CN115521283B - 源自瑞香狼毒根的新型色原酮类化合物及其制备与应用 - Google Patents

源自瑞香狼毒根的新型色原酮类化合物及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种色原酮类化合物，结构式如下所示；所述色原酮类化合物是从瑞香狼毒根部提取得到的；本发明提供的新型色原酮类化合物，能够抑制脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应以及LPS诱导的小鼠急性肺炎，具有良好的抗炎作用，可用于制备抗炎药物；

Description

源自瑞香狼毒根的新型色原酮类化合物及其制备与应用
技术领域
本发明涉及一种源自瑞香狼毒根的新型色原酮类化合物及其制备方法，以及在制备抗炎药物中的应用。
背景技术
炎症，是机体对于刺激的一种防御反应，是十分常见而又重要的基本病理过程，可分为感染性炎症和非感染性炎症。目前治疗炎症的药物主要有两大类：一类是甾体抗炎药，例如氢化可的松及其人工合成的衍生物；另一类是非甾体抗炎药，即解热镇痛抗炎药如阿司匹林、保泰松等。
肺炎作为一种炎症性疾病，主要指的是患者的肺泡、终末气道以及肺间质表现出炎症的现象。急性肺炎是呼吸内科多发常见疾病，对致病因素加以分析，主要集中于免疫损伤、病原微生物、药物、理化因素与过敏因素几方面。对于急性感染性肺炎，目前一般用抗生素或人工合成的抗菌药进行治疗。对于一些非感染性肺炎，由于其病程长，对患者的伤害性大，目前对于此类感染还没有较好的治疗药物。
瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)为瑞香科狼毒属植物的干燥根，广泛分布在我国北方地区。瑞香狼毒性味苦平，有大毒，有逐水祛痰、破积杀虫之功效。常用于入成药配伍治疗乳腺炎、水气肿胀、淋巴结核、骨结核，外用可治疥癣、瘙痒、腮腺炎及顽固性皮炎。现有文献报道，瑞香狼毒含有双二氢黄酮、香豆素、木脂素、二萜和多糖等成分，具有抗肿瘤、抗炎等多种活性。
本发明中涉及的源自瑞香狼毒根中的新色原酮类化合物(TT-11)，具有良好的抗炎作用，可用于制备抗炎药物。
发明内容
本发明提供了一种从瑞香狼毒根中分离提取的色原酮类化合物(记作TT-11)及其制备方法，以及在制备抗炎药物中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种色原酮类化合物，结构式为：
本发明所述色原酮类化合物是从瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)根部提取得到的，具体提取方法如下：
(1)将干燥的瑞香狼毒根粉碎，过筛(80目)，用95％乙醇提取，得到浸提液，浓缩后得到粗浸膏；
所述95％乙醇为体积分数95％的含水乙醇；
所述提取的具体操作方法为：常温(20～30℃)下，将瑞香狼毒根与95％乙醇按料液比1(kg)： 4～10(L)混合，静置浸泡5～7天，过滤，收集滤液，滤渣重复浸提1～3次，合并滤液得到浸提液；
(2)将粗浸膏悬浮于水中，用氯仿萃取，萃取液减压浓缩，得到氯仿萃取物；
所述粗浸膏与水的料液比为1(kg)：10(L)；
(3)用200～300目硅胶干法装柱，将氯仿萃取物上样，硅胶与氯仿萃取物质量比为20∶1，依次以石油醚∶乙酸乙酯体积比40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1梯度洗脱，每一个梯度洗脱2～3个柱体积，收集石油醚：乙酸乙酯体积比5：1洗脱部分，浓缩得到目标化合物粗品，用丙酮重结晶得到目标产物；
优选的，将氯仿萃取物与200～300目硅胶按质量比1：1拌样后干法上样；
梯度洗脱过程中，可进行TLC检测，以石油醚：乙酸乙酯体积比3：1为展开剂，在254nm紫外灯下有强紫外吸收且Rf值＝0.3为目标产物点，洗脱至TLC检测无显色点，用甲醇冲柱。
本发明所述色原酮类化合物具有抗炎活性，可用于制备抗炎药物，尤其是急性肺炎治疗药物。
本发明的有益效果在于：本发明提供的新型色原酮类化合物，能够抑制脂多糖(LPS)诱导的 RAW264.7细胞炎症反应以及LPS诱导的小鼠急性肺炎，具有良好的抗炎作用，可用于制备抗炎药物。
附图说明
图1不同浓度TT-11对RAW264.7细胞活力的影响。
图2 10μM浓度的TT-11对炎症相关基因表达的影响。
图3 TT-11对LPS诱导的小鼠急性肺炎左肺湿/干重比的影响。
图4 TT-11对LPS诱导的小鼠急性肺炎相关基因表达的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1化合物TT-11的分离提取
将瑞香狼毒根10kg粉碎打磨至粉末状，用80目筛子过筛。室温下用50L 95％乙醇提取三次，浸提液减压回收溶剂，得到粗浸膏1300g。粗浸膏悬浮于13L水中，用氯仿萃取，减压浓缩氯仿层，得氯仿萃取物122g。
将氯仿萃取物122g与200～300目硅胶122g拌样，用200～300目硅胶2440g干法装柱后干法上样，依次以石油醚:乙酸乙酯＝40:1→1:1(40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1)体系梯度洗脱，每一个梯度洗脱2000ml，洗脱至TLC检测无显色点，用甲醇冲柱，TLC检测(以石油醚:乙酸乙酯＝3:1为展开剂，收集在254nm紫外灯下有强紫外吸收且Rf值约为0.3的目标产物点)，收集石油醚: 乙酸乙酯＝5:1洗脱部分，浓缩得到目标化合物粗品，粗品用丙酮重结晶得TT-11纯品172mg。
实施例2化合物TT-11的结构鉴定
通过质谱核磁确定新化合物TT-11的结构式如下：
化合物TT-11的谱图数据如下：MS:344.1H NMR(Dimethyl sulfoxide-d6,600MHz):δ4.09(2H,s), 5.85(2H,s),6.21(1H,d,J＝2.1Hz),6.37(1H,d,J＝2.2Hz),8.16(1H,s),12.13(2H,s),12.64(1H,s). 13C NMR(Dimethyl sulfoxide-d6,150MHz):δ38.9,93.8,94.7(2×C),98.9,103.6,104.1,117.6,155.1, 157.9,161.5,164.2(2×C),164.3,164.9,180.8,200.3.
实施例3化合物TT-11对RAW264.7细胞的抗炎作用
实验方法：
1、细胞培养：RAW264.7细胞培养于含10％胎牛血清、1％双抗(青霉素和链霉素)的达尔伯克(氏) 必须培养基(DMEM)，在37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞长至对数生长期时，进行相关实验。
2、细胞活性检测：将对数生长期的RAW264.7细胞制备成细胞悬液，按照5×103/孔密度加入到 96孔板，每孔100μL细胞悬液，24h后分别使用不同浓度的TT-11(0、1、10、20、50μM)处理细胞，培养24h后弃去培养液，将CCK-8(Cell Counting Kit-8)与DMEM完全培养液按1:10的比例稀释后，每孔加入100μL稀释液，避光在培养箱中继续孵育2h后用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD) 值。
实验结果：细胞活力检测结果(图1)说明，用1、10、20、50μM的TT-11作用于RAW264.7细胞24h，对细胞活力并无显著影响。后续选用10μM的TT-11处理细胞。
3、实时荧光定量PCR检测炎症相关基因的表达：将对数生长期的RAW264.7细胞用0.25％胰酶消化，分别用DMEM培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、离心后接种到12孔板中，24h后按试验分成四组，每组三个复孔进行实验。对照组：加入1mL的DMEM培养基；LPS组：加入1mL含2μg/mLLPS的DMEM培养基；LPS+TT-11 3h处理组：用1mL含10μM TT-11的DMEM培养基孵育细胞3h 后弃去培养基，加入含2μg/mL LPS的DMEM溶液刺激细胞；LPS+TT-11 6h处理组：用1mL含10μMTT-11的DMEM培养基孵育细胞6h后弃去培养基，用含2μg/mL LPS的DMEM溶液刺激细胞。PCR 检测IL-6、IL-1β、IFN-β、iNOS mRNA水平，具体方法如下：
(a)用总RNA提取试剂盒抽提总mRNA，用Narnodrop2000测定样本的总RNA纯度及浓度后将样本保存于-80℃冰箱备用，以提取的RNA作为模板，按照TaKaRa逆转录试剂盒操作，合成第1链cDNA 后冻存于-80℃冰箱中备用。
(b)使用RT-PCR Buffer II荧光染料法在Armadillo 96-Well PCRPlates上进行荧光实时定量PCR扩增，分析IL-6、IL-1β、IFN-β、iNOS基因表达。以GAPDH作为内参，计算待测基因mRNA 相对量，均重复3次。
实验结果：如图2显示，LPS使IL-6、IL-1β、IFN-β、iNOS mRNA的表达水平显著提高(p<0.05)。图2A显示，用10μM TT-11处理后IL-6 mRNA的表达水平显著降低(p<0.01)，其中10μM TT-11处理6h后IL-6 mRNA的表达水平比处理3h降低作用更显著(p<0.01)。图2B表明，用10μM TT-11处理6h比处理3h显著降低IFN-β mRNA的表达水平(p<0.001)。图2C说明，用10μM TT-11处理后 iNOS mRNA的表达水平显著降低(p<0.05)，TT-11处理3h和6h的作用效果并无显著差别。图2D显示，用10μM TT-11处理后IL-1β mRNA的表达水平显著降低，其中10μMTT-11处理3h显著降低 IFN-β mRNA的表达水平(p<0.01)，处理6h的作用效果不如3h(p<0.05)。
实施例4化合物TT-11对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺炎的影响
实验方法：取18只5～8周龄雄性C57BL/6小鼠被随机分为3组：对照组，LPS(5mg/kg)，LPS+TT-11 (30mg/kg)。对照组连续四天腹腔注射30mg/kg的生理盐水，LPS(5mg/kg)组连续三天腹腔注射 30mg/kg的生理盐水，第四天腹腔注射30mg/kg的生理盐水后间隔30min再滴鼻注射用生理盐水配制的5mg/kg LPS。LPS+TT-11(30mg/kg)组连续三天腹腔注射用生理盐水配制的30mg/kg的TT-11，第四天腹腔注射用生理盐水配制的30mg/kg的TT-11后间隔30min再滴鼻注射用生理盐水配制的5 mg/kg LPS。18小时后处死小鼠，取左肺测定其湿/干重比(图3)，PCR检测肺组织匀浆中IL-6、IL-1β、 IFN-β、TNF-α mRNA水平(图4)。实验操作方法同实施例3(3)*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
实验结果：由图4可以看出，相对于LPS组，30mg/kg的TT-11能够显著降低小鼠左肺湿/干重比 (p<0.05)。
IL-6、IL-1β、TNF-α均为促炎性细胞因子，可诱导组织细胞严重的炎性反应。图4数据显示出相对于LPS组，30mg/kg的TT-11使肺组织匀浆中IL-6、IL-1β、IFN-β、TNF-α mRNA表达水平显著性降低(p<0.01)。化合物TT-11能够有效抑制LPS诱导的小鼠急性肺炎。

Claims (8)

1.一种色原酮类化合物，结构式为：
2.如权利要求1所述色原酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
(1)将干燥的瑞香狼毒根粉碎，过筛，用95％乙醇提取，得到浸提液，浓缩后得到粗浸膏；
(2)将粗浸膏悬浮于水中，用氯仿萃取，萃取液减压浓缩，得到氯仿萃取物；
(3)用200～300目硅胶干法装柱，将氯仿萃取物上样，硅胶与氯仿萃取物质量比为20：1，依次以石油醚：乙酸乙酯体积比40：1、30：1、20：1、10：1、5：1、3：1、1：1梯度洗脱，每一个梯度洗脱2～3个柱体积，收集石油醚：乙酸乙酯体积比5：1洗脱部分，浓缩得到目标化合物粗品，用丙酮重结晶得到目标产物；
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中提取的操作方法为：常温下，将瑞香狼毒根与95％乙醇按料液比1(kg)：4～10(L)混合，静置浸泡5～7天，过滤，收集滤液，滤渣重复浸提1～3次，合并滤液得到浸提液。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中粗浸膏与水的料液比为1(kg)：10(L)。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将氯仿萃取物与200～300目硅胶按质量比1：1拌样后干法上样。
6.如权利要求1所述色原酮类化合物在制备抗炎药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物为急性肺炎治疗药物。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物为能够抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应以及脂多糖诱导的急性肺炎的药物。
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Biflavanones, Chalconoids, and Flavonoid Analogues from the Stem Bark of Ochna holstii;Thobias M.等;J. Nat. Prod.(第84期);364-372 *

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