’-磷酸转移酶，其对G418抗生素产生耐药性，或潮霉素B磷酸转移酶，其对潮霉素产生耐药性。其他合适的选择标记基因对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
在本发明的一些实施例中，表达载体还包含分泌肽(例如αMF)，该分泌肽例如与感兴趣的转基因细胞产品连接或融合或在框架中，以便当感兴趣的转基因细胞产物的表达由可诱导启动子驱动时，由所得转录物产生的肽或多肽包括将新生多肽链引导至分泌途径的分泌肽，如本文所述。通过这种方式，感兴趣基因(GOI)的产物可操作地连接到分泌肽的下游。
在一些实施例中，由表达载体产生的多肽在其C’端或N’端还包含检测标签，该检测标签有助于例如通过蛋白质印迹法检测感兴趣的蛋白质。如本领域技术人员所知，人流感血凝素(HA)标签、Myc标签、FLAG标签或HIS标签是可以用作检测标签的短肽的示例。
如本文所述，抑制性碳源可以是任何可发酵碳源，例如，但绝不限于甘油或葡萄糖。
如本领域技术人员将显而易见的，如本文所用，“分批阶段”表示密集培养生长，例如，使宿主细胞培养达到高密度，例如250-350g/L培养物(湿细胞重量)。
如本领域技术人员将理解并如本文所述，当碳源从抑制性碳源切换到非抑制性碳源时，宿主细胞培养物的比密度可能会变化，这取决于所表达的产物和期望的结果。因此，理论上来说，虽然较低的细胞密度会产生较少的蛋白质，但如果所产生的产物或蛋白质对细胞有毒或在较高密度下合成和/或恢复存在其他问题，则这可能是可取的。类似地，虽然较高的细胞密度对于培养物整体而言可能不健康，但在一些实施例中，该较高密度对于产物的有效生产可能是可取的。
如本文所述，虽然不希望受到特定理论或假设的约束，但相信诱导剂化合物被甲酸脱氢酶降解。
如本文所述，可添加诱导剂化合物并多次从宿主细胞培养物中回收感兴趣的转基因细胞产物，这当然取决于所产生的转基因细胞产物的性质。如本领域技术人员显而易见的，在这些实施例中，可能希望将分泌肽并入编码转基因细胞产物的核酸分子中，以促进恢复并允许多个“诱导和恢复”阶段。在这些实施例中，如本文所述，还可以连续或分批将非抑制性碳源供给宿主细胞培养物。
本发明提供了一种通过在不使用甲醇作为诱导剂的情况下，即，前提是不添加甲醇作为诱导剂的情况下，培养甲基营养型酵母来生产多肽或小分子化合物等增值产品的方法。该方法而是使用非抑制性碳源进料，并使用替代诱导剂表达一个或多个感兴趣的基因。
因此，在一个实施例中，本文提供了一种使用甲基营养型酵母宿主表达系统生产增值化合物的方法，该系统包括(a)编码感兴趣的基因的一个或多个核苷酸序列，包括(i)在分批阶段培养酵母宿主细胞，为稳健生长提供供料；和(ii)在补料分批阶段培养宿主表达系统，提供具有替代诱导剂的进料，或(ii)在连续阶段培养宿主表达系统，提供具有替代诱导剂的连续发酵状态的进料。
分批和补料分批相碳源可以是除甲醇以外的任何碳源。在一个实施例中，第一和/或第二来源包括甘油、丙氨酸、乳酸、甘油、葡萄糖、乙醇、柠檬酸、山梨醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、果糖、蜜二糖、麦芽糖、鼠李糖、甘露糖、甘露醇和棉子糖中的一种或多种。在一个实施例中，分批阶段碳源为甘油。在另一实施例中，补料分批和诱导阶段碳源是山梨醇。其中，糖、甘油、乙醇、柠檬酸、木糖、阿拉伯糖、果糖、蜜二糖、麦芽糖、鼠李糖、甘露糖和棉子糖属于抑制性碳源；而山梨醇、甘露醇、丙氨酸和海藻糖是非抑制性碳源。
连续和感应阶段碳源可以是除甲醇以外的任何非抑制性碳源。在一个实施例中，第一和/或第二来源包含丙氨酸、山梨醇、甘露醇中的一种或多种。在一个实施例中，诱导阶段碳源为山梨醇。
在一个实施例中，启动子是驱动感兴趣的基因表达的调节性核苷酸序列。
在一个实施例中，诱导剂是调节基因表达的化合物。
在一个实施例中，诱导剂包含甲醛、S-甲酰谷胱甘肽、S-羟甲基谷胱甘肽、甲酸或使用任何碱金属或甲酸铵盐或甲酸碱土金属盐中的一种或多种。此类诱导剂的示例为甲酸钠、甲酸钾和甲酸铵。
在一个实施例中，调控序列是启动子。启动子是宿主细胞或宿主表达系统中的调节性核苷酸序列，其驱动刚兴趣的基因的表达。在另一实施例中，启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在一个实施例中，启动子选自以下组，组中包括：FDH启动子(NAD+依赖性甲酸脱氢酶)启动子、醇氧化酶2(AOX2)启动子、二羟丙酮激酶(DAK)启动子、二羟丙酮合酶1,2(DAS1,2)启动子、甲酰谷胱甘肽脱氢酶(FGH)启动子、甲醛脱氢酶1(FLD1)启动子、果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)启动子、过氧化物酶体膜信号受体PTS1(PEX5)启动子、乙醇脱氢酶2(ADH2)启动子和过氧化氢酶(CAT)启动子。
在一个实施例中，对包含宿主表达系统的培养基进行氧化。在另一个实施例中，在将培养物中宿主表达系统的特定生长速率(μ)保持在约0.03h-1至约0.5h-1范围内的速率下提供分批阶段进料。在另一实施例中，在将培养物中宿主表达系统的特定生长速率(μ)保持在约0.0001h-1至约0.465h-1范围内的速率下提供补料分批阶段或连续进料。
为了进行说明，值得注意的是，宿主细胞的非常快的生长速率(例如，在分批阶段的生长)被认为是大约0.3–0.4H-1，而缓慢的生长速率可以是例如大约0.01–0.04H-1，这可能是诱导阶段的细胞生长速率。如本领域技术人员将理解的，在一些实施例中，非抑制性碳源以支持宿主细胞培养物在约0.3–0.4H-1下生长的浓度或百分比供应给生长培养基或存在于生长培养基中，而非抑制性碳源以支持宿主细胞培养物在约0.01–0.04H-1下生长的浓度或百分比供应给生长培养基或存在于生长培养基中。
在一些实施例中，分批阶段和补料分批/连续阶段均在约21℃至约30℃的温度下进行。在一个实施例中，分批阶段和补料分批阶段均在约25℃的温度下进行。
在一个实施例中，多肽是异源多肽。
在一些实施例中，多肽包含约10个或更多个氨基酸。
术语“异源”是指通常在宿主有机体(如重组细胞)中未发现的多核苷酸、基因、多肽或酶。“异源”还包括以不同于相应天然基因的形式重新引入宿主生物体天然编码区或其部分，其中相应天然基因例如不在宿主基因组中的自然位置。异源多核苷酸或基因可通过例如基因转移(例如通过转化或转染)引入宿主生物体。异源基因可包括作为嵌合基因的一部分的天然编码区，该嵌合基因包括重新引入天然宿主的非天然调控区。外源基因可以被概念化为插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。因此，“异源”多肽是那些与所利用的宿主细胞无关的多肽，例如由酵母或细菌产生的植物或人类蛋白质。虽然异源多肽可以是原核或真核的，但在一些实施例中它是真核的。在一些实施例中，它是植物或人类蛋白质或肽。在一些实施例中，它是多肽(例如，酶)。
本文所述多肽的变体和/或片段也可通过本文所公开的方法制备。
在一些实施例中，本发明多肽的活性，包括其变体和片段的活性，可通过本领域已知的方法确定。
在一个实施例中，多肽为人表皮生长因子(hEGF)，其包含序列ID号17(NCBI登录号XP_U 016863338.1)中所述的氨基酸序列。hEGF)是一种约6.2kDa的多肽，由53个氨基酸残基和三个分子内二硫键组成。其主要生物学功能之一是促进新的上皮细胞和内皮细胞的生成，并刺激组织修复。hEGF已在各种宿主系统中产生，包括大肠杆菌、酿酒酵母和杆状病毒。在大肠杆菌中，产生的hEGF倾向于形成包涵体，这大大复杂了下游过程，因为它需要费力的复性和多步骤纯化过程。
在另一实施例中，多肽是细胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn](hSOD3)，包含SEQ IDNO:18(NCBI登录号NP_U 003093.2)中所述的氨基酸序列。SOD是一种约30kDa的多肽，据报道是一种多聚糖蛋白，由对肝素具有异质亲和力的人类细胞外液中至少四个相同的亚基组成。人类保健对SOD的潜在需求正在增长；因此，生产具有生物活性的SOD具有重要的意义。利用基因工程酵母生产治疗性蛋白质被证明是组织培养或动物组织纯化的一种经济有效的替代方法。
在另一实施例中，多肽是人乳铁蛋白(hLF)，其包含SEQ ID NO:19(NCBI登录号AAB60324.1)中所述的氨基酸序列。乳铁蛋白(LF)是铁结合糖蛋白的转铁蛋白家族的成员。最初在哺乳动物外分泌液和多形核白细胞的特定颗粒中发现。
在另一实施例中，该多肽是SARS-CoV-2病毒S(spike)糖蛋白的受体结合域(RBD)，其包含SEQ ID NO:20(PDB:7CM4_u A)中所述的氨基酸序列。S糖蛋白的表面暴露位置使其成为宿主免疫反应的直接靶点，使其成为中和抗体的主要靶点。S蛋白被认为是疫苗设计和抗病毒治疗的主要靶点。
通过本发明方法制备的多肽可在表达后通过本领域已知的技术分离，这些已知技术包括但不限于亲和层析、离子交换层析、抗体亲和、大小排斥或从多肽中去除大部分培养物和/或细胞碎片的任何其他方法。在一些实施例中，该方法提供基本纯化的多肽。分离的多肽可以具有类似于其衍生的相应天然蛋白质的活性。多肽可以以正确折叠的状态或构象分离，接近天然蛋白质的状态或构象，或者可以使用本领域已知的各种方法和/或试剂进一步复性或修饰以使其成为正确折叠的构象。
在一个实施例中，宿主细胞为毕赤酵母(例如，Komagataella spp)、安古斯塔毕赤酵母、吉列尔莫尔毕赤酵母、甲醇毕赤酵母或肌醇毕赤酵母。
在一些实施例中，重组或宿主细胞为毕赤酵母。
在其他实施例中，重组或宿主细胞是毕赤酵母KM71和KM71h的MutS(甲醇利用缓慢)菌株。然而，值得注意的是，诸如GS115等Mut+菌株可在本发明中使用，并且MutS菌株的使用不是本发明的要求。
在另一实施例中，宿主细胞或重组细胞为多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母和解脂耶氏酵母。
在一个实施例中，编码多肽的异源多核苷酸以每个宿主细胞单个或多个拷贝的形式提供在适于整合到宿主细胞基因组中的载体(例如质粒)上。在一些实施例中，载体是整合到基因组中的核苷酸序列。
在一个实施例中，载体是真核表达载体，优选酵母表达载体。
在另一实施例中，表达载体是克隆的重组核苷酸序列，例如一个或多个感兴趣的重组基因或肽的转录及其在适当宿主生物体中的mRNA翻译所需的DNA序列。
在其他实施例中，此类表达载体通常包括一个或多个用于在宿主细胞中进行自体复制的来源、适当的标记物(例如，对诸如吉欧霉素、卡那霉素G418或潮霉素等抗生素产生耐药性的基因)、限制性内切酶切割位点、适当的启动子序列和转录终止子，这些组件可操作地相互连接以进行交互。
在一些实施例中，表达载体包括但不限于克隆载体、修饰克隆载体和特定指定质粒。本发明的表达载体可以是适合于在宿主细胞中表达重组基因的任何表达载体，根据宿主生物体选择该表达载体。
在其他实施例中，调控序列包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列，包括翻译起始信号。此外，取决于所选择的宿主细胞和所使用的载体，其他序列，例如复制起点、额外的DNA限制位点、增强子和赋予转录诱导能力的序列可以并入表达载体中。
在一些实施例中，感兴趣的基因的核苷酸序列受以下类型的启动子的控制，这些启动子包括：组成型启动子、对在分批培养阶段进料的碳源有反应的启动子和/或对碳源和诱导子有反应的启动子，其中在分批培养阶段进料/添加碳源。
在一个实施例中，启动子是内源性启动子，其中编码多肽的多核苷酸整合到酵母宿主细胞的基因组中，使得内源性启动子可操作地连接到异源多核苷酸，从而能够驱动其表达。
在其他实施例中，表达载体pL(SEQ ID NO:3)还包含可有效诱导从宿主细胞分泌多肽的分泌先导序列。
在其他实施例中，表达载体pL(SEQ ID NO:13)还包含HA标签(血凝素标签)，用于使用抗HA标签抗体通过蛋白质印迹法进行常规检测。
在一些实施例中，分泌先导序列可来自酵母α因子源，例如来自αMF、酵母磷酸酶(PHO)、热休克蛋白(HSP)以及HSP标签重复、转化酶(SUC2)标签、OST1标签、DDDK标签或其组合，或文献中描述的任何其他分泌肽。
在一些实施例中，生长包含异源多核苷酸的重组细胞的步骤包括在包含第一碳源(例如，可发酵或抑制性碳源)的培养基中生长细胞。
本文讨论可添加到培养基中的其他成分的示例；然而，合适的成分及其量对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且/或者可以通过常规实验来确定。
在一个实施例中，介质是水介质，包括第一碳源和可选的一种或多种其他成分，例如盐(例如磷酸盐和/或硫酸盐等)、抗生素、维生素、痕量金属离子、将pH保持在所需水平的试剂、磷酸盐和/或消泡剂。
在另一实施例中，介质包含磷酸、硫酸钙、硫酸钾、硫酸镁、氢氧化钾和甘油中的一种或多种。
在一些实施例中，介质还包含硫酸铜、碘化钠、硫酸锰、钼酸钠、硼酸、氯化钴、氯化锌、硫酸亚铁、生物素和硫酸中的一种或多种。
在其他实施例中，分批和补料分批碳源(或第一碳源)包括丙氨酸、乳酸、甘油、葡萄糖、乙醇、柠檬酸盐、山梨醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、果糖、蜜二糖、麦芽糖、鼠李糖、甘露糖、甘露醇和棉子糖中的一种或多种。
在一个实施例中，连续和诱导阶段碳源(或第二碳源或非抑制性碳源)包括丙氨酸、山梨醇、甘露醇和海藻糖中的一种或多种。
具体而言，传统酵母(酿酒酵母)更喜欢葡萄糖或其前体(双糖)，以便通过糖酵解将其同化，而像巴斯德毕赤酵母这样的甲基营养型酵母更喜欢将甘油作为碳源，通过G3P(甘油-3-磷酸)-DHAP(二羟丙酮磷酸)途径将其同化。然而，毕赤酵母培养也可以很容易地使用葡萄糖。考虑到甘油更便宜，大多数培养过程都专为分批使用甘油而设计。
在一些实施例中，分批阶段和/或补料分批碳源是不可发酵碳源。
例如，在一个实施例中，在分批阶段，在含甘油的盐水培养基中培养重组细胞。
例如，在一些实施例，包含异源多核苷酸的重组细胞在发酵罐中的培养基中生长，如本文所用的发酵罐还指例如用于培养一个或多个重组细胞的生物反应器或任何其他合适的设备)，采用批处理协议，其中使用第一碳源(例如甘油)生长细胞。可定期监测细胞生长，并且细胞生长可持续到消耗第一个碳源(如甘油)为止。在一些实施例中，第一碳源(例如甘油)的完全消耗由溶解氧(DO)水平的峰值为100％来表示。消耗所有第一碳源(例如甘油)所需的时间长度可能会因初始接种物的密度而异。也就是说，可以添加甘油或其他可发酵碳源，以使宿主细胞培养密度达到所需密度。
在一些实施例中，可在第一碳源(例如甘油)进料阶段结束时进行培养物取样以测量细胞密度，例如，可通过在每个时间点从例如发酵罐中提取样品并使用等分试样测量细胞密度，例如在600nm波长下测量细胞密度。在其他实施例中，可通过测量湿细胞重量、pH值、显微纯度、蛋白质浓度和/或活性来评估细胞生长。
在一些实施例中，生长步骤包括将包含细胞的培养物添加到包含第一碳源的培养基中。
在另一实施例中，培养基中第一碳源的初始量约为第一碳源体积的4％。
在其他实施例中，在消耗甘油之后(例如，在分批阶段完成时)，碳源受限(例如，甘油受限)进料阶段(例如，采用分批进料协议)接着进行，例如，直到达到所需的生物量水平。在其他实施例中，在消耗甘油后(例如，在分批阶段完成时)，开始甘油限制进料阶段，直到达到所需的生物量水平。
因此，在一些实施例中，一旦第一碳源(例如甘油)在分批阶段(例如甘油分批阶段)中耗尽，则通过以重组细胞的限制生长速率向培养基中添加适当的碳源(例如甘油)开始第二阶段(例如甘油补料分批阶段)。
例如，在一个实施例中，生长步骤还包括从包含第一碳源的溶液中以第一进料速率将第一碳源连续添加到培养基中。
在另一实施例中，以这样的速率提供补料分批碳源的进料速率，以便将培养物的比生长速率(μ)保持在0.001–0.5h-1的范围内。
在另一实施例中，在培养物完全消耗初始量的分批阶段碳源之后开始第一进料速率。
在其他实施例中，培养步骤包括以第二进料速率向培养基中添加补料分批碳源并降低第一进料速率。如本文所述，这提供了从宿主细胞培养物在抑制性碳源上的生长到在非抑制性碳源上的生长的逐渐过渡。
在另一实施例中，以这样的速率提供连续和/或诱导阶段碳源的进料速率，以便将培养物的比生长速率(μ)保持在0.001–0,5h-1范围内。
在其他实施例中，一旦完成从第一碳源进料到第二碳源进料的过渡，将包含第二碳源和痕量盐的水溶液引入培养基中。
在一个实施例中，如果DO不能保持在20％以上，则停止第二碳源(例如山梨醇)进料，然后当DO增加到至少约20％时恢复进料。例如，增加搅拌、曝气、压力和/或供氧有助于增加和/或保持DO在20％以上。通常，甲基营养型酵母的培养是在有氧条件下进行的，因此细胞在任一底物上都具有呼吸活性。DO的逐渐增加意味着培养物尚未适应新的碳源，也没有积极地消耗这种新的碳源。所以，当DO尚未稳定且仍处于上升趋势时，添加更多的第二碳源可能会导致底物累积到压力阈值浓度。如本领域技术人员所理解的，需要完全耗尽分批和补料分批阶段中使用的抑制性碳源，以便在添加诱导剂后有效诱导所列启动子。
在一个实施例中，诱导剂包含甲醛、S-甲酰谷胱甘肽、S-羟甲基谷胱甘肽、甲酸或甲酸的任何碱金属盐或甲酸的碱土金属盐中的一种或多种。
在另一实施例中，诱导剂包括甲酸钠、甲酸钾和/或甲酸铵。
在一些实施例中，按照每1L培养物0.001-2.0g的剂量或大剂量添加诱导剂，最多为每天20次。
虽然不希望受到特定理论或假设的约束，但当添加甲酸盐或甲酸时，它显然会被毕赤酵母细胞内产生的NAD+依赖性甲酸脱氢酶(FDH)降解，因此会在一段时间内耗尽。目前还不清楚它被异化的速度有多快，但在某些情况下，当每天至多添加3-4次这种甲酸盐或甲酸时，产量会增加。
例如，在一个实施例中，在诱导阶段，以1g/1L培养物的量添加50％(w/v)甲酸钾溶液，每天2次。
在一个实施例中，本发明的方法允许在不含甲醇，或在不添加甲醇或基本不添加甲醇，即甲醇本身不足的条件下，生产异源多肽或任何其他增值化合物。
在其他方面，本发明提供了一种在不使用甲醇作为诱导剂的情况下生产重组蛋白和其他增值化合物的方法。该方法而是对感兴趣的诱导基因使用山梨醇喂养和/或替代诱导策略。
在一些实施例中，第一和/或第二碳源可以是除甲醇以外的任何碳源。在一个实施例中，第一和/或第二来源包含选自丙氨酸、乳酸、甘油、葡萄糖、乙醇、柠檬酸盐、山梨醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、果糖、蜜二糖、麦芽糖、鼠李糖、甘露糖和棉子糖的化合物。在一个实施例中，分批和补料分批阶段碳源为甘油，诱导阶段碳源为山梨醇。
将在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1
评估毕赤酵母(Komagataella phaffii)菌株KM71h和GS115的启动子集的诱导潜力或强度。
通过RT-qPCR方法测量转录水平，评估以下启动子的诱导模式：FDH启动子(NAD+依赖性甲酸脱氢酶)启动子、醇氧化酶1(AOX1)启动子、二羟丙酮激酶(DAK)启动子、二羟丙酮合酶2(DAS2)启动子、甲酰谷胱甘肽脱氢酶(FGH)启动子、果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)启动子、过氧化物酶体膜信号受体PTS1(PEX5)启动子、乙醇脱氢酶2(ADH2)启动子。将组成性GAP(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子的诱导水平作为参考。
酵母培养物毕赤酵母GS115和KM71h菌株在抑制、减压和诱导条件下生长。被抑制的条件表明，培养基中存在抑制性碳源，使相关的启动子，例如甘油受到抑制。去抑制条件表明培养基中存在非抑制性碳源，例如山梨醇或任何耗尽的碳源，这将相关的启动子转换为去抑制状态。诱导条件表明，在培养基中加入一种称为诱导剂的化合物，可以诱导相关的启动子。
将毕赤酵母菌株GS115的培养物从YPD平板接种到装有10ml液体YPD的摇瓶中。培养物在夜间生长，并按以下方式重新接种：
-将1％接种物接种到含有10ml YN培养基(+组氨酸)+1％(v/v)甘油的三个烧瓶中，这代表抑制条件
-将1％接种物接种到含有10ml YN培养基(+组氨酸)+1％(w/v)D(+)山梨醇的三个烧瓶中，这代表减压条件
-将1％接种物接种到含有10ml YN培养基(+组氨酸)+1％(w/v)D(+)山梨醇+0.2％(v/v)甲醇的三个烧瓶中，这代表诱导条件
-将1％的接种物接种到含有10ml YN培养基(+组氨酸)+1％(w/v)D(+)山梨醇+1％(w/v)甲酸钾的三个烧瓶中，这代表诱导条件
这4种培养基代表抑制、去抑制和诱导(含有甲醇和甲酸盐)条件。培养物在温度控制的轨道振动筛中在29℃、250RPM下培养6小时，然后收获生物量。根据制造商的方案，使用RNeasy试剂盒(Qiagen，德国)提取总RNA。使用高容量cDNA反转录试剂盒(ThermoFisherScientific，美国)进行反转录。每个适当基因的特异性引物：FDH、FGH、DAK、DAS2、AOX1、FBA、PEX5和ADH2用于RT-PCR，以评估它们的转录水平，从而评估各自启动子的诱导水平。根据制造商的方案，采用
Figure BDA0003708827040000181
qPCR主混合物(Bio-Rad，美国)针对RT-PCR进行SYBR绿色方法。
ΔCt法用于建立标准曲线。GAP基因(D-甘油醛3’-磷酸脱氢酶)被用作标准参考基因。
用于RT-PCR的引物列表
qGAP_for；CTGGTGTCGACTACGTCATTGAGTC(SEQ ID NO:22)
qGAP_rev；GCATTGGAGACAATGTTCAAGTCAG(SEQ ID NO:23)
qFDH_for；ACTCCATTCCATCCAGCCTACATC(SEQ ID NO:24)
qFDH_rev；CATAACGACATGCTCAGCCACTG(SEQ ID NO:25)
qFGH_for；CTTCAACACAAGTCCGATGAGACG(SEQ ID NO:26)
qFGH_rev；GGTTGCCAAAATGCCTTCTCTG(SEQ ID NO:27)
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qDAS2_rev；CCTCTAATACGGGCCTTTAATTCCTCA(SEQ ID NO:29)
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qDAK_rev；GGCAAGACCGAAGTGAAGAATGTC(SEQ ID NO:31)
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qFBA2_rev；TGGAAAAAAGCAGCACCTCCC(SEQ ID NO:35)
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qPEX5_rev；TGCATTACGTTCAGCTCGTGTTG(SEQ ID NO:37)
qADH2_for；AAGGGTGACTGGCCATTGGAC(SEQ ID NO:38)
qADH2_rev；TTGGCACAACTGGATTCAGCAC(SEQ ID NO:39)
结果如图1所示
YN培养基(+组氨酸)：6.7g酵母氮基和硫酸铵；20mg L-组氨酸；用蒸馏水稀释至1升。
实施例2
将hEGF、hSOD3和hLF克隆至pL整合载体、转化酵母菌株及筛选
将hEGF(SEQ ID NO:14)、hSOD3(SEQ ID NO:15)、hLF(SEQ ID NO:16)和RBD(SEQID NO:21)的密码子优化基因克隆到具有NheI和PacI克隆位点的标准质粒pL_FDH中，分别产生pL_hEGF、pL_hSOD3和pL_hLF，其中，GOI(感兴趣的基因)——hEGF或hSOD3或hLF或RBD与αMF分泌标签融合，αMF分泌标签位于可诱导FDH启动子下游，GOI上游。质粒用Bsp119I限制性位点线性化，并根据制造商的协议，使用BTX电穿孔(BTX，美国)通过电穿孔转化为毕赤酵母GS115菌株。图2示意性地示出了含有GOI的构建物及其在酵母基因组中的整合。利用对G418抗生素的耐药性筛选转化后的克隆。因此，在转化后，将酵母培养物用G418(0.8mg/ml)接种在YPD平板上。通过PCR验证各GOI的整合，使用正向引物退火至pAOX1的3’和反向引物退火至GOI的5’。
至少有10个克隆在摇瓶中生长。将重组菌株GS115/pL_hEGF、GS115/pL_hSOD3、GS115/pL_hLF和GS115/pL_RBD的选定克隆接种到10ml BMGY培养基中，在温度控制的定轨摇床中，在29℃，270RPM下，接种24小时。然后在2000g的离心力下，使预先生长的培养物旋转，在蒸馏水中清洗，分成两等分试样。将每个等分试样重新接种到10ml BMFSY培养基中，在29℃、270RPM下，在可诱导条件下在摇瓶中再培养72小时。24小时后，用最终浓度为0.2％(w/v)甲酸钾+1％(w/v)山梨醇的每日剂量连续诱导培养物3天。
YPD液：10g酵母抽提物；20g蛋白胨；20g葡萄糖；用蒸馏水稀释至1升。
YPD琼脂：10g酵母抽提物；20g蛋白胨；20g葡萄糖；20g琼脂；用蒸馏水稀释至1升。
BMGY：10g酵母抽提物；20g蛋白胨；100ml 1mM磷酸钾缓冲液；6.7g酵母氮基硫酸铵；10g甘油；用蒸馏水稀释至1升。
BMSFY：10g酵母抽提物；20g蛋白胨；100ml pH值为6.0的1mM磷酸钾缓冲液；6,7g酵母氮基硫酸铵；20g山梨醇；0.5g甲酸钾；用蒸馏水稀释至1升。
实施例3
发酵(培养)以下重组菌株GS115/pL_hEGF、GS115/pL_hSOD3、GS115/pL_hLF的选定克隆
将毕赤酵母重组菌株GS115/pL_hEGF、GS115/pL_hSOD3、GS115/pL_hLF菌株分别进行发酵，以分别生产hEGF、hSOD3和hLF。在温度可控的发酵罐(10L工作体积)中进行发酵，以将温度保持在28℃。整个发酵过程中，培养基的pH值通过pH探针、控制器(New Brunswick，BioFlo 3000)自动控制，且配有Biocommand batch软件(Eppendorf AG)的计算机用于监测和控制发酵。
使用细胞培养基进行发酵，所述细胞培养基包括含有PTM1微量盐和卡那霉素(50mg/L，可选地)的还原基盐培养基(BSM)。表2列出了BSM的成分(每1升)。
每个菌株的培养温度为25℃，培养基中的溶解氧(DO)含量为20％或更高。发酵期间的pH值保持在6.5，以便将蛋白质分泌到培养基中，并通过向发酵容器中滴定氢氧化铵溶液来实现最佳生长。搅拌速度保持在约500rpm至约1000rpm的范围内，以保持培养基中的上述氧气浓度。进行曝气速率以每分钟(vvm)每容积发酵培养物(升)提供约0.1至1.0容积的氧气(升)，从而维持培养基中的上述溶解氧浓度(DO)。使用最小量的消泡剂A(目录号A5633)或消泡剂204(目录号A6426)(Signa-Aldrich,St.Louis,MO)避免过度起泡，因为过度起泡会导致分泌蛋白变性，并有助于减少发酵罐中的顶部空间。对于碳源，甘油和山梨醇分别以可变速率用作第一碳源和第二碳源。此处甘油被用作第一个碳源来积累细胞质量，山梨醇被用作第二个碳源来维持细胞生长和诱导蛋白质表达。
表1：还原基盐培养基(BSM)
磷酸,85％ 4.25ml
硫酸钙 0.136g
硫酸钾 2.86g
硫酸镁 1.13g
氢氧化钾 0.64g
甘油 40g
水 使容积达到1L
向1L BSM培养基中添加十二(12)ml过滤法消毒的PTM1微量盐。表3列出了(每升)PTM1微量盐的成分。
表2：PTM1微量盐(每1升)
硫酸铜-5H2O 6.0g
碘化钠 0.08g
硫酸锰-H2O 3.0g
钼酸钠-2H2O 0.2g
硼酸 0.02g
氯化钴 0.5g
氯化锌 20.0g
硫酸亚铁-7H2O 65.0g
生物素 0.2g
硫酸 5.0ml
加水，使最终容积为1升
通过测量600nm(OD600)波长下培养物的光密度(OD)和通过测量湿细胞重量，监测发酵过程中不同时间点的细胞生长。通过监测溶解氧(DO)和溶解氧浓度随碳可用性的变化来监测培养物的代谢率。
溶解氧测量(“DO”)
根据DO水平调整第二碳源摄食率。
培养物中的碳源水平是蛋白质诱导的重要决定因素。例如，DO浓度(DO峰值)的变化可用于确定在添加第二碳源(例如山梨醇)之前是否消耗了培养物中的所有甘油。监测碳源水平可确保山梨醇进料不会在发酵罐中过度累积。
发酵罐制备和甘油分批阶段
发酵从制备用作接种物的种子培养瓶开始。通常，向一个共含有5mL BMGY培养基的烧瓶中接种50uL GS115/pL_hEGF或GS115/pL_hSOD3或GS115/pL_hLF甘油储备。接种物在29℃下生长，在250-300rpm下摇动烧瓶16-24小时，直到培养物在600nm(OD600)下的光密度为2-6。将初始培养物继代培养到第二个含有5mL BMGY培养基的烧瓶中，再培养24小时。在第3天，将第二个烧瓶再继代培养到含有200mL BMGY培养基的2升烧瓶中，培养16-24个小时，或直到培养物的OD600为2-6。
该200mL培养物用作发酵罐的接种物。在接种酵母培养物之前，对含有4LBSM的发酵罐进行灭菌。灭菌后，冷却培养物，并将温度设置为28℃。根据制造商协议(Mettler-Toledo<德国)校准DO和pH探针。使用Rushton叶轮在500RPM及更高转速下搅拌培养基，并使用压缩空气在1.0vvm下曝气，使培养基的溶解氧达到适合发酵的水平。在接种之前，使用氢氧化铵将培养基的pH值调整为6.5，然后每升发酵培养基中无菌添加4.35ml PTM1微量盐。为了避免细菌污染，将卡那霉素以100ug/ml的最终浓度添加到培养基中。使用200ml OD600酵母培养物在5.0-6.0下接种该培养基。接种后测量发酵罐中培养物(培养基+酵母细胞)的DO，并将DO记录为接近100％。发酵开始后，DO由发酵罐的控制单元采用PID(比例-积分-微分)算法进行监测。如果培养物的DO水平下降到20％以下，则增加搅拌，使培养物的DO水平高于20％。发酵罐的控制单元还使用PID(比例-积分-微分)算法监测和控制pH值，并通过控制单元用30％(v/v)的氢氧化铵溶液滴定培养物来调整pH值。
通过DO水平达到100％的峰值来表示添加的甘油已完全消耗。消耗所有甘油所需的时间长度可能因初始接种物的密度而异。
在甘油进料阶段结束时，对培养物进行取样，以测量细胞密度和湿细胞重量，之后每天至少两次。通过在每个时间点从发酵罐中提取5ml样品并使用1ml等分试样在600nm波长下测量细胞密度来测量细胞密度。此外，通过测量湿细胞重量、pH值、显微纯度、蛋白质浓度和活性来评估细胞生长。
在甘油补料分批阶段之后，该阶段的湿细胞重量在约90g/L至约150g/L的范围内。
甘油补料分批阶段
一旦消耗完补料分批阶段提供的甘油，通过开始稳定的甘油进料，细胞生物量进一步增加。使用每升甘油含有12ml PTM1微量盐的50％w/v甘油溶液开始甘油进料。将进料速率设置为初始发酵体积的18.15ml/hr/l。甘油进料大约四小时或更长时间(见下文)，直到湿细胞重量约为300g/l。研究发现，表达的蛋白质水平部分取决于发酵甘油进料阶段细胞颗粒的湿细胞重量。因此，改变甘油进料阶段的长度以优化蛋白质产量。
过渡阶段和山梨醇补料分批阶段
一旦在甘油进料阶段培养物的湿细胞重量约为250克/升至300克/升，碳源就从第一碳源甘油切换到第二碳源山梨醇。这种从甘油到山梨醇的转变最初是使用甘油和山梨醇的“混和进料”进行的。在混合进料阶段，甘油进料速度在2小时内从培养基的18.15ml/hr/L缓慢下降到0ml/hr/L，山梨醇进料速度在2小时内从培养基的0ml/hr/L缓慢上升到2.57ml/hr/L。在不会导致培养物pH值出现任何明显的峰值或漂移的速率下将甘油进料转变到山梨醇进料。在转变阶段，还监测了细胞生长和细胞健康的其他替代指标。
一旦完成从甘油进料到山梨醇进料的转变，通过引入每升该山梨醇溶液含有12mlPTM1微量盐的50％山梨醇水溶液，开始诱导蛋白质表达。
将搅拌速度增加至1000RPM，并使用纯氧将培养物的DO保持在20-25％的范围内。当培养物完全适应山梨醇利用(2-4小时)时，DO读数保持稳定。在2.57ml/hr/l进料速度下2-4小时后，山梨醇进料速度增加到每升初始发酵体积约5.13ml/hr。然后根据发酵过程中生物量的增加，每天按比例调整一次进料速度。
一旦培养物适应以山梨醇作为碳源，每12小时向细胞培养基中添加量为培养基的2ml/L的诱导剂(50％(w/v)甲酸钾溶液)。
整个山梨醇补料分批阶段持续约72小时，每升初始容积共补料约0.75L山梨醇。在山梨醇补料分批阶段，细胞密度增加到每升湿细胞350-500g的终水平。
SDS-PAGE和Western Blot用于在发酵结束时，使用收集的培养基上清液样本观察hEGF或hSOD3或hLF。
实施例4
通过SDS-PAGE和抗HA抗体Western Blot分析样本
该表达构建体整合到生产菌株基因组中，包含在其C端与HA标签融合的GOI，用于检测和可视化目的，并克隆了启动子FDH的下游。一旦hEGF、hSOD3、hLF或RBD在发酵过程中表达并分泌到培养基中，就可以用抗HA标签抗体在Western blot上检测到hEGF、hSOD3、hLF或RBD。根据标准协议(分子克隆：实验室手册，第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001)，完成了包括分子克隆、转化、PCR选择在内的菌株工程。
通过离心(10000g，5分钟)含有培养物的等分试样的小瓶收集上清液。使用10ul上清液进行SDS-PAGE，然后根据标准制造商协议(BioRad，美国)将其湿转移至PVDF膜。然后，根据标准方案(Invitrogen，美国)，将膜与第一批抗HA抗体(目录号sc-7392，Santa CruzBiotechnology,美国)孵育，然后与抗小鼠山羊抗体(目录号G-21040，Invitrogen,美国)孵育。用PierceTMECL Plus Western Blotting底物试剂盒(目录号32132，ThermoFisherScientific，美国)对膜进行染色。甲醇诱导培养物的上清液用作参考信号(图3-6)。
虽然上文已经描述了本发明的优选实施例，但将认识到并理解，可以对优选实施例进行各种改变，并且所附权利要求旨在涵盖可能属于本发明精神和范围的所有此类修改。
表3：
Figure BDA0003708827040000241
核苷酸序列
SEQ ID NO:1
ATTCTGGCCCTTGCACCTGATCGCGAAGGTGGAAATGGCAGAAGGATCAGCCTGGACGAAGCAACCAGTTCCAACTGCTAAGTAAAGAAGATGCTAGACGAAGGAGACTTCAGAGGTGAAAAGTTTGCAAGAAGAGAGCTGCGGGAAATAAATTTTCAATTTAAGGACTTGAGTGCGTCCATATTCGTGTACGTGTCCAACTGTTTTCCATTACCTAAGAAAAACATAAAGATTAAAAAGATAAACCCAATCGGGAAACTTTAGCGTGCCGTTTCGGATTCCGAAAAACTTTTGGAGCGCCAGATGACTATGGAAAGAGGAGTGTACCAAAATGGCAAGTCGGGGGCTACTCACCGGATAGCCAATACATTCTCTAGGAACCAGGGATGAATCCAGGTTTTTGTTGTCACGGTAGGTCAAGCATTCACTTCTTAGGAATATCTCGTTGAAAGCTACTTGAAATCCCATTGGGTGCGGAACCAGCTTCTAATTAAATAGTTCGATGATGTTCTCTAAGTGGGACTCTACGGCTCAAACTTCTACACAGCATCATCTTAGTAGTCCCTTCCCAAAACACCATTCTAGGTTTCGGAACGTAACGAAACAATGTTCCTCTCTTCACATTGGGCCGTTACTCTAGCCTTCCGAAGAACCAATAAAAGGGACCGGCTGAAACGGGTGTGGAAACTCCTGTCCAGTTTATGGCAAAGGCTACAGAAATCCCAATCTTGTCGGGATGTTGCTCCTCCCAAACGCCATATTGTACTGCAGTTGGTGCGCATTTTAGGGAAAATTTACCCCAGATGTCCTGATTTTCGAGGGCTACCCCCAACTCCCTGTGCTTATACTTAGTCTAATTCTATTCAGTGTGCTGACCTACACGTAATGATGTCGTAACCCAGTTAAATGGCCGAAAAACTATTTAAGTAAGTTTATTTCTCCTCCAGATGAGACTCTCCTTCTTTTCTCCGCTAGTTATCAAACTATAAACCTATTTTACCTCAAATACCTCCAACATCACCCACTTAAACA
SEQ ID NO:2
TTATTTTTTGACCGAATTCTTTTTTTCAGACCATATGACCGGTCCATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTATCTTGATTCTTTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACTTAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACAGATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGGTTGCACATTTGAGCCAGTAGGCTCCTAATAGAGGTTCGATACTTATTTTGATAATACGACATATTGTCTTACCTCTGAATGTGTCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAAAAATATAACACTTCGAGTAAGATACGCCCAATTGAAGGCTACGAGATACCAGACTATCACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAGCAGATCAAATATCCATTTATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGAAAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCTAAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTTCATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAACCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTAAGCGAGTCATCATCACCACCCAACGATGGTGAAAAACTTTAAGCATAGATTGATGGAGGGTGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGGAACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGATTATCGTTGCAATTCATCGTCTTAAACAGTACAAGAAACTTTATTCATGGGTCATTGGACTCTGATGAGGGGCACATTTCCCCAATGATTTTTTGGGAAAGAAAGCCGTAAGAGGACAGTTAAGCGAAAGAGACAAGACAACGAACAGCAAAAGTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGACAGTTGGGAGTTTCCAATTGGTTGGTTTTGAATTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTTCTCCTTGCAAACAATGCAAGTTGATAAGACATCACCTTCCAAGATAGGCTATTTTTGTCGCATAAATTTTTGTCTCGGAGTGAAAACCCCTTTTATGTGAACAGATTACAGAAGCGTCCTACCCTTCACCGGTTGAGATGGGGAGAAAATTAAGCGATGAGGAGACGATTATTGGTATAAAAGAAGCAACCAAAATCCCTTATTGTCCTTTTCTGATCAGCATCAAAGAATATTGTCTTAAAACGGGCTTTTAACTACATTGTTCTTACACATTGCAAACCTCTTCCTTCTATTTCGGATCAACTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTAACGAAGTTTACGACTTACTAAATCCCCACAAACAAATCAACTGAGAAAA
SEQ ID NO:3
ATTCTGGCCCTTGCACCTGATCGCGAAGGTGGAAATGGCAGAAGGATCAGCCTGGACGAAGCAACCAGTTCCAACTGCTAAGTAAAGAAGATGCTAGACGAAGGAGACTTCAGAGGTGAAAAGTTTGCAAGAAGAGAGCTGCGGGAAATAAATTTTCAATTTAAGGACTTGAGTGCGTCCATATTCGTGTACGTGTCCAACTGTTTTCCATTACCTAAGAAAAACATAAAGATTAAAAAGATAAACCCAATCGGGAAACTTTAGCGTGCCGTTTCGGATTCCGAAAAACTTTTGGAGCGCCAGATGACTATGGAAAGAGGAGTGTACCAAAATGGCAAGTCGGGGGCTACTCACCGGATAGCCAATACATTCTCTAGGAACCAGGGATGAATCCAGGTTTTTGTTGTCACGGTAGGTCAAGCATTCACTTCTTAGGAATATCTCGTTGAAAGCTACTTGAAATCCCATTGGGTGCGGAACCAGCTTCTAATTAAATAGTTCGATGATGTTCTCTAAGTGGGACTCTACGGCTCAAACTTCTACACAGCATCATCTTAGTAGTCCCTTCCCAAAACACCATTCTAGGTTTCGGAACGTAACGAAACAATGTTCCTCTCTTCACATTGGGCCGTTACTCTAGCCTTCCGAAGAACCAATAAAAGGGACCGGCTGAAACGGGTGTGGAAACTCCTGTCCAGTTTATGGCAAAGGCTACAGAAATCCCAATCTTGTCGGGATGTTGCTCCTCCCAAACGCCATATTGTACTGCAGTTGGTGCGCATTTTAGGGAAAATTTACCCCAGATGTCCTGATTTTCGAGGGCTACCCCCAACTCCCTGTGCTTATACTTAGTCTAATTCTATTCAGTGTGCTGACCTACACGTAATGATGTCGTAACCCAGTTAAATGGCCGAAAAACTATTTAAGTAAGTTTATTTCTCCTCCAGATGAGACTCTCCTTCTTTTCTCCGCTAGTTATCAAACTATAAACCTATTTTACCTCAAATACCTCCAACATCACCCACTTAAACA
SEQ ID NO:4
ATCTTCATTGATGAAACGTTGTGATCGGTGTGACTTTTATAGTAAAAGCTACAACTGTTTGAAATACCAAGATATCATTGTGAATGGCTCAAAAGGGTAATACATCTGAAAAACCTGAAGTGTGGAAAATTCCGATGGAGCCAACTCATGATAACGCAGAAGTCCCATTTTGCCATCTTCTCTTGGTATGAAACGGTAGAAAATGATCCGAGTATGCCAATTGATACTCTTGATTCATGCCCTATAGTTTGCGTAGGGTTTAATTGATCTCCTGGTCTATCGATCTGGGACGCAATGTAGACCCCATTAGTGGAAACACTGAAAGGGATCCAACACTCTAGGCGGACCCGCTCACAGTCATTTCAGGACAATCACCACAGGAATCAACTACTTCTCCCAGTCTTCCTTGCGTGAAGCTTCAAGCCTACAACATAACACTTCTTACTTAATCTTTGATTCTCGAATTGTTTACCCAATCTTGACAACTTAGCCTAAGCAATACTCTGGGGTTATATATAGCAATTGCTCTTCCTCGCTGTAGCGTTCATTCCATCTTTCTA
SEQ ID NO:5
TGTCATCTGCTGATGCTGTGAGGGAGAAAGAAGTAGGGGTGATACATGGTTTATAGGCAAAGCATGTTTGTTTCAGATCAAAGATTAGCGTTTCAAAGTTGTGGAAAAGTGACCATGCAACAATATGCAACACATTCGGATTATCTGATAAGTTTCAAAGCTACTAAGTAAGCCCGTTTCAAGTCTCCAGACCGACATCTGCCATCCAGTGATTTTCTTAGTCCTGAAAAATACGATGTGTAAACATAAACCACAAAGATCGGCCTCCGAGGTTGAACCCTTACGAAAGAGACATCTGGTAGCGCCAATGCCAAAAAAAAATCACACCAGAAGGACAATTCCCTTCCCCCCCAGCCCATTAAAGCTTACCATTTCCTATTCCAATACGTTCCATAGAGGGCATCGCTCGGCTCATTTTCGCGTGGGTCATACTAGAGCGGCTAGCTAGTCGGCTGTTTGAGCTCTCTAATCGAGGGGTAAGGATGTCTAATATGTCATAATGGCTCACTATATAAAGAACCCGCTTGCTCAACCTTCGACTCCTTTCCCGATCCTTTGCTTGTTGCTTCTTCTTTTATAACAGGAAACAAAGGAATTTATACACTTTAA
SEQ ID NO:6
AAATTAATCCATAAGATAAGGCAAATGTGCTTAAGTAATTGAAAACAGTGTTGTGATTATATAAGCATGGTATTTGAATAGAACTACTGGGGTTAACTTATCTAGTAGGATGGAAGTTGAGGGAGATCAAGATGCTTAAAGAAAAGGATTGGCCAATATGAAAGCCATAATTAGCAATACTTATTTAATCAGATAATTGTGGGGCATTGTGACTTGACTTTTACCAGGACTTCAAACCTCAACCATTTAAACAGTTATAGAAGACGTACCGTCACTTTTGCTTTTAATGTGATCTAAATGTGATCACATGAACTCAAACTAAAATGATATCTTTTACTGGACAAAAATGTTATCCTGCAAACAGAAAGCTTTCTTCTATTCTAAGAAGAACATTTACATTGGTGGGAAACCTGAAAACAGAAAATAAATACTCCCCAGTGACCCTATGAGCAGGATTTTTGCATCCCTATTGTAGGCCTTTCAAACTCACACCTAATATTTCCCGCCACTCACACTATCAATGATCACTTCCCAGTTCTCTTCTTCCCCTATTCGTACCATGCAACCCTTACACGCCTTTTCCATTTCGGTTCGGATGCGACTTCCAGTCTGTGGGGTACGTAGCCTATTCTCTTAGCCGGTATTTAAACATACAAATTCACCCAAATTCTACCTTGATAAGGTAATTGATTAATTTCATAAAT
SEQ ID NO:7
TCCAAACCAAACGGTCTAGCAAAAACGATAACTTTAAAGAACTTTTCAATTGGTTTTGTACACTACCACCGGTTTACTACCTCTGCCTTCGGTTCTTCTCCTCACATTTTTCGCAACTGGGATAGCGTAGCCTAAAGTGTCACATGCTCGCTGCTCACATTCCCTACACAACAGAGATTGTCAGCAGAGGAAATTGAGCTCCACCATTCAACACTTGTGGATTTATGATAGTCTGTGCTATCAGCTCTCTTTTTTTTGTTGCTGTAGAATTTACCGTGCTAGCAACCTTTTAAACTTTGTTTAGCTCTCCTTCCCTCTTCCATTCATCTGTTTCGGTCCGATCCGTCTCTGGTCATCTCCTCCGCATTTTTTTTTTACCGTTAGCGATAGGGGTCAGATCAATTCAATCAGTTTTGGCAAGGGTATTTAAAGGTGGCGAAATCCCCCTCCGTTTGTTGAACACATCCAACTATTCTCAACCCAACCATCTAACTAATCGTA
SEQ ID NO:8
CGCAGCGTTTTCTGACGGTACTAGAGGACTCTTAGGGGAAGGTAGAATCAATAAAGATCATATTAGGTAAGCAAATTTTGGATGGAATAGGAGACTAGGTGTGGATGCGCGATCTCGCCAAATTGCACGACCAGAGTGGATGCCGGATGGTGGTAAACCGTTTCTTCCTTTTTACCACCCAAGTGCGAGTGAAACACCCCATGGCTGCTCTCCGATTGCCCCTCTACAGGCATAAGGGTGTGACTTTGTGGGCTTGAATTTTACACCCCCTCCAACTTTTCTCGCATCAATTGATCCTGTTACCAATATTGCATGCCCGGAGGAGACTTGCCCCCTAATTTCGCGGCGTCGTCCCGGATCGCAGGGTGAGACTGTAGAGACCCCACATAGTGACAATGATTATGTAAGAAGAGGGGGGTGATTCGGCCGGCTATCGAACTCTAACAACTAGGGGGGTGAACAATGCCCAGCAGTCCTCCCCACTCTTTGACAAATCAGTATCACCGATTAACACCCCAAATCTTATTCTCAACGGTCCCTCATCCTTGCACCCCTCTTTGGACAAATGGCAGTTAGCATTGGTGCACTGACTGACTGCCCAACCTTAAACCCAAATTTCTTAGAAGGGGCCCATCTAGTTAGCGAGGGGTGAAAAATTCCTCCATCGGAGATGTATTGACCGTAAGTTGCTGCTTAAAAAAAATCAGTTCAGATAGCGAGACTTTTTTGATTTCGCAACGGGAGTGCCTGTTCCATTCGATTGCAATTCTCACCCCTTCTGCCCAGTCCTGCCAATTGCCCATGAATCTGCTAATTTCGTTGATTCCCACCCCCCTTTCCAACTCCACAAATTGTCCAATCTCGTTTTCCATTTGGGAGAATCTGCATGTCGACTACATAAAGCGACCGGTGTCCGAAAAGATCTGTGTAGTTTTCAACATTTTGTGCTCCCCCCGCTGTTTGAAAACGGGGGTGAGCGCTCTCCGGGGTGCGAATTCGTGCCCAATTCCTTTCACCCTGCCTATTGTAGACGTCAACCCGCATCTGGTGCGAATATAGCGCACCCCCAATGATCACACCAACAATTGGTCCACCCCTCCCCAATCTCTAATATTCACAATTCACCTCACTATAAATACCCCTGTCCTGCTCCCAAATTCTTTTTTCCTTCTTCCATCAGCTACTAGCTTTTATCTTATTTACTTTACGAAA
SEQ ID NO:9
TGTGTCTGTAAATTTAAATCCAAAGAAAAATAAAGGGCACTACATAGAACAACACAATCAACCTACATAGCTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTGTTTTTTCTCAATTTTCTTCATTTTTTGCATTGTTACTACTCTCCCATTAAGGGAAATTCTACCAGGAAAACCGAAGAAGACAAATGCAAAAGGGAAATATGAATACGCATGTATGCGCGCAAAACCGCACTTACAGAGGGCATTAGGACATT
SEQ ID NO:10
AGCAATGATATAAACAACAATTGAGTGACAGGTCTACTTTGTTCTCAAAAGGCCATAACCATCTGTTTGCATCTCTTATCACCACACCATCCTCCTCATCTGGCCTTCAATTGTGGGGAACAACTAGCATCCCAACACCAGACTAACTCCACCCAGATGAAACCAGTTGTCGCTTACCAGTCAATGAATGTTGAGCTAACGTTCCTTGAAACTCGAATGATCCCAGCCTTGCTGCGTATCATCCCTCCGCTATTCCGCCGCTTGCTCCAACCATGTTTCCGCCTTTTTCGAACAAGTTCAAATACCTATCTTTGGCAGGACTTTTCCTCCTGCCTTTTTTAGCCTCAGGTCTCGGTTAGCCTCTAGGCAAATTCTGGTCTTCATACCTATATCAACTTTTCATCAGATAGCCTTTGGGTTCAAAAAAGAACTAAAGCAGGATGCCTGATATATAAATCCCAGATGATCTGCTTTTGAAACTATTTTCAGTATCTTGATTCGTTTACTTACAAACAACTATTGTTGATTTTATCTGGAGAATAATCGAACAAA
SEQ ID NO:11
CATAATGATATTTGAGGGTGTTAGTTACTTCGTCTCCAGAGTAGCTTATAGGGAGAAAAACCGAGACAACGATGGAACTCCCATGTAGATTCCACCGCCCCAATTACTGTTTTGGGCAATCCTGTTGATAAGACGCATTCTAGAGTTGTTTCATGAAAGGGTTACGGGTGTTGATTGGTTTGAGATATGCCAGAGGACAGATCAATCTGTGGTTTGCTAAACTGGAAGTCTGGTAAGGACTCTAGCAAGTCCGTTACTCAAAAAGTCATACCAAGTAAGATTACGTAACACCTGGGCATGACTTTCTAAGTTAGCAAGTCACCAAGAGGGTCCTATTTAACGTTTGGCGGTATCTGAAACACAAGACTTGCCTATCCCATAGTACATCATATTACCTGTCAAGCTATGCTACCCCACAGAAATACCCCAAAAGTTGAAGTGAAAAAATGAAAATTACTGGTAACTTCACCCCATAACAAACTTAATAATTTCTGTAGCCAATGAAAGTAAACCCCATTCAATGTTCCGAGATTTAGTATACTTGCCCCTATAAGAAACGAAGGATTTCAGCTTCCTTACCCCATGAACAGAAATCTTCCATTTACCCCCCACTGGAGAGATCCGCCCAAACGAACAGATAATAGAAAAAAGAAATTCGGACAAATAGAACACTTTCTCAGCCAATTAAAGTCATTCCATGCACTCCCTTTAGCTGCCGTTCCATCCCTTTGTTGAGCAACACCATCGTTAGCCAGTACGAAAGAGGAAACTTAACCGATACCTTGGAGAAATCTAAGGCGCGAATGAGTTTAGCCTAGATATCCTTAGTGAAGGGTTGTTCCGATACTTCTCCACATTCAGTCATAGATGGGCAGCTTTGTTATCATGAAGAGACGGAAACGGGCATTAAGGGTTAACCGCCAAATTATATAAAGACAACATGTCCCCAGTTTAAAGTTTTTCTTTCCTATTCTTGTATCCTGAGTGACCGTTGTGTTTAATATAACAAGTTCGTTTTAACTTAAGACCAAAACCAGTTACAACAAATTATAACCCCTCTAAACACTAAAGTTCACTCTTATCAAACTATCAAACATCAAAA
SEQ ID NO:12
TGAGATAACAGAGTTGGGTAACTAGAGAGAATAATAGACGTATGCATGATTACTACACAACGGATGTCGCACTCTTTCCTTAGTTAAAACTATCATCCAATCACAAGATGCGGGCTGGAAAGACTTGCTCCCGAAGGATAATCTTCTGCTTCTATCTCCCTTCCTCATATGGTTTCGCAGGGCTCATGCCCCTTCTTCCTTCGAACTGCCCGATGAGGAAGTCCTTAGCCTATCAAAGAATTCGGGACCATCATCGATTTTTAGAGCCTTACCTGATCGCAATCAGGATTTCACTACTCATATAAATACATCGCTCAAAGCTCCAACTTTGCTTGTTCATACAATTCTTGATATTCAC
SEQ ID NO:13
ATTCTGGCCCTTGCACCTGATCGCGAAGGTGGAAATGGCAGAAGGATCAGCCTGGACGAAGCAACCAGTTCCAACTGCTAAGTAAAGAAGATGCTAGACGAAGGAGACTTCAGAGGTGAAAAGTTTGCAAGAAGAGAGCTGCGGGAAATAAATTTTCAATTTAAGGACTTGAGTGCGTCCATATTCGTGTACGTGTCCAACTGTTTTCCATTACCTAAGAAAAACATAAAGATTAAAAAGATAAACCCAATCGGGAAACTTTAGCGTGCCGTTTCGGATTCCGAAAAACTTTTGGAGCGCCAGATGACTATGGAAAGAGGAGTGTACCAAAATGGCAAGTCGGGGGCTACTCACCGGATAGCCAATACATTCTCTAGGAACCAGGGATGAATCCAGGTTTTTGTTGTCACGGTAGGTCAAGCATTCACTTCTTAGGAATATCTCGTTGAAAGCTACTTGAAATCCCATTGGGTGCGGAACCAGCTTCTAATTAAATAGTTCGATGATGTTCTCTAAGTGGGACTCTACGGCTCAAACTTCTACACAGCATCATCTTAGTAGTCCCTTCCCAAAACACCATTCTAGGTTTCGGAACGTAACGAAACAATGTTCCTCTCTTCACATTGGGCCGTTACTCTAGCCTTCCGAAGAACCAATAAAAGGGACCGGCTGAAACGGGTGTGGAAACTCCTGTCCAGTTTATGGCAAAGGCTACAGAAATCCCAATCTTGTCGGGATGTTGCTCCTCCCAAACGCCATATTGTACTGCAGTTGGTGCGCATTTTAGGGAAAATTTACCCCAGATGTCCTGATTTTCGAGGGCTACCCCCAACTCCCTGTGCTTATACTTAGTCTAATTCTATTCAGTGTGCTGACCTACACGTAATGATGTCGTAACCCAGTTAAATGGCCGAAAAACTATTTAAGTAAGTTTATTTCTCCTCCAGATGAGACTCTCCTTCTTTTCTCCGCTAGTTATCAAACTATAAACCTATTTTACCTCAAATACCTCCAACATCACCCACTTAAACACGGCCGAATTCATAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTTAATTAACTGGGCCGCGAATTAATTCGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGACGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGGTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGAGTATCTATGATTGGAAGTATGGGAATGGTGATACCCGCATTCTTCAGTGTCTTGAGGTCTCCTATCAGATTATGCCCAACTAAAGCAACCGGAGGAGGAGATTTCATGGTAAATTTCTCTGACTTTTGGTCATCAGTAGACTCGAACTGTGAGACTATCTCGGTTATGACAGCAGAAATGTCCTTCTTGGAGACAGTAAATGAAGTCCCACCAATAAAGAAATCCTTGTTATCAGGAACAAACTTCTTGTTTCGAACTTTTTCGGTGCCTTGAACTATAAAATGTAGAGTGGATATGTCGGGTAGGAATGGAGCGGGCAAATGCTTACCTTCTGGACCTTCAAGAGGTATGTAGGGTTTGTAGATACTGATGCCAACTTCAGTGACAACGTTGCTATTTCGTTCAAACCATTCCGAATCCAGAGAAATCAAAGTTGTTTGTCTACTATTGATCCAAGCCAGTGCGGTCTTGAAACTGACAATAGTGTGCTCGTGTTTTGAGGTCATCTTTGTATGAATAAATCTAGTCTTTGATCTAAATAATCTTGACGAGCCAAGGCGATAAATACCCAAATCTAAAACTCTTTTAAAACGTTAAAAGGACAAGTATGTCTGCCTGTATTAAACCCCAAATCAGCTCGTAGTCTGATCCTCATCAACTTGAGGGGCACTATCTTGTTTTAGAGAAATTTGCGGAGATGCGATATCGAGAAAAAGGTACGCTGATTTTAAACGTGAAATTTATCTCAAGATCTCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
SEQ ID NO:14
AATAGTGACTCTGAATGCCCTTTGTCCCATGACGGATACTGTCTTCACGACGGCGTTTGTATGTATATCGAGGCACTAGATAAGTATGCATGTAACTGCGTAGTAGGATACATTGGAGAACGTTGCCAATACCGTGATTTGAAGTGGTGGGAGTTGCGT
SEQ ID NO:15
TGGACGGGCGAGGACTCGGCGGAGCCCAACTCTGACTCGGCGGAGTGGATCCGAGACATGTACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGGTCATGCAGCGGCGGGACGACGACGGCGCGCTCCACGCCGCCTGCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGGGTGACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTTCTTCGCCCTGGAGGGCTTCCCGACCGAGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAGTTCGGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTGCCGCACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGGAGGTACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCGGGCCCGCACTCCATCGTGGGCCGGGCCGTGGTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGTAACCAGGCCAGCGTGGAGAACGGGAACGCGGGCCGGCGGCTGGCCTGCTGCGTGGTGGGCGTGTGCGGGCCCGGGCTCTGGGAGCGCCAGGCGCGGGAGCACTCAGAGCGCAAGAAGCGGCGGCGCGAGAGCGAGTGCAAGGCCGCC
SEQ ID NO:16
GGCCGTAGGAGAAGGAGTGTTCAGTGGTGCGCCGTATCCCAACCCGAGGCCACAAAATGCTTCCAATGGCAAAGGAATATGAGAAAAGTGCGTGGCCCTCCTGTCAGCTGCATAAAGAGAGACTCCCCCATCCAGTGTATCCAGGCCATTGCGGAAAACAGGGCCGATGCTGTGACCCTTGATGGTGGTTTCATATACGAGGCAGGCCTGGCCCCCTACAAACTGCGACCTGTAGCGGCGGAAGTCTACGGGACCGAAAGACAGCCACGAACTCACTATTATGCCGTGGCTGTGGTGAAGAAGGGCGGCAGCTTTCAGCTGAACGAACTGCAAGGTCTGAAGTCCTGCCACACAGGCCTTCGCAGGACCGCTGGATGGAATGTCCCTATAGGGACACTTCGTCCATTCTTGAATTGGACGGGTCCACCTGAGCCCATTGAGGCAGCTGTGGCCAGGTTCTTCTCAGCCAGCTGTGTTCCCGGTGCAGATAAAGGACAGTTCCCCAACCTGTGTCGCCTGTGTGCGGGGACAGGGGAAAACAAATGTGCCTTCTCCTCCCAGGAACCGTACTTCAGCTACTCTGGTGCCTTCAAGTGTCTGAGAGACGGGGCTGGAGACGTGGCTTTTATCAGAGAGAGCACAGTGTTTGAGGACCTGTCAGACGAGGCTGAAAGGGACGAGTATGAGTTACTCTGCCCAGACAACACTCGGAAGCCAGTGGACAAGTTCAAAGACTGCCATCTGGCCCGGGTCCCTTCTCATGCCGTTGTGGCACGAAGTGTGAATGGCAAGGAGGATGCCATCTGGAATCTTCTCCGCCAGGCACAGGAAAAGTTTGGAAAGGACAAGTCACCGAAATTCCAGCTCTTTGGCTCCCCTAGTGGGCAGAAAGATCTGCTGTTCAAGGACTCTGCCATTGGGTTTTCGAGGGTGCCCCCGAGGATAGATTCTGGGCTGTACCTTGGCTCCGGCTACTTCACTGCCATCCAGAACTTGAGGAAAAGTGAGGAGGAAGTGGCTGCCCGGCGTGCGCGGGTCGTGTGGTGTGCGGTGGGCGAGCAGGAGCTGCGCAAGTGTAACCAGTGGAGTGGCTTGAGCGAAGGCAGCGTGACCTGCTCCTCGGCCTCCACCACAGAGGACTGCATCGCCCTGGTGCTGAAAGGAGAAGCTGATGCCATGAGTTTGGATGGAGGATATGTGTACACTGCAGGCAAATGTGGTTTGGTGCCTGTCCTGGCAGAGAACTACAAATCCCAACAAAGCAGTGACCCTGATCCTAACTGTGTGGATAGACCTGTGGAAGGATATCTTGCTGTGGCGGTGGTTAGGAGATCAGACACTAGCCTTACCTGGAACTCTGTGAAAGGCAAGAAGTCCTGCCACACCGCCGTGGACAGGACTGCAGGCTGGAATATCCCCATGGGCCTGCTCTTCAACCAGACGGGCTCCTGCAAATTTGATGAATATTTCAGTCAAAGCTGTGCCCCTGGGTCTGACCCGAGATCTAATCTCTGTGCTCTGTGTATTGGCGACGAGCAGGGTGAGAATAAGTGCGTGCCCAACAGCAACGAGAGATACTACGGCTACACTGGGGCTTTCCGGTGCCTGGCTGAGAATGCTGGAGACGTTGCATTTGTGAAAGATGTCACTGTCTTGCAGAACACTGATGGAAATAACAATGAGGCATGGGCTAAGGATTTGAAGCTGGCAGACTTTGCGCTGCTGTGCCTCGATGGCAAACGGAAGCCTGTGACTGAGGCTAGAAGCTGCCATCTTGCCATGGCCCCGAATCATGCCGTGGTGTCTCGGATGGATAAGGTGGAACGCCTGAAACAGGTGTTGCTCCACCAACAGGCTAAATTTGGGAGAAATGGATCTGACTGCCCGGACAAGTTTTGCTTATTCCAGTCTGAAACCAAAAACCTTCTGTTCAATGACAACACTGAGTGTCTGGCCAGACTCCATGGCAAAACAACATATGAAAAATATTTGGGACCACAGTATGTCGCAGGCATTACTAATCTGAAAAAGTGCTCAACCTCCCCCCTCCTGGAAGCCTGTGAGTTCCTCAGGAAG
SEQ ID NO:20
GTACAGCCTACAGAAAGTATTGTCCGTTTCCCTAATATCACCAATTTATGCCCTTTTGGTGAAGTCTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCCGTATATGCCTGGAACCGTAAGAGAATCAGTAATTGCGTGGCCGATTATTCTGTGTTGTATAATAGTGCCTCCTTCTCCACCTTCAAGTGTTATGGCGTGTCCCCTACTAAGCTGAATGACTTATGTTTTACCAATGTTTATGCAGACTCATTCGTCATCCGTGGAGATGAAGTCCGTCAAATTGCCCCCGGACAGACAGGAAAAATCGCCGACTATAATTATAAACTGCCTGATGACTTCACCGGATGTGTCATCGCATGGAATAGTAATAATTTAGATTCAAAAGTAGGAGGAAATTATAATTATCTTTACCGTCTGTTTAGAAAATCAAACTTGAAACCATTCGAGAGAGATATTTCCACAGAGATCTACCAGGCAGGATCCACCCCTTGCAATGGAGTCGAAGGATTCAATTGCTATTTTCCTCTGCAGTCTTATGGATTTCAGCCTACAAATGGAGTCGGATACCAACCTTATAGAGTCGTGGTCTTAAGTTTCGAGTTGCTTCACGCCGTCGCCACAGTGTGCGGACCTAAAAAGTCAACAAATTTAGTCAAGAAT
氨基酸序列
SEQ ID NO:17
NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR
SEQ ID NO:18WTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYAKVTEIWQEVMQRRDDDGALHAACQVQPSATLDAAQPRVTGVVLFRQLAPRAKLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHQFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGSLWRYRAGLAASLAGPHSIVGRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENGNAGRRLACCVVGVCGPGLWERQAREHSERKKRRRESECKAA
SEQ ID NO:19
GRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAIAENRADAVTLDGGFIYEAGLAPYKLRPVAAEVYGTERQPRTHYYAVAVVKKGGSFQLNELQGLKSCHTGLRRTAGWNVPIGTLRPFLNWTGPPEPIEAAVARFFSASCVPGADKGQFPNLCRLCAGTGENKCAFSSQEPYFSYSGAFKCLRDGAGDVAFIRESTVFEDLSDEAERDEYELLCPDNTRKPVDKFKDCHLARVPSHAVVARSVNGKEDAIWNLLRQAQEKFGKDKSPKFQLFGSPSGQKDLLFKDSAIGFSRVPPRIDSGLYLGSGYFTAIQNLRKSEEEVAARRARVVWCAVGEQELRKCNQWSGLSEGSVTCSSASTTEDCIALVLKGEADAMSLDGGYVYTAGKCGLVPVLAENYKSQQSSDPDPNCVDRPVEGYLAVAVVRRSDTSLTWNSVKGKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLLFNQTGSCKFDEYFSQSCAPGSDPRSNLCALCIGDEQGENKCVPNSNERYYGYTGAFRCLAENAGDVAFVKDVTVLQNTDGNNNEAWAKDLKLADFALLCLDGKRKPVTEARSCHLAMAPNHAVVSRMDKVERLKQVLLHQQAKFGRNGSDCPDKFCLFQSETKNLLFNDNTECLARLHGKTTYEKYLGPQYVAGITNLKKCSTSPLLEACEFLRK
SEQ ID NO:21
VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAVATVCGPKKSTNLVKN
SEQUENCE LISTING
<110> Bioboost Synbio Consulting Inc.
<120> Method for methanol free culturing of methylotrophic yeast for
the biosynthesis of added value products
<130> 88366-1US
<150> US 63/214376
<151> 2021-06-24
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1032
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 1
attctggccc ttgcacctga tcgcgaaggt ggaaatggca gaaggatcag cctggacgaa 60
gcaaccagtt ccaactgcta agtaaagaag atgctagacg aaggagactt cagaggtgaa 120
aagtttgcaa gaagagagct gcgggaaata aattttcaat ttaaggactt gagtgcgtcc 180
atattcgtgt acgtgtccaa ctgttttcca ttacctaaga aaaacataaa gattaaaaag 240
ataaacccaa tcgggaaact ttagcgtgcc gtttcggatt ccgaaaaact tttggagcgc 300
cagatgacta tggaaagagg agtgtaccaa aatggcaagt cgggggctac tcaccggata 360
gccaatacat tctctaggaa ccagggatga atccaggttt ttgttgtcac ggtaggtcaa 420
gcattcactt cttaggaata tctcgttgaa agctacttga aatcccattg ggtgcggaac 480
cagcttctaa ttaaatagtt cgatgatgtt ctctaagtgg gactctacgg ctcaaacttc 540
tacacagcat catcttagta gtcccttccc aaaacaccat tctaggtttc ggaacgtaac 600
gaaacaatgt tcctctcttc acattgggcc gttactctag ccttccgaag aaccaataaa 660
agggaccggc tgaaacgggt gtggaaactc ctgtccagtt tatggcaaag gctacagaaa 720
tcccaatctt gtcgggatgt tgctcctccc aaacgccata ttgtactgca gttggtgcgc 780
attttaggga aaatttaccc cagatgtcct gattttcgag ggctaccccc aactccctgt 840
gcttatactt agtctaattc tattcagtgt gctgacctac acgtaatgat gtcgtaaccc 900
agttaaatgg ccgaaaaact atttaagtaa gtttatttct cctccagatg agactctcct 960
tcttttctcc gctagttatc aaactataaa cctattttac ctcaaatacc tccaacatca 1020
cccacttaaa ca 1032
<210> 2
<211> 1542
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 2
ttattttttg accgaattct ttttttcaga ccatatgacc ggtccatctt ctacgggggg 60
attatctatg ctttgacctc tatcttgatt cttttatgat tcaaatcact tttacgttat 120
ttattactta ctggttattt acttagcgcc ttttctgaaa aacatttact aaaaatcata 180
catcggcact ctcaaacacg acagattgtg atcaagaagc agagacaatc accactaagg 240
ttgcacattt gagccagtag gctcctaata gaggttcgat acttattttg ataatacgac 300
atattgtctt acctctgaat gtgtcaatac tctctcgttc ttcgtctcgt cagctaaaaa 360
tataacactt cgagtaagat acgcccaatt gaaggctacg agataccaga ctatcactag 420
tagaactttg acatctgcta aagcagatca aatatccatt tatccagaat caattacctt 480
cctttagctt gtcgaaggca tgaaaaagct acatgaaaat ccccatcctt gaagttttgt 540
cagcttaaag gactccattt cctaaaattt caagcagtcc tctcaactaa atttttttcc 600
attcctctgc acccagccct cttcatcaac cgtccagcct tctcaaaagt ccaatgtaag 660
tagcctgcaa attcaggtta caacccctca attttccatc caagggcgat ccttacaaag 720
ttaatatcga acagcagaga ctaagcgagt catcatcacc acccaacgat ggtgaaaaac 780
tttaagcata gattgatgga gggtgtatgg cacttggcgg ctgcattaga gtttgaaact 840
atggggtaat acatcacatc cggaactgat ccgactccga gatcatatgc aaagcacgtg 900
atgtaccccg taaactgctc ggattatcgt tgcaattcat cgtcttaaac agtacaagaa 960
actttattca tgggtcattg gactctgatg aggggcacat ttccccaatg attttttggg 1020
aaagaaagcc gtaagaggac agttaagcga aagagacaag acaacgaaca gcaaaagtga 1080
cagctgtcag ctacctagtg gacagttggg agtttccaat tggttggttt tgaattttta 1140
cccatgttga gttgtccttg cttctccttg caaacaatgc aagttgataa gacatcacct 1200
tccaagatag gctatttttg tcgcataaat ttttgtctcg gagtgaaaac cccttttatg 1260
tgaacagatt acagaagcgt cctacccttc accggttgag atggggagaa aattaagcga 1320
tgaggagacg attattggta taaaagaagc aaccaaaatc ccttattgtc cttttctgat 1380
cagcatcaaa gaatattgtc ttaaaacggg cttttaacta cattgttctt acacattgca 1440
aacctcttcc ttctatttcg gatcaactgt attgactaca ttgatctttt ttaacgaagt 1500
ttacgactta ctaaatcccc acaaacaaat caactgagaa aa 1542
<210> 3
<211> 1032
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 3
attctggccc ttgcacctga tcgcgaaggt ggaaatggca gaaggatcag cctggacgaa 60
gcaaccagtt ccaactgcta agtaaagaag atgctagacg aaggagactt cagaggtgaa 120
aagtttgcaa gaagagagct gcgggaaata aattttcaat ttaaggactt gagtgcgtcc 180
atattcgtgt acgtgtccaa ctgttttcca ttacctaaga aaaacataaa gattaaaaag 240
ataaacccaa tcgggaaact ttagcgtgcc gtttcggatt ccgaaaaact tttggagcgc 300
cagatgacta tggaaagagg agtgtaccaa aatggcaagt cgggggctac tcaccggata 360
gccaatacat tctctaggaa ccagggatga atccaggttt ttgttgtcac ggtaggtcaa 420
gcattcactt cttaggaata tctcgttgaa agctacttga aatcccattg ggtgcggaac 480
cagcttctaa ttaaatagtt cgatgatgtt ctctaagtgg gactctacgg ctcaaacttc 540
tacacagcat catcttagta gtcccttccc aaaacaccat tctaggtttc ggaacgtaac 600
gaaacaatgt tcctctcttc acattgggcc gttactctag ccttccgaag aaccaataaa 660
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tcccaatctt gtcgggatgt tgctcctccc aaacgccata ttgtactgca gttggtgcgc 780
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cccacttaaa ca 1032
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<211> 560
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 4
atcttcattg atgaaacgtt gtgatcggtg tgacttttat agtaaaagct acaactgttt 60
gaaataccaa gatatcattg tgaatggctc aaaagggtaa tacatctgaa aaacctgaag 120
tgtggaaaat tccgatggag ccaactcatg ataacgcaga agtcccattt tgccatcttc 180
tcttggtatg aaacggtaga aaatgatccg agtatgccaa ttgatactct tgattcatgc 240
cctatagttt gcgtagggtt taattgatct cctggtctat cgatctggga cgcaatgtag 300
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gcgttcattc catctttcta 560
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<212> DNA
<213> Pichia pastoris
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tgtcatctgc tgatgctgtg agggagaaag aagtaggggt gatacatggt ttataggcaa 60
agcatgtttg tttcagatca aagattagcg tttcaaagtt gtggaaaagt gaccatgcaa 120
caatatgcaa cacattcgga ttatctgata agtttcaaag ctactaagta agcccgtttc 180
aagtctccag accgacatct gccatccagt gattttctta gtcctgaaaa atacgatgtg 240
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acactttaa 609
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<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 6
aaattaatcc ataagataag gcaaatgtgc ttaagtaatt gaaaacagtg ttgtgattat 60
ataagcatgg tatttgaata gaactactgg ggttaactta tctagtagga tggaagttga 120
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<212> DNA
<213> Pichia pastoris
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<212> DNA
<213> Pichia pastoris
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cgcagcgttt tctgacggta ctagaggact cttaggggaa ggtagaatca ataaagatca 60
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<212> DNA
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<212> DNA
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agcaatgata taaacaacaa ttgagtgaca ggtctacttt gttctcaaaa ggccataacc 60
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<210> 11
<211> 1102
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 11
cataatgata tttgagggtg ttagttactt cgtctccaga gtagcttata gggagaaaaa 60
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tctagcaagt ccgttactca aaaagtcata ccaagtaaga ttacgtaaca cctgggcatg 300
actttctaag ttagcaagtc accaagaggg tcctatttaa cgtttggcgg tatctgaaac 360
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aataccccaa aagttgaagt gaaaaaatga aaattactgg taacttcacc ccataacaaa 480
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ccatcccttt gttgagcaac accatcgtta gccagtacga aagaggaaac ttaaccgata 780
ccttggagaa atctaaggcg cgaatgagtt tagcctagat atccttagtg aagggttgtt 840
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atcaaactat caaacatcaa aa 1102
<210> 12
<211> 358
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 12
tgagataaca gagttgggta actagagaga ataatagacg tatgcatgat tactacacaa 60
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<210> 13
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Plasmid promoter sequence
<400> 13
attctggccc ttgcacctga tcgcgaaggt ggaaatggca gaaggatcag cctggacgaa 60
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tttgtcattt tgtttcttct cgtacgagct tgctcctgat cagcctatct cgcagctgat 1560
gaatatcttg tggtaggggt ttgggaaaat cattcgagtt tgatgttttt cttggtattt 1620
cccactcctc ttcagagtac agaagattaa gtgagacgtt cgtttgtgca agcttatcga 1680
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cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg atattcttct 3000
aatacctgga atgctgtttt cccggggatc gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga 3060
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attggaagta tgggaatggt gatacccgca ttcttcagtg tcttgaggtc tcctatcaga 3780
ttatgcccaa ctaaagcaac cggaggagga gatttcatgg taaatttctc tgacttttgg 3840
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gagacagtaa atgaagtccc accaataaag aaatccttgt tatcaggaac aaacttcttg 3960
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ggagcgggca aatgcttacc ttctggacct tcaagaggta tgtagggttt gtagatactg 4080
atgccaactt cagtgacaac gttgctattt cgttcaaacc attccgaatc cagagaaatc 4140
aaagttgttt gtctactatt gatccaagcc agtgcggtct tgaaactgac aatagtgtgc 4200
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gagccaaggc gataaatacc caaatctaaa actcttttaa aacgttaaaa ggacaagtat 4320
gtctgcctgt attaaacccc aaatcagctc gtagtctgat cctcatcaac ttgaggggca 4380
ctatcttgtt ttagagaaat ttgcggagat gcgatatcga gaaaaaggta cgctgatttt 4440
aaacgtgaaa tttatctcaa gatctctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 4500
tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 4560
gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc 4620
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gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 4860
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gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 4980
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 5040
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 5100
cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 5160
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 5220
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 5280
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 5340
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 5400
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 5460
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 5520
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 5580
agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 5640
atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 5700
cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 5760
actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 5820
aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 5880
cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 5940
ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 6000
cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 6060
ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 6120
cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 6180
ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 6240
tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 6300
ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 6360
aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 6420
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 6480
gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 6540
ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 6600
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 6660
atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 6688
<210> 14
<211> 159
<212> DNA
<213> human
<400> 14
aatagtgact ctgaatgccc tttgtcccat gacggatact gtcttcacga cggcgtttgt 60
atgtatatcg aggcactaga taagtatgca tgtaactgcg tagtaggata cattggagaa 120
cgttgccaat accgtgattt gaagtggtgg gagttgcgt 159
<210> 15
<211> 666
<212> DNA
<213> human
<400> 15
tggacgggcg aggactcggc ggagcccaac tctgactcgg cggagtggat ccgagacatg 60
tacgccaagg tcacggagat ctggcaggag gtcatgcagc ggcgggacga cgacggcgcg 120
ctccacgccg cctgccaggt gcagccgtcg gccacgctgg acgccgcgca gccccgggtg 180
accggcgtcg tcctcttccg gcagcttgcg ccccgcgcca agctcgacgc cttcttcgcc 240
ctggagggct tcccgaccga gccgaacagc tccagccgcg ccatccacgt gcaccagttc 300
ggggacctga gccagggctg cgagtccacc gggccccact acaacccgct ggccgtgccg 360
cacccgcagc acccgggcga cttcggcaac ttcgcggtcc gcgacggcag cctctggagg 420
taccgcgccg gcctggccgc ctcgctcgcg ggcccgcact ccatcgtggg ccgggccgtg 480
gtcgtccacg ctggcgagga cgacctgggc cgcggcggta accaggccag cgtggagaac 540
gggaacgcgg gccggcggct ggcctgctgc gtggtgggcg tgtgcgggcc cgggctctgg 600
gagcgccagg cgcgggagca ctcagagcgc aagaagcggc ggcgcgagag cgagtgcaag 660
gccgcc 666
<210> 16
<211> 2076
<212> DNA
<213> human
<400> 16
ggccgtagga gaaggagtgt tcagtggtgc gccgtatccc aacccgaggc cacaaaatgc 60
ttccaatggc aaaggaatat gagaaaagtg cgtggccctc ctgtcagctg cataaagaga 120
gactccccca tccagtgtat ccaggccatt gcggaaaaca gggccgatgc tgtgaccctt 180
gatggtggtt tcatatacga ggcaggcctg gccccctaca aactgcgacc tgtagcggcg 240
gaagtctacg ggaccgaaag acagccacga actcactatt atgccgtggc tgtggtgaag 300
aagggcggca gctttcagct gaacgaactg caaggtctga agtcctgcca cacaggcctt 360
cgcaggaccg ctggatggaa tgtccctata gggacacttc gtccattctt gaattggacg 420
ggtccacctg agcccattga ggcagctgtg gccaggttct tctcagccag ctgtgttccc 480
ggtgcagata aaggacagtt ccccaacctg tgtcgcctgt gtgcggggac aggggaaaac 540
aaatgtgcct tctcctccca ggaaccgtac ttcagctact ctggtgcctt caagtgtctg 600
agagacgggg ctggagacgt ggcttttatc agagagagca cagtgtttga ggacctgtca 660
gacgaggctg aaagggacga gtatgagtta ctctgcccag acaacactcg gaagccagtg 720
gacaagttca aagactgcca tctggcccgg gtcccttctc atgccgttgt ggcacgaagt 780
gtgaatggca aggaggatgc catctggaat cttctccgcc aggcacagga aaagtttgga 840
aaggacaagt caccgaaatt ccagctcttt ggctccccta gtgggcagaa agatctgctg 900
ttcaaggact ctgccattgg gttttcgagg gtgcccccga ggatagattc tgggctgtac 960
cttggctccg gctacttcac tgccatccag aacttgagga aaagtgagga ggaagtggct 1020
gcccggcgtg cgcgggtcgt gtggtgtgcg gtgggcgagc aggagctgcg caagtgtaac 1080
cagtggagtg gcttgagcga aggcagcgtg acctgctcct cggcctccac cacagaggac 1140
tgcatcgccc tggtgctgaa aggagaagct gatgccatga gtttggatgg aggatatgtg 1200
tacactgcag gcaaatgtgg tttggtgcct gtcctggcag agaactacaa atcccaacaa 1260
agcagtgacc ctgatcctaa ctgtgtggat agacctgtgg aaggatatct tgctgtggcg 1320
gtggttagga gatcagacac tagccttacc tggaactctg tgaaaggcaa gaagtcctgc 1380
cacaccgccg tggacaggac tgcaggctgg aatatcccca tgggcctgct cttcaaccag 1440
acgggctcct gcaaatttga tgaatatttc agtcaaagct gtgcccctgg gtctgacccg 1500
agatctaatc tctgtgctct gtgtattggc gacgagcagg gtgagaataa gtgcgtgccc 1560
aacagcaacg agagatacta cggctacact ggggctttcc ggtgcctggc tgagaatgct 1620
ggagacgttg catttgtgaa agatgtcact gtcttgcaga acactgatgg aaataacaat 1680
gaggcatggg ctaaggattt gaagctggca gactttgcgc tgctgtgcct cgatggcaaa 1740
cggaagcctg tgactgaggc tagaagctgc catcttgcca tggccccgaa tcatgccgtg 1800
gtgtctcgga tggataaggt ggaacgcctg aaacaggtgt tgctccacca acaggctaaa 1860
tttgggagaa atggatctga ctgcccggac aagttttgct tattccagtc tgaaaccaaa 1920
aaccttctgt tcaatgacaa cactgagtgt ctggccagac tccatggcaa aacaacatat 1980
gaaaaatatt tgggaccaca gtatgtcgca ggcattacta atctgaaaaa gtgctcaacc 2040
tcccccctcc tggaagcctg tgagttcctc aggaag 2076
<210> 17
<211> 53
<212> PRT
<213> human
<400> 17
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 18
<211> 222
<212> PRT
<213> human
<400> 18
Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala Glu Trp
1 5 10 15
Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu Val Met
20 25 30
Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Ala Leu His Ala Ala Cys Gln Val Gln
35 40 45
Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly Val Val
50 55 60
Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe Phe Ala
65 70 75 80
Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala Ile His
85 90 95
Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr Gly Pro
100 105 110
His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln His Pro Gly Asp Phe
115 120 125
Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg Ala Gly
130 135 140
Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile Val Gly Arg Ala Val
145 150 155 160
Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Gln Ala
165 170 175
Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys Val Val
180 185 190
Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu His Ser
195 200 205
Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Glu Cys Lys Ala Ala
210 215 220
<210> 19
<211> 692
<212> PRT
<213> human
<400> 19
Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser Gln Pro Glu
1 5 10 15
Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly
20 25 30
Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln Cys Ile Gln
35 40 45
Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Gly Gly Phe
50 55 60
Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro Val Ala Ala
65 70 75 80
Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr Tyr Ala Val
85 90 95
Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu Leu Gln Gly
100 105 110
Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly Trp Asn Val
115 120 125
Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser Cys Val Pro
145 150 155 160
Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu Cys Ala Gly
165 170 175
Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro Tyr Phe Ser
180 185 190
Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala
195 200 205
Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp Glu Ala Glu
210 215 220
Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val
225 230 235 240
Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser His Ala Val
245 250 255
Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp Asn Leu Leu
260 265 270
Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro Lys Phe Gln
275 280 285
Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser
290 295 300
Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser Gly Leu Tyr
305 310 315 320
Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg Lys Ser Glu
325 330 335
Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys Ala Val Gly
340 345 350
Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu Ser Glu Gly
355 360 365
Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Leu
370 375 380
Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Val
385 390 395 400
Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr
405 410 415
Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val Asp Arg Pro
420 425 430
Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser Asp Thr Ser
435 440 445
Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val
450 455 460
Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Phe Asn Gln
465 470 475 480
Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser Cys Ala Pro
485 490 495
Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile Gly Asp Glu
500 505 510
Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg Tyr Tyr Gly
515 520 525
Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala
530 535 540
Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly Asn Asn Asn
545 550 555 560
Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala Leu Leu Cys
565 570 575
Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser Cys His Leu
580 585 590
Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp Lys Val Glu
595 600 605
Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe Gly Arg Asn
610 615 620
Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser Glu Thr Lys
625 630 635 640
Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg Leu His Gly
645 650 655
Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val Ala Gly Ile
660 665 670
Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu Ala Cys Glu
675 680 685
Phe Leu Arg Lys
690
<210> 20
<211> 651
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 20
gtacagccta cagaaagtat tgtccgtttc cctaatatca ccaatttatg cccttttggt 60
gaagtcttca atgccaccag attcgcctcc gtatatgcct ggaaccgtaa gagaatcagt 120
aattgcgtgg ccgattattc tgtgttgtat aatagtgcct ccttctccac cttcaagtgt 180
tatggcgtgt cccctactaa gctgaatgac ttatgtttta ccaatgttta tgcagactca 240
ttcgtcatcc gtggagatga agtccgtcaa attgcccccg gacagacagg aaaaatcgcc 300
gactataatt ataaactgcc tgatgacttc accggatgtg tcatcgcatg gaatagtaat 360
aatttagatt caaaagtagg aggaaattat aattatcttt accgtctgtt tagaaaatca 420
aacttgaaac cattcgagag agatatttcc acagagatct accaggcagg atccacccct 480
tgcaatggag tcgaaggatt caattgctat tttcctctgc agtcttatgg atttcagcct 540
acaaatggag tcggatacca accttataga gtcgtggtct taagtttcga gttgcttcac 600
gccgtcgcca cagtgtgcgg acctaaaaag tcaacaaatt tagtcaagaa t 651
<210> 21
<211> 217
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 21
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
1 5 10 15
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
20 25 30
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
35 40 45
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
50 55 60
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
65 70 75 80
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
85 90 95
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
100 105 110
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
115 120 125
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
130 135 140
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
145 150 155 160
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
165 170 175
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
180 185 190
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Val Ala Thr Val Cys Gly Pro
195 200 205
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn
210 215

Claims (10)

1.一种生产转基因细胞产物的方法，包括：
(a)提供一种表达系统，其包含：包含表达载体的甲基营养型酵母细胞，所述表达载体包含诱导型MUT(甲醇利用)途径启动子，该诱导型MUT(甲醇利用)途径启动子可操作地链接到核酸分子，该核酸分子编码用于产生感兴趣的转基因细胞产物的感兴趣的重组蛋白；
(b)在合适的碳源上生长甲基营养型酵母细胞，以支持甲基营养型酵母细胞的活跃生长和抑制诱导型MUT途径启动子，从而提供甲基营养型酵母细胞培养物；
(c)在甲基营养型酵母细胞培养物达到合适的甲基营养型酵母细胞培养密度后，在非抑制性碳源上生长甲基营养型酵母细胞培养物，所述非抑制性碳源选自：山梨醇、甘露醇、海藻糖和丙氨酸，从而解除对所述诱导型MUT途径启动子的抑制；
(d)添加一定量的诱导剂化合物，该诱导剂化合物选自以下组，组中包括：S-甲酰基谷胱甘肽；S-羟甲基谷胱甘肽；甲酸；甲酸的碱金属盐；和甲酸的碱土金属盐；足以将所述诱导型MUT途径启动子诱导到所述甲基营养型酵母细胞培养物中，使得所述诱导型MUT途径启动子表达所述核酸分子，该核酸分子编码所述感兴趣的重组蛋白，从而产生所述感兴趣的转基因细胞产物；和
(e)从所述甲基营养型酵母细胞培养物中回收所述感兴趣的转基因细胞产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可诱导MUT启动子选自以下组，组中包括：NAD+依赖型甲酸脱氢酶(FDH)启动子；醇氧化酶2(AOX2)启动子；过氧化物酶Pex14p(PEX14)启动子；二羟基丙酮激酶(DAK)启动子；二羟基丙酮合酶1,2(DAS1,2)启动子；甲酰谷胱甘肽脱氢酶(FGH)启动子；甲醛脱氢酶1(FLD1)启动子；果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)启动子；过氧化物酶体膜信号受体PTS1(PEX5)启动子；乙醇脱氢酶2(ADH2)启动子；和过氧化氢酶(CAT)启动子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲基营养型酵母选自以下组，组中包括：巴斯德毕赤酵母、Komagataella kurtzmanii、Komagataella phaffii、安格斯毕赤酵母、吉列尔莫尔毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、肌醇毕赤酵母、多形汉森酵母、博伊丁假丝酵母和解脂耶氏酵母。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲基营养型酵母为巴斯德毕赤酵母。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，测定所述甲基营养型酵母细胞培养密度，以便在足以诱导所述可诱导启动子的浓度上添加所述诱导剂化合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)、(d)和(e)重复多次。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述非抑制性碳源最初分阶段添加到所述甲基营养型酵母细胞培养物中。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述非抑制性碳源最初分阶段添加到所述甲基营养型酵母细胞培养物中，在耗尽生长所述抑制性碳源之前开始，以便所述甲基营养型酵母细胞培养物最初在所述抑制性碳源和所述非抑制性碳源上生长。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，按照每1L培养物0.001-2.0g的剂量或大剂量添加所述诱导剂，最多为每天20次。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，从所述生长培养基中回收所述感兴趣的转基因细胞产物，并添加额外的非抑制性碳源和诱导剂化合物以维持批处理阶段所述甲基营养型酵母细胞培养物的生长，从而使所述感兴趣的转基因细胞产物继续由所述甲基营养型酵母细胞生产并从所述培养基中回收。
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