CN115462427A

CN115462427A - 一种康普茶的制备方法

Info

Publication number: CN115462427A
Application number: CN202210991677.0A
Authority: CN
Inventors: 练庆旺; 王祝彬; 欧成成
Original assignee: Npgs Guangdong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Npgs Guangdong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-08-18
Filing date: 2022-08-18
Publication date: 2022-12-13
Anticipated expiration: 2042-08-18
Also published as: CN115462427B

Abstract

本发明提供一种康普茶的制备方法。所述康普茶的制备以葡萄糖和乳清蛋白粉为发酵基质，经植物乳杆菌发酵而形成康普茶，通过对发酵基质的筛选和优化组合能有效提高康普茶中多酚、生物碱、总酸和乳酸的含量，并提高康普茶的抗氧化效果。本发明提供的康普茶制备方法简单、发酵基质简单、菌种单一、发酵时间短且抗氧化能力强，可进行工业化生产。

Description

一种康普茶的制备方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种康普茶的制备方法。

背景技术

康普茶(Kombucha)，是一种发酵茶饮料，一般采用红茶或绿茶为原料，含有多种酵母和细菌以及这些微生物产生的有机酸、活性酶、氨基酸和多酚，富含B₃、B₁₂等维生素，有助于肠道健康，是近年来流行于欧美的功能性发酵茶饮料，又称为“红茶菌”、“海宝”和 “胃宝”等，起源于我国渤海一带。

康普茶是以茶糖水(红茶或绿茶浸提液加入蔗糖)为主要发酵基质，经酵母菌、醋酸菌以及乳酸菌等共生菌群(红茶菌)发酵而成的一种富含多种活性成分的功能性饮品，通过代谢产生一系列营养保健物质，其中包含部分茶叶浸出物、发酵微生物及其代谢产物，包括醋酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、茶多酚、咖啡因、葡萄糖、果糖、蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素等，具有抗心血管疾病、提高消化能力、刺激免疫系统、减少发炎等功效。

一直以来，康普茶主要以家庭作坊式生产，由于其菌种的多样性、发酵过程的复杂性及饮用的安全性，加上传统发酵工艺周期长(7天以上)，生产稳定性易受原料、菌种、发酵条件等因素影响，继而未能工业化生产。近年来，生物技术及生产体系的不断完善使康普茶的安全和规模化生产成为可能。现有专利公开了一种组合式红茶菌发酵剂，通过感官评分评定优选，但其仅从感官维度进行评价。并未对康普茶发酵液中活性物质，如多酚、生物碱、总酸和乳酸进行含量测定，尤其未对康普茶发酵前后中多酚及其抗氧化能力进行测定。

目前一些研究对于发酵基质只关注碳源，但对于发酵基质的氮源未作过多优化与组合应用，碳源和氮源的种类选择、添加量对康普茶的关键活性成分是否有影响亦未见有相关专利或研究报道。同时鉴于传统康普茶共生菌至少有3种或以上，对于同时适合3种益生菌发酵的条件会增加发酵及其产物的不可控性，且不利于工业化生产应用，为此简化益生菌菌种数量显得尤其重要。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一个方面提出一种康普茶的制备方法，能够克服目前康普茶发酵周期长、发酵基质复杂和益生菌菌种数量多的缺点，同时对发酵基质的种类、添加量对关键活性成分影响进行深入研究，简化并优化了康普茶制备。

本发明的第二个方面提出了一种康普茶饮品。

本发明的第三个方面提出了一种第一方面所述制备方法制得的康普茶在制备具有抗氧化能力和/或抑制肝癌细胞增殖的功能饮品中的应用。

根据本发明的第一个方面，提出了一种康普茶的制备方法，包括如下步骤：

S1：配制红茶混合液，灭菌，得到灭菌混合液；

S2：将葡萄糖、乳清蛋白与S1所述灭菌混合液混合，接种植物乳杆菌，发酵；

S3：终止发酵，将发酵液离心，取上清液，即得所述康普茶；

其中，S2所述植物乳杆菌的接种量为0.65g/L～0.75g/L。

在本发明的一些实施方式中，S1中所述配制红茶混合液具体包括：取粉碎过筛的红茶粉末，按1g:(30～45)mL料液比加入蒸馏水，充分搅拌均匀得混合液，料液比优选为1g:(30～40) mL。

在本发明的一些实施方式中，上述红茶粉末的制备包括：选取干净、整洁的红茶；去掉粗枝、粗梗，剔除破损、腐烂、霉变的红茶叶，将红茶叶进行打粉，过60～80目筛网。

在本发明的一些实施方式中，S1中所述灭菌的温度为65℃～80℃，时间为25min～35min。

在本发明的一些实施方式中，S2中所述葡萄糖的添加量为每100mLS1所述灭菌混合液加10g～15g葡萄糖。

在本发明的一些的实施方式中，S2中所述乳清蛋白为蛋白质含量为70％～90％的乳清蛋白。

在本发明的一些实施方式中，S2中所述接种的具体步骤包括：接种前菌种常温放置25 min～35min，接种，并轻摇混合均匀。

在本发明的一些实施方式中，S2所述植物乳杆菌的活菌数≥5.0×10¹¹CFU/g。

在本发明的一些实施方式中，S2所述发酵的温度为32℃～37℃。

在本发明的一些实施方式中，S2所述发酵的时间为45h～55h。

在本发明的一些实施方式中，S3所述终止发酵具体包括：将发酵体系pH降至3.3～3.6，终止发酵。

在本发明的一些实施方式中，S3所述终止发酵的温度为85℃～95℃，所述终止发酵的保持时间为5min～15min。

在本发明的一些实施方式中，S3所述离心的转速为4000rpm～5000rpm。

在本发明的一些实施方式中，S3所述离心的时间为5min～15min。

在本发明的一些优选的实施方式中，S1中所述灭菌的温度为70℃～75℃，时间为28 min～32min。

在本发明的一些优选的实施方式中，S2中所述乳清蛋白的添加量为每100mLS1所述灭菌混合液加0.2g～2g乳清蛋白。

在本发明的一些优选的实施方式中，S2中所述植物乳杆菌的接种量为0.70g/L～0.74g/L。

在本发明的一些优选的实施方式中，S2中所述葡萄糖的添加量为每100mLS1所述灭菌混合液加12g～14g葡萄糖。

在本发明的一些优选的实施方式中，S2所述发酵的温度为34℃～36℃。

在本发明的一些优选的实施方式中，S2所述发酵的时间为48h～52h。

在本发明的一些优选的实施方式中，S3所述终止发酵的温度为88℃～92℃，所述终止发酵的保持时间为8min～12min。

在本发明的一些优选的实施方式中，S3所述离心的转速为4000rpm～4500rpm。

在本发明的一些优选的实施方式中，S3所述离心的时间为8min～12min。

在本发明的一些优选的实施方式中，S3还包括将上清液灌装，终灭菌，得到所述康普茶；所述灌装包括但不限于灌装在10mL～50mL棕色玻璃瓶中；所述终灭菌的温度为85℃～95℃，时间为5min～15min。

在本发明的一些更优选的实施方式中，S2中所述乳清蛋白的添加量为每100mLS1所述灭菌混合液加0.4g～1.5g乳清蛋白。

根据本发明的第二个方面，提出了一种康普茶饮品，所述康普茶饮品包括第一方面所述的制备方法制得的康普茶。

在本发明的一些实施方式中，所述康普茶饮品还包括食品上可接受的添加剂。

根据本发明的第三个方面，提出了一种第一方面所述制备方法制得的康普茶在制备具有抗氧化能力和/或抑制肝癌细胞增殖的功能饮品中的应用。

本发明的有益效果为：

1.本发明利用单一商业化植物乳杆菌发酵制备康普茶，克服了现有康普茶发酵菌种数量多的缺陷，发酵工艺操作简单，具有发酵周期短、康普茶多酚含量高抗氧化活性能力强等优点。

2.本发明的发酵基质中，葡萄糖、乳清蛋白与植物乳杆菌的合理优化组合，有一定的协同增效，得到的康普茶对人体肝癌细胞有明显的抗增殖作用，对细胞抗氧化活性有明显的提升效果作用。

3.本发明方法具有条件温和、能耗低及不破坏康普茶多酚结构等优点，采用的植物乳杆菌为价格低廉的商业化用植物乳杆菌。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中未发酵前样品和发酵后所得康普茶对人体肝癌细胞HepG2抗增殖能力；

图2为本发明实施例1中未发酵前样品和发酵后所得康普茶对人体肝癌细胞HepG2抗氧化活性CAA值。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

以下各实施例和对比例中所用的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌购于仙农科技生物有限公司，其中植物乳酸菌的产品名称为：植物乳杆菌

-LP56；植物乳杆菌

-LP56活菌数≥5.0×10¹¹CFU/g；嗜酸乳杆菌

-LA26，嗜酸乳杆菌

-LA26活菌数≥1.0×10¹¹CFU/g；鼠李糖乳杆菌

-LR76，鼠李糖乳杆菌

-LR76活菌数≥3.0×10¹¹CFU/g；所用的红茶叶购于浙大百川生物食品技术有限公司；葡萄糖来源：西王药业有限公司；乳清蛋白来源：Glanbia nutritionals。

实施例1

本实施例制备了一种康普茶，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取红茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入葡萄糖和80％乳清蛋白(葡萄糖添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加12.5g，80％乳清蛋白添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加1g)，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75g/L接种植物乳杆菌，在35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

实施例2

本实施例制备了一种康普茶，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取红茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入葡萄糖和80％乳清蛋白(葡萄糖添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加10g，80％乳清蛋白添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加2g)，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75g/L接种植物乳杆菌，在35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

实施例3

本实施例制备了一种康普茶，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取红茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入葡萄糖和80％乳清蛋白(葡萄糖添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加15g，80％乳清蛋白添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加0.2g)，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75 g/L接种植物乳杆菌，在35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

实施例4

本实施例制备了一种康普茶，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取康普茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入葡萄糖和80％乳清蛋白(葡萄糖添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加10g，80％乳清蛋白添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加0.2g)，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75 g/L接种植物乳杆菌，在35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

实施例5

本实施例制备了一种康普茶，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取红茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入葡萄糖和80％乳清蛋白(葡萄糖添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加15g，80％乳清蛋白添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加2g)，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75g/L接种植物乳杆菌，在35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

对比例1

本对比例制备了一种康普茶，与实施例1的区别在于未添加碳源(葡萄糖)和氮源(80％乳清蛋白)，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取红茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入体积分数为13.5％ (以灭菌后的混合茶液为基础)的蒸馏水，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75 g/L接种植物乳杆菌，在35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

对比例2

本对比例制备了一种康普茶，与实施例1的区别在于未添加氮源(80％乳清蛋白)，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取红茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入葡萄糖(添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加12.5g)和体积分数为1％(以灭菌后的混合茶液为基础)的蒸馏水，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75g/L接种植物乳杆菌，在 35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

对比例3

本对比例制备了一种康普茶，与实施例1的区别在于未添加碳源(葡萄糖)，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取红茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入80％乳清蛋白(添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加1g)和体积分数为12.5％(以灭菌后的混合茶液为基础)的蒸馏水，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75g/L接种植物乳杆菌，在35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置 90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL 棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

对比例4

本对比例制备了一种康普茶，与实施例1的区别在于添加碳源(葡萄糖)和氮源(乳清蛋白)量低于本发明保护范围下限用量，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取红茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入葡萄糖和80％乳清蛋白(葡萄糖添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加8g，80％乳清蛋白添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加0.1g)，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75g/L接种植物乳杆菌，在35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

对比例5

本对比例制备了一种康普茶，与实施例1的区别在于添加碳源(葡萄糖)和氮源(乳清蛋白)量高于本发明保护范围上限用量，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取红茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入葡萄糖和80％乳清蛋白(葡萄糖添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加20g，80％乳清蛋白添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加3g)，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75g/L接种植物乳杆菌，在35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

对比例6

本对比例制备了一种康普茶，与实施例1的区别在于使用嗜酸乳杆菌替代植物乳杆菌，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取红茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入葡萄糖和80％乳清蛋白(葡萄糖添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加12.5g，80％乳清蛋白添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加1g)，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75g/L接种嗜酸乳杆菌，在35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

对比例7

本对比例制备了一种康普茶，与实施例1的区别在于使用鼠李糖乳杆菌替代植物乳杆菌，具体过程为：

红茶叶进行粉碎过80目筛，取红茶粉50g，按1:35料液比加入蒸馏水，得混合茶液。混合茶液使用湿热灭菌法，70℃条件下灭菌30min，冷却至30℃～40℃加入葡萄糖和80％乳清蛋白(葡萄糖添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加12.5g，80％乳清蛋白添加量为每100mL灭菌后的混合茶液添加1g)，混合均匀后缓慢加入，搅拌均匀。按0.65g/L～0.75g/L接种鼠李糖乳杆菌，在35℃控温无氧条件下发酵50h。当发酵液pH降至3.3～3.6时则终止发酵，发酵液置90℃水浴10min。发酵液置离心机4000rpm离心10min，取上清液，取上清液灌装在30mL棕色玻璃瓶中，于90℃水浴灭菌10min，得康普茶。

试验例

1.分别检测实施例1～5和对比例1～7制备的康普茶中多酚、生物碱、总酸和乳酸的含量：茶多酚的检测方法参考GB/T 31740.2-2015、生物碱的检测方法参考GB 8312-2013、总酸的检测方法参考GB 12456-2021及乳酸的检测方法参考GB 5009.157-2016，其结果见下表1。

表1康普茶中多酚、生物碱、总酸和乳酸含量

结果分析：

由表1可看出，实施例1～5在本发明条件范围内调整参数，其康普茶多酚、生物碱、总酸和乳酸含量结果相差不显著，其中实施例1中康普茶多酚含量2.78mg/g，生物碱1.13mg/g，总酸7.13mg/g和乳酸6.56mg/g。

对对比例1～3进行分析，对比例1是发酵基质中未添加碳源和氮源物质，康普茶中多酚、生物碱、总酸和乳酸含量均显著降低，这与植物乳杆菌生长繁殖过程中缺少营养物质有关。对比例2因未添加氮源营养物质，其多酚、生物碱、总酸和乳酸含量均有明显影响，含量分别为1.20mg/g、0.91mg/g、3.91mg/g和3.62mg/g；而对比例3因未添加碳源营养物质，其多酚、生物碱、总酸和乳酸含量也均有显著影响，含量分别为1.01mg/g、1.01mg/g、3.21mg/g 和2.98mg/g，表明本发明发酵基质对康普茶的活性物质影响明显，缺一不可，在本发明中二者的配合使用对本发明中活性的物质含量起关键性作用，尤其对康普茶多酚的含量。通过对比例2和对比例3结果分析，表明本发明中同时添加碳源和氮源两种发酵底物，可提高康普茶中多酚的含量，表明本发明中发酵底物的优化与组合存在一定协同增效的作用效果。对比例2和对比例3的康普茶多酚含量结果简单相加为2.21mg/g，而实施例1中康普茶多酚含量 2.78mg/g，含量提高了26％。但对于生物碱、总酸和乳酸的含量未有明显提升作用。

通过对比例4和对比例5结果分析，当添加的碳源和氮源两种发酵底物不足时，发酵产物多酚、生物碱、总酸和乳酸含量未达顶峰，说明碳源与氮源的缺乏会限制乳酸菌的生长代谢。但当添加的碳源和氮源两种发酵底物过高时，又抑制了发酵产物康普茶多酚、总酸和乳酸的含量，与实验例1相对比，分别下降低了58.6％、26.4％和36.3％，生物碱含量影响变化较小。分析其原因，如主要活性物质多酚含量可能因为碳源的过多致使植物乳杆菌生长过多可将简单的酚类物质转化，也可解聚大分子酚类化合物，使得总多酚含量降低。而乳清蛋白的添加量过高导致植物乳杆菌发酵活性增加，促进了生物碱的溶出，其可与多元酚类结合成复合物，进而导致含量的降低，其含量变化机理有待进一步研究。

对比例6和对比例7分别使用了嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌代替了植物乳杆菌进行发酵，其它条件参数相对于实施例1未作任何改变，发酵产物含量检测发现多酚和生物碱的含量有降低的趋势，且总酸和乳酸的含量降低明显，尤其是鼠李糖乳杆菌发酵，总酸和乳酸的降低量超50％，表明嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵产物含量不及本发明优选的植物乳杆菌菌种。

2.康普茶多酚对人体肝癌细胞(HepG2)抗增殖和胞内抗氧化活性(CAA)能力检测

细胞培养：基于HepG2细胞模型测定康普茶液的细胞抗氧化活性，用CM培养基培养细胞(于37℃，5％CO₂细胞培养箱)，待细胞密度为80％左右时，用2mL胰蛋白酶进行消化，于4℃离心(1000×g，4min)收集细胞，并转移至新鲜培养基继续培养，待细胞生长至指数增长期进行后续实验。

HepG2抗增殖实验：取指数生长期的HepG2细胞，以2.5×10⁵个/mL的细胞密度铺于96 孔板，置于细胞培养箱孵育4h，待细胞完全贴壁后用分别用实施例1中发酵前和发酵后的康普茶液处理细胞。孵育24h后，弃掉培养液，PBS清洗细胞，随后每孔加入50μL亚甲蓝染液，置于37℃，孵育1h。然后用清水清洗96孔板，待亚甲蓝染液被完全洗净，并用吸水纸拍板至水分挥干，随后加入EB洗脱缓冲液，在570nm波长下检测每孔的吸光度值。通过 OD值计算细胞的存活率。

CAA实验：选取指数生长期的HepG2细胞，以细胞密度6.0×10⁴个/孔接种在96孔板。用CAA抗氧化培养基稀释实施例1中发酵前的康普茶液备用，待贴壁培养24h后，弃掉培养基并用PBS清洗细胞，随后每孔加入50μL的上述备用的发酵前的康普茶液和50μL含有DCFH-DA(50μM)的CAA抗氧化培养基；与此同时，用CAA抗氧化培养基稀释实施例1 中发酵后的康普茶液备用，待细胞贴壁培养24h后，弃掉培养基并用PBS清洗细胞，随后每孔加入50μL上述备用的发酵后的康普茶液和50μL含有DCFH-DA(50μM)的CAA抗氧化培养基，并设置空白对照组，置于37℃孵育1h。弃掉培养基后，用PBS清洗细胞一次，随后每孔加入100μLABAP(2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐)(空白组除外)。立即运用多功能酶标仪分别测定荧光强度值，检测条件为：温度37℃，激发波长485nm，发射波长538 nm，每隔5min记录一次荧光强度值，总测定时长为60min。以时间和荧光度值为坐标分别绘制发酵前和发酵后的康普茶液的荧光强度变化曲线，通过荧光强度变化曲线计算出EC₅₀，进一步计算出CAA值。

CAA unit＝100-(∫SA/∫CA)×100

其中发酵前或后的康普茶液的荧光强度积累量为(∫SA)，空白对照组的荧光强度积累量(∫CA)。

HepG2细胞抗氧化模型不仅能有效检测到天然活性物质在细胞内的抗氧化活性，还可以阐述天然活性物的生物利用度，此验证方法比化学抗氧化方法更接近体内复杂的生理代谢环境，更具有说服力。酚类提取物对HepG2的抗增殖作用结果以EC₅₀形式表示，EC₅₀值越低，表示该物质具有越高的抗增殖活性，测试结果见图1，T-1为康普茶发酵前样品；T-2为康普茶发酵后样品，实验中有设空白对照，用于计算结果使用，但图中不体现空白组别。

从图1可看出通过本发明条件参数的发酵方法，可以提升康普茶发酵后的抗氧化能力。

细胞抗氧化活性(CAA)分析方法是在和人体相近的PH值和温度下测定天然活性物质的抗氧化活性，考虑到抗氧化剂的生物利用度，吸收和代谢，是更接近动物水平的体外抗氧化值。CAA是以槲皮素的EC₅₀/样品EC₅₀，且CAA和EC₅₀值呈负相关性，EC₅₀值越低则CAA值越高。测试结果见图2，T-1为康普茶发酵前样品；T-2为康普茶发酵后样品，实验中有设空白对照，用于计算结果使用，但图中不体现空白组别。

从图2可看出通过本发明条件参数的发酵方法，康普茶CAA值从0.309提高至0.830，约提升了1.69倍。表明在本发明条件参数发酵后的康普茶抗氧化活性高，对癌细胞体外抑制力强，是天然抗氧化、抗增殖活性物质的好资源。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一种康普茶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：配制红茶混合液，灭菌，得到灭菌混合液；

其中，S2所述植物乳杆菌的接种量为0.65g/L～0.75g/L。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中所述葡萄糖的添加量为每100mLS1所述灭菌混合液加10g～15g葡萄糖。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S2中所述乳清蛋白的添加量为每100mLS1所述灭菌混合液加0.2g～2g乳清蛋白。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S2所述植物乳杆菌的活菌数≥5.0×10¹¹CFU/g。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S2所述发酵的温度为32℃～37℃。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，S2所述发酵的时间为45h～55h。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，S3所述终止发酵的温度为85℃～95℃，所述终止发酵的保持时间为5min～15min。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，S3所述离心的转速为4000rpm～5000rpm，所述离心的时间为5min～15min。

9.一种康普茶饮品，其特征在于，所述康普茶饮品包括权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的康普茶。

10.如权利要求1～8任一项所述制备方法制得的康普茶在制备具有抗氧化能力和/或抑制肝癌细胞增殖的功能饮品中的应用。