CN115490779A - 一种用于治疗中枢神经系统损伤的仙人掌多糖提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了仙人掌多糖提取物在制备治疗中枢神经系统损伤药物中的新用途，本发明另一目的是提供一种仙人掌多糖提取物的制备方法。细胞增殖实验检测发现，仙人掌多糖提取物可促进神经元细胞增殖，减轻甲基苯丙胺引起的神经元损伤；能改善甲基苯丙胺引起的小鼠神经行为障碍以及学习记忆障碍，减少神经元丢失，并增加神经生长因子(BDNF)的表达。因此仙人掌多糖提取物对神经元损伤具有很好的保护作用，可用于中枢神经系统损伤的治疗。本发明专利试验证明，在获得三个多糖提取物组分中，MAP2组分即平均分子量为4.46×104～5.91×104的组分活性最强。本发明疗效确切，由于是天然产物，因此副作用少，安全可靠；所提供的制备方法产品收率高，活性成分含量高。

Description

一种用于治疗中枢神经系统损伤的仙人掌多糖提取物的制备 方法

技术领域

本发明涉及一种用于治疗中枢神经系统损伤的仙人掌多糖提取物的制备方法。

背景技术

米邦塔仙人掌(OpuntiaMilpaAlta)属仙人掌科、仙人掌属、双子叶植物，是墨西哥农业专家经过多年的种植、人工杂交、选育后培育出来的食用仙人掌品种。近年来的研究表明，仙人掌的药理作用已涉及到抑菌、抗炎、免疫、降血糖、抗癌及预防心脑血管疾病等范畴。仙人掌的诸多功效与其化学成分密切相关，主要包括多糖类、黄酮类、有机酸类、生物碱类和甾醇类等多种天然活性物质。从植物中提取的多糖是由多个单糖或单糖衍生物聚合而成的大分子化合物，具有抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、降血糖、抗病毒、抗氧化等生理活性。目前对于米邦塔仙人掌多糖的研究大多停留在提取方法和结构分析的阶段，各实验室对米邦塔仙人掌多糖结构特征的研究结果也存在一定差异，对于多糖的相对分子质量与生理活性之间关系的研究较少。米邦塔仙人掌中提取的多糖是一种天然的活性物质，目前其生理活性的研究主要停留在降血脂和降血糖方面，而对于米邦塔仙人掌多糖的抗氧化活性研究鲜见研究报道。而多糖是生物体内普遍存在的一类大分子物质，作为生命物质的组成成分之一，广泛参与细胞的各种生理活动的调节，特别在细胞识别、细胞间物质运输、免疫调节等生物学功能方面新的认识广泛引起人们的重视。近年来大量研究证实，许多多糖具有抗肿瘤、降血糖、抗凝血、抗炎、抗衰老及抗氧化等重要药理活性，已引起药理学家的极大关注，所以多糖也逐渐成为当今新药开发的重要方向之一。因为多糖来源广泛，而生物活性显著，毒副作用小，所以在医药方面具有广阔的开发和利用前景。有人预言：“21世纪将是多糖的世纪”。但是目前还没有文献报道米邦塔仙人掌多糖对中枢神经系统损伤尤其是毒品导致的脑组织损伤具有保护作用。

发明内容

本发明公开了仙人掌多糖提取物在制备治疗中枢神经系统损伤药物中的新用途，本发明另一目的是提供一种仙人掌多糖提取物的制备方法。

细胞增殖实验检测发现，仙人掌多糖提取物可促进神经元细胞增殖，减轻甲基苯丙胺引起的神经元损伤；能改善甲基苯丙胺引起的小鼠神经行为障碍以及学习记忆障碍，减少神经元丢失，并增加神经生长因子(BDNF)的表达。因此仙人掌多糖提取物对神经元损伤具有很好的保护作用，可用于中枢神经系统损伤的治疗。

申请人还发现，仙人掌多糖治疗中枢神经系统损伤的效果与多糖的制备方法和分子量大小有一定关系，按以下方法制备的仙人掌多糖提取物活性最强，该方法的步骤如下：新鲜米邦塔仙人掌→预处理→仙人掌干粉→热水提取→离心→取上清液，加4倍体积95％乙醇静置12h→离心→沉淀加500mL去离子水复溶→浓缩→三氯乙酸法除蛋白质→透析除杂→取上清液，加4倍体积95％乙醇静置12h→离心→分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀3次→冷冻干燥→得到米邦塔仙人掌粗多糖；

处理中需要注意的是：S1、预处理：取新鲜米邦塔仙人掌洗净、去皮、切片，置于80℃烘箱内烘干，然后粉碎成粉末，过60目筛，以1∶2的料液比添加石油醚，脱脂脱色素后晾干，密封保存；

S2、热水提取：精确称取10g米邦塔仙人掌干粉，按设定水提条件(料液比、提取温度、提取时间)进行提取试验，得到粗多糖浸提液；

S3、采用三氯乙酸法除去蛋白质：等体积加入3％三氯乙酸溶液，搅拌均匀后于4℃静置12h，10000r/min离心10min，上清液用NaOH调pH至中性，重复操作3次；

S4、米邦塔仙人掌粗多糖含量测定采用苯酚－硫酸法测定粗多糖含量，以阿拉伯糖为标准品测定粗多糖中多糖含量；粗多糖得率＝粗多糖重量/仙人掌干粉重量×100％；

S5、通过单因素试验，分别考察料液比、提取温度、提取时间、提取次数对米邦塔仙人掌粗多糖得率的影响。根据单因素试验结果，以料液比、提取温度和提取时间为参数，以粗多糖得率为响应值，按照Design－Expert10.0分析软件中的Box－Behnken中心组合设计法，设计三因素三水平的响应面试验，并对数据进行分析，得到响应面回归方程，进一步寻找最优工艺参数。

进一步地，一种用于治疗中枢神经系统损伤的仙人掌多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述的米邦塔仙人掌多糖的纯化步骤如下：

S1、阴离子交换柱DEAE－纤维素－52纯化称取0.1gMAP，加入10mL蒸馏水充分搅拌溶解，10000r/min离心15min，上清液过DEAE－纤维素－52柱。上样吸附半个小时，用蒸馏水和0.5mol/LNaCl分别洗脱，流速2mL/min，每管收集8mL。用苯酚－硫酸法在482nm处测定每管吸光度，以试管编号为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制洗脱曲线。收集合并洗脱峰段溶液，旋蒸浓缩和透析脱盐后，进行冷冻干燥得到水洗脱部分多糖MAP1和盐洗脱部分多糖MAP2；

S2、阴离子交换柱DEAE－琼脂糖－CL－6B纯化称取0.05gMAP，加入10mL蒸馏水充分搅拌溶解后10000r/min离心15min，上清液过DEAE－琼脂糖－CL－6B柱。上样吸附半个小时，用蒸馏水洗3个柱体积，弃去，然后用0.1mol/LNaCl洗脱，流速1.5mL/min，每管收集6mL。其他步骤同上，冷冻干燥后得到MAP3；

S3、总糖和糖醛酸含量的测定分别取2mL0.03mg/mL的各多糖溶液，2mL阿拉伯糖各标准品溶液，向各管加入4％的苯酚溶液0.5mL，迅速滴加5mL浓硫酸，摇匀，冷却至室温，静置15min，测定其在482nm处的吸光度，另取2mL蒸馏水同法操作为参比。根据标准曲线计算样品中总糖的含量。分别取1mL0.5mg/mL的各多糖溶液，1mLD－半乳糖醛酸各标准品溶液，在冰水浴中分别加入浓硫酸溶液6mL，混匀，于80℃水浴加热20min，取出后立即冷却至室温，加入0.15％咔唑溶液0.2mL，摇匀，室温下保持2h后，在530nm处测定吸光度，用1mL蒸馏水作为参比；根据标准曲线计算样品中糖醛酸的含量。

本发明专利有益效果：试验证明，在获得三个多糖提取物组分中，MAP2组分即平均分子量为4.46×104～5.91×104的组分活性最强。本发明疗效确切，由于是天然产物，因此副作用少，安全可靠；所提供的制备方法产品收率高，活性成分含量高。

附图说明

图1为本发明一种用于治疗中枢神经系统损伤的仙人掌多糖提取物的制备方法的流程图。

图2为本发明一种用于治疗中枢神经系统损伤的仙人掌多糖提取物的制备方法提纯检测流程图。

具体实施方式

下面结合附图1-2对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。

实施例1：米帮塔仙人掌多糖的提取、分离与纯化：

药材来源：米邦塔食用仙人掌购自河北省种植基地，新鲜采购。

主要试剂：纤维素DEAE-52(Whatman公司)；无水乙醇、95％乙醇、丙酮、乙醚、浓硫酸、苯酚均为国产市售分析纯。主要仪器：恒温水浴槽、真空干燥箱、电子天平、旋转蒸发仪、紫外分光光度计。

米帮塔仙人掌粗多糖的制备：将新鲜购置的米邦塔仙人掌茎清水洗净去皮后切成碎片，干燥。取干燥米邦塔仙人掌茎碎片用双蒸水按0.1∶1(重量与体积之比，即1千克物质∶1升溶剂水)95℃搅拌3h过滤，去滤液，在残渣中再次加入2倍的双蒸水95℃搅拌2h，再次去滤液。将2次提取的滤液充分搅拌后抽滤，然后将抽滤后的滤液放入旋转蒸发仪中，旋转蒸发至原体积的10％，再加入适量的氯仿萃取4-5次，然后将上层液体移至另一容器中，按体积比1∶4加入无水乙醇至终浓度为80％，4℃过夜，常温抽滤，留沉淀物。依次用无水乙醇，丙酮，乙醚分别将沉淀清洗3次，去杂质后进行真空干燥得米邦塔仙人掌粗糖粉末。

米邦塔仙人掌粗糖分离纯化：用纤维素DEAE-52分离柱进行分离纯化。首先用如下方法将上柱预处理：(1).将干粉的纤维素浸泡在蒸馏水中，约3小时左右，去除杂质，抽干；(2).用0.5mol/L的HCl溶液浸泡2小时，用去离子水洗净至PH中性，并抽干；(3).将抽干的纤维素再浸泡在0.5mol/L的NaOH溶液中2小时，用去离子水洗至中性，抽干。将粗糖粉末与45℃双蒸水按1∶4(重量与体积之比)溶解，将此溶解液分别用双蒸水及0.5M的NaOH溶液缓冲液，用上述处理后的分离柱进行洗脱，流速3ml/5min，然后将洗脱液用苯酚-硫酸法检测糖的出现，最后收集含糖洗脱液放入旋转蒸发仪中蒸发，转速为50-80/3min，温度60℃，蒸发至稠状液体，进行真空干燥得纯化米邦塔仙人掌多糖粉末。

米邦塔仙人掌多糖中可溶性糖的含量鉴定：苯酚-硫酸法测定测定原理：利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，开迅速脱水生成糖醛或羟甲基糠醛等衍生物，然后与苯酚缩合生成橙黄色化合物，其颜色深浅与糖的含量成正比，故可用比色法测定。所测的可溶性糖主要有葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖、乳糖、甲基化的糖、戊糖等。测定方法：试剂：6％苯酚溶液现配现用；浓硫酸(比重1.84)；分别从试管中精密量取冲洗液25ul，加ddH2O至2ml，在继续加入苯酚试液1.0ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀，置沸水浴中加热15min，取出，冷水冷却至室温，见颜色变化。根据所测吸光度值绘制工作曲线。

结果：新鲜米邦塔仙人掌茎，用热水浸提法提取多糖，经对米邦塔仙人掌多糖的提取工艺进行优化，最佳提取条件是：料液比为9∶1，提取温度95℃，提取时间4h，最佳醇沉条件为：乙醇体积分数为80％，乙醇用量为提取物体积的4倍，沉淀时间为15h。提取液用Savage法脱蛋白后，真空干燥。粗多糖的平均提取率为6.91％。粗多糖采用纤维素DEAE-52柱层析纯化，并经过硫酸-苯酚法检测糖的含量，真空干燥后得到米邦塔仙人掌多糖。多糖的得率为35％。

实施例2：米帮塔仙人掌多糖的提取、分离与纯化：

药材来源：米邦塔食用仙人掌购自河北省沧州种植基地，新鲜采购。

主要试剂：纤维素DEAE-52(Whatman公司)；无水乙醇、95％乙醇、丙酮、乙醚、浓硫酸、苯酚均为国产市售分析纯。主要仪器：恒温水浴槽、真空干燥箱、电子天平、旋转蒸发仪、紫外分光光度计。

米帮塔仙人掌粗多糖的制备：将新鲜购置的米邦塔仙人掌茎清水洗净去皮后切成碎片，干燥。取干燥米邦塔仙人掌茎碎片用双蒸水按0.15∶1(重量与体积之比，即1千克物质∶1升溶剂水)95℃搅拌2.5h过滤，去滤液，在残渣中再次加入2.2倍的双蒸水95℃搅拌2.5h，再次去滤液。将3次提取的滤液充分搅拌后抽滤，然后将抽滤后的滤液放入旋转蒸发仪中，旋转蒸发至原体积的10％，再加入适量的氯仿萃取5-6次，然后将上层液体移至另一容器中，按体积比1∶3.5加入无水乙醇至终浓度为80％，4℃过夜，常温抽滤，留沉淀物。依次用无水乙醇，丙酮，乙醚分别将沉淀清洗3次，去杂质后进行真空干燥得米邦塔仙人掌粗糖粉末。

米邦塔仙人掌粗糖分离纯化：用纤维素DEAE-52分离柱进行分离纯化。首先用如下方法将上柱预处理：(1).将干粉的纤维素浸泡在蒸馏水中，约4小时左右，去除杂质，抽干；(2).用0.5mol/L的HCl溶液浸泡2.2小时，用去离子水洗净至PH中性，并抽干；(3).将抽干的纤维素再浸泡在0.5mol/L的NaOH溶液中2小时，用去离子水洗至中性，抽干。将粗糖粉末与45℃双蒸水按1∶4(重量与体积之比)溶解，将此溶解液分别用双蒸水及0.5M的NaOH溶液缓冲液，用上述处理后的分离柱进行洗脱，流速3ml/5min，然后将洗脱液用苯酚-硫酸法检测糖的出现，最后收集含糖洗脱液放入旋转蒸发仪中蒸发，转速为80-100/3min，温度65℃，蒸发至稠状液体，进行真空干燥得纯化米邦塔仙人掌多糖粉末。

米邦塔仙人掌多糖中可溶性糖的含量鉴定：苯酚-硫酸法测定测定原理：利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，开迅速脱水生成糖醛或羟甲基糠醛等衍生物，然后与苯酚缩合生成橙黄色化合物，其颜色深浅与糖的含量成正比，故可用比色法测定。所测的可溶性糖主要有葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖、乳糖、甲基化的糖、戊糖等。测定方法：试剂：7％苯酚溶液现配现用；浓硫酸(比重1.84)；分别从试管中精密量取冲洗液25ul，加ddH2O至2ml，在继续加入苯酚试液1.0ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.5ml，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，冷水冷却至室温，见颜色变化。根据所测吸光度值绘制工作曲线。

结果：新鲜米邦塔仙人掌茎，用热水浸提法提取多糖，经对米邦塔仙人掌多糖的提取工艺进行优化，最佳提取条件是：料液比为8.2∶1，提取温度95℃，提取时间5h，最佳醇沉条件为：乙醇体积分数为80％，乙醇用量为提取物体积的4倍，沉淀时间为15h。提取液用Savage法脱蛋白后，真空干燥。粗多糖的平均提取率为6.91％。粗多糖采用纤维素DEAE-52柱层析纯化，并经过硫酸-苯酚法检测糖的含量，真空干燥后得到米邦塔仙人掌多糖。多糖的得率为37％。

实施例3：米帮塔仙人掌多糖的提取、分离与纯化：

药材来源：米邦塔食用仙人掌购自河北省沧州种植基地，新鲜采购。

主要试剂：纤维素DEAE-52(Whatman公司)；无水乙醇、95％乙醇、丙酮、乙醚、浓硫酸、苯酚均为国产市售分析纯。主要仪器：恒温水浴槽、真空干燥箱、电子天平、旋转蒸发仪、紫外分光光度计。

米帮塔仙人掌粗多糖的制备：将新鲜购置的米邦塔仙人掌茎清水洗净去皮后切成碎片，干燥。取干燥米邦塔仙人掌茎碎片用双蒸水按0.2∶1(重量与体积之比，即1千克物质∶1升溶剂水)95℃搅拌3h过滤，去滤液，在残渣中再次加入2.2倍的双蒸水95℃搅拌2.5h，再次去滤液。将3次提取的滤液充分搅拌后抽滤，然后将抽滤后的滤液放入旋转蒸发仪中，旋转蒸发至原体积的12％，再加入适量的氯仿萃取4-7次，然后将上层液体移至另一容器中，按体积比1∶3.5加入无水乙醇至终浓度为82％，4℃过夜，常温抽滤，留沉淀物。依次用无水乙醇，丙酮，乙醚分别将沉淀清洗5次，去杂质后进行真空干燥得米邦塔仙人掌粗糖粉末。

米邦塔仙人掌粗糖分离纯化：用纤维素DEAE-52分离柱进行分离纯化。首先用如下方法将上柱预处理：(1).将干粉的纤维素浸泡在蒸馏水中，约4小时左右，去除杂质，抽干；(2).用0.5mol/L的HCl溶液浸泡1.8小时，用去离子水洗净至PH中性，并抽干；(3).将抽干的纤维素再浸泡在0.5mol/L的NaOH溶液中1.8小时，用去离子水洗至中性，抽干。将粗糖粉末与45℃双蒸水按1∶4(重量与体积之比)溶解，将此溶解液分别用双蒸水及0.5M的NaOH溶液缓冲液，用上述处理后的分离柱进行洗脱，流速3ml/5min，然后将洗脱液用苯酚-硫酸法检测糖的出现，最后收集含糖洗脱液放入旋转蒸发仪中蒸发，转速为80-100/3min，温度70℃，蒸发至稠状液体，进行真空干燥得纯化米邦塔仙人掌多糖粉末。

米邦塔仙人掌多糖中可溶性糖的含量鉴定：苯酚-硫酸法测定测定原理：利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，开迅速脱水生成糖醛或羟甲基糠醛等衍生物，然后与苯酚缩合生成橙黄色化合物，其颜色深浅与糖的含量成正比，故可用比色法测定。所测的可溶性糖主要有葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖、乳糖、甲基化的糖、戊糖等。测定方法：试剂：7％苯酚溶液现配现用；浓硫酸(比重1.55)；分别从试管中精密量取冲洗液30ul，加ddH2O至2ml，在继续加入苯酚试液1.0ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.5ml，摇匀，置沸水浴中加热35min，取出，冷水冷却至室温，见颜色变化。根据所测吸光度值绘制工作曲线。

结果：新鲜米邦塔仙人掌茎，用热水浸提法提取多糖，经对米邦塔仙人掌多糖的提取工艺进行优化，最佳提取条件是：料液比为7.9∶1，提取温度95℃，提取时间5h，最佳醇沉条件为：乙醇体积分数为80％，乙醇用量为提取物体积的5倍，沉淀时间为15h。提取液用Savage法脱蛋白后，真空干燥。粗多糖的平均提取率为5.5％。粗多糖采用纤维素DEAE-52柱层析纯化，并经过硫酸-苯酚法检测糖的含量，真空干燥后得到米邦塔仙人掌多糖。多糖的得率为33％。

上述得到米邦塔仙人掌多糖对实验载体的应用如下：

实验一：对离体脑片氧糖剥夺损伤的保护作用；

实验动物：雄性SD大鼠，体重为200～300g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。试剂：2，3，5-三苯基氯化四氮唑，同第一部分，人工脑脊液组成(mmol·L-1：NaCl126，KCl3.5，NaH2PO41.2，MgCl21.3，CaCl22.0，葡萄糖11，NaHCO325，pH7.4)，避光保存；碘化丙啶(propidiumiodide，PI)，Sigma公司产品；乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，乳酸脱氢酶)、一氧化氮合酶(NOS，分型)、一氧化氮(NO)、考马氏亮蓝检测试剂盒(南京建成生物制品有限公司)，其余试剂均为分析纯。实验仪器：脑片切片机(美国生产)，酶标仪TECANA-5082(奥地利生产)。激光共聚焦显微镜：Leica，TCS-SP(德国生产)。

皮层和海马脑片的制备：成年SD大鼠快速断头，迅速将全脑取出，立即浸入冰冷的预先饱和混合氧气(95％O2+5％CO2)的人工脑脊液中，将小脑和脑干弃去，分离海马与皮质，.分别用切片机沿纵轴切成400μm厚脑片.用人工脑脊液漂洗两次后放置培养瓶内(瓶内盛3ml人工脑脊液，(35±0.5)℃，持续通入95％O2和5％CO2混合气，进行孵育。

脑片损伤模型的建立：脑片在35℃ACSF中孵育30min后，实施氧糖剥夺(oxygen-glucosedeprivation，OGD)损伤，用预先饱和混合氮气(95％N2和5％CO2)的无糖脑脊液(以10mmol·L-1的蔗糖代替ACSF中的葡萄糖)置换瓶内培养液，分别持续通95％N2+5％O2各5、10、15、20、25、30min，再恢复含氧、含糖孵育条件正常孵育2h(reoxygenation，REO)，孵育结束后，所有脑片进行TTC染色，用酶标仪测定490nm处光密度(OD)值。计算不同时间氧糖剥夺损伤后的脑组织与对照组的损伤百分率(％)，以确定损伤模型所需的最佳时间。

实验分组：随机分为①正常空白对照组：脑片在孵育过程中不作任何处理②损伤模型组：脑片在ACSF中孵育30min后，氧糖剥夺15min，随后恢复正常ACSF孵育2h。③米帮塔仙人掌多糖处理组：分为3个浓度组，在损伤前30min分别加入0.2mg·L-1、1mg·L-1、2mg·L-1米帮塔仙人掌多糖。

TTC染色脑片与2％TTC(用ACSF稀释)35℃条件下避光孵育30min，随后取出，生理盐水漂洗，吸去表面水分，称湿重，以1g脑片∶20ml比例加入抽提液(乙醇∶二甲亚砜＝1∶1)，避光24h，按皮层脑片：200μl/孔，海马脑片：100μl/孔的量加至96孔板，酶标仪测定各孔在490nm处吸光度值(A490)。组织损伤百分率＝(1-A490损伤/A490对照)×100％。

激光共聚焦检测大鼠脑片细胞内PI荧光强度：以二甲基亚砜为溶剂，将PI配制成1mmol/L浓度，以2μl/ml加入脑片孵育杯中，混匀，将各组孵育后的脑片移至含有2μl/mlPI的人工脑脊液中，35℃下避光负载30min，持续通氧，人工脑脊液漂洗3次，随后进行激光共聚焦检测，观察并记录脑片组织的损伤情况即平均荧光强度。激光共聚焦工作条件为：Power200mM；Zoom2，光切厚度10μm，中速扫描，激发波长490nm，发射波长650nm，10倍光学显微镜头进行观察。因PI可以透过损伤的细胞膜进入细胞内，和DNA结合后发出荧光，荧光愈强，表明损伤愈严重。

脑片孵育液生化指标检测：分别收集氧糖剥夺15min及复氧复糖2h后的脑片孵育上清液，按照试剂盒检测说明书检测孵育液中乳酸脱氢酶含量；实验结束后将各组脑片组织进行匀浆，检测组织中NO含量和iNOS活性变化。并进行组织蛋白含量测定。

统计学分析采用SPSS11.5统计软件，数值用表示，组间比较采用单因素方差分析(ONEWAY-ANOVA)和PLSD法进行显著性检验，p＜0.05有显著意义。

实验结果：(1)米邦塔仙人掌多糖对氧糖剥夺损伤脑片活性的影响：米邦塔仙人掌多糖对脑片TTC染色的影响将0.2mg·L-1、1mg·L-1及2mg·L-1的仙人掌多糖与大鼠皮层和海马脑片在正常条件共同孵育3h，对脑片TTC染色无影响。各组A490值之间差异无显著意义。氧糖剥夺损伤后大鼠皮层和海马脑片TTC染色A490值较正常对照组显降低，P＜0.01(组织损伤百分率：皮层36.36％；海马52.38％)。损伤前给与不同剂量仙人掌多糖均能明显逆转脑片TTC染色A490值的降低，与损伤组相比，P＜0.05。且其保护作用与剂量呈正相关，具有明显剂量依耐性。。(2)米邦塔仙人掌多糖对脑片PI染色的影响：大鼠皮层、海马脑片负载PI后均能在激光共聚焦下显示出清晰的荧光图像，损伤区坏死细胞呈现红色。结果表明，氧糖剥夺损伤后，其PI平均荧光强度明显增加，分别为：323.89±35.69和189.76±20.06与对照组相比，P＜0.01。米邦塔仙人掌多糖1mg/L及2mg/L处理后能显著减弱氧糖剥夺损伤后脑片PI荧光强度，表明坏死细胞减少，进一步证明对脑组织氧化应激损伤具有保护作用。(3)米邦塔仙人掌多糖对乳酸脱氢酶释放的影响：氧糖剥夺损伤15min，乳酸脱氢酶的释放轻度增加，与正常对照组比较，无统计学意义，(P＞0.05)。如脑片氧糖剥夺损伤15min再复氧复糖孵育2h后，皮层、海马脑片孵育液中乳酸脱氢酶量显著增加，与正常对照组比较(P＜0.01)，米帮塔仙人掌多糖0.2mg/L、1mg/L和2mg/L处理后能显著减弱复氧复糖孵育2h后海马、皮层乳酸脱氢酶的释放，与损伤模型组比较差异有显著意义(P＜0.01)。。(4)米邦塔仙人掌多糖对脑片NO/iNOS释放的影响：氧糖剥夺伤孵育15min后，皮层、海马脑片组织中NO含量明显增加，iNOS活性均显著增加，与对照组比较，P＜0.01；米帮塔仙人掌多糖0.2mg/L、1mg/L、2mg/L处理后均能不同程度降低海马、皮层脑片的NO的含量和减弱iNOS活性，与模型损伤组比较，P＜0.05。

实验二：米邦塔仙人掌多糖对H2O2所致大鼠离体脑片损伤保护作用

实验动物：雄性SD大鼠，体重为200～300g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。试剂：2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC)，仙人掌多糖，同第二部分；乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，乳酸脱氢酶)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathion，谷胱甘肽还原酶)、总抗氧化能力(totalantioxidationcapability)检测试剂盒购自南京建成生物制品有限公司。其余试剂均为分析纯。3.实验仪器：切片机和酶标仪同前；4.皮层和海马脑片的制备：同前。

H2O2致脑片氧化应激损伤模型的建立：脑片在35℃人工脑脊液中孵育30min后，分别用1，2和4mmol/LH2O2继续孵育30min，随后恢复正常人工脑脊液孵育2h。对照组实验步骤同损伤组，但孵育液中不含H2O2。TTC染色，计算不同浓度H2O2的脑组织损伤百分率，以确定损伤模型所需H2O2的最佳浓度。

实验分组：脑片在35℃人工脑脊液中孵育30min，随机分为对照组：继续正常孵育；模型组：用含2mmol/LH2O2人工脑脊液孵育30min，随后恢复正常人工脑脊液孵育2h；米帮塔仙人掌多糖处理组：在损伤前30min，分别用0.333和1.67mg/L米帮塔仙人掌多糖预孵育，用含2mmol/LH2O2人工脑脊液孵育30min，恢复正常孵育2h后，将脑片进行TTC染色。7.TTC染色：同前。8.脑片孵育液生化指标检测孵育结束，取出培养脑片，滤纸吸干表面水分后称取湿重。将收集的人工脑脊液分别按照试剂盒说明书进行乳酸脱氢酶、SOD活性，谷胱甘肽还原酶含量和总抗氧化能力检测，将检测结果除以相应培养脑片组织湿重，以每克组织的检测量为单位。亚硝酸法测定SOD活性，SOD活性表示为试剂盒对照管与样品管间亚硝酸盐量的差值(Δ)。亚硝酸盐量根据亚硝酸盐标准品的标准曲线(Y＝a+bX)计算得出，Y代表吸光度值，X代表亚硝酸盐浓度。9.统计采用SPSS11.5统计软件，数值用表示，组间比较采用单因素方差分析(ONEWAY-ANOVA)和PLSD法进行差异显著性检验，p＜0.05有显著意义。

实验结果：1.米邦塔仙人掌多糖对H2O2损伤脑片活性的影响：用含1，2和4mmol·L-1H2O2的人工脑脊液孵育脑片30min均可降低大脑皮层和海马脑片TTC染色A490nm值，表明H2O2对大鼠脑片可造成不同程度损伤。其中2mmol/LH2O2损伤强度适中，组织损伤百分率：皮层(42±3)％，海马(53±3)％，可以确定为本实验比较理想的造模浓度。损伤前或损伤同时给予米帮塔仙人掌多糖能逆转脑片A490nm值降低，表明其对H2O2所致脑片损伤具有一定的保护作用。实验发现不同时间给药所表现的效应不同，损伤前给药的脑组织保护作用优于损伤同时给药，如在损伤30min后给予则无明显保护作用(P＞0.05)。另外，其保护作用还与浓度相关，1.67mg·L-1的保护作用强于0.333mg·L-1(P＜0.01)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (2)

1.一种用于治疗中枢神经系统损伤的仙人掌多糖提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：新鲜米邦塔仙人掌→预处理→仙人掌干粉→热水提取→离心→取上清液，加4倍体积95％乙醇静置12h→离心→沉淀加500mL去离子水复溶→浓缩→三氯乙酸法除蛋白质→透析除杂→取上清液，加4倍体积95％乙醇静置12h→离心→分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀3次→冷冻干燥→得到米邦塔仙人掌粗多糖；

上述处理中需要注意的是：

S1、预处理：取新鲜米邦塔仙人掌洗净、去皮、切片，置于80℃烘箱内烘干，然后粉碎成粉末，过60目筛，以1∶2的料液比添加石油醚，脱脂脱色素后晾干，密封保存；

S2、热水提取：精确称取10g米邦塔仙人掌干粉，按设定水提条件(料液比、提取温度、提取时间)进行提取试验，得到粗多糖浸提液；

S3、采用三氯乙酸法除去蛋白质：等体积加入3％三氯乙酸溶液，搅拌均匀后于4℃静置12h，10000r/min离心10min，上清液用NaOH调pH至中性，重复操作3次；

S4、米邦塔仙人掌粗多糖含量测定采用苯酚－硫酸法测定粗多糖含量，以阿拉伯糖为标准品测定粗多糖中多糖含量；粗多糖得率＝粗多糖重量/仙人掌干粉重量×100％；

S5、通过单因素试验，分别考察料液比、提取温度、提取时间、提取次数对米邦塔仙人掌粗多糖得率的影响；根据单因素试验结果，以料液比、提取温度和提取时间为参数，以粗多糖得率为响应值，按照Design－Expert10.0分析软件中的Box－Behnken中心组合设计法，设计三因素三水平的响应面试验，并对数据进行分析，得到响应面回归方程，进一步寻找最优工艺参数。

2.根据权利要求1所述的一种用于治疗中枢神经系统损伤的仙人掌多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述的米邦塔仙人掌多糖的纯化步骤如下：

S1、阴离子交换柱DEAE－纤维素－52纯化称取0.1gMAP，加入10mL蒸馏水充分搅拌溶解，10000r/min离心15min，上清液过DEAE－纤维素－52柱；上样吸附半个小时，用蒸馏水和0.5mol/LNaCl分别洗脱，流速2mL/min，每管收集8mL；用苯酚－硫酸法在482nm处测定每管吸光度，以试管编号为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制洗脱曲线；收集合并洗脱峰段溶液，旋蒸浓缩和透析脱盐后，进行冷冻干燥得到水洗脱部分多糖MAP1和盐洗脱部分多糖MAP2；

S2、阴离子交换柱DEAE－琼脂糖－CL－6B纯化称取0.05gMAP，加入10mL蒸馏水充分搅拌溶解后10000r/min离心15min，上清液过DEAE－琼脂糖－CL－6B柱；上样吸附半个小时，用蒸馏水洗3个柱体积，弃去，然后用0.1mol/LNaCl洗脱，流速1.5mL/min，每管收集6mL；其他步骤同上，冷冻干燥后得到MAP3；

S3、总糖和糖醛酸含量的测定分别取2mL0.03mg/mL的各多糖溶液，2mL阿拉伯糖各标准品溶液，向各管加入4％的苯酚溶液0.5mL，迅速滴加5mL浓硫酸，摇匀，冷却至室温，静置15min，测定其在482nm处的吸光度，另取2mL蒸馏水同法操作为参比；根据标准曲线计算样品中总糖的含量；分别取1mL0.5mg/mL的各多糖溶液，1mLD－半乳糖醛酸各标准品溶液，在冰水浴中分别加入浓硫酸溶液6mL，混匀，于80℃水浴加热20min，取出后立即冷却至室温，加入0.15％咔唑溶液0.2mL，摇匀，室温下保持2h后，在530nm处测定吸光度，用1mL蒸馏水作为参比；根据标准曲线计算样品中糖醛酸的含量。

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