CN115515600A

CN115515600A - 免疫功能兴奋用组合物

Info

Publication number: CN115515600A
Application number: CN202180031509.0A
Authority: CN
Inventors: 藤野武彦; 马渡志郎; 庭濑纱明; 藤野稔; 入月浩美
Original assignee: Institute of Rheological Function of Food Co Ltd
Current assignee: Institute of Rheological Function of Food Co Ltd
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2021-04-27
Publication date: 2022-12-23
Anticipated expiration: 2041-04-27
Also published as: US20230158050A1; JPWO2021221066A1; WO2021221066A1; JP7033263B1; CN115515600B; JP2022044703A

Abstract

本发明涉及免疫功能兴奋用组合物或自然杀伤细胞激活用组合物，其特征在于，含有缩醛磷脂。

Description

免疫功能兴奋用组合物

技术领域

本发明涉及激活自然杀伤细胞，使免疫功能兴奋的组合物。

背景技术

已知缩醛磷脂具有神经发生的促进作用、脂多糖(LPS)引起的神经炎症的抑制作用、脑内β-淀粉样蛋白(Aβ)的蓄积的抑制作用等，据报道对阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症、精神分裂症等脑神经病有效。例如，非专利文献1中报道了在经口施予来自虾夷扇贝的精制缩醛磷脂的患者中，轻度阿尔茨海默病的记忆功能得到改善。

另一方面，面对以新型冠状病毒(SARS冠状病毒-2，SARS-CoV-2)为首的新型病毒等，固有免疫功能是重要的，需要加强该固有免疫功能。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Fujino T.et al,“Efficacy and Blood Plasmalogen Changes byOral Administration of Plasmalogen in Patients with Mild Alzheimer's Diseaseand Mild Cognitive Impairment:A Multicenter,Randomized,Double-blind,Placebo-controlled Trial”EBioMedicine,[17](2017)199-205

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，虽然已有各种关于缩醛磷脂的报道，但是针对与固有免疫功能有关的缩醛磷脂的效果，尚未详细地进行研究。

本发明的课题在于提供激活自然杀伤细胞、发挥优异的免疫功能兴奋效果的组合物。

用于解决课题的手段

本申请的发明人为了解决上述课题进行了认真研究，结果发现缩醛磷脂能够激活作为固有免疫的主要因素发挥作用的淋巴细胞中的一种即自然杀伤细胞，从而完成了本发明。

即，本发明为如下内容。

[1]免疫功能兴奋用组合物，其特征在于，含有缩醛磷脂。

[2]自然杀伤细胞激活用组合物，其特征在于，含有缩醛磷脂。

[3]抗感染用组合物，其特征在于，含有缩醛磷脂。

[4]如上述[1]所述的免疫功能兴奋用组合物，其特征在于，前述缩醛磷脂是从动物组织提取的缩醛磷脂。

[5]如上述[2]所述的自然杀伤细胞激活用组合物，其特征在于，前述缩醛磷脂是从动物组织提取的缩醛磷脂。

[6]如上述[3]所述的抗感染用组合物，其特征在于，前述缩醛磷脂是从动物组织提取的缩醛磷脂。

发明的效果

本发明的组合物激活自然杀伤细胞，发挥优异的免疫功能兴奋效果。

附图说明

图1是示出来自施予了缩醛磷脂的小鼠的脾脏及肝脏的单核细胞对靶细胞的细胞毒性的结果的图。

图2是示出施予了缩醛磷脂的小鼠的大脑皮质中的干扰素-γ(IFN-γ)的表达结果的图。

图3是示出施予了缩醛磷脂的小鼠的肺组织中的病毒DNA的RT-PCR的结果的图。

图4是示出施予了缩醛磷脂的小鼠的血中白细胞数的图。

图5是示出施予了缩醛磷脂的小鼠的脾脏重量的图。

图6是示出基因正常的线虫及产生缩醛磷脂的基因缺损的线虫感染了绿脓杆菌时的存活率的图。

图7是示出基因正常的线虫及产生缩醛磷脂的基因缺损的线虫感染了金黄葡萄球菌时的存活率的图。

图8是示出来自施予了缩醛磷脂的人的血液的单核细胞的自然杀伤细胞的活性(NK活性)的图(单核细胞:靶细胞＝10:1)。

图9是示出来自施予了缩醛磷脂的人的血液的单核细胞的NK活性的图(单核细胞:靶细胞＝20:1)。

图10是示出服用了缩醛磷脂的人的罹患感冒频度的图。

图11是示出伴随服用缩醛磷脂的RCDP患者的缩醛磷脂血中浓度、CRP炎症反应及发热频度的变化的图。

具体实施方式

本发明的组合物的特征在于含有缩醛磷脂。

本发明的组合物激活作为固有免疫的主要因素发挥作用的淋巴细胞中的一种即自然杀伤细胞(NK细胞)，使固有免疫功能兴奋。因此，能够期待对病毒、细菌等的抗感染效果。即，本发明的组合物作为免疫功能兴奋用组合物、自然杀伤细胞激活用组合物、抗细菌用组合物(抗细菌剂)、抗病毒用组合物(抗病毒剂)这样的抗感染用组合物(抗感染剂)是有用的。需要说明的是，本发明中所谓抗感染是包含对健康者预防病毒、细菌等的感染、对感染者缓解·治疗感染症状的概念。

另外，本发明的组合物能够期待改善肢近端型点状软骨发育不良(RCDP)患者的发热等症状的效果，也能够作为RCDP症状改善用组合物来使用。

缩醛磷脂是具有抗氧化作用的磷脂中的一种，是甘油磷脂之一。其为甘油磷脂中特有的亚类，以在甘油骨架的sn-1位具有乙烯基醚键为表征，在多数的哺乳动物的组织的细胞膜中确认到高浓度的缩醛磷脂。

本发明中使用的缩醛磷脂只要是一般被分类为缩醛磷脂的物质，则没有特别限制，例如能够举出胆碱型缩醛磷脂、乙醇胺型缩醛磷脂、肌醇型缩醛磷脂、丝氨酸型缩醛磷脂。其中，优选胆碱型缩醛磷脂、乙醇胺型缩醛磷脂，特别优选乙醇胺型缩醛磷脂。

本发明的缩醛磷脂能够从动物组织提取。作为动物组织，只要含缩醛磷脂，则没有特别限制，能够举出贝类、海鞘、海参、鲑鱼、秋刀鱼、鲣鱼等水生动物，鸟类等。其中，优选贝类、海鞘、鸟类，特别优选贝类。作为使用的部位，优选食用部位(可食部位)。这些动物组织可以使用切断物，但从能够更高效地提取缩醛磷脂的角度考虑，优选使用粉碎物。

作为贝类，能够例示出虾夷扇贝类、贻贝、鲍鱼等食用的双壳贝、卷贝，特别优选虾夷扇贝类。虾夷扇贝类是属于扇贝科的食用的双壳贝，例如能够举出属于Mizuhopecten属、海扇(pecten)属的扇贝。具体而言，能够举出在日本采集的虾夷扇贝(学名：Mizuhopectenyessoensis)、在欧洲采集的欧洲虾夷扇贝(学名：Pectenmaximus(Linnaeus))等。作为食用部位，能够举出贝柱、裙边等。

海鞘是属于真海鞘科的食用的脊索动物，能够举出属于真海鞘属、红海鞘属的海鞘。具体而言，能够举出真海鞘(学名：Halocynthia roretzi)、红海鞘(学名：Halocynthiaaurantium)等。作为食用部位，能够举出身体的部分(鳃囊)。

鸟类只要是食用的鸟类，则没有特别限制，例如能够举出鸡、乌鸡、鸭等。作为食用部位，优选富含缩醛磷脂的胸肉。

缩醛磷脂的提取能够使用水、有机溶剂、含水有机溶剂进行，优选并用酶处理。例如，能够举出乙醇提取法、己烷提取法，优选乙醇提取法。

作为乙醇提取法，只要是使用乙醇(包括含水乙醇)进行提取的方法，则没有特别限制，例如能够举出日本特开2019-140919号公报、日本特开2018-130130号公报、日本再表2012-039472号公报、日本特开2010-065167号公报、日本特开2010-063406号公报等中记载的方法。

作为己烷提取法，只要是使用己烷进行提取的方法，则没有特别限制，例如能够举出日本再表2009-154309号公报、日本再表2008-146942号公报等中记载的方法。

本发明的组合物能够作为例如医药品(包含准医药品)、特定保健用食品、营养功能食品、功能性食品等功效标识经规定机关许可的功能性食品等所谓的健康食品来使用。

在将本发明的组合物用作医药品、健康食品的情况下，本发明的组合物只要是在含有缩醛磷脂并且用于免疫功能兴奋、自然杀伤细胞的激活及/或抗感染的点上作为产品能够与其它产品进行区分，则没有特别限制，例如在本发明的产品的主体、包装、说明书、宣传物的任一者中标明、暗示具有免疫功能兴奋功能、自然杀伤细胞激活功能及/或抗感染症功能的主旨的产品包括在本发明的范围内。

本发明的组合物可以经口使用，也可以注射、滴注等非经口使用，从能够轻松摄取的点考虑，优选经口使用。在经口使用的情况下，作为其形态，例如能够举出片状、胶囊状、粉末状、颗粒状、液状、粒状、棒状、板状、块状、固体状、丸状、糊状、霜状、囊片状、胶状、咀嚼片(chewable)状、棒(stick)状等。其中，优选胶囊状的形态。

作为本发明的组合物中的缩醛磷脂的含量，只要在发挥其效果的范围内适当含有即可。虽然也与其形态有关，但以干燥质量换算，例如缩醛磷脂优选为本发明的组合物整体的10^-10质量％以上，更优选为10^-5质量％以上，进一步优选为0.1质量％以上，特别优选为1.0质量％以上。

作为本发明的经口组合物的摄取量，没有特别限制，但从更显著地发挥本发明的效果的观点考虑，缩醛磷脂的摄取量优选以成人每天10^-6μg/日以上进行摄取，更优选以1μg/日以上进行摄取，进一步优选以500μg/日以上进行摄取，特别优选以1000μg/日以上进行摄取。其上限例如为20,000μg/日，优选为10,000μg/日。

本发明的经口组合物能够以1日的摄取量成为前述摄取量的方式收纳于1个容器、或者分装于例如2～3的多个容器作为1日量。

根据需要，本发明的组合物能够添加本发明的成分以外的其它成分，并通过已知的方法来制造。作为本发明的成分以外的其它成分，例如能够举出维生素、矿物质、蛋白质、肽、氨基酸、动物性油、植物性油。

以下，基于实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1

使用小鼠，对基于缩醛磷脂的NK细胞的活性(NK活性)进行评价。

[缩醛磷脂]

缩醛磷脂使用通过以下方法由虾夷扇贝(学名：Mizuhopecten yessoensis)制备的己烷提取乙醇胺型缩醛磷脂(主要含乙醇胺型缩醛磷脂，此外，含胆碱型缩醛磷脂)。

1.向生虾夷扇贝裙边加入Kokulase P(三菱化学株式会社制)和磷脂酶A1(PLA1)(三菱化学株式会社制)并进行混合。

2.接下来，加入己烷/异丙醇，对上清液进行抽滤。

3.加入硫酸钠水溶液并充分混合。

4.将上层用旋转蒸发器干燥。

5.加入已冷却至4℃的丙酮并进行混合。

6.以3000rpm、10min、4℃进行离心。

7.弃去上清液，回收沉淀。

8.用干燥器干燥一晚。

[缩醛磷脂向小鼠的施予]

使用从Oriental Yeast购买的7周龄的C57BL/6J雄性小鼠。整个实验期间中在大学动物实验设施内的SPF(无特定病源体)环境下饲养。

用溶解于玉米油的缩醛磷脂以200μl/小鼠(缩醛磷脂20、2、0.2mg/kg)对4组各3只小鼠进行4天的经口施予。仅0.2mg/kg以n＝2进行实验。需要说明的是，作为对照，施予未配合缩醛磷脂的玉米油。

[单核细胞的分离]

从小鼠摘取脾脏和肝脏。

分别在10cm培养皿的金属网(0.12×80，孔径0.2mm)上添加10ml的3％FCS-RPMI将脾脏及肝脏研碎。将其液体移至50ml管，以1500rpm离心5分钟。

向得到的脾脏的细胞的颗粒(pellet)添加1ml裂解液，将红细胞溶解后，加入10ml的3％FCS-RPMI，以1500rpm离心5分钟，由此得到单核细胞。

另一方面，将用金属网研碎肝脏而得到的颗粒悬浮于33％Percoll液，以1800rpm离心15分钟。向得到的颗粒中添加1ml裂解液来溶解红细胞。移至15ml管，加入10ml的3％FCS-RPMI，于1500rpm离心5分钟，由此得到肝脏的单核细胞。

[NK活性的测定]

通过以NK敏感性细胞株YAC-1为靶细胞的4小时的Cr释放试验测定NK细胞活性。将YAC-1在Na⁵¹CrO₄存在下培养1小时，将细胞用⁵¹Cr标记后，将1×10⁵细胞/ml悬浮于含10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基。将从小鼠的脾脏和肝脏分离的单核细胞分别按效应物(单核细胞)：靶点(YAC-1)比悬浮于培养液。分别在96-孔圆底微量培养板(NUNC，Roskilde，Denmark)中以100μl进行混合，在5％CO₂存在下湿润空气中于37℃培养4小时后，回收上清液，测定其液体的γ射线量。特异性溶解百分率(the percentage of specific lysis)基于以下算式计算。

％特异性溶解

＝(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100

图1中示出来自脾脏及肝脏的单核细胞对靶细胞的细胞毒性的结果。结果以在各组中的各小鼠得到的值的平均值±SD表示。

如图1所示，确认到施予了缩醛磷脂的小鼠的单核细胞与对照的单核细胞相比，具有对NK敏感性细胞株YAC-1的高细胞毒性。即，证实了通过缩醛磷脂的经口施予，NK细胞被激活。因此，认为通过施予缩醛磷脂，免疫功能兴奋，能够期待对病毒、细菌等的抗感染效果。

实施例2

使用小鼠，对基于缩醛磷脂的干扰素(IFN)的表达增加进行评价。

[缩醛磷脂]

缩醛磷脂使用通过以下方法由虾夷扇贝(学名：Mizuhopecten yessoensis)制备的乙醇提取乙醇胺型缩醛磷脂(主要含乙醇胺型缩醛磷脂，此外，含胆碱型缩醛磷脂)。

1.向生虾夷扇贝裙边加入Kokulase P(三菱化学株式会社制)并进行混合。

2.接下来，加入乙醇，进行抽滤。

3.将滤液用旋转蒸发器干燥。

[缩醛磷脂向小鼠的施予]

使用从Oriental Yeast购买的7周龄的C57BL/6J雄性小鼠。整个实验期间中在大学动物实验设施内的SPF环境下饲养。

用溶解于水的缩醛磷脂(1mg/kg/日)对5只小鼠进行6周的经口施予。需要说明的是，对对照组施予水。

[干扰素-γ(IFN-γ)的表达量的测定]

从小鼠摘取脑，通过实时PCR确认大脑皮质的干扰素-γ(IFN-γ)的表达量。

将其结果示于图2。

如图2所示，施予了缩醛磷脂的小鼠的大脑皮质中的IFN-γ的表达与对照相比显著增加。即，确认到通过缩醛磷脂的施予，参与抑制病毒等的感染的干扰素-γ的表达增加。

实施例3

使用小鼠，对基于缩醛磷脂的病毒感染的抑制效果进行评价。

[缩醛磷脂]

缩醛磷脂使用与实施例2同样地经乙醇提取的乙醇胺型缩醛磷脂。

[缩醛磷脂向小鼠的施予]

小鼠的饲养与实施例2同样。

用溶解于水的缩醛磷脂(0.02、1、10mg/kg/日)对小鼠(n＝4)进行5周的经口施予。对对照小鼠施予不含缩醛磷脂的饮用水。

[对小鼠的病毒感染评价]

将鼠疱疹病毒1型(Murid herpesvirus 1，ATCC(R)VR-1399^TM)以1×108pfu(Plaque-Forming Unit：空斑形成单位)浓度向小鼠进行腹腔内注射，72小时后处死，采集肺、脾脏、肝脏的各组织。

针对各组织的提取基因组DNA，通过使用病毒特异性引物的RT-PCR(reversetranscription Polymerase Chain Reaction：逆转录聚合酶链反应)扩增病毒DNA。PCR法中，使用了来自各组的等量的基因组DNA(100ng)。通过PCR法扩增Gapdh基因(Glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase：3-磷酸甘油醛脱氢酶)的基因组DNA作为内部对照。

图3中示出小鼠的肺组织中的病毒DNA的RT-PCR的结果。图4中示出小鼠的血中白细胞数。另外，图5中示出小鼠的脾脏重量的测定结果。

如图3所示，在未施予缩醛磷脂的对照组的肺组织中，观察到病毒DNA的显著增加。另一方面，在施予了缩醛磷脂的小鼠的肺组织中，与对照组相比，确认到病毒DNA的显著减少。因此，证实了通过缩醛磷脂的施予，抑制小鼠的病毒感染。

如图4所示，在未施予缩醛磷脂的对照组中，病毒的感染导致血中白细胞数大幅减少。另一方面，在施予了缩醛磷脂的小鼠中，与对照组相比，显著地抑制了血中白细胞数的减少。因此，暗示通过缩醛磷脂的施予，抑制小鼠的病毒感染。

如图5所示，在未施予缩醛磷脂的对照组中，观察到病毒的感染导致脾脏的重量显著增加。另一方面，在施予了缩醛磷脂的小鼠中，与对照组相比，显著地抑制了脾脏重量的增加。因此，暗示通过缩醛磷脂的施予，抑制小鼠的病毒感染。

如上所述，认为通过缩醛磷脂的施予，NK活性提高，发挥对病毒等的抗感染效果。

实施例4

调查缩醛磷脂的不足对细菌感染带来的影响。

针对基因正常的野生型(WT N2)的线虫、和产生缩醛磷脂的基因缺损的线虫(acl-7、ads-1、fard-1)，比较对病原细菌(绿脓杆菌(P.aeruginosa)、金黄葡萄球菌(S.aureus))的抗性。

具体而言，按照下述方式进行。

1.将绿脓杆菌及金黄葡萄球菌在LB培养基中培养一晚。

2.准备线虫生长培养基(NGM)琼脂培养基，在一部分上涂布上述悬浮液，于37℃放置24小时后，进一步于25℃放置24小时。

3.将线虫的成虫在上述培养基中进行培养，确认生死，求出存活率。

图6中示出感染绿脓杆菌的线虫的存活率，图7中示出感染金黄葡萄球菌的线虫的存活率。

如图6及图7所示，产生缩醛磷脂的基因缺损的线虫与野生型相比，感染了绿脓杆菌及金黄葡萄球菌时的存活率显著低。因此，暗示缩醛磷脂表现出对细菌的抗感染效果。

实施例5

基于缩醛磷脂的人的NK活性进行评价。

[缩醛磷脂]

缩醛磷脂使用与实施例2同样地经提取的乙醇胺型缩醛磷脂。

[缩醛磷脂的施予]

受试者为肥胖症(32岁，男性)、焦虑症(52岁，女性)、糖尿病(73岁，男性)及高脂血症(59岁，男性)这4人。用含缩醛磷脂0.5mg的硬胶囊剂，对受试者以早、晚各2个胶囊、共计2mg(2mg/日)进行4天施予。

[NK活性]

NK活性的测定委托株式会社BML进行。需要说明的是，检查方法为51Cr.游离法。

图8及图9中示出来自人血液的单核细胞的NK活性的结果。图8是单核细胞:靶细胞的比率为10:1时的结果，图9是单核细胞:靶细胞的比率为20:1时的结果。

如图8及图9所示，在摄取缩醛磷脂4天后，确认到所有受试者的NK活性上升。即，能够期待通过对人施予缩醛磷脂使NK细胞激活，使免疫功能兴奋。

实施例6

对基于缩醛磷脂的人的罹患感冒频度进行评价。

[缩醛磷脂]

[缩醛磷脂向人的施予]

受试者为在诊所治疗的男性10人、女性23人，共计33人。用含缩醛磷脂0.5mg的硬胶囊剂，对受试者以早、晚各1个胶囊、共计1mg(1mg/日)进行12个月的施予。

[罹患感冒频度的评价]

针对受试者从服用缩醛磷脂前及开始服用起12个月期间中的1年间的罹患感冒次数进行问卷调查。

图10中示出从服用缩醛磷脂前及开始服用起12个月期间的罹患感冒的频度。

如图10所示，在服用缩醛磷脂前，21.2％的受试者的罹患感冒频度为4次/年，在开始服用12个月后，罹患感冒频度为4次/年的受试者为0％，确认到罹患感冒频度的明显减少。另外，在趋势检验中，也确认到统计学上的显著减少(趋势P＝0.0001)。因此，认为通过对人施予缩醛磷脂，NK活性提高，发挥对病毒等的抗感染效果。

实施例7

对缩醛磷脂血中浓度下降、引发病毒感染症的肢近端型点状软骨发育不良(RCDP)患者施予缩醛磷脂，对其影响进行评价。

[缩醛磷脂]

[缩醛磷脂向RCDP患者的施予]

受试者为患RCDP的3岁女童。在服用开始时，以0.25mg/日施予缩醛磷脂，并逐渐増加施予量，最大施予6.0mg/日。

[缩醛磷脂血中浓度、CRP炎症反应及发热频度的评价]

在缩醛磷脂的服用开始前及服用开始后对受试者进行采血，对缩醛磷脂血中浓度、CRP炎症反应进行测定。另外，确认发热频度作为病毒感染的指标。

图11中示出伴随服用缩醛磷脂的RCDP患者的缩醛磷脂血中浓度、CRP炎症反应及发热频度的变化。

如图11所示，确认到随着缩醛磷脂服用量的増加，缩醛磷脂的血中浓度上升。另外，CRP炎症反应随着缩醛磷脂的服用持续时间而减弱。此外，关于发热次数，服用缩醛磷脂前，发热为1次/周，服用开始后约2个月期间的发热次数为3次，进一步地缩醛磷脂的服用量达到6.0mg/日后，不发热。另外，在服用缩醛磷脂前，屡屡并发认为是由病毒感染引起的肺炎，但服用缩醛磷脂后，不再并发肺炎。即，认为在缩醛磷脂血中浓度低的RCDP患者中，缩醛磷脂具有对病毒等的抗感染效果。

由以上实施例1～7的结果表明，通过缩醛磷脂的施予能够预防·改善病毒、细菌引起的感染。作为该感染预防、治疗效果的作用机理，认为是通过缩醛磷脂的施予，NK细胞激活，免疫功能兴奋。

实施例8

[配合例]

通过以下示出的配合制造硬胶囊剂。

产业上的可利用性

本发明的组合物有助于固有免疫的兴奋，因此在产业上是有用的

Claims

1.免疫功能兴奋用组合物，其特征在于，含有缩醛磷脂。

2.自然杀伤细胞激活用组合物，其特征在于，含有缩醛磷脂。

3.抗感染用组合物，其特征在于，含有缩醛磷脂。

4.如权利要求1所述的免疫功能兴奋用组合物，其特征在于，所述缩醛磷脂是从动物组织提取的缩醛磷脂。

5.如权利要求2所述的自然杀伤细胞激活用组合物，其特征在于，所述缩醛磷脂是从动物组织提取的缩醛磷脂。

6.如权利要求3所述的抗感染用组合物，其特征在于，所述缩醛磷脂是从动物组织提取的缩醛磷脂。